CN116829188A - 抗pd-l1抗体及其融合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及抗PD‑L1抗体以及重组唾液酸酶和抗PD‑L1免疫球蛋白抗原结合结构域融合蛋白。本发明还提供了包含唾液酸酶和抗PD‑L1抗体或其部分的抗体缀合物。本发明还涉及使用所述抗体、唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物治疗癌症的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月6日提交的美国临时专利申请号63/134,412的权益和优先权，所述临时申请的公开内容出于所有目的通过引用以其全文并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及抗体、重组唾液酸酶融合蛋白和抗体缀合物，以及它们在癌症治疗中的用途。
背景技术
程序性死亡配体1(PD-L1)也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，是人类中由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1的上调可能会使某些癌症逃避宿主免疫系统。对196份来自患有肾细胞癌的患者的肿瘤样本的分析发现，PD-L1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性增加以及死亡风险增加4.5倍相关联(Thompson等人(2004)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 101(49)17174-17179)。PD-L1表达在许多人类癌症中检测到，这些癌症包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、肾癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌(Wang等，(2016)ONCO.TARGETS THER.9:5023–5039)。对于某些癌症，PD-L1的表达与肿瘤浸润淋巴细胞数目减少和预后不良相关联(Ohaegbulam等人(2015)TRENDS MOL.MED.21(1):24–33)。美国已批准许多抗PD-L1抗体用于治疗多种癌症。例如，阿特珠单抗(atezolizumab)已被批准用于例如尿路上皮癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、三阴性乳腺癌和小细胞肺癌，德瓦鲁单抗(durvalumab)已被批准用于例如尿路上皮癌和NSCLC，并且阿维单抗(avelumab)已被批准用于默克尔细胞癌、尿路上皮癌和肾细胞癌。其他PD-L1抗体作为免疫肿瘤疗法仍在开发中，并且在临床试验中显示出良好的结果(包括用于治疗NSCLC和黑色素瘤)(Akinleye等(2019)J.HEMATOL.ONCOL.12(1):92)。
越来越多的证据支持聚糖以及唾液酸聚糖特别是在肿瘤进展的各个病理生理步骤中的作用。聚糖调控肿瘤增殖、侵袭、血源性转移和血管生成(Fuster等人，(2005)NAT.REV.CANCER 5(7):526-42)。在癌症中细胞表面糖缀合物的唾液酸化经常被改变，导致唾液酸化肿瘤相关糖类抗原的表达。肿瘤细胞对唾液酸化聚糖的表达通常与肿瘤的侵袭性和转移潜力增加相关(Julien S.,Delannoy P.(2015)“Sialic Acid and Cancer”,In:Taniguchi N.,Endo T.,Hart G.,Seeberger P.,WongCH.(编)Glycoscience:Biology andMedicine.Springer,Tokyo.https://doi.org/10.1007/978-4-431-54841-6_193)。
最近变得越来越明显的是，Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素)，一个结合唾液酸的凝集素家族，通过与超唾液酸化的癌细胞结合并介导来自于活化的NK细胞受体的信号的压制，从而抑制NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀，而在癌症免疫压制中发挥作用(Jandus等，(2014)J.CLIN.INVEST.124:1810-1820；等，(2014)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 111:14211-14216；Hudak等，(2014)NAT.CHEM.BIOL.10:69-75)。同样地，通过用唾液酸酶处理来酶促去除唾液酸可以增强NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀(Jandus，同上；Hudak，同上；Xiao等，(2016)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 113(37):10304-9)。
使用包括阻断PD-1/PD-L1途径的抗体在内的免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法改善了许多癌症患者的结果。然而，尽管到目前为止已取得进展，但许多患者对目前可用的免疫检查点抑制剂没有响应。因此，对克服免疫压制性肿瘤微环境并用于治疗与超唾液酸化的癌细胞相关的癌症的有效干预手段，仍存在着需求。
发明内容
本发明部分基于影响或以其他方式下调由PD-1或PD-L1介导的信号传导的抗PD-L1抗体的发现。在适当的环境下，所述抗体可以消除PD-1或PD-L1介导的对受试者免疫系统的阻遏，从而介导非天然细胞，例如癌细胞的去除。
本发明还部分地基于以下发现：有可能产生含有唾液酸酶和抗PD-L1免疫球蛋白或其部分(例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域)的融合蛋白，和/或包含唾液酸酶和抗PD-L1抗体或其部分(例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域)的抗体缀合物。所述融合蛋白和/或抗体缀合物的唾液酸酶部分相对于野生型唾液酸酶可包含至少一个突变。所述突变或突变的组合可以改善唾液酸酶的表达、活性或表达和活性两者，以改善它在癌症诊断和/或治疗中的用途。
所述融合蛋白和/或抗体缀合物具有合适的底物特异性和活性从而可用于从癌细胞(例如，表达PD-L1的癌细胞)表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子)以及/或者从肿瘤微环境中除去唾液酸和/或含唾液酸分子，以及/或者降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
因此，在一方面，本发明提供了结合人类PD-L1的经分离的抗体。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3(PAL769-VL、h769-IF3-VL、h769-tm2-VL、h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO：163的氨基酸序列的CDRH3(PAL769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3(PAL769-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3(h769-IF3-VL、h769-tm2-VL、h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的CDRL3(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的CDRL3(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDRH3(PAL752-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDRL3(PAL752-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDRH3(PAL759-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDRL3(PAL759-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDRH3(PAL760-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDRL3(PAL760-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDRH3(PAL767-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDRL3(PAL767-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDRH3(PAL771-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的CDRL3(PAL771-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的CDRH3(PAL785-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的CDRL3(PAL785-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的CDRH3(PAL787-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的CDRL3(PAL787-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDRH3(PAL788-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDRL3(PAL788-VL)。
在任何前述抗体的某些实施方案中，CDR被嵌插在人类或人源化免疫球蛋白框架区之间。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL769-VH)，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL769-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和/或包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-IF3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769-VH)，和/或包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm2-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769-VH)，和/或包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和/或包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL752-VH)，和/或包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL752-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL759-VH)，和/或包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL759-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL760-VH)，和/或包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL760-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL767-VH)，和/或包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL767-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL771-VH)，和/或包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL771-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL785-VH)，和/或包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL785-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL787-VH)，和/或包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL787-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL788-VH)，和/或包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL788-VL)。
在任何前述抗体的某些实施方案中，所述抗体还包含重链恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链恒定区)和/或轻链恒定区。
在任何前述抗体的某些实施方案中，所述抗体以5nM或更低、3nM或更低、2.5nM或更低、2nM或更低、1nM或更低、0.75nM或更低、0.5nM或更低、0.1nM、0.075nM或0.05nM或更低的KD与人类PD-L1结合，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法测量的。在某些实施方案中，所述抗体还与食蟹猕猴(Macaca fascicularis)(猕猴)PD-L1结合。
在另一方面，本发明提供了经分离的抗体，所述抗体与任何前述抗体竞争结合至人类PD-L1并且/或者与任何前述抗体结合至人类PD-L1上的相同表位。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸，所述核酸包含编码任何前述抗体的免疫球蛋白重链可变区和/或任何前述抗体的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列。
在另一方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含：(i)包含编码任何前述抗体的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列的核酸；和/或(ii)包含编码任何前述抗体的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列的核酸。
在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含任何前述核酸或表达载体。
