CN116855451A - 一种pbmc分离置换方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种PBMC分离置换方法，涉及细胞分离技术领域。包括分离阶段与置换阶段，所述分离阶段和所述置换阶段均采用一进两出的离心杯，所述离心杯设有内口、外口和中心口；所述分离阶段包括以下步骤：将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆；进行离心分离，同时从所述外口持续泵入梯度液；离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞；收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液；将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内，开始所述置换阶段，置换结束后，排出洗涤废液，即得PBMC产品液。

Description

一种PBMC分离置换方法
技术领域
本申请涉及细胞分离技术领域，特别涉及一种PBMC分离置换方法。
背景技术
PBMC是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。PBMC主要的分离方法是Ficoll-hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心法，利用外周血单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同，红细胞和多核白细胞的比重在1.092左右，单个核细胞的比重为1.075-1.090，血小板为1.030-1.035，通过一种介于1.075-1.092之间而近于等渗的溶液(ficoll梯度液)作密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，可将各种血细胞与单个核细胞分离。操作者一般基于密度梯度分布原理，使用人工或者自动化设备，把血液(外周血、脐带血或者单采血)添加到分离液中进行离心分离。
目前对于自动化细胞分离设备制备PBMC，主要基于活塞式离心杯或是1进1出的离心杯实现，但在进行PBMC分离时往往存在一定的问题。基于活塞式离心杯进行PBMC分离时，无法处理大体积的样本量，且通过活推挤排出血浆，再收集PBMC，在向上推挤的过程中，分层状态在轴向、径向都有变化，会影响分装状态，回收收率降低；而基于1进1出的离心杯进行PBMC分离时，排完红细胞跟血浆后，将待收集的PBMC留在杯内，存在红细胞残留问题，并且残留的红细胞因密度大即使通过后续的洗涤置换也不能清除，回收效率低下。因此，本申请提出一种PBMC分离置换方法以解决上述技术问题。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种PBMC分离置换方法，旨在解决现有的PBMC分离方法对PBMC的收集效果不佳的技术问题。
为实现上述目的，本申请提出了一种PBMC分离置换方法，包括分离阶段与置换阶段，所述分离阶段和所述置换阶段均采用一进两出的离心杯，所述离心杯设有内口、外口和中心口；
所述分离阶段包括以下步骤：
S11、将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆；
S12、进行离心分离，同时从所述外口持续泵入梯度液；
S13、离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞；
S14、收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液；
S15、将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内，开始所述置换阶段，置换结束后，排出洗涤废液，即得PBMC产品液。
在其中一个实施例中，所述将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆的步骤，包括：
将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯旋转并在所述离心杯内形成梯度液柱面层；
形成梯度液柱面层后，再将样品袋内的血液样本从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯持续旋转，使血浆向所述离心杯中心层移动，所述离心杯填满后，从所述中心口排出内层血浆。
在其中一个实施例中，所述离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞的步骤，包括：
先从所述内口排出红细胞至废液袋，并通过管路探测器探测从所述离心杯排出液体的状态，当内口层以内的红细胞排完，开始排梯度液时，结束从所述内口排废液；
再从所述外口排出部分红细胞至废液袋。
在其中一个实施例中，所述步骤S13之后、所述步骤S14之前，还包括：
通过梯度液将所述样品袋、所述废液袋与所述产品袋之间的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋；
再通过梯度液将与所述离心杯连接的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋。
在其中一个实施例中，所述收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液的步骤，包括：
