CN116832140A - 使用多肽治疗白内障的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种能够溶解蛋白质聚集体的多肽。还提供了一种使用本文所提供的多肽治疗相分离相关疾病，如相分离相关视觉障碍(例如，白内障)的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为202210499226.5、申请日为2022年5月9日、发明名称为“使用多肽治疗白内障的方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请要求于2022年2月9日提交的国际申请PCT/CN2022/075738的优先权和权益。
技术领域
本发明总体上涉及相分离相关疾病，如白内障。具体而言，本发明涉及用于溶解和/或防止晶体蛋白聚集体，如βD-晶体蛋白聚集体、γD-晶体蛋白聚集体或其组合形成的组合物和方法。
背景技术
白内障是世界范围内导致失明和严重视力损害的第一大原因。晶状体是眼睛屈光系统的重要部分。如果由于各种原因导致部分或全部晶状体混浊，则会产生白内障。国际公认的快速且有效的白内障治疗是外科手术，其中患者的浑浊晶状体被移除并再植入人工晶状体。然而，一般而言，外科手术治疗的成本是相对高的，这对患者而言是很大的经济负担。随着人类预期寿命的延长和人口老龄化的出现，这个问题更加突出。
因此，需要针对白内障的有效、安全且价廉的治疗。
发明内容
本文提供了用于使用能够逆转相分离的多肽治疗相分离相关疾病(例如，相分离相关视觉障碍，如白内障)的方法。
一方面，本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关疾病的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体，所述多肽包含亲水区段和疏水区段，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够逆转相分离。
在某些实施方式中，所述相分离相关疾病是相分离相关视力障碍。
在某些实施方式中，所述相分离相关视力障碍是白内障。
在某些实施方式中，所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；
X1LX1X1X1SX1X1X1VX1X1X1QX1X1X1(SEQ ID NO:12)；
X1X1X1VX1X1X1X1X1VX1X1(SEQ ID NO:13)；以及
X1X1SX1VQX1LX1(SEQ ID NO:14)，
其中每个X1分别为Asp、Glu、Lys或Arg。
在某些实施方式中，所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEER(SEQ ID NO:15)；
TDPQDDSDDDVDDPDDR(SEQ ID NO:16)；
TKPQKKSKKKVKKPKKR(SEQ ID NO:17)；
TRPQRRSRRRVRRPRRR(SEQ ID NO:18)；
ELDEESEDEVEEEQEDR(SEQ ID NO:19)；
KEEVDEDRDVDE(SEQ ID NO:20)；以及
EKSEQDLE(SEQ ID NO:21)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在某些实施方式中，所述疏水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)；
ANSAYYDAHPVTNGI(SEQ ID NO:23)；
PPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:24)；以及
EGEVAEEPNSRP(SEQ ID NO:25)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在某些实施方式中，所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)(RJK001)；
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)(RJK002)；
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)(RJK012)；
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；
ELDEESEDEVEEEQEDRQPSPEPVQENANSAYYDAHPVTNGIE(SEQ ID NO:8)；
KEEVDEDRDVDESSPQDSPPSKASPAQDGRPPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:9)；以及
EGEVAEEPNSRPQEKSEQDLE(SEQ ID NO:10)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在某些实施方式中，所述亲水区段的长度为10-17个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少60％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-12个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少35％为Tyr、Phe、Leu或Val，并且
其中所述多肽的长度为20-28个氨基酸残基。
在某些实施方式中，所述亲水区段具有以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)，
其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
在某些实施方式中，所述疏水区段具有以下序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在某些实施方式中，所述多肽包含以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1RQQTPX1VVPDDSGTFYDQTVSNDLX1(SEQ ID NO:31)，
其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
在某些实施方式中，所述多肽与细胞穿透肽融合。
在某些实施方式中，所述细胞穿透肽包含选自由以下组成的组的序列：
GGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:26)；
RQIKIWFQNRRMKWKKK(SEQ ID NO:27)。
在某些实施方式中，所述细胞穿透肽融合在所述多肽的N末端或C末端处。
在某些实施方式中，所述多肽进一步与接头融合。
在某些实施方式中，所述连接子包含选自由以下组成的组的序列：
SGRPVL(SEQ ID NO:28)；
GAPGSAGSAAGGSG(SEQ ID NO:29)；以及
ENLVFQG(SEQ ID NO:30)。
在某些实施方式中，所述多肽进一步与his标签融合。
在某些实施方式中，所述多核苷酸是DNA或RNA。
在某些实施方式中，所述载体是病毒载体。
在某些实施方式中，所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体经口、静脉内、肌内、肠内、眼内、视网膜下、玻璃体内、局部、经眼(滴眼剂、插入物、注射液或植入物)、舌下、直肠或通过注射、鼻喷雾或吸入施用。
在某些实施方式中，所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体经眼(滴眼剂、插入物、注射液或植入物)施用。
在某些实施方式中，所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体被调配为眼用溶液、眼用软膏、眼用洗液、眼内输注溶液、前房用洗液、内服药、注射液、玻璃体内注射液、前房注射液、蛛网膜下注射液或提取角膜的防腐剂。
另一方面，本文还提供了一种用于溶解晶体蛋白聚集体和/或防止在细胞中形成晶体蛋白聚集体的方法，所述方法包括向所述细胞中引入包含亲水区段和疏水区段的多肽。
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够抑制相分离。
在某些实施方式中，所述晶体蛋白聚集体是βD-晶体蛋白聚集体、γD-晶体蛋白聚集体或其组合。
另一方面，本文还提供了一种用于治疗相分离相关疾病(例如，白内障)的试剂盒，所述试剂盒包含治疗有效量的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体、药学上可接受的载体的调配物以及施用所述调配物的说明书，使得所述施用治疗所述相分离相关疾病，
其中所述多肽包含亲水区段和疏水区段，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够抑制相分离。
另一方面，本文还提供了一种用于抑制或逆转晶体蛋白相分离的方法，所述方法包括使所述晶体蛋白与包含亲水区段和疏水区段的多肽接触，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基。
在某些实施方式中，所述晶体蛋白聚集体是βD-晶体蛋白聚集体、γD-晶体蛋白聚集体或其组合。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，结合本文中所呈现的具体实施方式的详细说明，可以更好地理解本公开。
图1示出了多肽Champ-E、Champ-D、Champ-K和Champ-Q对体外溶解G3BP1-GFP蛋白聚集体的影响。
图2示出了晶体蛋白的相分离是可逆状态。左，右，在室温(25℃)下；中间，在4℃下。
图3示出了通过考马斯亮蓝染色验证的经纯化的人全长γD-晶体蛋白。
图4示出Champ-E(RJK001)肽抑制γD-晶体蛋白的相分离。
图5示出了γD-晶体蛋白的1H-15N HSQC光谱。记录二维[1H-15N]异核单量子相干(HSQC)光谱以确定在残基特异性水平下的结构域相互作用。
图6示出了仅300μM 15NγD-晶体蛋白(深灰色)以及在存在摩尔比(γD-晶体蛋白:RJK001)为1:2的RJK001(浅灰色)的情况下的2D 1H-15N HSQC光谱的叠加。获取HSQC光谱并使用ccpNMR进行分析。
图7示出了在存在摩尔比(γD-晶体蛋白:RJK001)为1:2的RJK001的情况下γD-晶体蛋白之间的残基特异性化学位移偏差(CSD)，表明在用RJK001滴定后，显著的化学位移差异分布在整个链上。
图8示出了γD-晶体蛋白与RJK001相互作用的示意图(数据重构)。化学位移差异高于0.1的氨基酸在结构(2KFB)中突出显示，箭头表明晶体蛋白与RJK001的相互作用。
图9示出了与细胞穿透肽融合的RJK001和RJK012肽在体外对G3BP1蛋白解聚的定量影响。
图10示出了与细胞穿透肽融合的Champ肽转移到真核细胞中的比率和半衰期。
图11示出了Champ肽(例如，RJK001和RJK012)影响真核细胞中γD(W43R)聚集的实时成像和分析。
图12示出了用RJK001肽处理的白内障人晶状体裂解物的照片，示出了晶状体清晰度增加。
图13示出了Champ肽在体外通过ThT荧光对来自不同程度的人白内障患者(例如，C1N2P0)的晶体蛋白聚集体的再溶解的影响。DM：糖尿病。晶状体混浊分类：C：皮质；N：核；P：后晶状体囊。
图14示出了来自人白内障患者的可溶性晶体蛋白通过与Champ-E(RJK001)肽而非蛋白质缓冲液共同温育而增加。通过对细胞裂解物的上清液或不溶性级分进行蛋白质印迹分析，使用晶体蛋白的光密度测定法进行定量分析。
图15示出用C末端融合细胞穿透肽RJK001肽处理的人白内障晶状体的照片，示出了晶状体清晰度增加。
具体实施方式