在另一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含以下(或基本上由以下组成)：(a)唾液酸酶；和(b)源自于任何前述抗体的抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶是人类唾液酸酶，例如重组突变人类唾液酸酶。在某些实施方案中，唾液酸酶包含：(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的取代或缺失；(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的取代；(c)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基(K9)的取代；(d)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基(A42)的取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基(P62)的取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基(A93)的取代；(g)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的取代；(i)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基(A242)的取代；(j)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(k)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基(S301)的取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基(W302)的取代；(m)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的取代；(n)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基(V363)的取代；或(o)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基(L365)的取代；或任何前述取代的组合。
在某些实施方案中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸取代(M1A)或被天冬氨酸取代(M1D)；(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸取代(V6Y)；(c)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(d)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被精氨酸(A42R)或天冬氨酸(A42D)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；(g)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸取代(I187K)；(i)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、蛋氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(j)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；(k)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；(m)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸取代(C332A)；(n)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或(o)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；或者所述唾液酸酶包含任何前述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可包含选自ΔM1、M1A、M1D、V6Y、K9D、A42R、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、I187K、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、C332A、V363R和L365I的取代，或任何前述取代的组合。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A取代；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I取代；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A取代；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A取代；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A取代；(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；或(l)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变。
在某些实施方案中，唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4，例如，唾液酸酶是Neu2。
在某些实施方案中，唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。例如，在某些实施方案中，唾液酸酶可以切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。在某些实施方案中，唾液酸酶可以切割α2,3和α2,8键联。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含SEQ ID NO:48-62、94、97、100、126或234中的任一者，或与SEQ ID NO:48-62、94、97、100、126或234中任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含表1-9中任一者中所示的突变或突变的组合。
在某些实施方案中，融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM Fc结构域，例如，免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4 Fc结构域，例如免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
在某些实施方案中，抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域与第二抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域缔合(例如，共价或非共价缔合)以产生抗PD-L1抗原-结合位点。例如，在某些实施方案中，抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域是与免疫球蛋白轻链片段缔合以产生抗PD-L1抗原结合位点的免疫球蛋白重链片段。在其他实施方案中，抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域是与免疫球蛋白重链片段缔合以产生抗PD-L1抗原结合位点的免疫球蛋白轻链片段。
在某些实施方案中，唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域和/或抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸接头连接。
在某些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:205-207、211、213、214和219中的任一者。
在另一方面，本发明提供了包含任何前述融合蛋白的抗体缀合物。在某些实施方案中，抗体缀合物包含单一唾液酸酶。在其他实施方案中，抗体缀合物包含两个可以相同或不同的唾液酸酶。在某些实施方案中，抗体缀合物包含两个同一的唾液酸酶。在某些实施方案中，抗体缀合物包含单个抗PD-L1抗原结合位点。在其他实施方案中，抗体缀合物包含两个可以相同或不同的抗PD-L1抗原结合位点。在某些实施方案中，抗体缀合物包含两个同一的抗PD-L1抗原结合位点。
