CN116855579A - 抗体和dna寡核苷酸缀合物及其在elisa-pcr检测中的应用 - Google Patents

抗体和dna寡核苷酸缀合物及其在elisa-pcr检测中的应用 Download PDF

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CN116855579A CN202310831795.XA CN202310831795A CN116855579A CN 116855579 A CN116855579 A CN 116855579A CN 202310831795 A CN202310831795 A CN 202310831795A CN 116855579 A CN116855579 A CN 116855579A
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了抗体和DNA寡核苷酸缀合物及其在ELISA‑PCR检测中的应用，所述抗体‑DNA缀合物包含具有能够结合目标蛋白的第一抗体和连接至第一抗体的第一DNA寡核苷酸的第一抗体‑DNA缀合物及具有能够结合目标蛋白的第二抗体和连接至第二抗体的第二DNA寡核苷酸的第二抗体‑DNA缀合物。

Description

抗体和DNA寡核苷酸缀合物及其在ELISA-PCR检测中的应用
技术领域
本发明通常涉及分子检测领域。更具体地，本发明涉及抗体和DNA寡核苷酸缀合物，以及它们在通过ELISA-PCR检测平台检测目标蛋白中的用途。
背景技术
本文提供的背景技术描述是为了总体呈现本发明的背景。在本发明背景技术部分中讨论的主题不应仅仅因为在本发明背景技术部分中提及而被认为是现有技术。类似地，在本发明背景技术部分中提及的或者与本发明背景技术部分的主题相关的问题不应被认为在现有技术中已预先认识到。本发明背景技术部分中的主题仅代表不同的方法，这些方法本身也可以是发明。目前确定的发明人的工作，就其在本发明背景技术部分中描述的范围，以及在提交时可能不符合现有技术的描述的方面，既不明确也不隐含地认为是针对本发明的现有技术。
传统的免疫测定和分子诊断是医学诊断领域中检测目标分子(例如目标蛋白、DNA或RNA)的两种主要检测方法。免疫测定是一种选择性生物分析方法，其通过使用抗体或抗原作为生物识别剂来检测目标蛋白(例如，受试者中的酶蛋白或病毒的衣壳蛋白)的存在或浓度。几十年来，免疫测定在医学诊断中发挥了重要作用。然而，自20世纪90年代以来，分子诊断，如PCR检测，由于其高灵敏度、高特异性且能够定量分析，已经逐渐取代了免疫测定的中心地位。尽管分子诊断兴起，但与分子诊断相比，免疫测定由于其在基于蛋白的检测中的独特优势，以及其操作简单和低成本，而仍然是不可替代的。
另一方面，分子诊断在传染病等领域正呈指数式的增长。自2020年以来，COVID 19在世界范围内产生了巨大的经济和社会影响。在此期间，分子诊断的缺点引起了前所未有的关注。由于假阴性和假阳性都会带来严重的临床和社会后果，我们一直需要更高且更好的灵敏度和特异性，但尚未得到满足。由于人工操作是造成结果产生误差的主要因素，因此还希望分子诊断的人工干预最小化。同样需要提高分子检测的速度，这是因为由于COVID19的连续性，即时检测结果对流行病控制有重要意义。因此，现有的主流诊断技术受到了前所未有的挑战。例如，作为主流分子诊断技术的PCR暴露出其低灵敏度、需要实验室设施/培训、结果等待时间长及一系列其他缺点。
目前，在分子诊断市场上，在保证检测的高特异性和灵敏度的特性基础上，快速诊断是非常需要的(从样品到结果的时间少于60分钟)。还应提高检测的灵活性，使得可进行单个样品或小批量样品的检测，而无需等待大批量的样品。此外，全自动分子诊断仪器在全球仍然数量有限，这限制了分子诊断的应用。还需要多重检测，这是因为各种传染病的及时诊断需要同时快速检测多种病原体。此外，还需要简化运输和储存，这是因为分子诊断中所用的试剂需要冷链运输，这也增加了检测的总成本。
因此，本领域中仍存在迄今为止尚未解决的需求，以解决上述缺陷和不足。
发明内容
鉴于上述情况，本发明公开了一种ELISA-PCR检测，其将酶联反应的高特异性和PCR的扩增作用结合在突破性的、高灵敏度的蛋白质定量分析中。
在本发明的一方面，用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，包括：
第一抗体-DNA缀合物，其具有第一抗体和第一DNA寡核苷酸，所述第一抗体能够结合目标蛋白；并且所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体连接；以及
第二抗体-DNA缀合物，其具有第二抗体和第二DNA寡核苷酸，所述第二抗体能够在不同的结合位点结合目标蛋白；并且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体共价连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一DNA寡核苷酸在其3’端与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸在其5’端与所述第二抗体共价连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二DNA寡核苷酸各自具有20至300个核苷酸碱基之间的长度。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二抗体各自结合所述目标蛋白的不同位点。
在本发明的一个实施方案中，当所述第一和第二抗体各自结合所述目标蛋白时，所述第一DNA寡核苷酸的3’端和所述第二DNA寡核苷酸的5’端通过互补短链DNA相互连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二抗体、所述第一和第二DNA寡核苷酸及所述目标蛋白在通过DNA连接酶连接后形成闭环结构。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白选自病原体的蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为SARS-Cov2病毒的核衣壳蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人肌钙蛋白I(cTnI)。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人肌钙蛋白T(cTnT)。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人Tau蛋白及其磷酸化形式TauT181。