在更详细地描述本公开之前，应理解的是，本公开不限于所描述的具体实施方式，并且因此当然可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅仅是出于描述具体实施方式的目的，并且不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本公开的实践或测试中，但是现在描述优选的方法和材料。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用的方式并入本文，就好像每个单独的出版物或专利都被具体地且单独地指示为通过引用的方式并入并且通过引用的方式并入本文以公开和描述引用出版物所结合的方法和/或材料。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本公开因先前的公开而无权先于此类出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际的公开日期不同，实际的公开日期可能需要单独确认。
如对于本领域技术人员将显而易见的是，在阅读本公开时，本文描述和展示的单独实施方式中的每一个均具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征可以在不偏离本公开的范围或精神的情况下易于与其它若干实施方式中的任何实施方式的特征分离或组合。任何所叙述的方法都可以按所叙述的事件顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行。
I.定义
应当理解的是，前述概括描述和以下详细描述都仅是示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的本发明在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。在本公开中，除非明确指示仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的，否则术语“或”用于意指“和/或”。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。此外，术语“包括(including)”以及如“包括(includes)”和“包括(included)”等其它形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则如“元件”或“组件”等术语涵盖包括一个单元的元件和组件以及包括多于一个亚单元的元件和组件两者。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
如本文所使用的，除非上下文清楚地另外指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”以及“所述”包括复数指示物。
如本文所使用的，术语“G3BP1”是指触发相分离以组装应力颗粒的可调开关，例如，响应于细胞内游离RNA浓度的升高触发RNA依赖性液-液相分离(LLPS)。
如本文所使用的，术语“施用”是指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医务专业人员施用和自我施用。
如本文所使用的，术语“氨基酸”是指含有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)官能团以及每个氨基酸特有的侧链的有机化合物。氨基酸名称在本公开中也以标准的单字母或三字母代码表示：
如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以预防、治疗、减轻和/或改善任何病症或疾病的症状和/或潜在原因的药剂的量，或足以对细胞产生所需效果的药剂的量。在一个实施方式中，“治疗有效量”是指足以减少或消除疾病症状的量。在另一个实施方式中，治疗有效量是足以战胜疾病本身的量。在某些实施方式中，本文提供的眼用药物调配物中的治疗有效量的本文提供的多肽在液体滴剂中的浓度相对较低，例如至少10-9M、至少0.5到1×10-8M、至少0.5到1×10-7M、至少0.5到1×10-6M、至少0.5到1×10-5M、至少0.5到1×10-4M、至少0.5到1×10-3M、至少0.5到1×10-2M、至少0.5到1×10-1M、或至少0.5到1M或落入这些值之间范围内的任何浓度(例如，10-9M到1M)，可以通过每天一次、两次、三次或多次应用来逆转此类视力障碍，而且效果很快。
术语“宿主细胞”意指已经被核酸序列转化或能够被转化并由此表达所关注的蛋白质的细胞。所述术语包括亲本细胞的后代，无论后代与原始亲本细胞在形态上或遗传构成上是否一致，只要存在所关注的基因即可。
如本文所使用的，术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)和其聚合物。除非另外指出，否则特定多核苷酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地说，简并密码子取代可以通过生成序列来实现，在所述序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见Batzer等人,《核酸研究(Nucleic Acid Res.)》19:5081(1991)；Ohtsuka等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人,《分子与细胞探测(Mol.Cell.Probes)》,8:91-98(1994))。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列，并且必要时引入空位以实现最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，在候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可以或可以不视为相同残基。可以使用公开可用的工具，如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,215:403-410(1990)；Stephen F.等人,《核酸研究》,25:3389-3402(1997),ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,酶学方法(Methods In Enzymology),266:383-402(1996)；Larkin M.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(英国牛津),23(21):2947-8(2007)以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现比对以确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比。本领域技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过选择合适的算法。
术语“多肽”或“蛋白质”是指由至少两个氨基酸通过肽键相互连接的链。多肽和蛋白质可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖基化的)和/或可以以其它方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“多肽”或“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)或可以是其功能部分。本领域普通技术人员将进一步理解，蛋白质有时可以包括多于一个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。所述术语还包括氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是对应天然存在的氨基酸的化学类似物以及聚合物。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”是指如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂或溶剂包封材料等涉及将主题化合物从身体的一个器官或部分承载或输送到身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒剂。在与调配物的其它成分相容并且对患者无害的意义上来讲，每种载剂必须是“可接受的”。可以充当药学上可接受的载剂的材料的一些实例包括：糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇以及聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及药物调配物中采用的其它无毒的相容物质。
本文所使用的术语“蛋白质聚集体”是指出现在细胞内或细胞外的蛋白质的聚集。在一些实施方式中，蛋白质是本质上无序的蛋白质或错误折叠的蛋白质。在一些实施方式中，当蛋白质的浓度超过蛋白质的溶解度时产生聚集。在一些实施方式中，蛋白质的浓度超过热力学溶解度，但蛋白质通过异型相互作用的缓冲而保持在亚稳态类液态状态下。蛋白质亚稳态形式的紊乱会导致蛋白质溶解度丧失并导致蛋白质聚集。
如本文所使用的，术语“受试者”是指人类或任何非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人类包括出生前形式和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人类。受试者可以是患者，所述患者是指呈现给医疗提供者以进行疾病的诊断或治疗的人类。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换地使用。受试者可以患有或易于患上疾病或病症，但是可以表现或可以不表现出疾病或病症的症状。例如，受试者可能患有或有风险患上白内障。有风险患上白内障的受试者包括但不限于具有与白内障相关的突变的受试者、具有患白内障家族史的受试者、暴露于辐射的受试者和糖尿病患者等。
如本文所使用的，“治疗(Treating或treatment)”病状包括预防或减轻病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延迟与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。应当理解，“治疗”视力障碍不需要100％消除或逆转视力障碍。在某些实施方式中，与在不存在本文提供的眼用药物组合物或方法的情况下观察到的水平相比(例如，在未暴露于本文提供的眼用药物组合物或方法的生物学匹配的对照受试者或样本中)，通过本文提供的方法“治疗”视力障碍减轻、抑制、预防和/或逆转晶状体功能障碍(例如，晶状体核混浊(N)、皮质混浊(C)、后囊下混浊(P)和晶状体核颜色(NC))例如至少约5％、至少约10％或至少约20％。
如本文所使用的，“载体”是指引入到宿主细胞中由此产生经转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞(如复制起点)中进行复制的核酸序列。载体还可以包括一个或多个治疗基因和/或可选标记基因以及本领域中已知的其它基因元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此使细胞表达除对细胞来说天然的核酸和/或蛋白质之外的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞中的材料，如病毒颗粒、脂质体、蛋白质包衣等。
II.治疗相分离相关疾病的方法
相分离(也被称为相变)是最初源自物理化学的概念。相是指系统中具有完全统一的物理和化学特性的部分。当两相混合时，如将油滴入水中，将发生两相分离现象。对于组分复杂的细胞，某些蛋白质和核酸分子可以通过多价相互作用组合，由此自发地形成另一个物理和化学特性与原来环境不同的相——这种现象被称为“细胞内和生物相分离”。
Brangwynne和Hyman于2009年在研究秀丽新杆线虫(C.elegans)中的P微粒时，首次将“相分离”的概念引入到生物结构组装中以解释P颗粒的类液态行为(参见Brangwynne,Clifford P.等人,“种系P微粒是通过受控溶解/冷凝定位的液滴(Germline P granulesare liquid droplets that localize by controlled dissolution/condensation)”《科学(Science)》324.5935(2009):1729-1732)。近年来的研究表明，相分离在无膜细胞器、信号传导复合物、细胞骨架等的组装中起着重要作用，并且也已经在无膜细胞器中观察到相分离，所述无膜细胞器包括应激微粒、结构的核仁形成。生理相关条件的变化也可以改变相分离所形成的内稳态。在细胞中，相分离可能由例如饥饿诱导的pH降低、粘度变化或钙离子和其它高价阳离子浓度的增加、蛋白质本身表达水平的变化以及磷酸化修饰引起。对于如酵母和线虫等非等温生物体，温度变化也可能触发细胞内蛋白质相分离。换句话说，相分离在细胞中普遍存在。
