CN116836244A - 赤羽病毒akav/jl/2022的全基因组序列及其扩增引物 - Google Patents
赤羽病毒akav/jl/2022的全基因组序列及其扩增引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列及其扩增引物。本发明获得了赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列，有利于赤羽病毒的致病机制、分子流行病学、遗传学等的进一步研究，对赤羽病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等工作奠定了重要的数据支持和理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列及其扩增引物。
背景技术
赤羽病又称先天性关节弯曲-积水性无脑综合症(ArthrogryposisHydraencephaly，AH)。它通过吸血节肢动物媒介传播，临床上以牛和羊流产、早产、产死胎、新生胎儿畸形等异常生产为主要症状的虫媒性传染病，也称为阿卡斑病(AkabaneDisease)。赤羽病病毒又称阿卡斑病毒(Akabane virus)，属于布尼病毒科(Bunyaviridae)，布尼病毒属(Orthobunyavirus)，辛波病毒群(Simbuserogroup)。赤羽病毒AKAV的基因组为单股负链RNA，并含有3个核衣壳。核衣壳由大量的核衣壳蛋白和少量的大蛋白分别包裹大(Large)、中(Medium)、小(Small)3种RNA而成。测序和系统发育分析发现，在3个RNA片段中，编码诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体糖蛋白的M片段在分离毒株中是最可变的，编码核衣壳蛋白和非结构蛋白的S片段高度保守。有研究表明，病毒通过非结构蛋白与载体或宿主的免疫系统作用，从而造成疫病的发生。目前发现的AKAV只有1个血清型，但基于S片段序列，AKAV分离株被分为4个基因群(Ⅰ-Ⅳ),其中Ⅰ型基因群又可划分为Ⅰa和Ⅰb，分子量300-400×106，沉淀系数350-475S。在高浓度NaCl和pH6.1条件下，可凝集鸽、鸭和鹅的红细胞，但不能凝集人、羊、牛、豚鼠及1日龄的雏鸡的红细胞。病毒表面的糖蛋白突起不明显。赤羽病毒不耐热，对乙醚、氯仿、酸(pH3)敏感，不能过50nm滤膜。赤羽病毒为嗜神经性病毒，乳鼠对该病毒易感性最高，接种后出现神经病变。
发明内容
第一方面，本发明提供了赤羽病毒AKAV/JL/2022的蛋白质，包括以下至少一种氨基酸残基序列：
(1)如SEQ ID No.1所示的L基因的氨基酸残基序列；
(2)如SEQ ID No.2所示的M基因的氨基酸残基序列；
(3)如SEQ ID No.3所示的S基因的氨基酸残基序列。
该毒株为蚀斑克隆纯化分离培养所得的赤羽病病毒流行株，通过对大量毒株的筛选，发现了该毒株能够在细胞中稳定传代，经过MDBK细胞传代15代后，毒力变化较小，致病性强，免疫原性好，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，具有疫苗制备和赤羽病防控的巨大潜力。该毒株的具体信息已公开于CN2023100368830中。
该毒株已于2022年12月25日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101，分类命名：赤羽病毒，保藏编号为CGMCC No.45375。
本发明的赤羽病毒原代毒株分离自吉林赤羽病阳性牛采集的胎衣组织。
第二方面，本发明提供了编码上述蛋白质的核酸序列。
优选地，所述核酸序列包括：
L基因的编码序列：SEQ ID No.4所示序列中自5’端第31bp-6786bp的序列；和/或，
M基因的编码序列：SEQ ID No.5所示序列中自5’端第23bp-4228bp的序列；和/或，
S基因的编码序列：SEQ ID No.6所示序列中自5’端第34bp-735bp的序列。
优选地，所述核酸序列包括：如SEQ ID No.4所示的L基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.4杂交的核酸序列。
优选地，所述核酸序列包括：如SEQ ID No.5所示的M基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.5杂交的核酸序列。
优选地，所述核酸序列包括：如SEQ ID No.6所示的S基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.6杂交的核酸序列。
本发明的高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、以及1％SDS的溶液中，60～70℃条件下杂交并洗膜，优选为65℃。
本发明的SEQ ID No.4所示序列由6869个核苷酸组成，自5’端第31bp-6786bp(6756bp)为编码序列，编码2252个氨基酸。
本发明的SEQ ID No.5所示序列由4309个核苷酸组成，自5’端第23bp-4228bp(4206bp)为编码序列，编码1402个氨基酸。
本发明的SEQ ID No.6所示序列由856个核苷酸组成，自5’端第34bp-735bp(702bp)为编码序列，编码234个氨基酸。
第三方面，本发明提供了赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列，其包括上述SEQID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列；或在高严谨条件下可与SEQ ID No.4～6所示序列杂交的核酸序列。
第四方面，本发明进一步提供了扩增上述全基因组序列的引物组合物，包括：
扩增S1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.7所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.8所示序列；
扩增M1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.9所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.10所示序列；