在本发明的另一方面，一种利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，包括将第一抗体-DNA缀合物加入到含有所述目标蛋白的样品中；以及将第二抗体-DNA缀合物加入到含有所述目标蛋白的样品中。
在本发明的一个实施方案中，所述第一抗体-DNA缀合物具有能够结合所述目标蛋白的第一抗体和与所述第一抗体连接的第一DNA寡核苷酸；所述第二抗体-DNA缀合物具有能够结合所述目标蛋白的第二抗体和与所述第二抗体连接的第二DNA寡核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向所述样品中加入引物对的步骤，其中，一引物应该与第二DNA寡核苷酸3’端的序列互补并与其结合，而另一引物应该与第一DNA寡核苷酸的5’端相同，并与新合成的DNA分子的3’端结合。。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括开始PCR循环的步骤，以便扩增通过所述第一和第二DNA寡核苷酸与所述引物的连接形成的DNA链。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括定量分析所述PCR扩增的结果的步骤，以便确定所述样品中目标蛋白的量。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白选自病原体的标志蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白。
本发明的这些和其他方面将从以下结合以下附图对优选实施方案的描述中变得显而易见，尽管在不违背所公开的新概念的实质和范围的情况下，可以在其中进行变化和修改。
附图说明
附图示出了本发明的一个或多个实施方案，并与书面描述一起用于解释本发明的原理。尽可能地，在所有附图中使用相同的附图标记来指代实施方案中相同或相似的元件。
图1A示出了ELISA-PCR检测的A阶段。
图1B示出了ELISA-PCR检测的系统性图解的B阶段，其中抗体-DNA缀合物检测目标蛋白。
图2A示出了在ELISA-PCR检测中使用抗体-DNA寡核苷酸缀合物对13个COVID-19样品检测的CT值。
图2B示出了在ELISA-PCR检测中使用抗体-DNA寡核苷酸缀合物对13个COVID-19样品进行检测的病毒载量，检测范围低至10pg/ml到1000pg/ml。
图3A示出了传统ELISA检测和使用抗体-DNA缀合物的ELISA-PCR检测高SARS-Cov2病毒载量样品之间的检测灵敏度。
图3B示出了传统ELISA检测和使用抗体-DNA缀合物的ELISA-PCR检测低SARS-Cov2病毒载量样品之间的检测灵敏度。
图4A示出了传统ELISA检测和使用抗体-DNA缀合物的ELISA-PCR检测之间对检测目标NP蛋白的检测范围的对比图。
图4B示出了传统ELISA检测和使用抗体-DNA缀合物的ELISA-PCR检测之间对检测目标SARS-Cov2病毒的检测范围的对比图。
图5示出了使用抗体-DNA缀合物利用ELISA-PCR检测对肌钙蛋白I的检测。
图6示出了检测人心肌肌钙蛋白T(cTnT)达到了0.5pg/ml的LOD的ELISA-PCR检测结果。
图7示出了使用抗体-DNA缀合物利用ELISA-PCR检测检测Tau蛋白。
图8A示出了用于进行ELISA-PCR检测的集成设备的测试板的实施方案。
图8B示出了用于进行ELISA-PCR检测的集成设备的实施方案。
具体实施方式
现在将在下文中参考附图更全面地描述本发明，附图中示出了本发明的示例性实施方案。然而，本发明可以以许多不同的形式实施，且不应该解释为限于本文阐述的实施方案。相反，提供这些实施方案是为了使本发明全面并完整，且将本发明的范围完全传达给本领域技术人员。相同的附图标记在全文中指代相同的元件。
本说明书中所用的术语通常在本领域中、在本发明的上下文中以及在其中使用各术语的特定上下文中具有它们的普通含义。将在下文或说明书中的其他地方讨论用于描述本发明的某些术语，以向从业者提供关于本发明描述的额外指导。为方便起见，可能会突出显示某些术语，例如使用斜体和/或引号。使用突出显示对术语的范围和含义没有影响；在相同的上下文中，术语的范围和含义是相同的，无论它是否突出显示。应当理解，可用不止一种方式来表达同样的事物。因此，本文讨论的任何一个或多个术语可以使用替代语言和同义词，也不需要对是否在本文中阐述或讨论术语有任何特殊的意义。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的叙述不排除其他同义词的使用。在本说明书中的任何地方使用的示例，包括在本文讨论的任何术语的示例，仅仅是说明性的，并绝不限制本发明或任何示例术语的范围和含义。同样地，本发明不限于本说明书中给出的各种实施方案。
本领域的普通技术人员应理解，，除了那些具体举例说明之外的起始材料、生物材料、试剂、合成方法、纯化方法、分析方法、测定方法和生物方法可用于在本发明的实践中，而不需要诉诸于不适当的实验。任何此种材料和方法的所有本领域已知的功能等同物都旨在包括在本发明中。已经采用的术语和表达用作描述性术语，而非限制性术语，并且在使用此类术语和表达时，并不意图排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，而是应当认识到，在本发明要求保护的范围内，各种修改是可能的。因此，应理解，尽管本发明已经通过优选实施方案和可选特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以对本文公开的构思进行修改和变化，并且此类修改和变化被认为在由所附权利要求限定的本发明的范围内。