特异性蛋白质的异常相分离可能形成更稳定但难以逆转的结构，并且可能是特定疾病的原因。有大量证据表明由相分离形成的无膜结构与疾病之间存在联系。早在20世纪70年代，科学家就提出白内障是一种相分离疾病，其分子机制是蛋白质聚集。
形成人晶状体的大部分蛋白质都是晶体蛋白，并且晶状体能否正常工作取决于这些晶体蛋白。晶体蛋白中最丰富的蛋白质是CRYAA和CRYAB，其在应力或损伤下产生并作为“分子伴侣”发挥作用，即识别晶状体中受损和错误折叠的蛋白质并与其相互作用以防止其凝结在一起。但随着年龄的增长，错误折叠的蛋白质越来越多，而这些分子伴侣本身就有问题并累积，所以蛋白质累积将越来越多，并且最终将形成白内障。
白内障是一种退行性疾病，其中晶状体的光学质量由于透明度降低或颜色变化而降低。衰老、遗传、局部营养失调、免疫和代谢异常以及创伤、中毒、辐射等都可能引起晶状体代谢障碍，并且各种导致晶状体混浊的原因都可能引起白内障。为了保持视力，晶状体必须对可见光保持透明。晶状体是无血管的，没有动脉或静脉循环。在成纤维细胞成熟过程中，细胞器，包括细胞核、线粒体、内质网、核糖体和其它细胞器，逐渐消失，由此减少光散射。晶状体表达在分化过程中高度上调，在成熟晶状体中达到90％。在250-400mg/ml的浓度下，晶体细胞的短程有序堆积有助于改善浓缩溶液的清晰度，而晶状体蛋白的多分散混合物避免了结晶。由于晶状体核内的成熟成纤维细胞缺乏去除和替换受损蛋白质所必需的蛋白质合成和降解机制，因此对晶状体蛋白的主要要求是在其天然构象中具有出色的溶解性和长期稳定性。
由于共价修饰(如蛋白水解活性、非酶修饰和氧化损伤)的累积，晶状体蛋白会随着时间的推移累积多肽链的不稳定性。晶体蛋白的蛋白质组学分析已经鉴定了若干种损伤相关的共价修饰，包括脱酰胺、氧化、糖基化和截短。由于共价修饰/损伤的长期累积导致的不稳定性可能会促进部分蛋白质去折叠，从而导致形成暴露先前埋藏的疏水残基并允许晶体蛋白相分离的中间构象。白内障发展的早期阶段与晶状体细胞质的相分离相关。
相分离是可逆的并且由相分离临界温度Tc表征，在所述温度下，细胞质经历从透明状态到混浊状态的转变。在清晰状态下，细胞质蛋白质组织中的短程布置允许细胞质以单一均质相的形式存在。在细胞内晶体蛋白修饰或损伤后，短程顺序被破坏，并且细胞质以两个独立的相的形式存在。在显微镜下，两相具有适当的尺寸和折射率差异，从而引起光的散射。光散射导致白内障疾病影响正常视觉功能的混浊度。通常，晶状体蛋白的Tc在正常生理条件下远低于体温，因此没有光散射并保持晶状体透明度。在白内障形成过程中，Tc升高到体温以上，因此在体温下，晶体蛋白发生相分离并且晶状体变得混浊。
最近的研究表明，大量晶体蛋白经受翻译后修饰、相互聚集和自我降解，导致晶体蛋白结构发生变化，并且这些变化的累积导致形成白内障。晶状体中90％的蛋白质是结构蛋白——晶体蛋白，包括α、β和γ三个家族。晶体蛋白的异常结构和功能以及聚集是白内障形成的重要原因。然而，直到现在，晶体蛋白保持透明或产生混浊的确切机制尚未被完全了解。
对于白内障的药物治疗，常用的可商购获得的药物主要分为两类：西药和传统中药。西药包括：1)醛糖还原酶抑制剂，如卡他林法考林(catalin facolin)、苄基赖氨酸等；2)抗氧化损伤药物，如谷胱甘肽、牛磺酸、阿司匹林等；3)营养代谢药物，如维生素、类胡萝卜素等。目前，临床仍迫切需要研发更有效的药物组合物，以有效治疗并预防白内障进展，尤其是老年性白内障。
2009年以来，对相分离蛋白的认识逐渐加深，并且也发现了一系列与相分离相关的疾病。这些疾病中的许多疾病没有有效的临床研究方法和药物。本公开根据相分离的致病特性直接将相分离与疾病治疗联系起来，这提供了治疗这些疾病的新思路。本公开提供了多肽作为干预蛋白质物理状态并达到治疗效果的药物的用途，这为生物物理药物的研究提供了起点。
一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关疾病的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的能够逆转相分离的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体。在某些实施方式中，所述相分离相关疾病是相分离相关视力障碍，如白内障。如本文所使用的，术语“白内障”是指表现出症状的疾病或病状，所述症状如引起晶状体表面和/或内部混浊或不透明和/或诱导晶状体肿胀，所述疾病或病状可以分为先天性白内障和获得性白内障(参见PDR Staff,“2013年PDR眼用药物(PDR of Ophthalmic Medicines 2013)”,《PDR网络(PDR Network)》,2012)。示例性先天性白内障包括但不限于先天性假性白内障、先天性膜性白内障、先天性板层白内障、先天性冠状白内障、先天性点状白内障和先天性丝状白内障。示例性获得性白内障包括但不限于继发性白内障、老年性白内障、褐变性白内障、复杂性白内障、外伤性白内障、糖尿病性白内障以及可由电击、辐射、药物、全身性疾病、超声和营养障碍诱导的其它白内障。示例性获得性白内障可以进一步包括术后白内障，其具有在封装有插入以治疗白内障的晶状体的后部中引起混浊的症状。在一些实施方式中，白内障是糖尿病性白内障、由暴露于辐射引起的白内障、由感染引起的白内障、与年龄相关的白内障、与外科手术相关的白内障、由遗传疾病引起的白内障或由药物引起的白内障。
另一方面，本公开提供了一种用于溶解蛋白质聚集体(例如，晶体聚集体(例如，γD晶体蛋白聚集体)、应激颗粒蛋白聚集体(G3BP1蛋白聚集体))和/或防止晶体蛋白聚集体(例如，晶体聚集体(例如，γD晶体蛋白聚集体)、应激颗粒蛋白聚集体(G3BP1蛋白聚集体))形成的方法，所述方法包括使所述蛋白质聚集体与能够逆转相分离的多肽接触。
另一方面，本公开提供了一种用于溶解蛋白质聚集体(例如，晶体聚集体(例如，γD晶体蛋白聚集体)、应激颗粒蛋白聚集体(G3BP1蛋白聚集体))和/或防止在细胞中形成晶体蛋白聚集体(例如，晶体聚集体(例如，γD晶体蛋白聚集体)、应激颗粒蛋白聚集体(G3BP1蛋白聚集体))的方法，所述方法包括向所述细胞中引入能够逆转相分离的多肽。
多肽、多核苷酸、载体
在一些实施方式中，多肽包含以下特性中的一项或多项：1)具有大于或等于30％的电荷；2)具有14％-26％的疏水性氨基酸以及大于或等于10％的极性氨基酸；以及3)长度为20-100个氨基酸。应当理解，带电荷的氨基酸可以相互替换，如E突变为D、或K或R等。
在一些实施方式中，多肽包含亲水区段和疏水区段，所述亲水区段的长度为10-20个(例如，11-19、12-18、13-17、14-16或15个)氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％(例如，至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％)为Asp、Glu、Lys或Arg，所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少30％(例如，至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％)为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，并且其中所述多肽的长度为20-60个(例如，25-55、30-50、35-45或40个)氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；X1LX1X1X1SX1X1X1VX1X1X1QX1X1X1(SEQ ID NO:12)；X1X1X1VX1X1X1X1X1VX1X1(SEQ ID NO:13)；以及X1X1SX1VQX1LX1(SEQ ID NO:14)，其中每个X1分别为Asp、Glu、Lys或Arg。
在一些实施方式中，所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：TEPQEESEEEVEEPEER(SEQ ID NO:15)；TDPQDDSDDDVDDPDDR(SEQ ID NO:16)；TKPQKKSKKKVKKPKKR(SEQ ID NO:17)；TRPQRRSRRRVRRPRRR(SEQ ID NO:18)；ELDEESEDEVEEEQEDR(SEQ ID NO:19)；KEEVDEDRDVDE(SEQ ID NO:20)；以及EKSEQDLE(SEQID NO:21)，或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方式中，所述疏水区段具有选自以下的序列：TFYDQTVSNDL(SEQ IDNO:22)；ANSAYYDAHPVTNGI(SEQ ID NO:23)；PPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:24)；以及EGEVAEEPNSRP(SEQ ID NO:25)，或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方式中，所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)(RJK001)；TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)(RJK002)；TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)(RJK012)；TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；ELDEESEDEVEEEQEDRQPSPEPVQENANSAYYDAHPVTNGIE(SEQ ID NO:8)；KEEVDEDRDVDESSPQDSPPSKASPAQDGRPPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:9)；以及EGEVAEEPNSRPQEKSEQDLE(SEQ ID NO:10)，或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在一些实施方式中，所述多肽包含亲水区段和疏水区段，所述亲水区段的长度为10-17个(例如，11-16、12-15或13-14个)氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％或至少80％)为Asp、Glu、Lys或Arg，其中所述疏水区段的长度为10-12个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少35％(例如，至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％或至少80％)为Tyr、Phe、Leu或Val，其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，其中所述多肽的长度为20-29个(例如，21-28、22-27、23-26或24-25个)氨基酸残基，并且其中所述多肽能够逆转相分离。
在某些实施方式中，所述亲水区段具有以下序列：TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)，其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
在某些实施方式中，所述疏水区段具有以下序列：TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)，或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
在某些实施方式中，所述多肽包含以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1RQQTPX1VVPDDSGTFYDQTVSNDLX1，其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
应当理解，除Asp、Glu和Lys之外的亲水性氨基酸(如Arg、Asn、Gln、His、Ser和Thr)也可以用作上述序列中的X1，并且可以预期类似的技术效果。
