CN116837071A - 核糖体图谱分析中rna片段的去除方法及应用 - Google Patents

核糖体图谱分析中rna片段的去除方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法及应用。其中，去除方法包括：利用tRNA去除探针与核糖体图谱分析样本结合，tRNA去除探针与RNA片段中的tRNA片段形成双链RNA结构，通过去除双链RNA结构实现对于tRNA片段的去除；tRNA去除探针包括能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的序列。能够解决现有技术中难以去除Ribo‑seq文库中的tRNA片段的问题。适用于核糖体图谱分析领域。

Description

核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法及应用
技术领域
本发明涉及核糖体图谱分析领域，具体而言，涉及一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法及应用。
背景技术
经典的中心法则展示了基因从DNA转录成RNA，RNA翻译成蛋白，最终通过蛋白行使功能的过程。蛋白表达水平是基因功能的重要体现之一，目前检测蛋白表达可以通过ELISA、质谱和核糖体图谱分析进行评估。核糖体图谱分析(Ribosome profiling，Ribo-seq)促进了多样化且复杂的生物过程中基因表达调控层面的新发现，是蛋白质合成机制，乃至新蛋白质研究的重要手段之一，为编码区域的实验注释提供了一个系统化的方法。
核糖体图谱分析是通过RNA酶处理细胞裂解物，把不受核糖体保护的RNA降解掉，随后分离被核糖体保护的mRNA片段。通过这一实验处理可得到30个核苷酸左右的RNA序列，可将其直接定位(map)到原始的mRNA，用于确定翻译中的核糖体的准确位置。核糖体图谱用于构建链特异性文库并进行高通量测序，再将这些测序片段map到合适的基因组上。通过对蛋白合成的比率和mRNA的丰度比较，可检测每个mRNA的翻译效率。
但在核糖体图谱数据中，包括鼠样本的核糖体图谱数据中，除了rRNA残留外还有大量的tRNA片段，这些tRNA片段数据平均占据整体过滤后数据(clean reads)的30％以上，且现有技术没有能够去除相关的tRNA的方法和试剂。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法及应用，以解决现有技术中难以去除Ribo-seq文库中的tRNA片段的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种tRNA去除探针，该tRNA去除探针包括能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的序列。
进一步地，tRNA去除探针包括由脱氧核糖核苷酸组成的DNA序列。
进一步地，tRNA去除探针包括含有SEQ ID NO：2所示序列的序列；优选地，tRNA去除探针的5’端为SEQ ID NO：2所示序列；优选地，tRNA去除探针为SEQ ID NO：2所示的序列。
进一步地，tRNA去除探针的核糖核苷酸上具有锁核酸修饰；优选地，锁核酸修饰的个数为1-10个，更优选为3-8个，进一步优选为5-7个；优选地，tRNA去除探针的长度为18-29nt，更优选为19-25nt，进一步优选为22-24nt。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法，该去除方法包括：利用上述tRNA去除探针与核糖体图谱分析样本结合，tRNA去除探针与RNA片段中的tRNA片段形成双链RNA结构，通过去除双链RNA结构实现对于RNA片段的去除。
进一步地，去除双链RNA结构的方法包括利用磁珠、RNA酶、层析柱或过滤膜中的一种或多种去除双链RNA结构。
进一步地，去除方法包括：在核糖体图谱分析文库的建库过程中，将tRNA去除探针与连接有测序接头的核糖体图谱分析样本结合；核糖体图谱分析文库的建库过程包括：将细胞或组织样本进行裂解，利用翻译抑制剂固定核糖体，获得核糖体固定样本；利用RNA酶消化核糖体固定样本，纯化获得核糖体保护片段；将核糖体保护片段进行末端磷酸化和测序接头连接，获得连接有测序接头的核糖体图谱分析样本；将tRNA去除探针与连接有测序接头的核糖体图谱分析样本结合，去除双链RNA结构，获得去除tRNA样本；将去除tRNA样本进行反转录、PCR富集和纯化，获得去除tRNA的核糖体图谱分析文库。
进一步地，去除方法还包括利用用于去除rRNA的探针，去除RNA片段中的rRNA片段；优选地，tRNA去除探针与用于去除rRNA的探针同时与核糖体图谱分析样本结合，tRNA去除探针与tRNA片段形成第一双链RNA结构，用于去除rRNA的探针与rRNA片段形成第二双链RNA结构，同时去除第一双链RNA结构和第二双链RNA结构。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种RNA去除试剂盒，该RNA去除试剂盒包括上述tRNA去除探针。