每当说明书中给出范围时，例如温度范围、时间范围、或组成或浓度范围，所有中间范围和子范围，以及所给范围中包括的所有单个值都旨在包括在本发明中。应当理解，可从本文的权利要求中排除包括在说明书中的任何子范围或范围或子范围中的单个值。
应当理解，除非上下文中另有明确规定，否则如本文的说明书和随后的权利要求中使用的，“一种”、“一个”、“一”和“该”的含义包括复数。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞及本领域技术人员已知的其等同物。同样，在本文中可互换使用术语“一种”(或“一个”或“一”)、“一个或多个”和“至少一个”。还应注意，术语“包括”、“包含”和“具有”可互换使用。
应当理解，当元件被称为在另一个元件“上”、“附接”在另一个元件上、“连接”到另一个元件、与另一个元件“耦合”、“接触”另一个元件等时，它可直接在另一个元件上、附着在另一个元件上、连接在另一个元件上、与另一个元件耦合或接触另一个元件，或者也可以存在中间元件。相反，当元件被称为例如“直接在另一个元件上”、“直接附接”在另一个元件上、“直接连接”到另一个元件、与另一个元件“直接耦合”或“直接接触”另一个元件时，不存在中间元件。本领域的技术人员还应当理解，提及的结构或特征设置成与另一个特征“相邻”可以具有与相邻特征重叠或位于相邻特征之下的部分。
应当理解，尽管可以在本文使用术语第一、第二、第三等来描述各种元件、部件、区域、层和/或部分，但是这些元件、部件、区域、层和/或部分不应该受到这些术语的限制。这些术语仅用于将一个元件、部件、区域、层或部分与另一个元件、部件、区域、层或部分区分开来。因此，在不脱离本发明的教导的情况下，下面讨论的第一元件、部件、区域、层或部分可以被称为第二元件、部件、区域、层或部分。
还应当理解，术语“包含”、或“包括”、或“具有”、或“携带”、或“含有”、或“涉及”、“特征在于”等是开放式的，即，意味着包括但不限于。当在本公开中使用时，它们明确指出所陈述的特征、区域、整数、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但是不排除一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、元件、部件和/或其组合的存在或添加。
除非另有定义，本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。进一步理解地，术语，诸如在常用字典中定义的那些术语，应被解释为具有与其在相关领域和本发明的上下文中的含义一致的含义，并且不会以理想化或过度正式的意义来解释，除非本文明确定义。
如本公开中所使用的，“约”、“大约”、“近似”或“基本上”通常应意指在给定值或范围的20％以内，优选在10％以内，更优选在5％以内。本文给出的数值是近似的，这意味着如果没有明确说明，可推断出术语“约”、“大约”、“近似”或“基本上”。
如本公开中所使用的，短语“A、B和C中的至少一个”应解释为使用了非排他性的逻辑或，表示逻辑(A或B或C)。如本文所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。
如本公开中所使用的，术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸以及氨基酸类似物和模拟物。天然存在的氨基酸包括在蛋白生物合成过程中利用的20种(L)-氨基酸以及其它氨基酸，诸如4-羟基脯氨酸、羟基赖氨酸、锁链素、异锁链素、高半胱氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸。非天然存在的氨基酸包括例如本领域技术人员已知的(D)-氨基酸、正亮氨酸、正缬氨酸、对氟苯丙氨酸和乙硫氨酸等。氨基酸类似物包括天然和非天然存在的氨基酸的修饰形式。此种修饰可包括，例如，氨基酸上的化学基团和部分的取代或置换，或者通过氨基酸的衍生化。氨基酸模拟物包括，例如，表现出诸如参照氨基酸的电荷和电荷间距特征的功能类似性质的有机结构。例如，模拟精氨酸(Arg或R)的有机结构将具有位于类似分子空间并具有与天然存在的Arg氨基酸的侧链的氨基基团相同的迁移率的正电荷部分。模拟物还包括受约束的结构，以便保持氨基酸或氨基酸官能团的最佳间距和电荷相互作用。本领域技术人员知道或能够确定什么结构构成功能等同的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
如本公开中所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及人工合成的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物。本文描述的多肽不限于特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义中，并且此类术语在本文中可以互换使用，除非另有特别说明。本文所述的多肽还可以包含表达后修饰，诸如糖基化、乙酰化和磷酸化等；以及本领域已知的其他修饰，包括天然存在的和非天然存在的。多肽可以是完整的蛋白质，或其亚序列、片段、变体或衍生物。
如本公开中所使用的，术语“寡核苷酸”指短的核苷酸序列。
如本公开中所使用的，核酸(例如，DNA)分子视为具有“5’端”和“3’端”，因为以使得单核苷酸戊糖环的5’磷酸经由磷酸二酯键与其邻位单核苷酸戊糖环的3’氧相连的方式使具有此类侧式的单核苷酸反应以产生寡核苷酸或多核苷酸。因此，寡核苷酸或多核苷酸的末端，如果其5’磷酸没有与单核苷酸戊糖环的3’氧相连，则称为“5’端”，而如果其3’氧随后没有与单核苷酸戊糖环的5’磷酸连接，则称为“3’端”。如本文所使用的，即使在较大的寡核苷酸或多核苷酸内部，核苷酸序列也有可能被称为具有5’和3’端。在线性或环状DNA分子中，离散元件被称为“上游”或“下游”的5’端或3’端元件。这个术语反映了沿DNA进行以5’端转录至3’端模式的事实。基因连接和增强子元件的转录的启动子被指示通常位于编码区的5’端或上游。但是，增强子元件甚至在位于启动子元件和编码区的3’端时也可发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3’端或下游。