在一些实施方式中，所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)(RJK001)、TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)(RJK002)、TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)(RJK012)。
本文提供的多肽可以使用PCT/CN2021/111683中描述的方法来鉴定，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，所述多肽与细胞穿透肽融合(CPP)。在一些实施方式中，所述细胞穿透肽包含选自由以下组成的组的序列：GGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:26)和RQIKIWFQNRRMKWKKK(SEQ ID NO:27)。可以本文提供的多肽进入细胞的其它可用CPP也在本公开的考虑范围内。CPP可以融合到本文提供的多肽的N末端或C末端。
在一些实施方式中，所述多肽进一步与接头融合，例如SGRPVL(SEQ ID NO:28)、GAPGSAGSAAGGSG(SEQ ID NO:29)和/或ENLVFQG(SEQ ID NO:30)。
在一些实施方式中，所述多肽进一步与his标签融合。本公开中使用的his标签可以增加本文提供的多肽的半衰期。
在一些实施方式中，本文提供的多肽包含以下序列：
TEPQEESEEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLEGGRKKRRQRRRHHHHHHHH(SEQ IDNO:32)或RQIKIWFQNRRMKWKKK
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLKSSGRPVLHHHHHHH(SEQ ID NO:33)。
本文提供的多肽可以通过在允许本文提供的多核苷酸表达的条件下培养包含本文提供的多核苷酸的宿主细胞(例如，真核或原核细胞)产生。本文提供的多核苷酸可以使用无细胞蛋白质合成(CFPS)系统构建。本文提供的多核苷酸可以使用重组技术构建。为此，可以获得编码本文提供的多核苷酸的DNA以及编码CPP、接头和/或his标签的DNA，并且将其可操作地连接以允许在宿主细胞中转录和表达以产生融合多肽。
为了产生本文提供的融合多肽，可以在多种培养基中培养用表达载体转化的宿主细胞。可商购获得的细菌生长培养基(如Terrific肉汤、LB肉汤、LB琼脂、M9基本培养基、MagiaMedia培养基以及ImMedia培养基(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))适用于培养细菌宿主细胞。可商购获得的培养基(如Ham's F10(西格马公司(Sigma))、最低必需培养基(Minimal Essential Medium，MEM)(西格马公司)、RPMI-1640(西格马公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(西格马公司))适用于培养真核宿主细胞。任何这些培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。培养条件(如温度、pH等)是先前与所选的用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括分离融合多肽和/或多肽复合物。
由细胞制备的本文提供的融合多肽可以使用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱来纯化。
根据待回收的蛋白质，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在一些实施方式中，所述多核苷酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，所述多核苷酸为单链DNA或双链DNA。
另一方面，本公开提供一种宿主细胞，其包含本文所提供的载体。所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。可以在常规营养培养基中培养用上述表达或克隆载体转化的宿主细胞，所述培养基视需要进行修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增克隆载体。
在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。
在一些实施方式中，所述载体进一步包含促进多肽表达的另外元件，如启动子、增强子、polyA区等。在一些实施方式中，所述载体是病毒载体。在一些实施方式中，所述载体是腺相关病毒(AAV)载体。在一些实施方式中，所述AAV载体进一步包含ITR序列。
在一些实施方式中，所述AAV具有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11和AAV12的血清型。
眼用药物组合物
另一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关视觉障碍(例如，白内障)的眼用药物组合物，所述眼用药物组合物包含药学上可接受的眼用载体以及治疗有效量的本文提供的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体。
如本文所使用的，“药学上可接受的眼用载体”是指用于将本文提供的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体直接或间接地递送到眼睛、眼睛上或眼睛附近的药学上可接受的赋形剂、粘合剂、载体和/或稀释剂。
眼用药物组合物可以呈滴眼剂的形式，所述滴眼剂可以使用水溶液和稀释剂制备，包括但不限于蒸馏水、生理盐水等。滴眼剂中可以根据需要含有各种添加剂。这些添加剂可以包括但不限于适用于接触眼睛上或眼睛周围而没有过度毒性、不相容性、舒缓剂、不稳定性、刺激性、等渗性调节剂、过敏反应等的额外的成分、添加剂或载体。添加剂(如溶剂、碱、溶液助剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、pH调节剂、调味剂、螯合剂、防腐剂、矫味剂、着色剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、吸收促进剂、分散剂、防腐剂、增溶剂等)可以在适当的情况下加入调配物中。
一方面，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关的视觉障碍(例如，白内障)的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的眼用药物组合物。
剂量
本文提供的眼用药物组合物的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，如待治疗的疾病类型、体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、受试者的健康状况、免疫状况和交叉反应的可能性、过敏、敏感性和不良副作用以及施用途径和类型、疾病的严重程度和发展以及主治医师或兽医的判断。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物可以每天一次或多次以约0.001mg/kg到约100mg/kg的治疗有效剂量施用(例如，每天一次或多次施用约0.001mg/kg、约0.3mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约3mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在某些实施方式中，药物组合物以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在某些实施方式中，剂量为20mg/kg或更少、10mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.3mg/kg或更少、0.1mg/kg或更少、或0.01mg/kg或更少、或0.001mg/kg或更少。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。在某些实施方式中，本文提供的眼用药物组合物一次或在一系列治疗中施用于受试者。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物根据疾病的类型和严重程度通过一次或多次单独施用或通过连续输注施用于受试者。
本文提供的眼用药物组合物可以以单剂量或多剂量施用。本文提供的眼用药物组合物可以作为单独的治疗剂或与其它治疗剂组合施用，或与可以按顺序或同时施用的常规疗法组合。在一些实施方式中，本文提供的眼用药物组合物以约1滴/眼、约2滴/眼、约3滴/眼、约4滴/眼、约5滴/眼、约6滴/眼、约7滴/眼、约8滴/眼、约9滴/眼、约10滴/眼、约11滴/眼、约12滴/眼或超过约12滴/眼的每日剂量施用。在一些实施方式中，本文提供的眼用药物组合物施用约1次/天、约2次/天、约3次/天、约4次/天、约5次/天、约6次/天、约7次/天、约8次/天、约9次/天、约10次/天、约11次/天、约12次/天或超过约12次/天。
施用途径
向受试者施用本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸、本文提供的载体和/或本文提供的药物组合物的最合适的方法取决于许多因素。在各个实施方式中，将本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸、本文提供的载体和/或本文提供的药物组合物局部(locally)施用于眼睛，例如局部(topically)、结膜下、眼球后、眼周、视网膜下、脉络膜上或眼内。
本文提供的药物组合物被调配成使得尤其可用于直接施用于眼睛。本文提供的药物组合物的示例性调配物包括但不限于滴眼剂(其呈水溶液和/或悬浮剂的形式)、眼用凝胶或软膏(其呈增稠溶液和/或悬浮剂的形式)、眼用洗液、前房用洗液、眼内输注溶液、内服药或提取角膜的防腐剂。
用于眼用药物递送的其它剂型包括眼部插入物、玻璃体内注射液和植入物。可注射溶液可以使用细针直接注射到角膜、晶状体和玻璃体或其邻近组织中。所述组合物也可以作为眼内灌注液施用。
在一些实施方式中，施用途径是通过接触透镜。晶状体可以用本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸、本文提供的载体和/或本文提供的药物组合物进行预处理。在替代实施方式中，以试剂盒的形式提供晶状体，所述试剂盒具有用于制备涂覆晶状体的组分，这些组分以冻干粉末的形式提供以进行重构或以浓缩溶液或即用溶液的形式提供。所述组合物可以以单次或多次使用的试剂盒的形式提供。
用于基因疗法的药物组合物
在某些实施方式中，本文提供的多核苷酸和/或载体可以调配为药物组合物，所述药物组合物直接注射到有需要的受试者的眼睛以进行基因治疗。此类药物组合物可以进一步包含药学上可接受的媒剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的媒剂是脂质体。脂质体是单层或多层囊泡，其膜由亲脂性材料和内部水性部分形成。本文提供的多肽和/或载体可以封装在脂质体的水性部分中。示例性脂质体包含但不限于基于3[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chlo)的脂质体、基于N-(2,3-二油酰基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)的脂质体和基于1,2-二油酰基-3-三甲基丙烷(DOTAP)的脂质体。制备脂质体并将核酸分子和/或载体包封到脂质体中的方法在本领域中是众所周知的。(参见例如D.D.Lasic等人,《基因递送中的脂质体(Liposomes in gene delivery)》,由CRC出版社(CRC Press)出版,1997)。