扩增M2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.11所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.12所示序列；
扩增M3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.13所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.14所示序列；
扩增M4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.15所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.16所示序列；
扩增L1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.17所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.18所示序列；
扩增L2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.19所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.20所示序列；
扩增L3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.21所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.22所示序列；
扩增L4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.23所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.24所示序列；
扩增L5核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.25所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.26所示序列；
扩增L6核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.27所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.28所示序列；
扩增L7核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.29所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.30所示序列；
扩增L8核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.31所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.32所示序列。
第五方面，本发明还提供了获得上述赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组序列的方法，包括：
(1)提取赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA；
(2)以RNA为模板，在上述引物组合物的引导下，通过RT-PCR扩增赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组序列的13个核苷酸序列片段，分别为S1(856bp)、M1(1144bp)、M2(1459bp)、M3(1224bp)、M4(541bp)、L1(1210bp)、L2(1326bp)、L3(918bp)、L4(848bp)、L5(964bp)、L6(993bp)、L7(1090bp)、L8(956bp)；
(3)将含3’与5’端的目的核苷酸序列片段回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌后进行测序，剩余的8个目的核苷酸序列片段回收后直接测序；
(4)将所述总RNA构建文库进行高通量测序；
(5)用生物信息学软件将步骤(3)中获得的13个核苷酸序列片段的RNA序列重叠部分进行拼接、编辑及校正，获得一代测序结果；
再将步骤(4)中获得的高通量测序的原始数据根据参考序列与接头引物进行拼接、编辑及校正，获得二代测序结果；
最后利用一代测序结果补全二代测序结果。
优选地，RT-PCR的程序为：48℃～52℃反转录25～35min；92℃～97℃预变性1～3min；92℃～97℃变性1min以内；54℃～58℃退火1min以内(优选Tm-5℃)；70～74℃延伸30s～90s，所述变性、退火和延伸循环30～40次，最后70～74℃延伸5～15min。
优选地，RT-PCR的体系为50μL：总RNA2μL、2×1 Step Buffer(Dye Plus)25μL、Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2.0μL、上游引物(10μM)1.0μL、下游引物(10μM)1.0μL、无核酸水(Nuclease-free Water)19μL。
第六方面，本发明还提供了所述的蛋白质、或所述的核酸序列、或所述的全基因组序列、或所述的引物组合物、或所述的方法在制备赤羽病毒诊断试剂或制备预防或治疗赤羽病毒药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明获得了赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列，有利于赤羽病毒的致病机制、分子流行病学、遗传学等的进一步研究，对赤羽病毒的诊断试剂开发、疫苗研制等工作奠定了重要的数据支持和理论基础。
附图说明
图1是本发明提供的赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因的13个核苷酸序列片段RT-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
图2是本发明提供的赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因序列编码序列(CDS)二代测序圈图谱。