在某些实施方案中，抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa的分子量，或者抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
在某些实施方案中，抗体缀合物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；其中第一和第二多肽被共价连接在一起，并且第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。第三多肽可以例如以N-端至C-端的取向包含唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。第一多肽可以例如包含SEQ ID NO:205，第二多肽可以例如包含SEQ ID NO:206或213中的任一者，并且/或者第三多肽可以例如包含SEQID NO:207、211、214或219中的任一者。
在某些实施方案中，抗体缀合物包含：(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；其中第一和第二多肽被共价连接在一起，第三和第四多肽被共价连接在一起，并且第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。第二和第三多肽可以例如分别以N-端至C-端的取向包含第一和第二免疫球蛋白重链和第一和第二唾液酸酶。
在某些实施方案中，抗体缀合物包含：(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；其中第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中第一scFv限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且第二scFv在存在时限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。第一多肽可以例如以N-端至C-端的取向包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。第二多肽可以例如以N-端至C-端的取向包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二scFv。
在某些实施方案中，抗体缀合物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽，其中第一和第二多肽被共价连接在一起，并且第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且scFv限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。第二多肽可以例如以N-端至C-端的取向包含免疫球蛋白重链和scFv。第三多肽可以例如以N-端至C-端的取向包含唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
在另一方面，本发明提供了一种经分离的核酸，其包含编码任何前述抗体的至少一部分、任何前述融合蛋白，或任何前述抗体缀合物的至少一部分的核苷酸序列。在另一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含任何前述核酸。在另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含任何前述表达载体。
在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何前述抗体、任何前述融合蛋白，或任何前述抗体缀合物。
在另一方面，本发明提供了治疗有需要的受试者中的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的任何前述抗体、任何前述融合蛋白、任何前述抗体缀合物，或任何前述药物组合物。
在某些实施方案中，所述癌症选自非小细胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、转移性默克尔细胞癌(MCC)、转移性尿路上皮癌(UC)和胰腺癌。
本发明的这些和其他方面和特征描述在下面的详细描述和权利要求中。
附图说明
参考以下附图可以更全面地理解本发明。
图1描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组人类Neu1、Neu2、Neu3和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(St-唾液酸酶)。单体和二聚体物质被注明。
图2是示出了重组人类Neu1、Neu2和Neu3的酶促活性的条形图。
图3是示出了在所指示的pH下重组人类Neu2和Neu3的酶促活性随底物浓度而变的线图。
图4A-4I描绘了含有唾液酸酶例如人类唾液酸酶和抗PD-L1抗原结合位点的某些抗体缀合物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)唾液酸酶的每种抗体缀合物构建物来说，每个唾液酸酶可以相同或不同。对于含有超过一个(例如两个)抗PD-L1抗原结合位点的每种抗体缀合物构建物来说，每个抗PD-L1抗原结合位点可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体缀合物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化成含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化成含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图5描绘了含有唾液酸酶例如人类唾液酸酶和抗原结合位点的某些抗体缀合物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)抗原结合位点的每种抗体缀合物构建物来说，每个抗原结合位点可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体缀合物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化成含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化成含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图6A-6D是被称为Raptor抗体-唾液酸酶缀合物(图6A)、Janus抗体-唾液酸酶缀合物(图6B)、Lobster抗体-唾液酸酶缀合物(图6C)、Bunk抗体-唾液酸酶缀合物(图6D)和Lobster-Fab抗体唾液酸酶缀合物(图6E)的示例性融合蛋白缀合物的示意图。
图7提供了图表，该图表示出了包含抗PD-L1抗体的所指示杂交瘤上清液对PD-1/PD-L1连接的NFAT驱动的荧光素酶报道分子的诱导倍数，其证明了该抗体在功能上阻断PD-1/PD-L1之间相互作用的能力。图7A、图7B和图7C代表不同的杂交瘤，其中鉴定了诱导倍数大于4的候选抗体。
图8A、图8B、图8C和图8D提供了图表，该图表示出人类PD-L1与经纯化的杂交瘤抗体结合的ForteBio octet结合动力学。
图9A、图9B、图9C和图9D提供了图表，该图表示出猕猴PD-L1与经纯化的杂交瘤抗体结合的ForteBio octet结合动力学。
图10提供了图表，该图表示出指示经纯化的杂交瘤抗体阻断人类PD-1-Fc与人类PD-L1结合的能力的ELISA结果。示出了每种抗体的IC50(nM)。
图11提供了图表，该图表示出人类PD-L1(图11A和图11B)和猕猴PD-L1(图11C和图11D)与嵌合IgG抗体结合的ForteBio octet结合动力学。
图12提供了图表，该图表示出指示抗hPD-L1嵌合IgG阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力的ELISA结果。示出了每种抗体的IC50(nM)。