在某些实施方式中，药学上可接受的媒剂是聚合物赋形剂，包括但不限于微球、微胶囊、聚合物胶束和树枝状聚合物。本文提供的核酸分子和/或载体可以通过本领域已知的方法封装、粘附或涂覆在基于聚合物的组分上(参见例如W.Heiser,《非病毒基因转移技术(Nonviral gene transfer technologies)》,由胡玛纳出版社(Humana Press)出版,2004；美国专利6025337；《先进药物递送评论(Advanced Drug Delivery Reviews),57(15):2177-2202(2005))。
在某些实施方式中，药学上可接受的媒剂是胶体或载体颗粒，如金胶体、金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和多段纳米棒。本文提供的核酸分子和/或载体可以通过本领域已知的任何合适方法涂覆、粘附或结合到载体上(参见例如M.Sullivan等人,《基因疗法(GeneTherapy)》,10:1882-1890(2003)；C.Mclntosh等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》,123(31):7626-7629(2001)；D.Luo等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》,18:893-895(2000)；以及A.Salem等人,《自然材料(Nature Materials)》,2:668-671(2003))。
在某些实施方式中，药物组合物可以进一步包含添加剂，包括但不限于促进药物细胞摄取的稳定剂、防腐剂和转染促进剂。合适的稳定剂可以包括但不限于谷氨酸钠、甘氨酸、EDTA和白蛋白。合适的防腐剂可以包括但不限于2-苯氧基乙醇、苯甲酸钠、山梨酸钾、羟基苯甲酸甲酯、酚类、硫柳汞和抗生素。合适的转染促进剂可以包括但不限于钙离子。
本文提供的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的途径施用，包括但不限于胃肠道、口服、肠道、口腔、鼻腔、局部、直肠、阴道、肌内、鼻内、粘膜、表皮、经皮、皮肤、眼部、肺部、玻璃体内注射、前房注射、蛛网膜下注射和皮下途径。本文提供的药物组合物可以以适合于每种施用途径的制剂或调配物的形式施用于受试者。适用于施用药物组合物的调配物可以包括但不限于溶液、分散体、乳剂、粉剂、悬浮剂、气溶胶、喷雾剂、滴鼻剂、基于脂质体的调配物、贴片、植入物和栓剂。
调配物可以容易地以单位剂型的形式存在并且可以通过制药领域中已知的任何方法制备。制备这些调配物或药物组合物的方法包括将本文所述的多核苷酸供应到一种或多种药学上可接受的媒剂以及任选地一种或多种添加剂中的步骤。对于制备此类调配物的方法，参见例如《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(《雷明顿：药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)》第19版编辑,A.R.Gennaro(编辑),新泽西州麦克出版公司(Mack Publishing Co.,N.J.),1995；R.Stribling等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》89:11277-11281(1992)；A.Barnes等人,《分子治疗学的当前观点(Current Opinion in Molecular Therapeutics)》2000 2:87-93(2000)；T.W.Kim等人,《基因医学杂志(The Journal of Gene Medicine)》,7(6):749-758(2005)；以及S.F.Jia等人,《临床癌症研究(Clinical Cancer Research)》,9:3462(2003)；A.Shahiwala等人,《最近药物递送和调配专利(Recent patents on drug delivery andformulation)》,1:1-9(2007)；所述参考文献以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方式中，本文提供的多核苷酸(例如，mRNA)可以通过物理、生物或化学方法递送(参见例如S.Guan、J.Rosenecker,《基因疗法》2017,24,133)。
物理方法包括但不限于通过基因枪(例如，带有Au粒子的基因枪)、电穿孔、声学穿孔等递送(参见例如Kutzler等人,(2008)DNA疫苗：准备好迎接黄金时段了吗？(DNAvaccines:Ready for prime time？)《遗传学自然评论(Nat Rev Genet)》9:776-788；Geall等人,自扩增RNA疫苗的非病毒递送(Nonviral delivery of self-amplifying RNAvaccines)《美国国家科学院院刊》2012年9月4日；109(36):14604-9)。
生物学方法包括但不限于通过病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)递送。
化学方法包括但不限于通过天然蛋白质/聚糖、聚合物、脂质递送。示例性天然蛋白质/聚糖包括鱼精蛋白和壳聚糖(参见例如A.E.等人,《癌症免疫学免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother.)》2015,64,1461；U.S.Kumar等人,《ACS纳米(ACS Nano)》2021,11,17582)。示例性聚合物包括聚乙烯亚胺(PEI)(如线性PEI、支化PEI和树枝状PEI)、聚(-氨基酯)(PBAE)(参见例如K.Singha等人,《核酸疗法(Nucleic Acid Ther.)》2011,21,133；A.A.Eltoukhy等人,《生物材料学(Biomaterials)》2012,33,3594)。
示例性脂质包括：阳离子脂质，如1,2-二八-癸烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)(参见例如X.Hou等人,《材料自然评论(Nat.Rev.Mater.)》2021,10,1078.)；由DOTMA、DOTAP和DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，辅助脂质)形成的脂质体，所述脂质体可以在与mRNA自组装后形成胶体稳定的纳米颗粒(参见例如L.M.Kranz等人,《自然(Nature)》2016,534,396)。
示例性脂质也可以是可电离脂质。可电离脂质(pKa 6.5-6.9)是一种替代性脂质材料，其在生理pH下呈中性，但在酸性环境中通过游离胺的质子化而带正电荷(参见例如S.C.Semple等人,《自然生物技术》2010,28,172)。在细胞内化后，由可电离脂质形成的纳米颗粒被包封在内体中。随后，由于内体和溶酶体中pH值持续降低，可电离脂质获得质子以进行电离，这促进脂质纳米颗粒(LNP)与内体膜融合，并且最终导致装载在脂质纳米颗粒上的mRNA释放到细胞质中(参见例如L.Miao等人,《分子癌症(Mol.Cancer)》2021,20,41)。
可电离脂质可以与胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质(pegylated lipid/PEGylated lipid)一起形成脂质纳米颗粒调配物。胆固醇是一种天然的可维持脂质纳米颗粒的结构和稳定性的刚性且疏水性脂质。其还促进装载mRNA的脂质纳米颗粒(即mRNA纳米颗粒)与内体膜融合。辅助脂质(例如，两性离子脂质DOPE、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC))被广泛用于促进细胞膜渗透和内体膜逃逸(参见例如N.Chaudhary等人,《自然评论药物发现(Nat.Rev.Drug Discovery)》2021,20,817)。聚乙二醇化脂质由PEG和锚定脂质构成。亲水性PEG主要分布在mRNA复合物表面上，而疏水区嵌入在脂质双层中。聚乙二醇化脂质的引入不仅增加了脂质纳米颗粒的半衰期，还可以通过改变PEG链的分子量来调节粒径。通常，分子量和脂质尾长的范围可以分别为350到3000Da以及10到18个碳(参见例如N.Chaudhary等人,《自然评论药物发现》2021,20,817)。
在过去几十年中，研究人员研发了用于mRNA递送的大型可电离脂质库，包括DLin-MC3-DMA、SM-102、TT3、C12-200、306Oi10和ALC-0315(参见例如M.Yanez Arteta等人,《美国国家科学院院刊》2018,115,E3351；R.Verbeke等人,《控释(Controlled Release)》2021,333,511；B.Li等人,《纳米快报(Nano Lett.)》2015,15,8099；K.A.Hajj等人,《纳米快报》2020,20,5167；K.A.Hajj等人,《Small杂志(Small)》2019,15,1805097；A.B.Vogel等人,《自然》2021,592,283)。其中一些在临床应用中取得了显著成果。一个典型实例是DLin-MC3-DMA，其是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于siRNA递送的Onpattro的关键组分(参见例如A.Akinc等人,《自然生物技术》2019,14,1084)。DLin-MC3-DMA还广泛用于mRNA递送，包括蛋白质和肽取代、基因编辑和抗病毒感染(参见例如R.S.Riley等人,《科学进展(Sci.Adv.)2021,7,eaba1028)。两个“明星分子”，即SM-102和ALC-0315已被FDA批准分别作为用于预防COVID-19的BNT162b和mRNA-1273疫苗中的关键组分(参见例如X.Hou等人,《材料自然评论》2021,10,1078)。
理想的基于脂质的mRNA载体必须满足以下要求：1)暴露的mRNA可以形成保护mRNA免于降解的稳定复合物；2)应添加四种关键组分(可电离脂质、胆固醇、辅助脂质和聚乙二醇化脂质)以稳定mRNA复合物；3)脂质纳米颗粒的组成应被质子化以触发膜不稳定性并促进mRNA复合物的内体逃逸；以及4)所有脂质材料都是可生物降解的，并且将不对患者造成任何伤害。
在优化基于脂质的递送平台时，应考虑以下几点：1)降解可电离脂质的能力：脂质的骨架结构通过将炔烃和酯基引入到脂质尾部来促进脂质的清除并降低毒性；2)脂质纳米粒的免疫原性：脂质纳米颗粒中的杂环脂质可以通过激活树突细胞(DCS)的干扰素基因刺激物(STING)通路来提高mRNA疫苗的效率(参见例如L.Miao等人,《自然生物技术》2019,37,1174)；3)脂质纳米颗粒的稳定性：改进mRNA疫苗稳定性的一些潜在策略包括优化pKa、引入赋形剂以及修饰mRNA等。
可以使用本领域已知的组分、组合物和方法来产生脂质纳米颗粒，参见例如PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2017/037551、PCT/US2015/027400、PCT/US2016/047406、PCT/US2016/000129、PCT/US2016/014280、PCT/US2016/014280、PCT/US2017/038426、PCT/US2014/027077、PCT/US2014/055394、PCT/US2016/052117、PCT/US2012/069610、PCT/US2017/027492、PCT/US2016/059575和PCT/US2016/069491，其以全文引用的方式并入本文中。
试剂盒
另一方面，本公开提供了一种用于治疗相分离相关疾病(例如，白内障)的试剂盒，所述试剂盒包含治疗有效量的本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体的调配物、药学上可接受的载体以及施用所述调配物的说明书，使得所述施用治疗所述相分离相关疾病。
在一些实施方式中，所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体中的一种或多种。本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体可以作为制备的药物组合物存在于容器中，或者可替代地可以未调配。在此类实施方式中，试剂盒可以包括未调配在容器中的本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体，其与存在于另一个容器中的药学上可接受的载体分开。在使用前，本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体与药学上可接受的载体稀释或以其它方式混合。