图3是本发明提供的赤羽病毒AKAV/JL/2022与NCBI赤羽病毒参考毒株L基因的遗传进化树。
图4是本发明提供的赤羽病毒AKAV/JL/2022与NCBI赤羽病毒参考毒株M基因的遗传进化树。
图5是本发明提供的赤羽病毒AKAV/JL/2022与NCBI赤羽病毒参考毒株S基因的遗传进化树。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
下述实施例中的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
实施例
1、设计用于RT-PCR扩增赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因13个核苷酸序列片段的引物组合:
根据NCBI中赤羽病毒参考毒株的L基因核苷酸序列，如GenBank：MW822046.1、KR260716.1、MH735054.1、MH484339.1、LC552052.1、JQ308779.1、AB968525.1、MT761689.1、MZ547650.1、KY284021.1、MH174979.1、KY381282.1；M基因核苷酸序列，如GenBank：MW822047.1、LC217500.1、KY381278.1、MH174978.1、AB297820.1、AB289322.1、AB297831.1、KY284022.1、FJ498799.1、AB297840.1；S基因核苷酸序列，如GenBank：MW822048.1、KR260714.1、AB289320.1、AB289321.1、LC552050.1、LC217464.1、LC217482.1、LC217486.1、AB968527.1、AF034942.1、KY284023.1、MT755621.1、MK783270.1；应用生物信息学DNA Star软件进行分析、比对、筛选和优化，最终确定将赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列分成13个核苷酸序列片段S1(856bp)、M1(1144bp)、M2(1459bp)、M3(1224bp)、M4(541bp)、L1(1210bp)、L2(1326bp)、L3(918bp)、L4(848bp)、L5(964bp)、L6(993bp)、L7(1090bp)、L8(956bp)，分别在保守序列区域内设计RT-PCR扩增13个核苷酸序列片段的引物组合，经分析、比对、筛选和优化，最终确定的引物序列如表1所示。其中，由于M基因可变，L基因片段较大，设计过程中设计了很多对引物组合对M基因和L基因进行扩增，经过大量组合筛选后最终发现下表中的M基因片段引物组合与L基因片段引物组合扩增后的产物目的片段单一，非特异性条带较少。
表1
2、获得赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列：
(一)赤羽病毒AKAV/JL/2022接毒Vero细胞扩大培养，细胞培养约45h左右至80％面积脱落时收毒。TCID50测毒价，留存TCID＞5.5细胞毒，反复冻融三次。10000×g离心15min，收集上清22000×g4℃离心2h弃上清，收集沉淀提取赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA，具体步骤为：
按照AxyprepTM Body Fluid Viral RNA/RNAMiniprep Kit(购自AXYGEN公司)说明书，提取赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA，具体步骤如下：
(1)试剂准备：预先配制含1％(V/V)冰乙酸的异丙醇；分别在试剂Buffer W1A和Buffer W2中添加指定体积的无水乙醇。即，24mL Buffer W1A中加入17mL无水乙醇；24mLBuffer W2中加入56mL无水乙醇。
(2)取1mL待检样品(赤羽病毒AKAV/JL/2022在非洲绿猴肾细胞(Vero)上培养得到的毒液)加入1.5mL离心管中按步骤1处理。
(3)加入200μL Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，静置5min。
(4)加入75μL Buffer V-L，涡旋振荡混合均匀，12000rpm离心5min。
(5)将上清转移至新的2mL离心管(试剂盒内提供)中，加入300μL异丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均匀。
(6)将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，取步骤(5)中的混合液移入制备管中，6000rpm离心1min。
(7)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500μL Buffer W1A，室温静置1min，12000rpm离心1min。
(8)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800μL Buffer W2，12000rpm离心1min。
(9)弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，12000rpm离心1min。
(10)将制备管置于洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加40μL无酶水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱RNA，-20℃冻存备用。
(二)RT-PCR扩增赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组的13个核苷酸序列片段
将步骤1提取的赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA作为模板，在上述引物组合的引导下，用RT-PCR扩增赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组的13个核苷酸序列片段，具体步骤如下：