图13提供了所选嵌合IgG的尺寸排阻色谱(SEC)图谱。示出了每种嵌合抗体的单体百分比。
图14是示出嵌合PD-L1抗体与HCC827(图14A)和NCI-H292(图14B)肺上皮细胞系的结合的图表。使用用荧光素标记的二抗的FACS分析来测量结合。MFI＝平均荧光强度。示出了每种抗体的表观Kd(nM)。
图15是描绘嵌合PD-L1抗体在人类单核细胞来源的树突细胞(moDC)上的结合和内化水平的图表。在PAM3K存在或不存在(无-刺激)的情况下，将细胞与1nM、10nM所指示的抗体和10nM抗体一起孵育。
图16描绘了使用PD-L1/PD-1生物测定法时嵌合PD-L1抗体在功能上阻断PD-L1和PD-1之间的相互作用的能力。通过将经诱导细胞的RLU减去本底的RLU除以无抗体对照的RLU减去本底的RLU来计算诱导倍数。指示出了每种抗体的表观Kd(nM)。
图17描绘了嵌合PD-L1抗体与表达PD-L1的CHO细胞(CHO-PD-L1，在10nM下染色)相对于亲本CHO细胞(在100nM下染色)的结合特异性。
图18A-D是描绘在所指示的PD-L1抗体存在下T细胞增殖和细胞因子对同种异体moDC的响应与同种型对照(001-1)相比增强的图表。描绘了CD4 T细胞增殖水平(图18A)、CD8 T细胞增殖水平(图18B)、TNFα(图18C)和IFN-γ水平(图18D)。
图19是描绘在所指示的PD-L1抗体存在下T细胞中细胞因子对同种异体moDC的响应与同种型对照(001-1)相比增强的图表。描绘了IL-2(图19A)、IL-4(图19B)、IL-6(图19C)和IL-10(图19D)的水平。
图20是描绘在所指示的PD-L1抗体的存在下moDC-T细胞混合淋巴细胞反应(MLR)的脱粒化与同种型对照(001-1)相比增强。描绘了可溶性Fas配体(图20A)、颗粒酶A(图20B)、穿孔素(图20C)和颗粒溶素(图20D)的水平。
图21A描绘了鼠769VH-wt(SEQ ID NO：164)与人源化h769VH-mF0(SEQ ID NO：199)之间的比对。图21B描绘了鼠769Vk-wt(SEQ ID NO:167)与人源化h769Vk-mF0(SEQ ID NO:242)、h769Vk-T53I(SEQ ID NO:243)、h769Vk-A55F(SEQ ID NO:244)、h769Vk-S67Y(SEQ IDNO:245)和h769Vk-Y87F(SEQ ID NO:246)之间的比对。图21C描绘了人源化h769Vk-IY(SEQID NO:247)、h769Vk-IF2(SEQ ID NO:248)、h769Vk-tml(SEQ ID NO:249)、h769Vk-IF3(SEQID NO:200)、h769Vk-tm2(SEQ ID NO:201)和h769Vk-tm3(SEQ ID NO:202)之间的比对。框架区域以灰色示出。作为人源化一部分而制得的Vκ回复突变显示在方框中。
图22描绘了所选的769-hIgG1人源化变体的SEC图谱。
图23提供了图表，该图表示出人类PD-L1(图23A)和猕猴PD-L1(图23B)与所选的769-hIgG1人源化变体的ForteBio octet结合动力学。
图24提供了图表，该图表示出人源化PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。示出了每种抗体的IC50(nM)。
图25提供了图表，该图表示出所选的769-hIgG1人源化变体与人类PD-L1的ForteBio octet结合动力学。
图26描绘了所选的769-hIgG1人源化变体的SEC图谱。
图27提供了图表，该图表描绘了所选的769-hIgG1人源化变体增强T细胞对同种异体moDC的响应的能力。示出了CD4 T细胞增殖(图27A)、颗粒酶B(图27B)和IFN-γ(图27C)以及CD8 T细胞增殖(图27D)、颗粒酶A(图27E)和TNFα(图27F)的水平。
图28提供了图表，该图表描绘了响应于所选的769-hIgG1人源化变体而释放的所指示细胞因子的水平，其表明769-hIgG1人源化变体能够增强T细胞对同种异体moDC的响应。示出了穿孔素(图28A)、可溶性Fas(图28B)、IL-6(图28C)、颗粒溶素(图28D)、可溶性Fas配体(图28E)和IL-10水平(图28F)。
图29提供了图表，该图表描绘了响应于巨细胞病毒pp65肽混合物(“CMV pp65”)并且在存在所选的769-hIgG1人源化变体的情况下从外周血单核细胞(PBMC)释放的所指示细胞因子的水平。“无刺激”＝未经刺激的对照(即，细胞未暴露于CMV pp65)。示出了以pg/ml表示的IL-2(图29A)和TNFα(图29B)的水平。
图30提供了图表，该图表描绘了响应于巨细胞病毒pp65肽混合物(“CMV pp65”)并且在存在所选的769-hIgG1人源化变体的情况下从外周血单核细胞(PBMC)释放的所指示细胞因子的水平。“无刺激”＝未经刺激的对照(即，细胞未暴露于CMV pp65)。示出了以pg/ml表示的IL-6(图30A)和IL-17A(图30B)的水平。
图31提供了图表，该图表描绘了响应于巨细胞病毒pp65肽混合物(“CMV pp65”)并且在存在所选的769-hIgG1人源化变体的情况下从外周血单核细胞(PBMC)释放的所指示细胞因子的水平。“无刺激”＝未经刺激的对照(即，细胞未暴露于CMV pp65)。示出了以pg/ml表示的颗粒酶A(图31A)和颗粒酶B(图31B)的水平。
图32提供了图表，该图表描绘了响应于巨细胞病毒pp65肽混合物(“CMV pp65”)并且在存在所选的769-hIgG1人源化变体的情况下从外周血单核细胞(PBMC)释放的所指示细胞因子的水平。“无刺激”＝未经刺激的对照(即，细胞未暴露于CMV pp65)。示出了以pg/ml表示的穿孔素(图32A)和颗粒溶素(图32B)的水平。
图33提供了图表，该图表描绘了响应于巨细胞病毒pp65肽混合物(“CMV pp65”)并且在存在所选的769-hIgG1人源化变体的情况下从外周血单核细胞(PBMC)释放的IFN-γ的水平。“无刺激”＝未经刺激的对照(即，细胞未暴露于CMV pp65)。
图34描绘了所指示抗体的表位分箱夹心测定。
图35描述了唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物的生化特征。图35A提供了经纯化分子的非还原和还原PAGE的照片。图35B示出唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物(ASC1)的SEC图谱，经证明该缀合物的纯度为89％。
图36提供了图表，该图表示出所选的769-hIgG1人源化变体、PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC1)和阿特珠单抗与人类PD-L1的ForteBio octet结合动力学。
图37A和图37B描绘了第二唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物(ASC3)的生化特征。图37A描绘了第二唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物(ASC3)的SEC图谱。图37B是示出随着底物浓度的不断增加的指示唾液酸酶活性的相对荧光单位(RFU)的图表。测试了三个批次的经纯化的第二唾液酸酶抗PD-L1缀合物WG7、WG8和WG9，它们具有相似的活性。
图38描绘了具有失活唾液酸酶(ASC4功能丧失或LOF)的第三唾液酸酶-抗PD-L1缀合物的SEC图谱。
图39A和图39B描绘了第四唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物的生化特征。图39A描绘了第四唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物(ASC5)的SEC图谱。图39B是示出随着底物浓度的不断增加的指示第四唾液酸酶-抗PD-L1缀合物(ASC5)的唾液酸酶活性的相对荧光单位(RFU)的图表。
图40A描绘了第五唾液酸酶-抗-PD-L1缀合物(ASC2)的SEC图谱。图40B是示出随着底物浓度的不断增加的指示第五唾液酸酶-抗PD-L1缀合物(ASC2)的唾液酸酶活性的相对荧光单位(RFU)的图表。还描绘了ASC。