进一步地，RNA去除试剂盒还包括用于去除rRNA的探针。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种上述tRNA去除探针、去除方法或RNA去除试剂盒在核糖体图谱分析或核糖体保护tRNA分析中的应用。
应用本发明的技术方案，利用上述能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的tRNA去除探针，能够去除核糖体图谱分析中被核糖体保护的tRNA片段，提高Ribo-seq文库的有效数据的比例。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例3的核糖体图谱分析文库的建库过程示意图。
图2示出了根据本发明实施例6的对于21个小鼠样本处理前后的结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，在现有的鼠样本的核糖体图谱数据中，含有大量的tRNA片段，这些tRNA片段数据平均占据clean reads的30％以上，占用测序资源，造成测序资源的浪费和成本的提高，并对后续数据分析产生影响。因而，在本申请中发明人尝试开发一种能够去除核糖体图谱分析中tRNA片段的tRNA去除探针，基于该探针提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种tRNA去除探针，该tRNA去除探针包括能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的序列。
SEQ ID NO：1：GCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC。
上述SEQ ID NO：1所示的序列为小鼠样本中的鼠源核糖体保护的tRNA片段保守序列。上述保守序列为核糖核苷酸组成的RNA序列。利用能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的探针，此种探针能够与核糖体图谱分析中tRNA片段(包括但不限于保守序列)特异性结合形成双链结构，通过去除双链结构能够实现对于样本中tRNA片段的去除。探针包括但不限于由核糖核苷酸组成的RNA序列、由脱氧核糖核苷酸组成的DNA序列或由脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸共同组成的DNA-RNA序列。
上述SEQ ID NO：1所示的保守序列与小鼠的转录本数据库进行比对，未匹配到序列。即上述序列不能匹配到基因编码区，能够与上述保守序列互补配对的序列不会对含有编码信息的mRNA产生影响，不影响核糖体图谱分析的准确性。
上述tRNA去除探针能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列的全部或部分序列进行特异性结合，“部分特异性结合”包括与保守序列中的一部分进行特异性结合，“一部分”包括连续或不连续的10个或更多个碱基，包括但不限于与保守序列上的10、12、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个碱基特异性结合。
在一种优选的实施例中，tRNA去除探针包括由核糖核苷酸组成的RNA序列。
在一种优选的实施例中，tRNA去除探针包括含有SEQ ID NO：2所示序列的序列；优选地，tRNA去除探针的5’端为SEQ ID NO：2所示序列；优选地，tRNA去除探针为SEQ ID NO：2所示的序列。
SEQ ID NO：2：CGAGAATTCTACCACTGAACCAC。
上述SEQ ID NO：2为脱氧核糖核苷酸组成的DNA序列。SEQ ID NO：2能够与上述SEQID NO：1特异性结合，形成双链结构。tRNA去除探针中含有SEQ ID NO：2所示的序列。优选地，在tRNA去除探针中，SEQ ID NO：2位于该tRNA去除探针的5’端，SEQ ID NO：2的3’端可选地设置有其他能够与保守序列互补配对的核糖核苷酸。
在一种优选的实施例中，tRNA去除探针的核糖核苷酸上具有锁核酸修饰；优选地，锁核酸修饰的个数为1-10个，更优选为3-8个，进一步优选为5-7个；优选地，锁核酸修饰的核糖核苷酸位于tRNA去除探针5’端第1位至第23位中的任意一个或多个位置，包括但不限于tRNA去除探针5’端第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23位；优选地，锁核酸修饰的核糖核苷酸位于tRNA去除探针5’端第3位、6位、9位、12位、15位或19位中的任意一个或多个位置；优选地，tRNA去除探针的长度为18-29nt，包括但不限于18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29nt，更优选为19-29nt，19-25nt，22-29nt，进一步优选为22-24nt。