(1)按照Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(Dye Plus)试剂盒(购自TaKaRa公司)说明书中的试剂比例配制反应体系，具体组分体系如表2所示。
表2
| 试剂名称 | 体积(μL) |
| 2×1 Step Buffer(Dye Plus) | 25 |
| Prime Script 1 Step Enzyme Mix | 2 |
| 上游引物(Forward Primer，10μM) | 1 |
| 下游引物(Reverse Primer，10μM) | 1 |
| 总RNA | 2 |
| Nuclease-free Water | 19 |
| 总体积 | 50 |
(2)将上述配置好的试剂进行RT-PCR扩增，RT-PCR反应程序如表3所示。
表3
(三)将含3’与5’端的目的核苷酸序列片段回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，剩余的8个目的核苷酸片段回收后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。具体步骤为：
A.回收含3’与5’端的目的核苷酸序列片段
将步骤(二)RT-PCR扩增的赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组的13个核苷酸序列片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1(S1(856bp)、M1(1144bp)、M2(1459bp)、M3(1224bp)、M4(541bp)、L1(1210bp)、L2(1326bp)、L3(918bp)、L4(848bp)、L5(964bp)、L6(993bp)、L7(1090bp)、L8(956bp))所示，RT-PCR扩增的13个目的核苷酸序列片段与预期相符。按照Thermo Scientific Gene JET Gel Extraction Kit试剂盒(购自Thermo Fisher公司)说明书，回收并纯化13个目的核苷酸序列片段，具体步骤如下：
(1)试剂准备：向Wash Buffer中添加指定体积(具体为9mL中加入45mL无水乙醇)的无水乙醇。
(2)在紫外灯下，用干净的刀片切下含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块，将其放入1.5mL灭菌离心管中(先称空的1.5mL离心管重量，然后再称放入琼脂糖凝胶块的1.5mL离心管重量)。
(3)称量琼脂糖凝胶块重量，按1mg＝1μL计算琼脂糖凝胶块的体积。
(4)向盛有胶块的1.5mL离心管中，加入1:1凝胶体积量(琼脂糖凝胶浓度为1％)的Binding Buffer。
(5)均匀混合后，60℃溶解胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解(约5-10分钟)。
(6)将试剂盒中的Gene JET Purification Column安置于收集管上。
(7)Gene JET Purification Column中加入100Binding Buffer室温静置1min，10000rpm离心1min，弃滤液，后将步骤(5)的溶液转移至Gene JET Purification Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
(8)将700μL的Wash Buffer加入Gene JET Purification Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。
(9)重复步骤(8)。
(10)将Gene JET Purification Column安置于收集管上，12000rpm离心1min。
(11)将Gene JET Purification Column安置于新的1.5mL的离心管上，在GeneJET Purification Column膜中央处加入30uL灭菌水或Elution Buffer，室温静置1min。
(12)12000rpm离心一分钟洗脱DNA。
B.连接目的基因片段
将步骤A回收纯化的3’与5’目的核苷酸序列片段分别连接到载体(购自Life technologies invitrogen公司)中，按照/>载体说明书中的试剂比例配制反应体系，反应体系如表4所示。
表4
将表4中的各种试剂加入0.2mL离心管中，轻轻混匀，室温连接30min。反应结束后将PCR管置于冰上冷却。
C.转化
将3’与5’目的核苷酸序列片段的连接产物分别转化到E.Coli JM109感受态细胞(购自TaKaRa公司)中，具体步骤如下：
(1)将E.Coli JM109感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。
(2)42℃热激45s，迅速置于冰上2-5min。
(3)加入800μL SOC液体培养基(购自TaKaRa公司)，37℃、150rpm振荡培养1h，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
(4)取200μL步骤(4)中的菌液，转移到含50μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，均匀涂板，待全部菌液被吸收后，37℃温箱倒置培养12-14h。
D.筛选阳性克隆
挑取LB琼脂平板上长出的白色单一菌落，分别接种于3mL LB液体培养基中(含50μg/mL氨苄青霉素)，37℃、180rpm振摇过夜(12-16h)。选取阳性单克隆菌，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。剩余的8个目的核苷酸片段回收后直接送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
(四)将提取到的赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA送探普股份有限公司建文库进行高通量测序，结果如图2所示。
图2中，CDS：组装序列注释后的cds片段；GC content：组装序列上的GC含量变化展示(根据序列长度选择不同长度的滑窗；contig长度＜10000，滑窗长度为50；contig长度＜100000，滑窗长度为500)；GC skew+/-:GC含量偏移量，GC skew＝(G-C)/(G+C)，用来衡量G和C的相对含量，如果G大于C则GC skew的值为正值，G小于C则为负值。