如本公开中所使用的，术语“缀合物”是指由于抗体或其它分子的共价或非共价附接或连接而形成的实体，例如附接于抗体的DNA寡核苷酸。缀合物的一个示例是“抗体-DNA缀合物”，也就是说，共价连接到至少一个20-300个碱基的DNA寡核苷酸上的抗体。
如本公开中所使用的，术语“功能”和“功能性”等是指生物、酶的或治疗功能。
如本公开中所使用的，“同源”是指相同的或构成保守性置换的氨基酸的百分比数。可以使用序列比较程序如GAP(Deveraux等人，Nucleic Acids Research，12，387-395，1984)来确定同源，所述GAP以引用方式并入本文。以这种方式，可以通过在比对中插入空位来比较与本文引用的序列具有相似或基本上不同长度的序列，所述空位例如通过GAP使用的比较算法来确定。
如本公开中所使用的，“分离的”是指基本上或本质上不含通常在其天然状态下伴随其的成分的材料。例如，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”、“分离的DNA”等包括从其天然细胞环境中以及从与细胞的其它成分的结合中，体外分离和/或纯化肽、多肽、DNA分子；即，它不与体内物质明显相关。
在本文中，术语“连接”、“接头”、“接头部分”或“L”用于指可用于从DNA中分离抗体或抗体片段，或将第一试剂与另一试剂分离的接头，例如其中两种或多种试剂连接形成抗体-DNA缀合物。所述接头可以是生理稳定的，或者可包括可释放的接头，诸如可酶降解的接头(例如，可蛋白裂解的接头)。在某些方面，所述接头可以是肽接头，例如，作为抗体蛋白的一部分。在一些方面，所述接头可以是非肽接头或非蛋白质接头，例如DNA。在一些方面，所述接头可以是颗粒，如纳米颗粒。
如本公开中所使用的，术语“调节”和“改变”包括“增加”、“增强”或“刺激”，以及“减少”或“降低”，通常是相对于对照组而言在统计上显著的或生理上显著的量或程度。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计上显著的”量，且可包括由无组合物(例如，不含本发明的缀合物的多肽)或对照组合物、样品或测试受试者产生的量的1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多倍(例如，500、1000倍)(包括介于1和1以上的所有整数和小数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的增加。“减少的”或“降低的”量通常是“统计上显著的”量，且可包括由无组合物或对照组合物产生的量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的减少，包括其间的所有整数。
如本公开中所使用的，在某些实施方案中，可以具体定义组合物中任何给定试剂的“纯度”。例如，某些组合物可以包含至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的试剂，包括其间的所有小数，所述纯度例如但不限于通过高压液相色谱(HPLC)所测量的，HPLC是一种生物化学和分析化学中常用于分离、鉴定和定量化合物的柱色谱的众所周知的形式。
如本公开中所使用的，术语“样品”在本文中以其最广泛的含义使用，并且可包括生物样品和环形边界样品。患者样品A可包括从人类和其他动物获得的所有类型的样品，且包括但不限于体液，诸如尿液、血液(全血、血清和血浆)、粪便、脑脊液(CSF)、精液和唾液；以及固体组织。这些生物样品也可是来源于患者但在体外进一步开发的材料，诸如细胞培养物和组织培养物。生物样品可是动物，包括人类、液体或组织。
如本公开中使用的，术语“热循环仪”是指可编程的热循环仪仪器，诸如用于进行PCR设备的仪器。
如本公开中所使用的，术语“扩增试剂”可指这些试剂，诸如扩增核酸序列所需的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲溶液等。“生理上可裂解的”或“可水解的”或“可降解的”键是在生理条件下与水反应(即被水解)的键。键在水中水解的趋势不仅取决于连接两个中心原子的一般连接类型，还取决于附接在这些中心原子上的取代基。合适的水解不稳定连接或弱连接包括但不限于：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、硫酯、硫羟酸酯、碳酸酯和腙、肽和寡核苷酸。
如本公开中所使用的，术语“参考序列”通常指与另一序列进行比较的核酸编码序列或氨基酸序列。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列都作为参考序列包括在内，包括通过名称描述的序列和在表格和序列表中描述的序列。
如本公开中所使用的，术语“序列同一性”或，例如在本文中所使用的，包含“与...具有50％同一性的序列”，是指序列在比较窗内在逐个核苷酸基础上或逐个氨基酸基础上相同的程度。因此，可以通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列，确定相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、lie、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gin、Cys和Met)在两个序列中出现的位置数，以得到匹配的位置数，将匹配的位置数除以比较窗的总位置数(即窗口大小)，并将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比来计算“序列同一性百分比”。包括与本文所述的任何参考序列(例如，参见序列表)具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
如本公开中所用的，用于描述两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”的长度至少为12个，但时常为15至18个，且通常为至少25个单体单位，包括核苷酸和氨基酸残基。
如本公开中所使用的，“统计上显著的”是指结果不可能是偶然发生的。可通过本领域已知的任何方法来确定统计显著性。常用的显著性度量包括p值，如果零假设为真，则p值是观察到的事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为其p值为0.05或更小。