在一些实施方式中，本文提供的试剂盒还包含描述用于以与相分离相关疾病(例如，白内障)相关的一种或多种症状的方式施用药物组合物的方法的说明书。在一些实施方式中，说明书还描述了将试剂盒中包含的本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体与眼用药学上可接受的载体混合的程序。
在一些实施方式中，包含本文提供的多肽、本文提供的多核苷酸和/或本文提供的载体的容器是用于眼部施用的容器。在一些实施方式中，容器是用于施用滴眼剂的滴管。
其他项目：
项目1.一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关疾病的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体，所述多肽包含亲水区段和疏水区段，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够逆转相分离。项目2.根据项目1所述的方法，其中所述相分离相关疾病是相分离相关视力障碍。
项目3.根据项目2所述的方法，其中所述相分离相关视力障碍是白内障。
项目4.根据项目1所述的方法，其中所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；
X1LX1X1X1SX1X1X1VX1X1X1QX1X1X1(SEQ ID NO:12)；
X1X1X1VX1X1X1X1X1VX1X1(SEQ ID NO:13)；以及
X1X1SX1VQX1LX1(SEQ ID NO:14)，
其中每个X1分别为Asp、Glu、Lys或Arg。
项目5.根据项目1所述的方法，其中所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEER(SEQ ID NO:15)；
TDPQDDSDDDVDDPDDR(SEQ ID NO:16)；
TKPQKKSKKKVKKPKKR(SEQ ID NO:17)；
TRPQRRSRRRVRRPRRR(SEQ ID NO:18)；
ELDEESEDEVEEEQEDR(SEQ ID NO:19)；
KEEVDEDRDVDE(SEQ ID NO:20)；以及
EKSEQDLE(SEQ ID NO:21)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目6.根据项目1所述的方法，其中所述疏水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)；
ANSAYYDAHPVTNGI(SEQ ID NO:23)；
PPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:24)；以及
EGEVAEEPNSRP(SEQ ID NO:25)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目7.根据项目1所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)
(RJK001)；
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)
(RJK002)；
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)
(RJK012)；
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；
ELDEESEDEVEEEQEDRQPSPEPVQENANSAYYDAHPVTNGIE(SEQ ID NO:
8)；
KEEVDEDRDVDESSPQDSPPSKASPAQDGRPPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:9)；以及
EGEVAEEPNSRPQEKSEQDLE(SEQ ID NO:10)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目8.根据项目1到3中任一项所述的方法，其中所述亲水区段的长度为10-17个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少60％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-12个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少35％为Tyr、Phe、Leu或Val，并且
其中所述多肽的长度为20-28个氨基酸残基。
项目9.根据项目8所述的方法，其中所述亲水区段具有以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；
其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
项目10.根据项目8所述的方法，其中所述疏水区段具有以下序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
项目11.根据项目8所述的方法，其中所述多肽包含以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1RQQTPX1VVPDDSGTFYDQTVSNDLX1(SEQID NO:31)；
其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
项目12.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多肽与细胞穿透肽融合。
项目13.根据项目12所述的方法，其中所述细胞穿透肽包含选自由以下组成的组的序列：
GGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:26)；
RQIKIWFQNRRMKWKKK(SEQ ID NO:27)。
项目14.根据项目12或13所述的方法，其中所述细胞穿透肽融合在所述多肽的N末端或C末端处。
项目15.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多肽进一步与接头融合。
项目16.根据项目15所述的方法，其中所述接头包含选自由以下组成的组的序列：
SGRPVL(SEQ ID NO:28)；
GAPGSAGSAAGGSG(SEQ ID NO:29)；以及
ENLVFQG(SEQ ID NO:30)。
项目17.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多肽进一步与his标签融合。项目18.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸是DNA或RNA。
项目19.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述载体是病毒载体。
项目20.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体经口、静脉内、肌内、肠内、眼内、视网膜下、玻璃体内、局部、经眼(滴眼剂、插入物、注射液或植入物)、舌下、直肠或通过注射、鼻喷雾或吸入施用。
项目21.根据项目19所述的方法，其中所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体经眼(滴眼剂、插入物、注射液或植入物)施用。
项目22.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述多肽、所述编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体被调配为眼用溶液、眼用软膏、眼用洗液、眼内输注溶液、前房用洗液、内服药、注射液、玻璃体内注射液、前房注射液、蛛网膜下注射液或提取角膜的防腐剂。
项目23.一种用于溶解晶体蛋白聚集体和/或防止在细胞中形成晶体蛋白聚集体的方法，所述方法包括向所述细胞中引入包含亲水区段和疏水区段的多肽，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够抑制相分离。项目24.根据项目23所述的方法，其中所述晶体蛋白聚集体是βD-晶体蛋白聚集体、γD-晶体蛋白聚集体或其组合。
项目25.一种用于治疗相分离相关疾病(例如，白内障)的试剂盒，所述试剂盒包含治疗有效量的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体、药学上可接受的载体的调配物以及施用所述调配物的说明书，使得所述施用治疗所述相分离相关疾病，
其中所述多肽包含亲水区段和疏水区段，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够抑制相分离。项目26.一种用于抑制、减轻和/或防止晶体蛋白相分离的方法，所述方法包括使所述晶体蛋白与包含亲水区段和疏水区段的多肽接触，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％
为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基。
项目27.根据项目26所述的方法，其中所述晶体蛋白聚集体是βD-晶体蛋白聚集体、γD-晶体蛋白聚集体或其组合。
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。下面描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法并不旨在限制本发明，而是仅说明落入本发明的范围内的具体实施方式。本领域的技术人员可以开发出等效的组合物、材料和方法，而无需行使发明能力且不脱离本发明的范围。应理解，可以在本文所述的程序中进行许多变化，同时仍保持在本发明的范围内。本发明的发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。
V.实施例
实施例1：对G3BP1蛋白的相分离逆转
原核表达和纯化的G3BP1-GFP蛋白(pH 7.5，20uM G3BP1-GFP)在体外诱导以形成相分离的液滴。将多肽Champ-E(RJK001)、Champ-D(RJK002)、Champ-K(RJK012)和Champ-Q(RJK005，TQPQQQSQQQVQQPQQRQQTPQVVPDDSGTFYDQTVSNDLQ,SEQ ID NO:34)(各60uM)逐滴添加到G3BP1-GFP液滴中。通过共焦激光显微镜连续进行观察。如图1中左图所示，其中左边图像为仅加入多肽后的显微图像，中间图像为加入多肽40秒后的显微图像，并且右边图像为加入多肽80秒后的显微图像，多肽Champ-E和Champ-K在加入多肽后40秒显著溶解相分离的液滴，Champ-D在加入多肽后40秒部分溶解相分离的液滴并且在加入多肽后120秒溶解更多相分离的液滴，而Champ-Q甚至在加入多肽后120秒也没有溶解相分离的液滴。这表明多肽Champ-E(RJK001)、Champ-D(RJK002)和Champ-K(RJK012)可以以时间依赖性方式逆转相分离。
在存在不同浓度的Champ-E、Champ-D、Champ-K或Champ-Q的情况下，在395nm波长下测量G3BP1(30μM)的浊度。简而言之，在浊度测定之前，在室温下以范围为0.75到25的比率充分混合G3BP1蛋白(30μM)和多肽Champ-E(RJK001)、Champ-D(RJK002)、Champ-K(RJK012)和Champ-Q(RJK005)持续10分钟。使用Nanodrop ONE(赛默飞世尔科技公司)在室温下监测395nm处的吸光度(OD395 nm)。如图1中右图所示，多肽Champ-E、Champ-D和Champ-K以浓度依赖性方式降低浊度，而Champ-Q对浊度降低的影响要小得多。浊度水平反映了相分离的程度。因此，这表明本文提供的多肽(例如，Champ-E、Champ-D和Champ-K)可以以剂量依赖性方式逆转相分离。