通过管路探测器探测或分层界面传感器识别梯度液与PBMC的分层界面位置来判断分层状态，再根据所述分层状态决定将梯度液排出至所述废液袋中的量，再将所述离心杯内剩余梯度液与产品液一同从所述内口排出至产品袋，得到待置换液；
所述待置换液收集完成后，将所述离心杯内所有液体从所述外口排出至废液袋。
在其中一个实施例中，所述步骤S14之后、所述步骤S15之前，还包括：
S141、将洗涤液加入所述离心杯内，对所述离心杯进行清洗，再将清洗后所述离心杯内的液体排出至废液袋；重复进行步骤S141。
在其中一个实施例中，所述将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内的步骤，包括：
步骤S151、将所述待置换液从所述内口泵入经过所述步骤S141处理后的离心杯内，将洗涤液加入所述产品袋内，对所述产品袋进行清洗并将清洗所述产品袋后的液体排至所述离心杯内；重复进行所述步骤S151。
在其中一个实施例中，所述置换阶段包括以下步骤：
S21、将第一洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第一洗涤液排出，对所述待置换液进行连续洗涤置换；
S22、连续洗涤置换后，对所述离心杯进行混匀，再通过离心分离，得到集中在所述离心杯外层的细胞液和集中在所述离心杯内层的洗涤废液；
S23、离心分离后，将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液，即得PBMC产品液。
在其中一个实施例中，所述将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液的步骤后，还包括：
将第二洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第二洗涤液排出，进行连续洗涤置换；
重复进行步骤S22-步骤S23。
在其中一个实施例中，所述步骤S23之后，还包括：
将所述离心杯杯壁残留的细胞摇下并与所述PBMC产品液混合。
本申请通过一进两出的离心杯来实现PBMC的分离和置换，如图4所示，分离阶段首先将梯度液从外口泵入离心杯内，再从外口泵入血液样本，离心杯持续旋转，使红细胞聚集在离心杯最外层，而PBMC、血浆向离心杯内层移动，离心杯填满后，最内层的血浆从中心口排出；再进行离心分离，为使红细胞层中的PBMC充分分离，在离心分离的同时从外口持续低速泵入梯度液，可将红细胞层中的PBMC带出，提高对PBMC的回收率；离心分离后，先从内口排出红细胞废液，内口层以内的红细胞排完，排到梯度液时，再转到外口排出红细胞，可使红细胞层远离内口位置，后续从内口收集PBMC产品液时可避免红细胞的混入；再开始对产品液和梯度液的收集，对于某些血液样本，分离状态较好，梯度液层中混入PBMC少，可多排出梯度液至废液袋，再将剩余梯度液与PBMC收集至产品袋，此时收集较少的梯度液可降低后续洗涤置换的次数，而对于有些血液样本，分离后PBMC与梯度液无明显的分层界面，即PBMC是混在梯度液层中的，此时只需少量排出梯度液至废液袋中，将大部分梯度液与PBMC一同收集至产品袋，从而达到尽可能多地收集PBMC产品液的目的，分层状态如图12所示(左为分层状态好时，PBMC在梯度液和血浆之间，右为分层状态不好时，PBMC混在梯度液中间)，收集产品后，再从外口将离心杯内所有废液排出；再将待置换液从内口泵入离心杯内进行洗涤置换，尽可能多地排出废液，提高稀释比例，提高细胞的纯度。本申请可用于大体积PBMC的分离处理，连续进出液，可处理超过一个离心杯容积的样本量，在同一个杯子实现对PBMC的分离和洗涤置换，处理效率较高，且对PBMC的分层位置进行定位，实现对PBMC的定位收集，提高了对PBMC的回收率，PBMC的纯度较高，且极大程度上减少了红细胞的残留，避免了红细胞对收集PBMC的影响。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的离心杯的中心口的示意图；
图2为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的离心杯的内口的示意图；
图3为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的离心杯的外口的示意图；
图4为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段的流程示意图；
图5为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的置换阶段的流程示意图；
图6为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段加梯度液的液路流程示意图；
图7为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段加血液样本的液路流程示意图；
图8为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段外口排废液的液路流程示意图；
图9为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段内口排废液的液路流程示意图；
图10为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段内口排产品液的液路流程示意图；