如本公开中所使用的，术语“互补”用于提及与许多核苷酸(即，核苷酸序列)相关的碱基配对原则。例如，对于序列“A-G-T”，其与序列“T-C-A”互补。互补性可是“部分点”，其在扩增核酸中的一些碱基根据碱基配对原则进行配对。或者说，核酸之间可存在“完全的(完整的)”或“(全部)恰好彻底的”互补。
如本公开中所使用的，“受试者”，如在本文中所使用的，包括表现出症状或有表现出症状的风险的任何动物，该症状可用本发明的抗体-DNA寡核苷酸缀合物来诊断。合适的受试者(患者)包括实验室动物(诸如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家畜或宠物(诸如猫或狗)。非人灵长类动物，优选人类患者也包括在内。
如本公开中所使用的，“基本上”或“本质上”是指几乎全部或完全地，例如，一些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更多。
如本公开中所使用的，“基本上不含”是指几乎完全或完全不含给定量，例如，小于约10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或更少的一些给定量。例如，某些组合物可以“基本上不含”细胞蛋白、膜、核酸、内毒素或其他污染物。
如本公开中所使用的，术语“野生型”是指当从天然存在的来源分离时具有该基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最常观察到的，并因此被任意地设计为基因的“正常”或“野生型”形式。
如本公开中所使用的，术语“实时”和“实时连续”是可互换的，且指一种其中在聚合反应过程中通过定期监测的过程中进行数据收集的方法。因此，该方法将扩增和检测合并到单个步骤中。
如本公开中所使用的，术语“定量PCR”或“qPCR”是指使用聚合酶链式反应(PCR)来定量基因表达。
如本公开中所使用的，术语“Ct”和“循环阈值”是指荧光强度大于背景荧光的时间。其特征在于首次检测到靶扩增的时间点(或PCR循环)。因此，起始材料中靶DNA的数量越大，荧光信号的显著增加就越快，从而导致Ct越低。
下文参考附图详细说明本发明的实施方案。一下描述本质上仅仅是说明性的，而决不旨在限制本发明、其应用或用途。本发明的广泛教导能够以多种形式实现。因此，尽管本发明包括特定的实施例，但是本发明的真正范围不应被如此限制，这是因为在研究附图、说明书和下面的权利要求后，其他修改将变得显而易见。为了清楚起见，在附图中使用相同的附图标记来标识相似的元件。应当理解，在不改变本发明原理的情况下，可以以不同的顺序(或同时)执行方法中的一个或多个步骤。
本发明引入了一种ELISA-PCR检测，其将酶联免疫测定反应的高特异性和PCR的扩增作用结合在突破性的、高灵敏度的蛋白质定量分析中。
在本发明的一个方面，用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，包括：
第一抗体-DNA缀合物，其具有第一抗体和第一DNA寡核苷酸，所述第一抗体能够结合所述目标蛋白；并且所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体连接；以及
第二抗体-DNA缀合物，其具有第二抗体和第二DNA寡核苷酸，所述第二抗体能够结合所述目标蛋白；并且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一DNA寡核苷酸在其3’端与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸在其5’端与所述第二抗体共价连接。
在本发明的一个实施方案中，所述第一和第二抗体各自结合所述目标蛋白，所述第一DNA寡核苷酸的5’端和所述第二DNA寡核苷酸的3’端相互连接。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括向所述样品中加入引物对的步骤，其中，一引物与所述第一DNA寡核苷酸的5’端互补结合，且另一引物与所述第二DNA寡核苷酸的3’端结合。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括开始PCR循环的步骤，以便用所述引物扩增所述第一和第二DNA寡核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括定量分析所述PCR扩增的结果的步骤，以便确定所述样品中目标蛋白的量。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白选自病原体的标志蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为SARS-Cov2病毒的刺突蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人肌钙蛋白I(cTnI)。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人肌钙蛋白T(cTnT)。
在本发明的一个实施方案中，所述目标蛋白为人Tau和在Thr18位点磷酸化的人Tau(Tau磷酸-Thr181或Tau Thr181)。
下面进一步描述本发明的这些和其他方面。下面给出了根据本发明实施方案的示例性仪器、装置、方法及其相关结果，而非意在限制本发明的范围。应注意，为了方便读者，可以在实施例中使用标题或副标题，这决不应该限制本发明的范围。此外，本文提出并公开了某些理论；然而，在不考虑任何特定的理论或行动方案的情况下，无论它们是对还是错，只要根据本发明实施本发明，都决不应该限制本发明的范围。
抗体-DNA缀合物
本发明提供了一种以位点特异性的方式用20-300个碱基的DNA分子共价标记抗体的方法，其用于下游应用，诸如免疫PCR、邻位连接PCR或使用抗体-DNA缀合物作为探针的任何免疫测定。
在本发明的一个实施方案中，这些抗体-DNA缀合物中每个抗体具有1至10个DNA分子。在本发明的另一个实施方案中，多于1个DNA分子可附接到抗体上。DNA分子共价附接到抗体的重链上。这种标记方法不干扰抗体的表位结合位点，从而保证了抗体结合的亲和力和特异性。这种标记方法产生了用于ELISA-PCR检测中的共价标记抗体。与传统的ELISA检测相比，使用抗体-DNA缀合物的ELISA-PCR检测将目标蛋白的检测灵敏度提高了10倍或更多。