上述tRNA去除探针中的核糖核苷酸可选地为具有锁核酸(LNA，Locked NucleicAcid)结构的核糖核苷酸，上述锁核酸能够提高tRNA去除探针与样本中tRNA片段结合的特异性，防止错配导致的核糖体图谱分析中编码信息的丢失。
在本申请第二种典型的实施方式中，提供了一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法，该去除方法包括：利用上述tRNA去除探针与核糖体图谱分析样本结合，tRNA去除探针与RNA片段中的tRNA片段形成双链RNA结构，通过去除双链RNA结构实现对于tRNA片段的去除。
在一种优选的实施例中，去除双链RNA结构的方法包括利用磁珠、RNA酶、层析柱或过滤膜中的一种或多种去除双链RNA结构。
在一种优选的实施例中，去除方法包括：在核糖体图谱分析文库的建库过程中，将tRNA去除探针与连接有测序接头的核糖体图谱分析样本结合；核糖体图谱分析文库的建库过程包括但不限于：将细胞或组织样本进行裂解，利用翻译抑制剂固定核糖体，获得核糖体固定样本；利用RNA酶消化核糖体固定样本，纯化获得核糖体保护片段；将核糖体保护片段进行末端磷酸化和测序接头连接，获得连接有测序接头的核糖体图谱分析样本；将tRNA去除探针与连接有测序接头的核糖体图谱分析样本结合，去除双链RNA结构，获得去除tRNA样本；将去除tRNA样本进行反转录、PCR富集和纯化，获得去除tRNA片段的核糖体图谱分析文库。
上述去除方法中涉及的建库过程属于现有技术，将上述tRNA去除探针用于包括但不限于上述的建库方法或其它建库方法中，均能够实现对于样本中tRNA片段的去除，从而降低核糖体图谱分析文库中tRNA的含量，提高核糖体图谱分析文库中的有效数据量的比例。有效数据表示对样本中mRNA等有数据分析价值的片段的测序数据，而不包括对于rRNA和tRNA等序列信息重复、无分析价值的片段的测序数据。
在一种优选的实施例中，去除方法还包括利用用于去除rRNA的探针，去除RNA片段中的rRNA片段；优选地，tRNA去除探针与用于去除rRNA的探针同时与核糖体图谱分析样本结合，tRNA去除探针与tRNA片段形成第一双链RNA结构，用于去除rRNA的探针与rRNA片段形成第二双链RNA结构，同时去除第一双链RNA结构和第二双链RNA结构。
用于去除rRNA的探针属于现有技术，在上述去除方法中，将用于去除rRNA的探针与上述tRNA去除探针同时或分别与核糖体图谱分析样本结合，均能够实现减低样本中tRNA片段和rRNA片段的效果。去除rRNA的探针的使用，不限于在使用tRNA去除探针之前、之后使用或同时与tRNA去除探针使用，均能够进一步实现对于rRNA的去除，也不影响对于tRNA的去除效果。优选地，为了提高操作效率，减少操作所用的步骤和时间，用于去除rRNA的探针与tRNA去除探针能够同时与核糖体图谱分析样本结合，2类探针直接不会互相影响，能够实现在一个实验操作中同时去除tRNA和rRNA片段。上述第一双链RNA结构和第二双链RNA结构仅用于区分形成的不同RNA双链结构，不限定探针加入或双链结构形成的先后顺序。
在本申请第三种典型的实施方式中，提供了一种RNA去除试剂盒，该RNA去除试剂盒包括上述tRNA去除探针。
在一种优选的实施例中，RNA去除试剂盒还包括用于去除rRNA的探针。
在本申请第四种典型的实施方式中，提供了一种上述tRNA去除探针、去除方法或RNA去除试剂盒在核糖体图谱分析或核糖体保护tRNA分析中的应用，该应用能够获得含有较低核糖体保护tRNA片段的文库和被分离的核糖体保护tRNA，在对于核糖体图谱分析中能够提高文库中有效数据的比例，减少测序成本和测序数据分析难度；也能够在对核糖体保护tRNA的分析研究中获得富集的核糖体保护tRNA。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1
在实际的鼠源样本Riboseq数据里我们发现除了未去除的无效数据核糖体RNA残留外，依然存在很多tRNA的残留，rRNA和tRNA的残留均视为无效数据，为了去除这两部分残留，需要使用两种探针捕获，但现实中只有商业化的rRNA去除探针，并没有tRNA去除探针。针对tRNA去除探针的设计，我们从不同小鼠组织样本的Riboseq数据中分析得到tRNA残留的保守序列，针对该序列进行探针设计，以便在后续Riboseq建库过程中更好地去除tRNA残留，提高有效数据量。
我们从鼠源组织样本的Riboseq数据中分析tRNA序列，分析每个样本的tRNAreads的种类和丰度，将按照丰度排名后的tRNA序列保留下来，随后对筛选出来的tRNAreads序列进行命名，样本编号+reads占比作为序列名称进行区分，然后将序列转换成fasta格式，使用mafft软件进行多重序列相似性比对，将比对完的结果文件导入BioEdit或其他序列编辑软件，对序列文件进行分类，得到三个排序靠前序列：