图41提供了图表，该图表示出与h769.T-1A进行比较的人类PD-L1(图41A)和猕猴PD-L1(图41B)与所选的唾液酸酶-抗PD-L1缀合物的ForteBio octet结合动力学，其中第二唾液酸酶PD-L1异二聚体是ASC2，第三唾液酸酶PD-L1异二聚体是ASC3，并且第四唾液酸酶PD-L1异二聚体是ASC4 LOF。
图42提供了实验的结果，在该实验中，使PD-L1抗体唾液酸酶缀合物或对照分子结合至表达PD-L1的细胞系(HCC827和NC-H292)，并然后暴露于缀合至荧光部分的二抗。该图示出随着唾液酸酶-抗PD-L1缀合物或对照分子浓度的不断增加的平均荧光单位(MFI)，其描绘了所指示ASC或抗体与HCC827(图42A)和NCI-H292(图42B)肺上皮细胞系的结合。
图43描绘了K562细胞(图43A)和HT-29细胞(图43B)上随唾液酸酶-抗PD-L1缀合物浓度的不断增加的MFI，其指示去唾液酸化。
图44描绘了所指示抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物在小鼠同基因皮下肿瘤模型中的体内功效。图44A中指示出所指示治疗21天内的平均肿瘤体积。三角形指示剂量。第21天的单个肿瘤体积描绘于图44B中。单向ANOVA(*p<0.05；**p<0.005；ns：不显著)。
图45描绘了如通过ELISA测量的ASC5对人类PD-L1和人类PD-1-Fc之间的相互作用的阻断。测试了ASC5的两个独立制剂(批号1和批号2)。还示出了h769.T-1A和阿特珠单抗的结果。仅人类PD-1-Fc(无抗体；完全PD-L1/PD-1结合)和仅缓冲液(无抗体且无人类PD-1-Fc；无PD-L1/PD-1结合)被用作对照。
图46描绘了ASC5对PD-L1和PD-1相互作用的阻断，如通过PD-1/PD-L1连接的NFAT驱动的荧光素酶报告基因的倍数诱导来测量的。示出了ASC5的三种独立制剂(第一批号、第二批号和第三批号)的结果。还示出了二价抗PD-L1抗体h769.T-1A和阿特珠单抗的结果。
图47描绘了DC-T共培养实验中ASC5对细胞因子释放的影响。ASC5在700nM(100mg/ml)下进行测试，h769.T-1A和阿特珠单抗在70nM(10mg/ml)下进行测试，并且同种型对照(001-1G)在100mg/ml下进行测试。每个数据点均代表单独的DC-T供体对。图47A描绘了ASC5、h769.T-1A、阿特珠单抗和同种型对照的IL-2的变化倍数。图47B、图47C和图47D分别示出了IFN-γ、IL-8和MCP1的类似数据。
图48描绘了各自处于所指示剂量下的ASC5和h769.T-1A在MC38小鼠同基因皮下肿瘤模型中的体内功效。同种型抗体(001-1G)和阿特珠单抗被用作对照。18天内的平均肿瘤体积±SEM描绘在图48A中。三角形指示药物施用。第18天的单个肿瘤体积描绘于图48B中。单向ANOVA(**p<0.005)。
图49描绘了ASC5和h769.T-1A在CT26小鼠同基因皮下肿瘤模型中的体内功效。同种型抗体(001-1G)被用作对照。18天内的肿瘤生长抑制描绘在图49A中。第18天的单个肿瘤体积描绘于图49B中。单向ANOVA(****p<0.05；ns：不显著)。
图50描绘了各自处于所指示剂量下的ASC5、ASC4 LOF和h769.T-1A在CT26小鼠同基因皮下肿瘤模型中的体内功效。同种型抗体(001-1G)和阿特珠单抗被用作对照。16天内的平均肿瘤体积±SEM描绘在图50A中。第16天的单个肿瘤体积描绘于图50B中。单向ANOVA(***p<0.05；ns：不显著)。
图51A描绘了重链可变区序列SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:199的CDR和框架序列。图51B描绘了轻链可变区序列SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248和SEQ ID NO:249的CDR和框架序列。框架序列以灰色示出。
具体实施方式
本发明部分基于影响或以其他方式下调由PD-1或PD-L1介导的信号传导的抗PD-L1抗体的发现。
此外，本发明还部分地基于以下发现：有可能产生含有唾液酸酶和抗PD-L1免疫球蛋白或其部分(例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域)的融合蛋白，和/或包含唾液酸酶和抗PD-L1抗体或其部分(例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域)的抗体缀合物。所述融合蛋白和/或抗体缀合物的唾液酸酶部分相对于野生型唾液酸酶可包含至少一个突变。所述突变或突变的组合可以改善唾液酸酶的表达、活性或表达和活性两者，以改善它在癌症诊断和/或治疗中的用途。所述融合蛋白和/或抗体缀合物具有合适的底物特异性和活性从而可用于从癌细胞(例如，表达PD-L1的癌细胞)表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子)以及/或者从肿瘤微环境中除去唾液酸和/或含唾液酸分子，以及/或者降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
本发明还涉及使用抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物治疗癌症的药物组合物和方法。
I.抗PD-L1抗体
除此之外，本发明提供了这样的抗体，该抗体结合PD-L1并且具有抑制PD-L1和/或PD-L1介导的下游活性的能力，并且因此可用于治疗与PD-L1水平升高相关联的病症，例如，癌症，例如，通过PD-L1介导的对受试者免疫系统的压制而逃避受试者免疫系统的癌症。据信，在某些实施方案中，本文所述的抗PD-L1抗体破坏PD-L1和PD-1之间的相互作用。
通常，抗体是含有四个多肽链的多聚蛋白质。其中两条多肽链被称为免疫球蛋白重链(H链)，并且其中两条多肽链被称为免疫球蛋白轻链(L链)。该免疫球蛋白重链和轻链通过链间二硫键连接。该免疫球蛋白重链通过链间二硫键连接。轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区(CL)组成。重链由一个可变区(VH)和至少三个恒定区(CH1、CH2和CH3)组成。该可变区决定抗体的结合特异性。
每个可变区均含有三个称为互补决定区(CDR)的高变区，其两侧是称为框架区(FR)的四个相对保守的区域。FR和CDR的范围已被定义(Kabat,E.A.等(1991)SEQUENCES OFPROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242；和Chothia,C.等(1987)J.MOL.BIOL.196:901-917)。称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR有助于抗体结合特异性。天然存在的抗体已被用作工程化抗体的起始材料，诸如嵌合抗体和人源化抗体。
当在本文中使用时，除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为意指完整的抗体(例如，完整的单克隆抗体)或其片段，诸如抗体的抗原结合片段(例如，单克隆抗体的抗原结合抗体)或抗体的Fc片段(例如，单克隆抗体的Fc片段)，包括完整抗体，抗原结合片段，或已被修饰、工程化或化学缀合的Fc片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链抗体(例如scFv)、微型抗体和双抗体。已被修饰或工程化的抗体的实例包括嵌合抗体、人源化抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。化学缀合抗体的实例是与毒素部分缀合的抗体。
