CN116083337A - 一种全自动外周血分离方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种全自动外周血分离方法及装置，该方法包括如下步骤：将样本袋中的外周血样本液和梯度液加入离心杯中，离心后收集目标细胞液到中间袋中；将中间袋中的目标细胞液和洗涤液加入离心杯内进行洗涤置换后得到预产品；将预产品和细胞稀释液混合得到终产品。该方法为自动化操作，不仅降低了操作人员的工作强度，还使得生产速率也能得到提高，提高了产品的回收率和纯度，该方法中一次性能添加大量样本液，克服了Ficoll密度梯度离心法的样本量过多的缺点，且本方法使用的是一次性全密封耗材，降低了污染的风险。

Description

一种全自动外周血分离方法及装置
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种全自动外周血分离方法及装置。
背景技术
细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使细胞具有增强免疫、杀死病原体和肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，进而可以治疗各种疾病。
目前，分离外周血单个核细胞的方法主要有黏附法、免疫磁珠分离法、流式细胞分离以及经典的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法。黏附法操作麻烦、回收率低，分离纯度不高，免疫磁珠法虽然分离纯度较高，回收率也高，但其成本过高，流式细胞分离成本较高，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法所得到的细胞虽然纯度较好，但是样本量不能过多，样本量多的话也会影响其分离的效果，而且对操作人员的要求比较高，产品的一致性较差，且生产效率不高。
中国专利CN112251404A公开了一种外周血单个核细胞的分离方法，结合了羟乙基淀粉沉淀以及Ficoll密度梯度离心法，实现对单个核细胞的进一步纯化，纯度和活力较高，但其都为人工操作，生产速率较慢，产品一致性较差，并未解决回收率较差的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一个方面提供了一种全自动外周血分离方法，包括如下步骤：将样本袋中的外周血样本液和梯度液加入离心杯中，离心后收集目标细胞液到中间袋中；将中间袋中的目标细胞液和洗涤液加入离心杯内进行洗涤置换后得到预产品；将预产品和细胞稀释液混合得到终产品。
进一步优选的，该方法具体包括：分离前处理、设置分离参数、启动分离、结束流程；
进一步优选的，所述分离前处理步骤具体为，在全自动外周血分离装置上安装耗材，接入外周血样本液(本申请指外周血)、梯度液、洗涤液(置换液)、细胞稀释液。
进一步优选的，将所述样本袋中的外周血样本液经样本液排气后，再加入离心杯，此时的进液速度为18-22mL/min。
进一步优选的，所述进液速度为20mL/min。
优选的，所述离心后产生分层现象，之后，将管路中残留的所述样本液回排到所述样本袋中。
优选的，当所述外周血样本液的量大于一次离心杯的分离量时，则需要将所述样本液进行多次进液分离。
优选的，所述收集目标细胞液后，清洗离心杯和管路。
优选的，所述目标细胞液和洗涤液加入离心杯的顺序为，先将中间袋内的目标细胞液排空至离心杯，再加入洗涤液至中间袋内后排入离心杯。
优选的，所述洗涤置换的次数为1-3次。
进一步优选的，所述洗涤置换的次数为3次。
优选的，在所述得到终产品后，将所述终产品排入产品袋中，用所述细胞稀释液清洗所述离心杯，并将清洗后的液体排入到所述产品袋中，清洗离心杯的次数为1-20次。
进一步优选的，所述清洗离心杯的次数为3次。
优选的，所述清洗离心杯结束后，对所述产品袋中的终产品进行分装。