(五)用生物信息学软件依次将步骤(三)中得到的13个核苷酸序列片段：S1(856bp)、M1(1144bp)、M2(1459bp)、M3(1224bp)、M4(541bp)、L1(1210bp)、L2(1326bp)、L3(918bp)、L4(848bp)、L5(964bp)、L6(993bp)、L7(1090bp)、L8(956bp)的RNA序列重叠部分进行拼接、信息编辑及校正分析，再将步骤(四)中得到的二代测序原始数据根据参考序列与接头引物进行拼接、信息编辑及校正分析。利用步骤(三)测序结果补全验证步骤(四)的测序结果，得到赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列，如序列表中SEQ ID No.4-6所示，序列表中的SEQ ID NO.4为L基因序列，其由6869个核苷酸组成，自5’端第31bp-6786bp(6756bp)为编码序列，编码2252个氨基酸。序列表中的SEQ ID NO.5为M基因序列，其由4309个核苷酸组成，自5’端第23bp-4228bp(4206bp)为编码序列，编码1402个氨基酸。序列表中的SEQ ID NO.6为S基因序列，其由856个核苷酸组成，自5’端第34bp-735bp(702bp)为编码序列，编码234个氨基酸。其中，本发明发现采用二代测序获得的测序结果是有缺漏的，准确率存在缺陷，因此通过一代克隆测序，得到准确有效的参考序列后，进一步结合二代测序结果进行拼接，拼接过程中对大量碱基进行校准，最终获得了上述全基因组序列。
将赤羽病毒AKAV/JL/2022与NCBI(美国国家生物技术信息中心)中赤羽病毒参考毒株全基因组序列制作遗传进化树，结果如图3-5所示，可以看出赤羽病毒AKAV/JL/2022与参考毒株位于同一分支内，表明赤羽病毒AKAV/JL/2022属于AKAV，证明赤羽病毒AKAV/JL/2022同ISR-170/18同源性最高。
试验例
2.1赤羽病毒种毒的制备
取生长至良好单层的MDBK贴壁细胞，弃掉原有培养液，按0.5％-2％(v/v)的比例加入AKAV/JL/2022毒株F9病毒液，于37℃条件下培养，当细胞病变≧80％时，收获病毒液并冻融3次，即为基础种毒，将此基础毒种用DMEM培养液作10倍系列稀释，取102-106共5个稀释度，接种长成单层的MDBK细胞96孔板，每个稀释度分别接种4孔，每孔加100ul稀释液，然后补加100ul的DMEM，同时设置阴、阳性对照。37℃，5％CO2培养箱中培养5天，显微镜下观察细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID50。经计算该毒种的病毒含量不低于106TCID50/ml。
2.2制苗用病毒液的纯净性检验
按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明该基础毒种无细菌、支原体和外源病毒污染。
2.3制苗用病毒液的灭活
使用0.25‰的β-丙内酯在转速为80-100r/min的摇床上4℃灭活24h，室温再次灭活24小时以水解残余的β-丙内酯，获得灭活病毒液。将灭活病毒液用DMEM培养液稀释后，按照培养液10％(V/V)的比例接种于生长良好的MDBK贴壁细胞，置37℃、含5％CO2培养箱中培养5日，逐日观察，将培养物于-80℃冻融3次后，按上述方法盲传3代，观察每代培养物CPE。结果表明均无CPE产生，确定灭活完全。
2.4疫苗制备
(1)水相的制备：将灭活病毒液加热至31±1℃备用。
(2)油相的制备：采用油佐剂，预热至31±1℃备用。
(3)乳化：将油相和水相按质量比为佐剂︰水相＝1︰1的比例配比。具体操作为：将佐剂进料到乳化缸中，在搅拌条件下，将水相正压缓慢进料到乳化缸中，于30-33℃搅拌30min至水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗。随后定量分装，加盖密封，贴签，置2～8℃保存。
2.5疫苗产品检测
(1)外观：乳白色略带粘滞性乳状液。
(2)剂型：水包油包水型。
(3)稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不多于0.5ml。
(4)黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
(5)装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。
(6)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
(7)安全检验：
用体重350～450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2ml；用体重18～22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.5ml。逐日观察7日，结果均不出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应。
2.6中和抗体效价检测
选取体重为350～450g的健康雌性豚鼠(赤羽病毒中和抗体效价不高于1:4)8只，随机分为2组。第一组4只豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0ml，作为免疫组；第二组4只豚鼠各腿部注射DMEM 1.0ml，作为对照组；21天后以同样方式加强免疫，二免后21天心脏采血，分离血清，测定赤羽病毒中和抗体效价水平，结果如表5所示。结果可见免疫组4只豚鼠血清中抗赤羽病毒中和抗体效价水平均不低于1:128，而对照组中和抗体效价均不高于1:2。
表5豚鼠血清中和抗体效价检测结果
以上结果表明，赤羽病毒AKAV/JL/2022制备的灭活疫苗免疫豚鼠后，能够诱导豚鼠产生高效价的抗赤羽病中和抗体(≥128)，因此该灭活疫苗能够长久有效地保护豚鼠免受赤羽病病毒的感染。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.赤羽病毒AKAV/JL/2022的蛋白质，其特征在于，包括以下至少一种氨基酸残基序列：
(1)如SEQ ID No.1所示的L基因的氨基酸残基序列；
(2)如SEQ ID No.2所示的M基因的氨基酸残基序列；