SEQ ID NO：1:GCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC；
SEQ ID NO：5:CGUGAUCGUAUAGUGGUUAGUACU；
SEQ ID NO：6:GUUUCCGUAGUGUAGUGGUUAUC。
SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6在tRNA数据中的占比分别是69％、20％和5％。考虑到后续针对这3条tRNA序列的探针设计是否对RPF有影响，设计过程中也对上述3条tRNA序列进行mRNA比对，发现没有比对到mRNA上，对RPF无影响，因此本发明对丰度占比较高的SEQ NO1序列进行探针设计并应用在后续的Riboseq建库过程中。
实施例2Ribo-seq中tRNA去除探针设计
1.1样本信息和tRNA reads丰度分析
选择3个小鼠组织样本的Ribo-seq测序数据进行分析，分析每个样本的tRNAreads的种类和丰度，将丰度排名top10的tRNA序列保留下来(top10的reads数占总reads数的60％以上)，做下一步分析。
1.2tRNA reads相似性分析
对上一步筛选出来的tRNA reads序列进行命名，样本编号+reads占比作为序列名称进行区分，然后将序列转换成fasta格式，使用mafft软件进行多重序列相似性比对。
将比对完的结果文件导入BioEdit或其他序列编辑软件，对序列文件进行分类，分类原则：差异位点≤1个归为一类，筛选出如下序列：
SEQ ID NO：1：GCAUUGGUGGUUCAGUGGUAGAAUUCUCGC，占比在10％以上，作为小鼠样本tRNA去除的保守序列。
1.3序列特异性分析
采用bowtie将SEQ ID NO：1序列与小鼠的转录本数据库进行比对，未匹配到序列。由于未匹配到基因编码区，不会对mRNA序列产生影响。
1.4tRNA去除探针序列设计
针对上述SEQ ID NO：1，设计能够与SEQ ID NO：1互补配对的SEQ ID NO：2探针。
SEQ ID NO：2：CGAGAATTCTACCACTGAACCAC。
SEQ ID NO：2的信息如表1所示。
表1：tRNA去除探针序列信息
名称 序列 长度 纯化方式 OD260 质量(μg) nmol GC(％) TM(℃) MW
mou SEQ ID NO：2 23nt HPLC 1 32.3 4.5 47.8 55.3 7157.6
其中，SEQ ID NO：2的第3、6、9、12、15和19位的核糖核苷酸上具有锁核酸修饰；
SEQ ID NO：2为由脱氧核糖核苷酸组成的DNA序列。
实施例3
1.样本裂解
1.1组织样本裂解
1)准备研磨珠、2.0mL研磨管，将样本切碎放入研磨管中并放入液氮中速冻。
2)使用自动研磨器，在48Hz，20s的条件下研磨2次，将组织研磨成粉末状。
3)试剂准备，配方如表2和表3所示。
表2多聚体缓冲液(polysome buffer)配方
试剂 使用量(μL)/样本 储存条件(℃)
1M Tris-Cl pH7.5 20 常温
5M NaCl 30 4
1M MgCl2 5 常温
NF-H2O 945 4
总体积 1000
表3动物组织和细胞裂解液配方
试剂 使用量(μL)/样本 储存条件(℃)
Polysome Buffer 878 4
10％Triton X-100 100 -20
100mM DTT 10 -20
DNasel(1U/μL) 10 -20
50mg/mL放线菌酮(cycloheximide) 2 -20
总体积 1000
4)加入1mL裂解液，枪头充分吹打混匀。
5)冰上裂解20min，期间每2min轻微震荡混匀。
6)4℃，13000rpm离心10min，将上清转移至冰上预冷的新离心管中。
7)Qubit测量裂解液浓度并记录，初浓度≥100ng/μL即可进行下步反应。
1.2细胞样本裂解
1)明确细胞样本类型，若为冻存液保存的细胞，需在37℃水浴复苏细胞后常温500g 5min离心收集细胞，弃去保护液后进行裂解。
2)加入600μL细胞裂解液，枪头充分吹打混匀。
3)5号注射器反复吹打细胞裂解液8次。
4)冰上裂解20min，期间每2min轻微震荡混匀。
5)4℃，13000rpm离心10min，将上清转移至冰上预冷的新离心管中。
6)Qubit测量裂解液浓度并记录，初浓度≥100ng/μL即可进行下步反应。
2.核糖体保护片段(RPF)富集
2.1试剂和耗材准备
所用试剂如表4所示。
表4
2.2RNA酶消化
1)取上步裂解液200μL，依据RNA总量计算需要的RNaseI，加入7.5μL RNaseI(100U/μL)。
注：裂解液浓度在100-200ng/μL时，200μL裂解液加7.5μL Rnase I。
2)不同样本类型酶切环境不一样，4℃混匀仪孵育1h。
3)孵育30min后，可准备MicroSpinS-400Columns树脂柱。
2.3RNA酶消化终止