在存在不同浓度的在其C末端与细胞穿透肽(GGRKKRRQRRR)融合的RJK001和在其N末端与细胞穿透肽(RQIKIWFQNRRMKWKKK)融合的RJK012的情况下，在395nm波长下测量G3BP1(30μM)的浊度。简而言之，在浊度测定之前，在室温下将G3BP1蛋白和上述肽混合10分钟。测试前，以范围为0.75到25的比率充分混合30μM G3BP1和肽。使用Nanodrop ONE(赛默飞世尔科技公司)在室温下监测395nm处的吸光度(OD395nm)。如图9所示，多肽RJK001和RJK012两者各自在N末端或C末端与细胞穿透肽融合可以以浓度依赖性方式降低浊度(图9中的“RJK001”和“RJK012”分别指C末端或N末端融合了细胞穿透肽的RJK001和RJK012)。这表明本文提供的多肽在N末端或C末端与细胞穿透肽(例如，RJK001和RJK012)融合可以以剂量依赖性方式逆转相分离。此结果进一步表明，与细胞穿透肽融合不影响本文提供的多肽溶解或逆转相分离的能力。
实施例2：对管中γD-晶体蛋白的相分离逆转
将小鼠晶状体置于不同的温度下并拍摄照片。如图2所示，小鼠晶状体在室温下呈透明状，然后在4℃下变浑浊，并且在升温至室温后又恢复透明状。这表明γD-晶体蛋白在低温(例如，4℃)下表现出相分离，当温度升高至室温时，这种相分离是可逆的。接下来，本公开的发明人测试了本文提供的多肽是否可以逆转γD-晶体蛋白的相分离，由此治疗由γD-晶体蛋白的相分离诱导的视觉障碍，如白内障。
在体外纯化γD-晶体蛋白，其验证如图3所示。然后将经纯化的γD-晶体蛋白溶解在蛋白质溶解缓冲液中至最终浓度为50mg/ml，将γD-晶体蛋白置于4℃下持续20分钟以形成稳定双相，在5ulγD-晶体蛋白中加入不同浓度的短肽RJK001，体积比为1:1，RJK001的最终浓度从低到高分别为0uM、20uM、50uM、100uM、150uM、200uM、250uM、300uM和500uM，使用10ul移液管尖充分混合，然后将其置于4℃下持续5分钟，使用Nanodrop ONE(赛默飞世尔科技公司)在4℃下监测395nm处的吸光度(OD395 nm)。如图4所示，多肽RJK001以浓度依赖性方式降低γD-晶体蛋白的浊度。浊度水平反映了相分离的程度。因此，这表明本文提供的多肽(例如，RJK001)可以以剂量依赖性方式逆转γD-晶体蛋白的相分离。
为了评估蛋白质在添加多肽前后是否发生微小或显著的结构变化，1H-15N HSQC光谱是一种有用的工具并且可以用作三维结构的“指纹”。如图5所示，在大肠杆菌(E.coli)中表达了全长γD-晶体蛋白，通过bruker avance III HD光谱仪表征所述晶体蛋白。将野生型人全长γD-晶体蛋白基因插入到pET14b载体中。用这些载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。对于蛋白质产生，使细胞在37℃下生长至600nm处的吸光度为0.6，并通过在37℃下添加0.5mM IPTG诱导持续4小时。对于蛋白质的N15标记，在NH4Cl作为唯一氮源的情况下，在M9培养基中培养和诱导经转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。通过Ni亲和色谱法在Tris HCl pH7.5、150mM NaCl中使用咪唑的线性梯度纯化蛋白质。汇集所有含有γD-晶体蛋白的级分并在Supdex75柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上进行凝胶过滤以进行最终纯化。在HSQC光谱测定之前，将经纯化的蛋白质装载到SDS-PAGE以进行纯度检查。在25℃下使用最终的300uM人γD-晶体蛋白，记录二维[1H-15N]异核单量子相干(HSQC)光谱以确定在残基特异性水平下的结构域相互作用。
H-N分析揭示了单独残基的环境变化，如其对应的化学位移所指示的。测量单独γD-晶体蛋白或具有Champ-E(RJK001)的晶体蛋白的化学位移差异(CSD)。如图6所示，首先记录单独的300μM 15NγD-晶体蛋白(深灰色)的信号2D 1H-15N HSQC光谱，并且然后将等体积的1.2mM RJK001溶液加入到晶体蛋白溶液中以达到最终摩尔比1:2。在将1.2mM RJK001添加到15N标记的样品中后，记录随时间变化的1H-15N HSQC光谱，记录具有RJK001的300μM15NγD-晶体蛋白(浅灰色)的信号2D 1H-15N HSQC光谱。RJK001温育前后的1H-15N HSQC光谱的比较表明，化学位移显著，尤其是在极性氨基酸区域中。
获取HSQC光谱并使用ccpNMR进行分析，使用方程Δδ＝[(0.125ΔδN)2+ΔδH2]1/2计算酰胺1H-15N组合化学位移差异。在存在RJK001(最终600mM)的情况下，观察到γD-晶体蛋白总残基的CSD，如图7所示。γD-晶体蛋白的CSD示出更大的变化，表明RJK001与全长野生型γD-晶体蛋白相互作用，由此收紧表面张力并提高γD-晶体蛋白溶解度。
如图8所示，与全长野生型γD-晶体蛋白相比，用箭头标记1H,15N化学位移差异>0.1ppm的残基。示意图描绘了化学差异映射到的野生型γD-晶体蛋白(2KFB)的骨架结构。用箭头示出酰胺共振表现出Δδ>0.1ppm的残基位置，表明RJK001相互作用的位置。事实上，目前可用的所有数据都支持这样一种观点，即不同类型晶体蛋白之间的异型相互作用在眼睛晶状体中得以微妙地平衡，使得此类相互作用的甚至轻微加强或减弱也可能导致这些蛋白质的混合物不稳定，30与α-晶体蛋白凭借其分子伴侣特性在防止其它晶状体晶体蛋白聚集和/或沉淀方面发挥关键作用。因此，RJK001使用此类相互作用提高γD-晶体蛋白的溶解度。
实施例3：对细胞中γD-晶体蛋白的相分离逆转
如实施例1所述，多肽RJK001在其C末端与细胞穿透肽(GGRKKRRQRRR)融合，并且多肽RJK012在其N末端与细胞穿透肽(RQIKIWFQNRRMKWKKK)融合。测试融合肽在真核细胞中的半衰期，并且结果如图10中所示，这表明融合多肽在真核细胞中的半衰期为约8小时。
使细胞在12孔板(每孔1×105个细胞)中生长持续24小时，并使用EZtrans转染试剂用γD(W42D)质粒进行转染。转染后24小时，每4小时将Champ肽RJK001(最终浓度为20uM)和RJK0012(最终浓度为10uM和20uM)添加到SH-SY5Y细胞培养基中，持续总共24小时。使用定制的CellProfiler软件分析RJK001和RJK012多肽对SH-SY5Y细胞模式下的γD(W42D)聚集体的影响。简而言之，然后通过GFP荧光通道图像对细胞体进行分割和鉴定，并向外追踪到细胞质的极限(使用100-300像素的直径截止值)。细胞体用作掩膜以消除细胞边界外的成像伪影，如背景荧光或死细胞。掩蔽后，通过对SH-SY5Y细胞的直径为10像素的斑点状特征进行图像处理来增强点状结构，并且然后将这些点状结构注释为特征，如γD(W42D)点。最后，计算包围在经鉴定的特征(多个细胞和点状)中的每个特征的总图像面积，并将其输出为电子制表。每个样品分析至少200个细胞。如图11所示，随着时间的推移，对照组不影响SH-SY5Y细胞中的γD(W42D)聚集体；20uM的多肽RJK001和20uM的RJK012以时间依赖性方式减少SH-SY5Y细胞中的γD(W42D)聚集体的数量，直至加入多肽后12小时为止；并且10uM的多肽RJK012以时间依赖性方式减少SH-SY5Y细胞中的γD(W42D)聚集体的数量，直到加入所述多肽后6小时为止。这些数据表明，本文提供的多肽(例如，RJK001和RJK012)可以以剂量依赖性和时间依赖性方式溶解或逆转真核细胞内的γD晶体蛋白聚集体。
实施例4：人晶状体的处理与分析
从具有不同疾病进展的白内障患者中收集超声乳化后的30-50ml晶状体裂解物。羊毛甾醇被用作基准药物(参见Zhao、Ling等人“羊毛甾醇逆转白内障中的蛋白质聚集(Lanosterol reverses protein aggregation in cataracts)”《自然》523.7562(2015):607-611)。如图12所示，本文提供的多肽(例如，RJK001)可以有效地溶解来自白内障患者的晶体蛋白聚集体。此外，本文提供的多肽(例如，RJK001)的浓度低至达到相同溶解效果所需的羊毛甾醇浓度的1/100。此结果表明，相较于羊毛甾醇，本文提供的多肽(例如，RJK001)对来自白内障患者的晶体蛋白聚集表现出更好的溶解作用。
本研究中使用的人晶状体从经受白内障囊外手术的身份不明的患者获得。所述材料已被归类为非人类丢弃的材料。术前临床检查使用LOCS II四点分级系统将白内障分类为混合皮质和核。LOCS II四点分级系统也常用于临床环境。(Chylack LT Jr、Leske MC、McCarthy D、Khu P、Kashiwagi T、Sperduto R.,晶状体混浊分类系统II(Lens opacitiesclassification systemII，LOCS II),《眼科学档案(Arch Ophthalmol.)》1989年7月；107(7):991-7.doi:10.1001/archopht.1989.01070020053028.PMID:2751471)。对患有不同程度的白内障的患者的晶体蛋白浓缩物逐一进行测试。如图13所示，本文提供的多肽(例如，RJK001)对患有不同程度(例如，C1N2P0)白内障的患者具有良好的解聚作用。
人类白内障分级系统。
N 0级：无混浊(无白内障)；
N 1级：轻度混浊(初期)；
N 2级：几乎整个晶状体存在弥漫性混浊(未成熟阶段)；
N 3级：存在涉及整个晶状体的广泛、厚重的混浊(成熟期)
C 0级：晶状体清晰，无聚集点、斑点(无白内障)；
C 1级：最小程度的皮质混浊和/或更广泛的小混浊；
C 2级：皮质轮辐模糊超过2个顶点；
C 3级：浑浊化模糊约50％；
C 4级：高度浑浊填充约90％的晶状体；
P 0级：清晰的后囊(无白内障)；
P 1级：白内障填充后囊面积的约3％；
P 2级：后囊面积的约30％混浊；
P 3级：后囊面积的约50％混浊。
从具有不同疾病进展的白内障患者中收集30-50ml的眼晶状体超声乳化。使超声乳化通过3KD蛋白浓缩管，以4000g离心持续20分钟，在重复上一步后，以14000g离心持续5分钟以得到浓缩液。将超声乳化浓缩至每个晶状体200-300ul。在以下组中添加8ul超声乳化浓缩液：1、8ul晶体蛋白浓缩物；2、8ul 1mM羊毛甾醇；3、8ul 1mM短肽RJK001；4、8ul蛋白质溶解缓冲液。使用20ul移液器尖充分混合，然后在室温下静置20分钟。
通过对晶状体裂解物的上清液或不溶性级分进行蛋白质印迹分析，使用晶体蛋白的光密度测定法进行定量分析。从白内障患者中收集一个完整的眼晶状体。将其置于含有700ul蛋白质溶解缓冲液的2ml Eppendorf管中，在4℃下用电动研磨机研磨整个晶状体3次，每次30秒，以获得1ml研磨液，在2ul研磨液中加入20ul 2.5mM RJK001作为实验组，在2ul研磨液中加入20ul蛋白质溶解液作为对照，将其置于室温下持续10分钟，以13000rpm离心并取上清液以进行蛋白质印迹分析，在用5％乳封闭后，在4℃下将膜与抗βB1晶体蛋白(Santacruz，sc-48335，1:3000)一起温育过夜，在室温下将膜与次级抗体一起温育持续1小时，然后通过增强化学发光检测印迹。
在体外纯化C末端融合细胞穿透肽RJK001和N末端融合细胞穿透肽RJK012并将其加入SH-SY5Y细胞中。分别在1小时、4小时、8小时和24小时采集细胞并用PBS洗涤。用裂解缓冲液从SH-SY5Y细胞中萃取总蛋白。通过SDS-PAGE(15％分离凝胶)分离等量的蛋白质(20μg)。对于数据分析，ImageJ用于检测每个蛋白质条带的整合密度，并且通过与阳性对照比较来计算Champ肽的比率和半衰期。如图14所示，本文提供的多肽(例如，RJK001)可以提高来自白内障患者的晶状体的晶体蛋白的溶解度。
接下来，将在手术期间取出的白内障晶状体直接浸没于对照组的缓冲液和实验组的RJK001蛋白溶液中。在长达6天的浸没过程中，每天对患者的晶状体进行拍照和记录。所述方法的更详细描述是：从白内障患者中收集两个完整的眼晶状体。向每个管中加入400μL媒剂溶液(0.1％ NaN3、0.3％triton X-100，含有1:1000蛋白酶抑制剂混合物)或含RJK001(0.5mM)的完全覆盖晶状体组织的媒剂。在室温下，将晶状体组织在黑暗中在这些溶液中温育持续6天。在用封口膜密封48孔板以避免液体蒸发后，每天在立体镜下观察晶状体的状态并拍照记录。如图15所示，本文提供的多肽(例如，RJK001)降低了白内障患者的晶状体的混浊，而缓冲液不能降低白内障患者的晶状体的混浊。这些数据共同表明，本文提供的多肽能够预防、减轻或治疗诱导视觉障碍(如白内障)的(由例如相分离引起的)蛋白质聚集。