在本发明的一个实施方案中，根据以下步骤产生用于ELISA-PCR检测的抗体-DNA缀合物：
(1)用一种或多种化学物质修饰DNA寡核苷酸，以形成具有活性官能团的DNA寡核苷酸。在本发明的一个实施方案中，在该反应过程中，DNA寡核苷酸分子在3’或5’端附接有-NH2官能团。然后，将DNA-NH2与DBCO、TCO、四嗪、叠氮化物、炔烃或类似化学物质以1:10的比例在约25℃的室温(RT)下孵育1-24小时。
(2)通过在DNA分子的重链上添加1至10个叠氮基团，利用点击化学来修饰抗体。该过程包括通过酶促步骤修饰抗体重链。例如，每次与100-10,000微克UDG-GalNaz反应使用1-10微克Gal-T转移酶以在约30℃下与100-1000微克抗体孵育过夜(18小时以上)。
(3)用步骤(2)的活化抗体孵育步骤(1)的DNA寡核苷酸以形成最终产物：具有1至10个DNA寡核苷酸的位点特异的，共价标记抗体。在一个实施方案中，具有-NH2官能团的DNA寡核苷酸的3’或5’端附接到活化的抗体的碳水化合物基团上。
在本发明的一个实施例中，所述抗体可以是Tau抗体，例如sc-21796(克隆Tau-13)，其特异性结合蛋白Tau，并用作阿尔茨海默疾病的标志物。在本发明的一个实施例中，一个或多个DNA寡核苷酸共价连接到抗体Tau抗体sc-21796(克隆Tau-13)。
应该注意的是，所述抗体Tau抗体sc-21796仅用作示例。其他抗体，无论是市售的还是实验室产生的，都可经由官能团标记，然后与DNA寡核苷酸共价连接，以用于ELISA-PCR检测，从而检测不同的目标蛋白。在某些实施方案中，所述抗体选自一种或多种市场上的Tau抗体，诸如Tau Thr181特异性抗体(PA5114656，赛默飞世尔)和Tau单克隆抗体BT2(目录号MN1010，赛默飞世尔)等。
在其他实施方案中，结合病毒、细菌、疾病标志物的抗体可用于ELISA-PCR检测。
在一个实施方案中，第一DNA寡核苷酸可以包含SEQ ID No:1，而第二DNA寡核苷酸可以包含SEQ ID No:2。在其他实施方案中，可使用具有其他氨基酸序列的DNA寡核苷酸。
ELISA-PCR检测的过程
如图1A和图1B所示，ELISA-PCR检测具有阶段(A)和阶段(B)。
在本发明的一个实施方案中，在阶段(A)期间，用于检测目标蛋白的ELISA-PCR检测需要两种不同的抗体-DNA缀合物。第一抗体-DNA缀合物结合目标蛋白的特定区域，且第一DNA寡核苷酸的3’端共价连接到第一抗体，而第二抗体-DNA缀合物结合目标蛋白的不同区域，且第二DNA寡核苷酸的5’端共价连接到第二抗体。
应当注意，第一和第二抗体可以结合目标蛋白的两个独立的结合位点。不管结合位点如何，第一和第二DNA寡核苷酸的长度应足以使第一DNA寡核苷酸的5’端和第二DNA寡核苷酸的3’端相互附接。
在ELISA-PCR检测的阶段(B)期间，第一DNA寡核苷酸的5’端和第二DNA寡核苷酸的3’端连接成一个寡核苷酸。一旦第一和第二抗体与目标蛋白结合，第一DNA寡核苷酸的5’端和第二DNA寡核苷酸的3’端将足够接近以进行连接。在两个DNA寡核苷酸连接后，目标蛋白、第一和第二抗体、第一和第二DNA寡核苷酸形成闭环结构。在阶段(B)中，溶液含有对两个DNA寡核苷酸特异的引物对。一引物与第一DNA寡核苷酸的3’端的序列互补且结合。合成后且在第一个循环结束时，每个双链DNA分子由一条新的和一条旧的DNA链组成。另一引物与第二DNA寡核苷酸的5’端的前5-40个碱基相同并将在第一个循环后与新合成的DNA的3’端结合。然后，PCR继续进行重复上述步骤的额外循环。新合成的DNA片段在以后的循环中充当模板，这使得DNA靶标以指数方式扩增数百万倍。
作为一个示例，所述引物包含SEQ ID No:3和/或4的核苷酸序列。
然后，进行常规的实时PCR检测。如果第一和第二抗体都与目标蛋白结合，并且第一DNA寡核苷酸的5’端和第二DNA寡核苷酸的3’端连接，则PCR检测将从引物开始产生扩增DNA序列。
因为所有的DNA聚合酶都具有5’→3’聚合酶活性，即掺入核苷酸以在其3’端以5’至3’方向延伸引物，所以3’端附接到第二抗体的第二DNA寡核苷酸应最先扩增，且扩增量最大。第一次合成的DNA分子的量与目标蛋白的存在相关。存在的目标蛋白越多，PCR反应将越快达到可检测的阈值，即实时PCR的Ct或Cq值。
在本发明的一个实施方案中，两引物都有5-40个碱基。本领域普通技术人员可根据第一和第二DNA寡核苷酸序列设计具有不同序列的引物对。一引物应该与第二DNA寡核苷酸3’端的序列互补并与其结合，而第另一引物应该与第一DNA寡核苷酸的5’端相同，并与新合成的DNA分子的3’端结合。
用引物扩增环结构反映了目标蛋白的存在。
ELISA-PCR的优点
与传统的ELISA检测相比，本发明的ELISA-PCR检测具有许多优点。
首先，ELISA-PCR检测比传统的ELISA检测具有更高的灵敏度。在本发明的一个实施方案中，与传统的酶联反应相比，所述ELISA-PCR检测能够以10-100倍的灵敏度检测目标蛋白。
与传统的ELISA检测相比，所述ELISA-PCR检测还具有更高的特异性，这是因为有两种抗体同时与目标蛋白结合形成闭合的DNA环，从而使得随后的核酸扩增成为可能。
鉴于上述情况，在一个实施方案中，目标蛋白的检测上限和下限跨越超过5个对数。此外，所述ELISA-PCR检测显著减少了处理所需的样品量。在一个实施方案中，需要少于1μL的样品。在一个实施方案中，需要少于5μL的样品。在另一个实施方案中，需要5-10μL的样品。在又一个实施方案中，需要10-20μL的样品。
此外，通过使用不同的DNA寡核苷酸和引物，可检测多于一种目标蛋白。在一个实施方案中，具有第一DNA寡核苷酸的第一抗体和具有第二寡核苷酸的第二抗体结合第一目标蛋白，使得PCR扩增将从第一引物对开始。同时，具有第三DNA寡核苷酸的第三抗体和具有第四寡核苷酸的第四抗体结合第二目标蛋白，使得PCR扩增将从第二引物对开始。通过分析PCR扩增过程中产生的产物，技术人员将确定样品中第一和第二目标蛋白的量。