加入10μL SUPERase*In RNase inhibitor，充分混匀，终止核酸酶消化反应。
2.4MicroSpin S-400column过滤
1)每个样本准备3mL Polysome Buffer。
2)将MicroSpin S-400column颠倒几次混匀树脂，轻弹色谱柱以除去树脂中的气泡。
3)打开色谱柱上下两端，加入缓冲液(Polysome Buffer)，使缓冲液在重力作用下滴出。
4)连接收集管，在固定角度的台式离心机中，600g室温离心4min。弃去流出的缓冲液并将柱子转移到新的2mLEP管中。
5)立即取200μL核酸酶消化后的RPF样本(确认已添加RNase inhibitor)在600g离心2min。收集流出液。
6)加20μL的10％SDS(每100uL加入10μL的10％SDS)，用作RPF RNA后续处理。
7)若上述混合物大于220μL，则平分成两管，并按照2.5的试剂配比配置体系。
2.5RNA Clean&Concentrator-25Kit纯化RPF RNA样本
1)使用试剂盒(ZYMO RESEARCH，Cat#R1017)进行试验，使用前确定RNAWashBuffer中已加入乙醇。
2)按下表5配制体系并混匀。
表5RNA Clean&Concentrator-25Kit纯化体系
试剂 使用量(μL)/样本
RNA Binding Buffer 220
无水乙醇 495
RPF样本 110
3)将Zymo-SpinTM IIC Column放置在收集管中，将上述体系转移至柱子中，室温13000rpm离心1min，弃收集液。
4)重复上述操作，将剩余体系转移至柱子中，室温13000rpm离心1min，弃收集液。
5)加入400μL RNAPrep Buffer到柱子中，室温13000rpm离心1min，弃收集液。
6)加入700μL RNAWash Buffer到柱子中，室温13000rpm离心1min，弃收集液。
7)加入400μL RNA Wash Buffer到柱子中，室温13000rpm离心2min，弃收集液，将柱子转移至新的无RNA酶的1.5mL离心管中。
8)将18μLNF-H2O小心加入回收柱中央，室温静置2min，室温13000rpm离心2min。
9)用Qubit定量并记录总的RNA量。
3.变性PAGE切胶
3.1试剂准备
所用试剂如表6所示。
表6
试剂 储存条件(℃)
尿素 常温
30％聚丙烯酰胺 4
10×TBE 4
dd H2O 常温
10％过硫酸铵 4
TEMED 4
Denaturing Gel Loading Dye(ThermoFisher，R0641) -20
20/100Oligo Ladder(1ng/μL)(ThermoFisher，10597012) -20
SYBR Gold(ThermoFisher，S11494) 常温
3.2配制15％变性PAGE胶
15％变性PAGE胶配方如表7所示。
表7
试剂 15mL胶用量 30mL胶用量
尿素 6.3g 12.6g
30％聚丙烯酰胺 6mL 12mL
10×TBE 1.5mL 3mL
dd H2O 7.5mL 15mL
10％过硫酸铵 75μL 150μL
TEMED 15μL 30μL
3.3准备样本和marker(20/100Oligo Ladder)
1)10μL样本与10μL2x loading dye(Denaturing Gel Loading Dye)混匀，总体积20μL。
2)8μL20/100Oligo Ladder与10μL 2x loading dye混匀，5μL28/30nt maker与5μL 2x loading dye混匀。
28/30nt marker由2条RNA序列组成，其中：
28nt序列为5’-AUGUACACGGAGUCGACCCGCAACGCGA-3’(SEQ ID NO：3)，
30nt序列为5’-AUGUACACGGAGUCGAAACCCGCAACGCGA-3’(SEQ ID NO：4)，
28nt序列和30nt序列的3’端均具有磷酸化修饰(Phos)。
3)PCR仪75℃，3min。使样本和20/100Oligo ladder变性，结束后立即置于冰上。
3.4电泳和染色
180V电泳50min～1h，电泳完成后，将胶切角标记后取下，使用SYBR Gold染色5min，1：6000(30mL纯水+5μL SYBR Gold)。暗室蓝光观察RNA条带。
3.5切胶
切胶，范围28-30nt。将切取的胶转移至扎好孔的离心管中。
4.核糖体保护片段(RPF)回收纯化
4.1耗材准备
取0.5mL离心管，用注射器针头在底部扎孔呈筛状，置于2mL离心管中。准备Spin-X过滤管。
4.2试剂准备
所用试剂如表8所示。
表8
试剂 储存条件(℃)
NF H2O 常温
3M醋酸钠 常温
糖原(Glycogen) -20
无水乙醇 -20
80％乙醇 -20，现配现用
4.3回收纯化
1)将切下来的胶放入准备好的2mL离心管中(套0.5mL离心管)，4℃13000rpm离心5min。