图11为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的连续流洗涤置换液路流程示意图；
图12为本申请实施例所述的PBMC分离置换方法的分离阶段的分层状态示意图。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
现有的PBMC分离置换方法基于活塞式离心杯或是1进1出的离心杯实现，基于活塞式离心杯进行PBMC分离时，无法处理大体积的样本量，且通过活推挤排出血浆，再收集PBMC，在向上推挤的过程中，分层状态在轴向、径向都有变化，会影响分装状态，回收收率降低；而基于1进1出的离心杯进行PBMC分离时，排完红细胞跟血浆后，将待收集的PBMC留在杯内，存在红细胞残留问题，并且残留的红细胞因密度大即使通过后续的洗涤置换也不能清除，回收效率低下。
针对上述现有的PBMC分离置换所存在的技术问题，本申请的实施例提供了一种PBMC分离置换方法，包括分离阶段与置换阶段，所述分离阶段和所述置换阶段均采用一进两出的离心杯，所述离心杯设有内口、外口和中心口；
所述分离阶段包括以下步骤：
S11、将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆；
S12、进行离心分离，同时从所述外口持续泵入梯度液；
S13、离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞；
S14、收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液；
S15、将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内，开始所述置换阶段，置换结束后，排出洗涤废液，即得PBMC产品液。
本申请通过一进两出的离心杯来实现PBMC的分离和置换，如图4所示，分离阶段首先将梯度液从外口泵入离心杯内，再从外口泵入血液样本，离心杯持续旋转，使红细胞聚集在离心杯最外层，而PBMC、血浆向离心杯内层移动，离心杯填满后，最内层的血浆从中心口排出；再进行离心分离，为使红细胞层中的PBMC充分分离，在离心分离的同时从外口持续低速泵入梯度液，可将红细胞层中的PBMC带出，提高对PBMC的回收率；离心分离后，先从内口排出红细胞废液，内口层以内的红细胞排完，再转到外口排出红细胞，可使红细胞层远离内口位置，后续从内口收集PBMC产品液时可避免红细胞的混入；再开始对产品液和梯度液的收集，对于某些血液样本，分离状态较好，梯度液层中混入PBMC少，可将少量的梯度液与PBMC收集至产品袋，此时收集较少的梯度液可降低后续洗涤置换的次数，而对于有些血液样本，分离后PBMC与梯度液无明显的分层界面，即PBMC是混在梯度液层中的，需要将大部分梯度液与PBMC一同收集至产品袋，从而达到尽可能多地收集PBMC产品液的目的，分层状态如图12所示，收集产品后，再从外口将离心杯内所有废液排出；再将待置换液从内口泵入离心杯内进行洗涤置换，尽可能多地排出废液，提高稀释比例，提高细胞的纯度。本申请可用于大体积PBMC的分离处理，连续进出液，可处理超过一个离心杯容积的样本量，在同一个杯子实现对PBMC的分离和洗涤置换，处理效率较高，且极大程度上减少了红细胞的残留，避免了红细胞对收集PBMC的影响，提高了对PBMC的回收率，PBMC的纯度较高。
在具体实施方式中，如图1-图3所示，离心杯的中心口与离心杯的中心层连通，中心层为离心杯内最中间的位置，离心杯的外口与离心杯的外层连通，外层为离心杯内靠近杯壁位置，离心杯的内口与离心杯的内层连通，内层为离心杯内中心层与外层之间的位置。
作为本申请的一种可实施方式，所述将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆的步骤，包括：
将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯旋转并在所述离心杯内形成梯度液柱面层；
形成梯度液柱面层后，再将样品袋内的血液样本从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯持续旋转，使血浆向所述离心杯中心层移动，所述离心杯填满后，从所述中心口排出内层血浆。
本申请将梯度液从外口泵入离心杯内，液路流程如图6所示，离心杯旋转并形成梯度液柱面层后，再泵入血液样本，液路流程如图7所示，在离心杯的旋转作用下，血液样本中的红细胞集中在离心杯杯壁处，PBMC和血浆往离心杯中心层移动，在离心杯填满后，可通过中心口将最内层的血浆排出，对于大体积样本量，先除去最内层血浆，便于后续对PBMC的分离。
作为本申请的一种可实施方式，所述离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞的步骤，包括：
先从所述内口排出红细胞至废液袋，并通过管路探测器探测从所述离心杯排出液体的状态，当内口层以内的红细胞排完，开始排梯度液时，结束从所述内口排废液；
再从所述外口排出部分红细胞至废液袋。
为避免红细胞对收集PBMC的影响，本申请在离心分离后，先从内口排出红细胞废液，液路流程如图9所示，并通过管路探测器探测从离心杯排出液体的状态，内口层以内的红细胞排完，排到梯度液时，再转到外口排出部分红细胞废液，液路流程如图8所示，可使红细胞层远离内口位置，后续从内口收集PBMC产品液时可避免红细胞的混入，红细胞的排出量根据细胞分层状态决定，细胞分层状态好时，可以更多地排出红细胞，细胞分层状态不好时，少排红细胞。具体的，本申请还可通过分层界面传感器来识别从离心杯排出液体的状态。