如本文所公开的，本发明的抗体可以包含：(a)包含结构CDRH1-CDRH2-CDRH3的免疫球蛋白重链可变区和(b)包含结构CDRL1-CDRL2-CDRL3的免疫球蛋白轻链可变区，其中该重链可变区和轻链可变区共同限定用于结合PD-L1的单个结合位点。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL769-VL、h769-IF3-VL、h769-tm2-VL、h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:251的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:253的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL769-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(h769-IF3-VL、h769-tm2-VL、h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:250的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:252的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:255的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:254的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL752-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL752-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL759-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL759-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL760-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL760-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL767-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL767-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL771-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL771-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL785-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL785-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL787-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL787-VL)。
在某些实施方案中，抗体可包含：免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDRH3，其中CDRH1、CDRH2和CDRH3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL788-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDRL3，其中CDRL1、CDRL2和CDRL3序列嵌插在免疫球蛋白FR序列之间(PAL788-VL)。
类似地，本文公开的抗体可包含免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含选自SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:148、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:194的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含选自SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:190、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:242，SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248和SEQ ID NO:249的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL769-VH)，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL769-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-IF3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm2-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm3-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769.T-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL752-VH)，和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL752-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL759-VH)，和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL759-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL760-VH)，和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL760-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL767-VH)，和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL767-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL771-VH)，和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL771-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL785-VH)，和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL785-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL787-VH)，和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL787-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含：包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL788-VH)，和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL788-VL)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含氨基酸序列EVQLX1X2SGAEX3X4KPGAX5VX6X7SCX8X9SGFNIKDTYMHWVX10QX11PX12X13GLEWX14GX15IDPANDNTX16YX17X18KFQX19X20X21TIT ADTSX22DTAYX23X24LSSLX25SEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYW GQGTX26X27TVSS(SEQ ID NO:236)，