实施例5：方法和材料
质粒
将全长人γD-晶体蛋白基因(NCBI参考序列：NM_006891.4)，即γD-晶体蛋白(W43R)的截短插入到pCMV7.1载体中，其中N末端带有3×Flag标签并且GFP在C末端融合。将人γD-晶体蛋白基因克隆到pET14b质粒中。将全长小鼠G3BP1、G3BP1-eGFP和Champ-E(RJK001)以及其变体(Champ-K/Champ-D/Champ-K/Champ-Q)的基因插入到pET-23b载体中，其中C末端带有His6-标签和凝血酶蛋白酶切割位点。
蛋白质表达和纯化
在大肠杆菌罗塞塔(Escherichia coli rosetta，DE3)细胞中表达所有质粒。使细胞生长至OD600为0.8，并在16℃下用0.4mM IPTG诱导过夜。用具有Tris缓冲液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，梯度为约0-500mM咪唑，pH 7.5)的HisTrap FF柱(通用电气医疗集团)纯化Champ-E以及其变体(Champ-K/Champ-D/Champ-K/Champ-Q)。在pH为7.5的50mM Tris-HCl、150mM NaCl的缓冲液中，用凝血酶蛋白酶去除N末端Trx1标签。将经切割的蛋白质立即装载到尺寸排阻色谱柱Superdex 75 10/300(通用电气医疗集团)上。pH为7.5的50mMTris-HCl、150mM NaCl的缓冲液用于Superdex 75柱。通过离心过滤(Amicon，密理博公司(Millipore))浓缩所有蛋白质并用液氮快速冷冻。
在37℃下，用1mM IPTG在经转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中产生γD-晶体蛋白持续4小时。通过Ni亲和色谱法在Tris HCl pH 7.5、150mM NaCl中使用咪唑的线性梯度纯化蛋白质。汇集所有含有γD-晶体蛋白的级分并在Supdex75柱(通用电气医疗集团(GEHealthcare))上进行凝胶过滤以进行最终纯化。
将经纯化的蛋白质装载到SDS-PAGE以进行纯度检查。
体外相分离测定
显微镜液滴测定
对于G3BP1(FL)-eGFP，使用SpinDesalt柱(智能)将经纯化的G3BP1(FL)-eGFP、Champ-E以及其变体稀释到液滴缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl)。将G3BP1(FL)-eGFP蛋白稀释到指定浓度，并用PEG8000补充，最终浓度为1.25％，持续10分钟以诱导相分离，如[1]报道的。
对于γD-晶体蛋白，在体外纯化γD-晶体蛋白，然后将其溶解在蛋白质溶解缓冲液(150mM NaCl，50mM tris-HCl，PH 7.5)中至最终浓度为50mg/ml，将γD-晶体蛋白置于4℃下持续20分钟以诱导相分离。
浊度测定
遵循如[2]先前报道的浊度测定实验。简而言之，在室温下进行G3BP1浊度分析，在4℃下进行γD-晶体蛋白浊度分析。在进行浊度测定之前，将蛋白质和Champ-E(RJK001)、Champ-K、Champ-D或突变体在室温下混合持续10分钟。在测试前，以范围为0.75到25的比率充分混合20μM G3BP1和50mg/ml(2.5mM)γD-晶体蛋白和肽。使用Nanodrop ONE(赛默飞世尔科技公司)在室温下监测395nm处的吸光度(OD395 nm)。
核磁共振光谱法
在25℃下在bruker avance III HD光谱仪上进行NMR。
对于蛋白质的N15标记，在NH4Cl作为唯一氮源的情况下，在M9培养基中培养和诱导经转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
以1:0、1:2的比率将N15标记的蛋白质与未标记的肽混合。获取HSQC光谱并使用ccpNMR进行分析。使用方程Δδ)[(0.125ΔδN)2+ΔδH2]计算酰胺1H-15N组合化学位移差异。通过I/I0计算强度变化。使用基于先前研究的方程计算组合的化学位移扰动。
结构中突出显示化学位移差异大于0.1的氨基酸(2KFB)。
细胞培养和转染
将SH-SY5Y细胞在培养基(补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(英杰公司(Invitrogen))的DMEM(高葡萄糖))中以每孔1×105个细胞平板接种于12孔室上。体外纯化C末端融合细胞穿透肽RJK001和N末端融合细胞穿透肽RJK012并加入SH-SY5Y细胞中。
对于γD(W43R)微粒测定，在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素(英杰公司)的DMEM(高葡萄糖)中培养SH-SY5Y细胞。使细胞在12孔板(每孔1×105个细胞)中生长持续24小时，并使用EZtrans转染试剂用γD(W43R)质粒进行转染。
细胞中微粒的定量分析
使用定制的CellProfiler和ImageJ软件对微粒筛选和测定图像进行分割并对图像特征进行定量。简而言之，在37℃下使用BioPipeline LIVE实时观察和分析系统每小时收集实时成像。使用定制的CellProfiler软件分析RJK001和RJK012多肽对SH-SY5Y细胞模式下的γD(W43R)聚集体的影响。简而言之，然后通过GFP荧光通道图像对细胞体进行分割和鉴定，并向外追踪到细胞质的极限(使用100-300像素的直径截止值)。细胞体用作掩膜以消除细胞边界外的成像伪影，如背景荧光或死细胞。掩蔽后，通过对SH-SY5Y细胞的直径为10像素的斑点状特征进行图像处理来增强点状结构，并且然后将这些点状结构注释为特征，如γD(W43R)点。最后，计算包围在经鉴定的特征(多个细胞和点状)中的每个特征的总图像面积，并将其输出为电子制表。每个样品分析至少200个细胞。
蛋白质印迹
分别在1小时、4小时、8小时和24小时采集细胞并用PBS洗涤。用裂解缓冲液(50mMTris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％ NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％ SDS和1mM PMSF)从SH-SY5Y细胞中萃取总蛋白。通过SDS-PAGE(15％分离凝胶)分离等量的蛋白质(20μg)。电泳后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(300mA持续1.5小时)。然后在室温下将印迹在5％脱脂奶粉溶液中封闭持续1小时。使用对细胞穿透肽具有特异性的抗体并在4℃下温育过夜。对于数据分析，使用软件GELPRO(Media Cybernetics)实现了对蛋白质印迹条带的定量。通过与阳性对照比较来计算Champ肽的比率和半衰期。根据三个独立实验计算所呈现的定量数据。
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虽然本发明已经参照具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体地示出和描述，但所属领域的技术人员应理解，在不脱离如本文所公开的本发明的精神和范围的情况下，可以在其中进行形式和细节上的各种改变。
Claims (10)
1.一种用于治疗有需要的受试者的相分离相关疾病的方法，所述方法包括向所述有需要的受试者施用治疗有效量的多肽、编码所述多肽的多核苷酸和/或包含所述多核苷酸的载体，所述多肽包含亲水区段和疏水区段，
其中所述亲水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-20个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少50％为Tyr、Phe、Trp、Leu、Ile、Val、Met、Pro、Ala或Cys，
其中所述亲水区段处于N末端并且所述疏水区段处于C末端，或反之亦然，
其中所述多肽的长度为20-60个氨基酸残基，并且其中所述多肽能够逆转相分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述相分离相关疾病是相分离相关视力障碍。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述相分离相关视力障碍是白内障。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；
X1LX1X1X1SX1X1X1VX1X1X1QX1X1X1(SEQ ID NO:12)；
X1X1X1VX1X1X1X1X1VX1X1(SEQ ID NO:13)；以及
X1X1SX1VQX1LX1(SEQ ID NO:14)，
其中每个X1分别为Asp、Glu、Lys或Arg。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEER(SEQ ID NO:15)；
TDPQDDSDDDVDDPDDR(SEQ ID NO:16)；
TKPQKKSKKKVKKPKKR(SEQ ID NO:17)；
TRPQRRSRRRVRRPRRR(SEQ ID NO:18)；
ELDEESEDEVEEEQEDR(SEQ ID NO:19)；
KEEVDEDRDVDE(SEQ ID NO:20)；以及
EKSEQDLE(SEQ ID NO:21)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水区段具有选自由以下组成的组的序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)；
ANSAYYDAHPVTNGI(SEQ ID NO:23)；
PPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:24)；以及
EGEVAEEPNSRP(SEQ ID NO:25)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含选自由以下组成的组的序列：
TEPQEESEEEVEEPEERQQTPEVVPDDSGTFYDQTVSNDLE(SEQ ID NO:1)(RJK001)；
TDPQDDSDDDVDDPDDRQQTPDVVPDDSGTFYDQTVSNDLD(SEQ ID NO:2)(RJK002)；
TKPQKKSKKKVKKPKKRQQTPKVVPDDSGTFYDQTVSNDLK(SEQ ID NO:3)(RJK012)；
TRPQRRSRRRVRRPRRRQQTPRVVPDDSGTFYDQTVSNDLR(SEQ ID NO:4)；ELDEESEDEVEEEQEDRQPSPEPVQENANSAYYDAHPVTNGIE(SEQ ID NO:8)；
KEEVDEDRDVDESSPQDSPPSKASPAQDGRPPQTAAREATSIPGFPAEGAIPLPV(SEQ ID NO:9)；以及
EGEVAEEPNSRPQEKSEQDLE(SEQ ID NO:10)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
8.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述亲水区段的长度为10-17个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少60％为Asp、Glu、Lys或Arg，
其中所述疏水区段的长度为10-12个氨基酸残基，在所述氨基酸残基中，至少35％为Tyr、Phe、Leu或Val，并且
其中所述多肽的长度为20-28个氨基酸残基。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述亲水区段具有以下序列：
TX1PQX1X1SX1X1X1VX1X1PX1X1R(SEQ ID NO:11)；
其中每个X1为Asp、Glu或Lys。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述疏水区段具有以下序列：
TFYDQTVSNDL(SEQ ID NO:22)，
或与其具有至少90％同一性的序列或与其具有1、2、3、4或5个氨基酸残基差异的序列。
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