(3)如SEQ ID No.3所示的S基因的氨基酸残基序列。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，包括：
L基因的编码序列：SEQ ID No.4所示序列中自5’端第31bp-6786bp的序列；和/或，
M基因的编码序列：SEQ ID No.5所示序列中自5’端第23bp-4228bp的序列；和/或，
S基因的编码序列：SEQ ID No.6所示序列中自5’端第34bp-735bp的序列。
4.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，包括：
如SEQ ID No.4所示的L基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.4杂交的核酸序列。
5.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，包括：
如SEQ ID No.5所示的M基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.5杂交的核酸序列。
6.根据权利要求2所述的核酸序列，其特征在于，包括：
如SEQ ID No.6所示的S基因序列，或在高严谨条件下可与SEQ ID No.6杂交的核酸序列。
7.赤羽病毒AKAV/JL/2022的全基因组序列，其特征在于，包括权利要求4、5和6中所述的核酸序列。
8.扩增权利要求7所述全基因组序列的引物组合物，其特征在于，包括：
扩增S1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.7所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.8所示序列；
扩增M1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ ID No.9所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.10所示序列；
扩增M2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.11所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.12所示序列；
扩增M3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.13所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.14所示序列；
扩增M4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.15所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.16所示序列；
扩增L1核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.17所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.18所示序列；
扩增L2核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.19所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.20所示序列；
扩增L3核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.21所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.22所示序列；
扩增L4核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.23所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.24所示序列；
扩增L5核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.25所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.26所示序列；
扩增L6核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.27所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.28所示序列；
扩增L7核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.29所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.30所示序列；
扩增L8核苷酸序列片段的引物对，其上游引物含有SEQ IDNo.31所示序列，其下游引物含有SEQ ID No.32所示序列。
9.一种获得权利要求7所述的赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组序列的方法，其特征在于，包括：
(1)提取赤羽病毒AKAV/JL/2022的总RNA；
(2)以RNA为模板，在权利要求8所述的引物组合物的引导下，通过RT-PCR扩增赤羽病毒AKAV/JL/2022全基因组序列的13个核苷酸序列片段；
(3)将含3’与5’端的目的核苷酸序列片段回收、连接、转化，挑取阳性单克隆菌后进行测序，剩余的8个目的核苷酸序列片段回收后直接测序；
(4)将所述总RNA构建文库进行高通量测序；
(5)用生物信息学软件将步骤(3)中获得的13个核苷酸序列片段的RNA序列重叠部分进行拼接、编辑及校正，获得一代测序结果；
再将步骤(4)中获得的高通量测序的原始数据根据参考序列与接头引物进行拼接、编辑及校正，获得二代测序结果；
最后利用一代测序结果补全二代测序结果。
10.权利要求1所述的蛋白质、或权利要求2～6中任一项所述的核酸序列、或权利要求7所述的全基因组序列、或权利要求8所述的引物组合物、或权利要求9所述的方法在制备赤羽病毒诊断试剂或制备预防或治疗赤羽病毒药物中的应用。
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