进一步优选的，对所述产品袋中的终产品进行分装后，进行残余收集。
本发明第二方面提供了一种全自动外周血分离装置，所述的全自动外周血分离方法应用于所述装置中。
进一步优选的，所述全自动外周血分离装置包括样本秤、置换液2秤、置换液1秤、离心机、中间秤、产品秤、触摸显示屏、急停按钮、气泡检测器、离心机压力监测器、蠕动泵、旋压阀和报警系统，所述样本秤用于称量外周血样本液的进液量；所述置换液1秤和置换液2秤用于称量置换液(洗涤液)的进液量；所述离心机用于对离心杯提供旋转动力以分离细胞液；所述中间秤用于称量中间袋中目标细胞液的重量；所述产品秤用于称量终产品的重量；所述触摸显示屏用于设置分离参数；所述急停按钮用于停止离心机的转动；所述气泡检测器用于检测管路中是否存在气泡；所述离心机压力监测器用于监测离心机内部的压力情况，用以确保离心过程的安全性，如果离心机压力过高，报警系统就会启动，立即按压急停按钮停止离心机的运行；所述蠕动泵用于向离心杯泵入液体或从离心杯内泵出液体；所述旋压阀用于控制管路的开闭。
有益效果：
(1)本发明提供了一种全自动外周血分离方法，该方法为自动化操作，将配套一次性耗材，分离、洗涤置换、制剂分装整合在一个设备上，不仅降低了操作人员的工作强度，还使得生产速率也能得到提高，产品一致性提高。
(2)本发明提供了一种全自动外周血分离方法，该方法中通过梯度液排气、缓慢加入样本液和样本液回排，减少了样本液损失，提高了回收率，除此之外，排浓缩废液这个步骤减少了红细胞的混入，提高了产品的纯度，在分离杯冲洗残留步骤中，将管路和离心杯内残留红细胞去除，进一步提高了产品纯度。
(3)本发明提供了一种全自动外周血分离方法，该方法中一次性能添加大量样本液，克服了Ficoll密度梯度离心法的样本量过多的缺点，且本方法使用的是一次性全密封耗材，降低了污染的风险。
附图说明
图1：全自动外周血分离方法。
图2：全自动外周血分离方法中启动分离的流程。
图3：启动分离中梯度液分离的具体流程。
图4：全自动分离设备正视图和全自动分离设备侧视图。
图4包括：样本秤；管路探测器；离心机压力检测器；离心机；触摸显示屏；报警系统；急停按钮；旋压阀；气泡探测器；蠕动泵；置换液2秤，置换液1秤；中间秤；产品秤。
具体实施方式
一方面，本发明提供一种全自动外周血分离方法，包括如下步骤：将样本袋中的外周血样本液和梯度液加入离心杯中，离心后收集目标细胞液到中间袋中；将中间袋中的目标细胞液和洗涤液加入离心杯内进行洗涤置换后得到预产品；将预产品和细胞稀释液混合得到终产品。
所述离心后产生分层现象，之后，将管路中残留的所述样本液回排到所述样本袋中。
当所述外周血样本液的量大于一次离心杯的分离量时，则需要将所述样本液进行多次进液分离。
所述收集目标细胞液后，清洗离心杯和管路。
所述目标细胞液和洗涤液加入离心杯的顺序为，先将中间袋内的目标细胞液排空至离心杯，再加入洗涤液至中间袋内后排入离心杯。
在所述得到终产品后，将所述终产品排入产品袋中，用所述细胞稀释液清洗所述离心杯，并将清洗后的液体排入到所述产品袋中。
所述清洗离心杯结束后，对所述产品袋中的终产品进行分装后，进行残余收集。
如图1所示，上述全自动外周血分离方法的具体流程为：
该方法具体包括：分离前处理、设置分离参数、启动分离、结束流程。
所述分离前处理步骤具体为，在全自动外周血分离装置上安装耗材，接入外周血样本液(本申请指外周血)、梯度液、洗涤液(置换液)、细胞稀释液。
在全自动分离设备上的触摸显示屏中设置分离参数，所述设置分离参数包括：梯度液定时阶段的时间，样本进液的速度，循环分离的次数，循环分离结束判断，离心杯冲洗残留的重复次数，洗涤离心杯中的重复次数。
之后，进入启动分离步骤，设备自动运行分离、置换、分装流程，结束后再取下产品、拆耗材，即完成整个全自动分离方法的流程。
如图2所示，所述启动分离的具体步骤如下：
S1：梯度液分离；
如图3所示，所述梯度液分离的具体流程如下：
(1)：第一梯度液排气；