2)向凝胶碎末中加入200μL NF-H2O，震荡器37℃，1000rpm摇1h。
3)将上述溶液转移至Spin-X离心过滤管中，4℃，13000rpm离心10min。
4)按下表9加入试剂并充分混匀。
表9
试剂 使用量(μL)/样本
3M醋酸钠 13
Glycogen 2.5
无水乙醇 600
5)瞬时离心，置于-20℃放置1h以上。
6)4℃13000rpm离心15min，小心吸取上清。
7)加入1000μL70％乙醇，13000rpm离心5min后弃上清。
8)重复第7步，尽可能吸走上清。
9)用43μL NF-H2O溶解RNA沉淀，轻柔吹吸20次促进溶解。
5.磷酸化(末端修复)
5.1试剂准备
所用试剂如表10所示。
表10
试剂 储存条件(℃)
T4 PNK buffer(NEB，M0201V) -20
SUPERase*In RNase inhibitor(20U/μL)(ThermoFisher，AM2694) -20
T4 PNK(10U/μL)(NEB，M0201V) -20
无水乙醇 4
NF H2O 常温
5.2末端磷酸化
1)按下表11依次添加试剂：
表11末端修复体系
体积(μL)
RNA样本 43
T4 PNK buffer 5
SUPERase*In RNase inhibitor(20U/μL) 1
T4 PNK(10U/μL) 1
2)震荡混匀，瞬时离心，PCR仪上反应：37℃，1h；70℃，10min。
3)向样本中加入NF-H2O，将样本体积补足至100μL，按下表12配制体系并混匀。
表12
试剂 使用量(μL)/样本
3M醋酸钠 13
Glycogen 2.5
无水乙醇 300
4)瞬时离心，置于-20℃放置1h以上。
5)4℃13000rpm离心15min，小心吸取上清。
6)加入500μL70％乙醇，13000rpm离心5min后弃上清。
8)重复第7步，尽可能吸走上清。
9)待沉淀晾干2min后，用7μL NF-H2O溶解样本。
6.接头连接
6.1试剂准备
所用试剂如表13所示，本申请建库部分涉及的试剂来源于NEB试剂盒，货号为NEB#E7300S。
表13
试剂 储存条件(℃)
3′SR Adaptor for Illumina(稀释4倍) -20
NF H2O 常温
3′Ligation Reaction Buffer(2X) -20
3′Ligation Enzyme Mix -20
SR RT Primer for Illumina(稀释一倍) -20
5′SR Adaptor for Illumina(denatured) -20
5′Ligation Reaction Buffer(10X) -20
5′Ligation Enzyme Mix -20
6.23’接头连接
1)将末端修复后的样本放入新的PCR管中，加入下列表14所示的反应体系，充分混匀。
表14
2)PCR仪70℃变性2min之后立即放冰上。
3)向上述体系中加入下列表15所示的反应液
表15
试剂 使用量(μL)
3′Ligation Reaction Buffer(2X) 5
3′Ligation Enzyme Mix 1.5
Total volume 14
4)25℃孵育1h，之后立即放冰上。
6.3反转录引物杂交(除游离3’接头)
1)将以下表16所示组分添加到连接混合物中并充分混合。
表16
试剂 使用量(μL)
SR RT Primer for Illumina(稀释一倍) 1.5
Total volume 15.5
2)反应条件如表17所示。
表17
温度 时间
75℃ 5min
37℃ 15min
25℃ 15min
4℃ Hold
6.4 5’接头连接
1)取1μL 5′SR adaptor(存放在-80℃)至新的PCR管中，70℃变性2min，之后立刻放置在冰上。
注意：第一次使用5′SR adaptor先离心，再加入120μL的DEPC水溶解，分装至PCR管中，每管10μL，放于-80℃储存。
1)向上管反应体系中加入下列表18所示反应溶液，充分混匀；
表18
试剂 使用量(μL)
5′SR Adaptor for Illumina(denatured) 0.5
5′Ligation Reaction Buffer(10X) 0.5
5′Ligation Enzyme Mix 1.25
Total volume 17.25
4)25℃孵育1小时，之后立刻放在冰上。
7.去除rRNA和tRNA
7.1去除rRNA
在上一步样本中添加1μL QIAseq FastSelect-rRNA HMR和1μL tRNA去除探针(1ng)，充分混匀，在热循环仪中执行以下表19所示程序：
表19
阶段 温度(℃) 时间(min)
1 75 2
2 70 2
3 65 2
4 60 2
5 55 2
6 37 2
7 25 2
8 4 Hold
7.2磁珠纯化
1)准备XP磁珠，提前取出，室温放置30min，使用之前旋涡振荡充分混匀，吸取110μL(2.2×)加入到50μL下机的样本中，用移液器吹打10次充分混匀，室温静置孵育5min；