作为本申请的一种可实施方式，所述步骤S13之后、所述步骤S14之前，还包括：
通过梯度液将所述样品袋、所述废液袋与所述产品袋之间的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋；
再通过梯度液将与所述离心杯连接的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋。
为避免管路中残留的红细胞进入产品袋中，本申请通过梯度液对样品袋、废液袋以及产品袋之间的公共管路和与离心杯连接的公共管路中残留的红细胞进行清洗，减少红细胞的混入量。
作为本申请的一种可实施方式，所述收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液的步骤，包括：
通过管路探测器探测或分层界面传感器识别梯度液与PBMC的分层界面位置来判断分层状态，再根据所述分层状态决定将梯度液排出至所述废液袋中的量，再将所述离心杯内剩余梯度液与产品液一同从所述内口排出至产品袋，液路流程如图10所示，得到待置换液；
所述待置换液收集完成后，将所述离心杯内所有液体从所述外口排出至废液袋。
本申请为提高对PBMC的回收率，通过管路探测器探测或分层界面传感器识别梯度液与PBMC的分层界面位置来判断分层状态，若分离状态较好，则梯度液层中混入PBMC少，可较多地排出梯度液至废液袋，再将剩余梯度液与PBMC收集至产品袋，此时收集较少的梯度液可降低后续洗涤置换的次数，而对于有些血液样本，分离后PBMC与梯度液无明显的分层界面，即PBMC是混在梯度液层中的，此时只需少量排出梯度液至废液袋中，将大部分梯度液与PBMC一同收集至产品袋，从而达到尽可能多地收集PBMC产品液的目的，再从外口将离心杯内所有废液排出，提高PBMC产品的纯度。
作为本申请的一种可实施方式，所述步骤S14之后、所述步骤S15之前，还包括：
S141、将洗涤液加入所述离心杯内，对所述离心杯进行清洗，再将清洗后所述离心杯内的液体排出至废液袋；重复进行步骤S141。
本步骤为后续洗涤置换作准备，先将离心杯内残留的红细胞清除干净，以防止红细胞混入产品液中影响后续孵育转导效率，故而通过加洗涤液至离心杯，混匀后再排出清洗后的液体至废液袋，如此循环多次，以达到将红细胞清除干净的目的。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内的步骤，包括：
步骤S151、将所述待置换液从所述内口泵入经过所述步骤S141处理后的离心杯内，将洗涤液加入所述产品袋内，对所述产品袋进行清洗并将清洗所述产品袋后的液体排至所述离心杯内；重复进行所述步骤S151。
将离心杯清洗干净后，再将产品袋内的待置换液排至离心杯内，为后续洗涤置换做准备，为减少产品袋内PBMC的损失，产品袋排空后再加洗涤液至产品袋，对产品袋进行清洗，再排至离心杯内，重复多次以达到将产品袋清洗干净的目的，提高了PBMC的回收率。
作为本申请的一种可实施方式，所述置换阶段包括以下步骤：
S21、将第一洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第一洗涤液排出，对所述待置换液进行连续洗涤置换；
S22、连续洗涤置换后，对所述离心杯进行混匀，再通过离心分离，得到集中在所述离心杯外层的细胞液和集中在所述离心杯内层的洗涤废液；
S23、离心分离后，将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液，即得PBMC产品液。
如图5所示，本申请的置换阶段将待置换液从内口泵入离心杯内，再将第一洗涤液从外口连续泵入离心杯内并将离心杯填满后，从中心口将第一洗涤液排出，进行连续洗涤置换，液路流程如图11所示，待置换液位于离心杯内层，第一洗涤液从外口进入离心杯，使得第一洗涤液从离心杯外层穿过细胞层到离心杯中心层，能够将细胞层穿透，第一洗涤液装满离心杯后，从离心杯中心口排出，实现连续流洗涤置换过程；再通过将第一洗涤液与细胞液充分混合均匀，达到对残留培养基均匀稀释的目的；再对混匀后的第一洗涤液与细胞液的混合液体进行离心分离，使细胞液集中在离心杯外层，洗涤废液集中在离心杯内层，再从内口排出分层后的洗涤废液，离心杯内保留集中在离心杯外层的细胞液，从而实现了在连续流洗涤的基础上再进一步减容排废液，通过尽可能多地排出废液，提高了细胞的纯度，提高了稀释比例，缩短了置换时间，提高了置换效率，避免了常规的置换阶段未穿透细胞层就直接排出洗涤液，不能实现减容的同时对细胞洗涤置换的问题，并且也降低了长时间的洗涤置换对PBMC产品的损伤。
作为本申请的一种可实施方式，所述将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液的步骤后，还包括：
将第二洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第二洗涤液排出，进行连续洗涤置换；
重复进行步骤S22-步骤S23。
优选地，将第一洗涤液更换为第二洗涤液，对细胞液进行重复洗涤，从而进一步提高对废液的稀释比例，以便尽可能多地排出废液，提高细胞的纯度。
作为本申请的一种可实施方式，所述步骤S23之后，还包括：
将所述离心杯杯壁残留的细胞摇下并与所述PBMC产品液混合。