开启旋压阀，将第一梯度液加入至离心杯，离心杯活塞上移的同时排出离心杯上部和管路中空气，同时，加入的第一梯度液也排出至废液袋，即排气完成。
(2)：加第一梯度液；
经步骤(1)后，重新加入第一梯度液至离心杯内，得到具有第一梯度液的离心杯。
(3)：第一梯度液定时；
经步骤(2)后，转动离心机，离心杯位于离心杯机里面，设置离心时间为30s，之后，观察到具有第一梯度液的离心杯内呈现分层界面，即停止转动离心机。
(4)：样本液排气；
经步骤(3)后，通过样本秤称量外周血样本液进液量，将样本袋中的样本液(本申请指外周血)加入离心杯中，此时，离心杯活塞上移后排出离心杯上部和管路中空气，同时也排出样本液，即排气完成，之后，再从样本袋中导入样本液(本申请指外周血)至排气完成后的离心杯中。
(5)：样本进液；
转动离心机，让步骤(3)中的呈现分层界面的离心杯处于旋转状态，此时离心杯内充满梯度液，之后，按18-22mL/min的进液速度将样本液加入至离心杯中，直到加完，优选为20mL/min。。
(6)：分离定时；
通过全自动分离装备上的触摸显示屏将步骤(5)的离心机设置为离心定时阶段，25min后，离心杯内产生分层现象，离心机停止转动，从上往下分别是血浆层、目标细胞液层、梯度液层和红细胞层。
(7)：样本液回排；
经步骤(6)后，将已经产生分层现象的离心杯进行样本液回排，此时，通过管路探测器来探测管路残余的外周血样本液，再将最外层血浆层导入至管道后，将部分血浆层和管道中残留的样本液导回样本袋中，重复步骤(5)后，将离心杯的血浆层导入至废液袋中。
(8)：细胞液收集；
打开旋压阀，步骤(7)中已经排完血浆层的离心杯中，还具有目标细胞液、红细胞层和梯度液，开启旋压阀，将目标细胞液排入中间袋中，同时用中间秤称量目标细胞液的量。
(9)：排梯度液层和红细胞层；
收集完目标细胞液后，停止离心杯的转动，之后，排出梯度液层和红细胞层至废液袋内。
(10)：循环分离结束判断。
当所述外周血样本液的量大于一次离心杯的分离量时，则需要将所述外周血样本液进行多次进液分离，即重复步骤2-9后，重复次数依据样本液的量来确定。
S2：离心杯冲洗残留；
经步骤S1中的梯度液分离结束后，将洗涤液加入离心杯中，清洗离心杯及管路中残留的红细胞，再排入废液袋，重复次数为3次。
S3：清空中间袋至离心杯；
开启旋压阀，将中间袋中的目标细胞液全部排入到经步骤S2后的离心杯，此时，中间袋中还残留有目标细胞液。
S4：添加洗涤液至中间袋；
之后，将洗涤液加入至步骤S3中含有残留目标细胞液的中间袋中清洗。
S5：清洗中间袋；
将步骤S4中排入中间袋内的洗涤液和残留目标细胞液通过蠕动泵泵入至步骤S3中的离心杯，对离心杯内的细胞液进行稀释洗涤后，离心，将废液排出至废液袋，留下细胞液在离心杯中。
S6：洗涤置换；
首先，通过置换液1秤称量加入第一洗涤液的量，再将第一洗涤液通过蠕动泵泵入步骤S5中的离心杯，通过第一洗涤液对离心杯内细胞液进行稀释洗涤，离心后，将上清废液排至废液袋，留下细胞液，此时，第二次洗涤液的量由置换液2秤称量，继续加入第二洗涤液，对离心杯内细胞液进行稀释洗涤，离心后排上清废液至废液袋，留下细胞液，继续加入第三洗涤液，对离心杯内细胞液进行稀释洗涤，离心后排上清废液至废液袋，得到预产品。前述洗涤置换的次数优选为1-3次，当然也可根据需求设置更多的洗涤次置换次数，在此不做限制；第一洗涤液，第二洗涤液和第三洗涤液可以相同，也可以不同，可以根据具体的需求进行选择。
S7：终产品；
经过步骤S6后，将细胞稀释液加入至步骤S6含有预产品的离心杯中，之后，对预产品进行稀释后得到终产品。
S8：将终产品排入产品袋；
将步骤S7中得到的终产品排入产品袋中，同时，通过终产品秤称量终产品的量。
S9：清洗离心杯；
在步骤S8中排完终产品后，离心杯内可能会残留一定量的终产品，此时，将细胞稀释液泵入离心杯中，对离心杯内残留的终产品进行洗涤后排入产品袋内，清洗离心杯的次数可为1-20次，优选为3次。