在一个实施方案中，所述ELISA-PCR检测可用于定量测定至少两种目标蛋白。在一个实施方案中，所述ELISA-PCR检测可用于定量测定至少五种目标蛋白。在一个实施方案中，ELISA-PCR检测可用于定量测定至少十种目标蛋白。
此外，所述E LISA-PCR检测的步骤简单，使得从个体采集的样品不需要预处理、洗脱和/或稀释。在本发明的一个实施方案中，所述ELISA-PCR检测的操作可以是全自动的，其与自动数据分析相结合。在本发明的一个实施方案中，所述ELISA-PCR检测的自动操作可通过如图8A和图8B所示的微型仪器进行。
ELISA-PCR应用-传染病COVID 19
如图2A和2B所示，本发明的ELISA-PCR检测提供了对11名COVID-19阳性患者和2名COVID-19阴性对照中SARS-Cov2病毒量的精确定量分析。典型的测试方案如下所示。
这些测试中使用的抗体和寡核苷酸序列已在上文公开。
所述示例性抗体包括：
Tau单克隆抗体MAB3494(克隆号376720)
Tau Thr181特异性抗体MN1050(克隆号AT270)
Tau单克隆抗体MAB106291(克隆号1032501)
所述示例性DNA寡核苷酸分别具有SEQ ID No:1和2。
如图2A和图2B所示，所述ELISA-PCR检测对13个COVID-19样品，特别是对低病毒载量的样品，显示了出色的定量检测结果。在本发明的一个实施方案中，检测范围低至10pg/ml到1000pg/ml。
此外，如图3A和图3B所示，本发明明显减少了传统ELISA和其他免疫测定试验中常见的假阳性和假阴性结果。
具体而言，如图3A和图3B所示，对40份个体样品进行了SARS-Cov2病毒的检测。比较了所述ELISA-PCR检测和传统ELISA检测对SARS-Cov2病毒的检出量。
如图3A所示，对于具有C25高病毒载量的样品，所述ELISA-PCR检测和传统ELISA检测的结果是一致的，如圈出的椭圆形所示，其可在较高的检测限内进行定量分析。具体而言，当SARS-Cov2病毒的量在500-1500pg/ml时，所述ELISA-PCR检测和传统ELISA检测之间的结果是一致的。然而，在C30低病毒载量的样品中，所述ELISA-PCR检测可检测到传统ELISA不能正确检测到并被鉴定为阴性结果(假阴性)的样品的病毒量。
具体而言，如图3B所示，当SARS-Cov2病毒量低于30pg/ml时，传统的ELISA检测可能无法检测到样品中SARS-Cov2病毒的存在，并将样品报告为SARS-Cov2阴性。然而，所述ELISA-PCR检测准确地检测出低于30pg/ml、低于20pg/ml、低于10pg/ml或低于5pg/ml的SARS-Cov2病毒量。
因此，与传统的ELISA检测相比，本发明的ELISA-PCR检测明显提高了检测SARS-Cov2病毒的灵敏度和准确性，并降低了可检测的病毒的最小量。
如图4A、图4B和下表1所示，与传统的ELISA检测相比，本发明的ELISA-PCR检测明显拓宽了检测目标蛋白的动态范围。
表1 NP蛋白和COVID病毒的动态范围(对数)
ELISA_NP(130-28000) 2.33 ELISA-PCR_NP(1-250,000) 5.40
ELISA_COVID(200-42000) 2.32 ELISA-PCR_COVID(1-167,000) 5.22
如图4A和图4B所示，所述ELISA-PCR检测明显拓宽了检测目标蛋白NP和SARS-Cov2的灵敏度和准确度。具体来说，对于NP蛋白和SARS-Cov2病毒，当目标蛋白的浓度在1pg/ml和10,000pg/ml之间时，通过ELISA-PCR检测的检测限(LOD)比传统ELISA检测的检测限低得多(低超过10倍)。
在本发明的一个实施方案中，可检测的病原体包括COVID、MEMS、甲型和乙型流感、HIV和HPV等。
ELISA-PCR应用-心血管疾病
本发明在检测其他通常用于医学诊断中的目标蛋白方面也是有效的。在本发明的一个实施方案中，可通过本发明的ELISA-PCR检测来测量人肌钙蛋白I和肌钙蛋白T，从而诊断与心脏相关的医学状况。人肌钙蛋白I和肌钙蛋白T是一种非常特异的心肌酶，临床上将其用于诊断急性心肌梗死、心力衰竭等。使用传统的免疫测定法，在心肌坏死后3-4小时内检测肌钙蛋白I和肌钙蛋白T是可行的。然而，采用更敏感和更快速的ELISA-PCR检测，可更早地进行正确的诊断和治疗。
如图5所示，用于检测人心肌肌钙蛋白I(cTnI)的ELISA-PCR检测达到了2.4pg/ml的LOD。
如图6所示，用于检测人心肌肌钙蛋白T(cTnT)的ELISA-PCR检测达到了0.5pg/ml的LOD。
ELISA-PCR应用-退行性疾病
在本发明的一个实施方案中，所述ELISA-PCR检测用于检测某些神经退行性疾病中的目标蛋白。Tau蛋白在某些神经退行性疾病诸如阿尔茨海默疾病(AD)中起关键作用。大量证据表明，大脑中的第一次变化至少在AD患者开始出现并表现出AD症状的15年前就发生。如果能够提高检测灵敏度，就可显著更早做出正确诊断，并对症治疗和预防。
如图7所示，使用ELISA-PCR检测，总Tau的LOD为1pg/ml，且Tau Thr181的LOD为2pg/ml。可看出的是，LOD明显低于现有的检测方法，现有的检测方法仅可检测浓度为约10至1000pg/ml的Tau和Tau Thr181。
在本发明的一个实施方案中，目标蛋白可以是病原体的标志蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白、癌症的标志蛋白等。标志蛋白是通常或典型用于相关疾病诊断的蛋白，诸如用于诊断冠状病毒感染的刺突蛋白；用于诊断急性心肌梗塞和其他心力衰竭的人肌钙蛋白I和人肌钙蛋白；用于诊断某些神经退行性疾病的Tau蛋白。可用ELISA-PCT检测法检测的目标蛋白和抗体列于下表2中。
表2用于ELISA-PCR检测的目标蛋白和抗体
本发明的示例性实施方案的前述描述仅仅是为了说明和描述的目的而呈现的，并非旨在穷举或将本发明限制于所公开的精确形式。根据上述教导，许多修改和变化是可能的。
选择和描述实施方案是为了解释本发明的原理及其实际应用，以便使本领域的其他技术人员能够利用本发明和各种实施方案，并且在考虑到特定用途的情况下适合进行各种修改。对于本发明所属领域的技术人员来说，在不脱离其实质和范围的情况下，替换实施方案将变得显而易见。因此，本发明的范围由所附权利要求书进行限定，而不是由前述说明书和其中描述的示例性实施方案限定。