优选地，由于洗涤置换过程和减容过程都是在离心分离状态下进行的，受离心力作用，细胞会贴在离心杯壁上，可通过离心机对离心杯加速启动停止，将贴壁细胞摇下并与细胞产品液混匀。
以上所述仅为本申请的可选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种PBMC分离置换方法，包括分离阶段与置换阶段，其特征在于，所述分离阶段和所述置换阶段均采用一进两出的离心杯，所述离心杯设有内口、外口和中心口；
所述分离阶段包括以下步骤：
S11、将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆；
S12、进行离心分离，同时从所述外口持续泵入梯度液；
S13、离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞；
S14、收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液；
S15、将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内，开始所述置换阶段，置换结束后，排出洗涤废液，即得PBMC产品液。
2.根据权利要求1所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，再从所述外口泵入血液样本，所述离心杯旋转并从所述中心口排出内层血浆的步骤，包括：
将梯度液从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯旋转并在所述离心杯内形成梯度液柱面层；
形成梯度液柱面层后，再将样品袋内的血液样本从所述外口泵入所述离心杯内，所述离心杯持续旋转，使血浆向所述离心杯中心层移动，所述离心杯填满后，从所述中心口排出内层血浆。
3.根据权利要求2所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述离心分离后，从所述内口排出红细胞，后再从所述外口排出红细胞的步骤，包括：
先从所述内口排出红细胞至废液袋，并通过管路探测器探测从所述离心杯排出液体的状态，当内口层以内的红细胞排完，开始排梯度液时，结束从所述内口排废液；
再从所述外口排出部分红细胞至废液袋。
4.根据权利要求3所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述步骤S13之后、所述步骤S14之前，还包括：
通过梯度液将所述样品袋、所述废液袋与所述产品袋之间的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋；
再通过梯度液将与所述离心杯连接的公共管路中残留的红细胞清洗至废液袋。
5.根据权利要求1所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述收集产品液和梯度液并从所述内口排出至产品袋，得到待置换液，再从所述外口排废液的步骤，包括：
通过管路探测器探测或分层界面传感器识别梯度液与PBMC的分层界面位置来判断分层状态，再根据所述分层状态决定将梯度液排出至所述废液袋中的量，再将所述离心杯内剩余梯度液与产品液一同从所述内口排出至产品袋，得到待置换液；
所述待置换液收集完成后，将所述离心杯内所有液体从所述外口排出至废液袋。
6.根据权利要求1所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述步骤S14之后、所述步骤S15之前，还包括：
S141、将洗涤液加入所述离心杯内，对所述离心杯进行清洗，再将清洗后所述离心杯内的液体排出至废液袋；重复进行步骤S141。
7.根据权利要求6所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述将所述待置换液从所述内口泵入所述离心杯内的步骤，包括：
步骤S151、将所述待置换液从所述内口泵入经过所述步骤S141处理后的离心杯内，将洗涤液加入所述产品袋内，对所述产品袋进行清洗并将清洗所述产品袋后的液体排至所述离心杯内；重复进行所述步骤S151。
8.根据权利要求1所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述置换阶段包括以下步骤：
S21、将第一洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第一洗涤液排出，对所述待置换液进行连续洗涤置换；
S22、连续洗涤置换后，对所述离心杯进行混匀，再通过离心分离，得到集中在所述离心杯外层的细胞液和集中在所述离心杯内层的洗涤废液；
S23、离心分离后，将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液，即得PBMC产品液。
9.根据权利要求8所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述将所述洗涤废液从所述内口排出，所述离心杯内保留集中在所述离心杯外层的细胞液的步骤后，还包括：
将第二洗涤液从所述外口连续泵入所述离心杯内并将所述离心杯填满后，从所述中心口将所述第二洗涤液排出，进行连续洗涤置换；
重复进行步骤S22-步骤S23。
10.根据权利要求8所述的PBMC分离置换方法，其特征在于，所述步骤S23之后，还包括：
将所述离心杯杯壁残留的细胞摇下并与所述PBMC产品液混合。
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