S10：确认取样；
对步骤S9中排入产品袋的细胞液进行取样计数，结合体积计算回收细胞数和回收率。
S11：单袋分装；
取样后，据细胞计数信息加入制剂液稀释至待分装浓度，再将终产品进行分装。
S12：残余收集。
分装结束后，在拆卸耗材前，通过从耗材上的无菌过滤器抽入空气，通过气体将离心杯内残留的终产品完全排出。
本发明第二方面提供了一种全自动外周血分离装置，所述的全自动外周血分离方法应用于所述装置中。
如图4所示，所述全自动外周血分离装置包括样本秤、置换液2秤、置换液1秤、离心机、中间秤、产品秤、触摸显示屏、急停按钮、气泡检测器、离心机压力监测器、蠕动泵、旋压阀和报警系统。所述样本秤用于称量外周血样本液的进液量；所述置换液1秤和置换液2秤用于称量置换液(洗涤液)的进液量；所述离心机用于对离心杯提供旋转动力以分离细胞液；所述中间秤用于称量中间袋中目标细胞液的重量；所述产品秤用于称量终产品的重量；所述触摸显示屏用于设置分离参数；所述急停按钮用于停止离心机的转动；所述气泡检测器用于检测管路中是否存在气泡；所述离心机压力监测器用于监测离心机内部的压力情况，用以确保离心过程的安全性，如果离心机压力过高，报警系统就会启动，立即按压急停按钮停止离心机的运行；所述蠕动泵用于向离心杯泵入液体或从离心杯内泵出液体；所述旋压阀用于控制管路的开闭。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种全自动外周血分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将样本袋中的外周血样本液和梯度液加入离心杯中，离心后收集目标细胞液到中间袋中；将中间袋中的目标细胞液和洗涤液加入离心杯内进行洗涤置换后得到预产品；将预产品和细胞稀释液混合得到终产品。
2.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，将所述样本袋中的外周血样本液经样本液排气后，再加入离心杯，此时的进液速度为18-22mL/min。
3.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，所述离心后产生分层现象，之后，将管路中残留的所述样本液回排到所述样本袋中。
4.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，当所述外周血样本液的量大于一次离心杯的分离量时，则需要将所述样本液进行多次进液分离。
5.根据权利要求4所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，所述收集目标细胞液后，清洗离心杯和管路。
6.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，所述目标细胞液和洗涤液加入离心杯的顺序为，先将中间袋内的目标细胞液排空至离心杯，再加入洗涤液至中间袋内后排入离心杯。
7.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，所述洗涤置换的次数为1-3次。
8.根据权利要求1所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，在所述得到终产品后，将所述终产品排入产品袋中，用所述细胞稀释液清洗所述离心杯，并将清洗后的液体排入到所述产品袋中，清洗离心杯的次数为1-20次。
9.根据权利要求8所述的一种全自动外周血分离方法，其特征在于，所述清洗离心杯结束后，对所述产品袋中的终产品进行分装。
10.一种全自动外周血分离装置，其特征在于，所述权利要求1-9任一项所述的全自动外周血分离方法应用于所述装置中。
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