在本发明的说明书中引用和讨论了一些参考文献，其可以包括专利、专利申请和各种出版物。引用和/或讨论此类参考文献仅仅是为了阐明本发明的说明书，而不是承认任何此类参考文献是本文所述的本发明的“现有技术”。本说明书中引用和讨论的所有参考文献都以引用方式整体并入本文，其程度如同每个参考文献都以引用方式单独并入。

Claims (20)

1.一种用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其包括：
第一抗体-DNA缀合物，其具有第一抗体和第一DNA寡核苷酸，所述第一抗体配置成结合所述目标蛋白；且所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体连接；以及
第二抗体-DNA缀合物，其具有第二抗体和第二DNA寡核苷酸，所述第二抗体配置成结合所述目标蛋白；并且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体连接。
2.根据权利要求1所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体共价连接。
3.根据权利要求2所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述第一DNA寡核苷酸在其3’端与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸在其5’端与所述第二抗体共价连接。
4.根据权利要求1所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述第一DNA寡核苷酸和第二DNA寡核苷酸各自具有20至300个核苷酸碱基之间的长度。
5.根据权利要求1所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述第一抗体和第二抗体各自结合所述目标蛋白的不同位点。
6.根据权利要求3所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，当所述第一抗体和第二抗体各自结合所述目标蛋白时，所述第一DNA寡核苷酸的5’端和所述第二DNA寡核苷酸的3’端相互连接。
7.根据权利要求6所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述第一抗体和第二抗体、所述第一DNA寡核苷酸和第二DNA寡核苷酸以及所述目标蛋白形成闭环结构。
8.根据权利要求1所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述目标蛋白选自病原体的标志蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白。
9.根据权利要求8所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述目标蛋白为SARS-Cov2病毒的刺突蛋白。
10.根据权利要求9所述的用于检测目标蛋白的抗体-DNA缀合物组，其中，所述目标蛋白为肌钙蛋白I、AZ生物标志物和癌症生物标志物。
11.一种利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其包括：
将第一抗体-DNA缀合物加入到含有目标蛋白的样品中；以及，
将第二抗体-DNA缀合物加入到含有所述目标蛋白的所述样品中。
12.根据权利要求11所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，
所述第一抗体-DNA缀合物具有第一抗体和第一DNA寡核苷酸，所述第一抗体配置成结合所述目标蛋白，且所述第一DNA寡核苷酸与所述第一抗体连接；
所述第二抗体-DNA缀合物具有第二抗体和第二DNA寡核苷酸，所述第二抗体配置成结合所述目标蛋白；且所述第二DNA寡核苷酸与所述第二抗体连接。
13.根据权利要求11所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述第一DNA寡核苷酸在其3’端与所述第一抗体共价连接，且所述第二DNA寡核苷酸在其5’端与所述第二抗体共价连接。
14.根据权利要求13所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述第一抗体和第二抗体各自结合所述目标蛋白，所述第一DNA寡核苷酸的5’端和所述第二DNA寡核苷酸的3’端相互连接。
15.根据权利要求14所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述方法还包括
向所述样品中加入引物对，其中，一引物应该与第二DNA寡核苷酸3’端的序列互补并与其结合，而另一引物应该与第一DNA寡核苷酸的5’端相同，并与新合成的DNA分子的3’端结合。
16.根据权利要求15所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述方法还包括
开始PCR循环的步骤，以便利用所述引物扩增所述第一和第二DNA寡核苷酸。
17.根据权利要求15所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述方法还包括
定量分析所述PCR扩增的结果，以便确定所述样品中所述目标蛋白的量。
18.根据权利要求11所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述目标蛋白选自病原体的标志蛋白、感染性疾病的标志蛋白；遗传性疾病的标志蛋白、获得性疾病的标志蛋白。
19.根据权利要求18所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述目标蛋白为SARS-Cov2病毒的刺突蛋白。
20.根据权利要求19所述的利用抗体-DNA缀合物定量检测目标蛋白的方法，其中，所述目标蛋白为肌钙蛋白I。
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