2)将样品置于磁力架上，静置5min，待溶液澄清后，小心移除上清；
3)保持样品始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠(注意使用新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，且不要吹散磁珠)，室温孵育30s，小心移除上清；
4)重复上一步，总计漂洗磁珠2次；
5)保持样品始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠5min；应避免磁珠过分干燥(龟裂)而降低回收效率；
6)将样品从磁力架中取出，加入18μL NF-H2O，轻轻吹打10次充分混匀液体，室温静置5min。将样品置于磁力架上，静置5min(待溶液澄清)后，小心吸取18μL上清至一个新的nuclease-free PCR管中。
8.反转录
8.1试剂准备
所用试剂如表20所示，所用试剂来源于试剂盒(NEB，#E7300S)。
表20
试剂 储存条件(℃)
First Strand Synthesis Reaction Buffer -20(红盖)
Murine RNase Inhibitor -20(红盖)
ProtoScriptll Reverse Transcriptase -20(红盖)
8.2反转录
1)向5’接头连接产物中加入以下表21所示成分。
表21
试剂 使用量(μL)
First Strand Synthesis Reaction Buffer 4
Murine RNase Inhibitor 0.5
ProtoScriptll Reverse Transcriptase 0.5
Total volume 22.25
2)在50℃下孵育1小时，立即进行PCR扩增。
9.PCR富集
9.1试剂准备
所用试剂如表22所示。
表22
试剂 储存条件(℃)
LongAmp Taq 2X Master Mix(NEB，#E7300S) -20
SR Primer for Illumina(NEB，#E7300S) -20
Index(X)Primer(NEB，#E7300S) -20
Nuclease-Free Water 常温
9.2PCR富集
1)将以下表23所示组分添加到RT反应混合物中并混匀。
表23
试剂 使用量(μL)
LongAmp Taq 2X Master Mix 25
SR Primer for Illumina 1.5
Index(X)Primer 1.5
Nuclease-Free Water 2.5
Total volume 52.75
2)PCR循环条件如表24所示。
表24
3)Qubit定量并记录。
10.非变性PAGE切胶
1)配制12％的非变性PAGE，比例如表25所示。
表25
试剂 15mL胶用量 30mL胶用量
30％聚丙烯酰胺 6mL 12mL
10X TBE 1.5mL 3mL
ddH2O 7.5mL 15mL
10％过硫酸铵 75μL 150μL
TEMED 15μL 30μL
2)取50μL PCR产物加入10μL 6x loading buffer(NEB，#E7300S)，一板胶准备5μL20bp-500bp的Maker。
3)按需求对样本进行编号，依次点样。
4)150V电泳100min。
5)电泳完成后，将胶切角标记后取下，使用SYBR Gold染色5min，1：6000(30mL纯水+5μL SYBR Gold)。
6)切胶，范围140-160bp。将切取的胶转移至扎好孔的离心管中。
11.建库产物回收纯化
11.1耗材准备
取0.5mL离心管，用注射器针头在底部扎孔呈筛状，置于2mL离心管中。准备Spin-X过滤管。
11.2试剂准备
所用试剂如表26所示。
表26
试剂 储存条件(℃)
NF H2O 常温
3M醋酸钠 常温
Glycogen -20
无水乙醇 -20
80％乙醇 -20，现配现用
11.3回收纯化
1)将切下来的胶放入准备好的2mL离心管中(套0.5mL离心管)，4℃13000rpm离心5min。
2)向凝胶碎末中加入200μL EB(Gel Elution Buffer)，震荡器50℃1000rpm摇1h。
3)将上述溶液转移至Spin-X离心过滤管中，4℃13000rpm离心10min。
4)按下表27加入试剂并充分混匀。
表27
试剂 使用量(μL)/样本
3M醋酸钠 13
Glycogen 2.5
无水乙醇 600
5)瞬时离心，置于-20℃放置1h以上。
6)4℃13000rpm离心15min，小心吸取上清。
7)加入1000μL 70％乙醇，13000rpm离心5min后弃上清。
8)重复第7步，尽可能吸走上清。
9)用11μL EB溶解DNA沉淀，轻柔吹吸20次促进溶解。
10)Qubit定量并记录，在每个文库管盖上写上文库名称，将文库稀释至1ng/μL，取20μL稀释液送库检。
上述核糖体图谱分析文库的建库过程示意图如图1所示。
实施例4
选择小鼠脏器组织样本，利用实施例3所示的方法进行测试，结果如表28所示，结果显示数据中tRNA片段的残留效果显著被清除掉，降低了无效数据的产出，小鼠脏器组织样本中tRNA片段残留维持在10％以下。
表28：小鼠组织样本tRNA去除探针序列有效性测试结果
实施例5
利用实施例3所示的方法对鼠相关细胞和组织进行测试，结果显示tRNA探针的去除效果表现超出预期，有效性上非常高，可以使tRNA的片段残留维持在10％以内，具体实验结果如表29所示。
表29
样本类型 rRNA占比 tRNA占比 rRNA+tRNA占比 coding％
小鼠睾丸组织 43.45％ 5.05％ 48.50％ 72.74％
小鼠睾丸组织 50.50％ 6.52％ 57.02％ 74.92％
实施例6
利用上述实施例3所示的方法对21个小鼠样本进行测试，使用21只小鼠不同脏器组织进行Riboseq，每组分别使用和不使用tRNA探针，对比实验数据中rRNA和tRNA残留数据结果汇总后的结果如图2所示。加入tRNA探针的样本中tRNA的含量下降明显。对于rRNA残留的降低，申请人推测是上述tRNA探针还能够与部分残留的rRNA结合，从而实现在去除tRNA的同时也去除部分rRNA的预料不到的技术效果。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：利用上述能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的tRNA去除探针，包括但不限于SEQ IDNO：2所示的tRNA去除探针，或利用上述去除方法或试剂盒，均能够去除核糖体图谱分析中被核糖体保护的tRNA片段，提高Ribo-seq文库的有效数据的比例。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种核糖体图谱分析中RNA片段的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：利用tRNA去除探针与核糖体图谱分析样本结合，所述tRNA去除探针与所述RNA片段中的tRNA片段形成双链RNA结构，通过去除所述双链RNA结构实现对于所述tRNA片段的去除；
所述tRNA去除探针包括能够与SEQ ID NO：1所示的保守序列特异性结合的序列。
2.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述tRNA去除探针包括由脱氧核糖核苷酸组成的DNA序列；
优选地，所述tRNA去除探针包括含有SEQ ID NO：2所示序列的序列；
优选地，所述tRNA去除探针的5’端为SEQ ID NO：2所示序列。
3.根据权利要求2所述的tRNA去除探针，其特征在于，所述tRNA去除探针为SEQ ID NO：2所示的序列。
4.根据权利要求1所述的tRNA去除探针，其特征在于，所述tRNA去除探针的核糖核苷酸上具有锁核酸修饰。
5.根据权利要求1项所述的tRNA去除探针，其特征在于，所述tRNA去除探针的长度为18-29nt。
6.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于，去除所述双链RNA结构的方法包括利用磁珠、RNA酶、层析柱或过滤膜中的一种或多种去除所述双链RNA结构。
7.根据权利要求1所述的去除方法，其特征在于，所述去除方法包括：在核糖体图谱分析文库的建库过程中，将所述tRNA去除探针与连接有测序接头的所述核糖体图谱分析样本结合；
所述核糖体图谱分析文库的建库过程包括：
将细胞或组织样本进行裂解，利用翻译抑制剂固定核糖体，获得核糖体固定样本；
利用RNA酶消化所述核糖体固定样本，纯化获得核糖体保护片段；
将所述核糖体保护片段进行末端磷酸化和测序接头连接，获得所述连接有测序接头的所述核糖体图谱分析样本；
将所述tRNA去除探针与所述连接有测序接头的所述核糖体图谱分析样本结合，去除所述双链RNA结构，获得去除tRNA样本；
将所述去除tRNA样本进行反转录、PCR富集和纯化，获得去除tRNA片段的所述核糖体图谱分析文库。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的去除方法，其特征在于，所述去除方法还包括利用用于去除rRNA的探针，去除所述RNA片段中的rRNA片段。
9.根据权利要求8所述的去除方法，其特征在于，所述tRNA去除探针与所述用于去除rRNA的探针同时与所述核糖体图谱分析样本结合，所述tRNA去除探针与所述tRNA片段形成第一双链RNA结构，所述用于去除rRNA的探针与所述rRNA片段形成第二双链RNA结构，同时去除所述第一双链RNA结构和所述第二双链RNA结构。
10.权利要求1至9中任一项所述的去除方法在核糖体图谱分析或核糖体保护tRNA分析中的应用。
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