其中X1是Gln或Val，X2是Glu或Gln，X3是Leu或Val，X4是Val或Lys，X5是Ser或Thr，X6是Thr或Lys，X7是Leu或Ile，X8是Thr或Lys，X9是Ala或Val，X10是Lys或Gln，X11是Arg或Ala，X12是Glu或Gly，X13是Gln或Lys，X14是Ile或Met，X15是Arg或Leu，X16是Lys或Ile，X17是Asp或Ala，X18是Pro或Glu，X19是Asp或Gly，X20是Lys或Arg，X21是Ala或Val，X22是Ser或Thr，X23是Leu或Met，X24是Arg或Glu，X25是Thr或Arg，X26是Thr或Leu，并且X27是Leu或Val；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含氨基酸序列
X1IVMTQX2PX3X4LX5X6SX7GX8RVTX9X10CX11ASQSVSNDX12X13WYQQKPGQX14PX15LLIYYASIRFTGX16PX17RFX18GSGX19GTDF TX20TIX21X22X23QX24EDX25AVYX26CQQDYX27SPWTFGX28GTKX29EIK(SEQID NO:237),
其中X1是Ser或Glu，X2是Thr或Ser，X3是Lys或Pro，X4是Phe或Thr，X5是Leu或Ser，X6是Val或Leu，X7是Ala或Pro，X8是Asp或Glu，X9是Ile或Leu，X10是Thr或Ser，X11是Lys或Arg，X12是Val或Leu，X13是Ile或Ser，X14是Ser或Ala，X15是Lys或Arg，X16是Val或Ile，X17是AspX18是Ala或Ser，X19是Tyr或Ser，X20是Phe或Leu，X21是Asn或Ser，X22是Thr或Ser，X23是Val或Leu，X24是Ala或Pro，X25是Leu或Phe X26是Phe或Tyr，X27是Tyr或Thr，X28是Gly或Gln，并且X29是Leu或Val。
在某些实施方案中，分离的结合PD-L1的抗体包含免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含与选自SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:132、SEQ IDNO:140、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:194的氨基酸序列的整个可变区和/或框架区序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。可替代地或另外地，分离的结合PD-L1的抗体包含免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含与选自SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:144、SEQID NO:152、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQID NO:247、SEQ ID NO:248和SEQ ID NO:249的氨基酸序列的整个可变区和/或框架区序列至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。CDR和框架序列的鉴定在本领域普通技术人员的水平之内，并且应当理解，CDR和框架序列之间的界限可能取决于所使用的定义或惯例(例如，Kabat、Chothia、IMGT等)。重链可变区序列SEQ ID NO:164和SEQ ID NO:199的示例性CDR和框架序列描绘于图51A中，并且轻链可变区序列SEQ ID NO:167、SEQ IDNO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248和SEQ IDNO:249的示例性CDR和框架序列描绘于图51B中。
序列同一性可以以本领域技术范围内的各种方式，例如使用公开可用的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来确定。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool))分析(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL 36:290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402，其通过引用并入)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS 6:119-129，其整体通过引用并入。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合的参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大对齐所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于报告与数据库序列匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA89:10915-10919，其整体通过引用并入)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(空位生成罚分)；R＝10(空位延伸罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生单词命中)；和gapw＝16(设置在其中生成带空位的对齐的窗口宽度)。等效的Blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))的BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，开放空位成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延伸空位成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[整数]：默认值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[整数]：默认值＝1；-e，预期值[实数]：默认值＝10；-W，词长[整数]：默认值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast延伸的衰减(X)：默认值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带空位的比对的X衰减值(以字节为单位)：默认值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和-Z，带空位的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。用于逐对蛋白质比对的ClustalW也可以被使用(默认参数可以包括例如Blosum62矩阵和空位开放罚分＝10和空位延伸罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(空位生成罚分)和LEN＝3(空位延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设置是GAP＝8和LEN＝2。
在每个前述实施方案中，本文设想了一起结合PD-L1的免疫球蛋白重链可变区序列和/或轻链可变区序列可以各自在重链和/或轻链可变区的框架区中含有氨基酸改变(例如，至少1、2、3、4、5或10个氨基酸取代、缺失或添加)。
在某些实施方案中，设想了重链可变区序列，例如SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:170、SEQID NO:178、SEQ ID NO:186，或SEQ ID NO:194的VH序列，或它们的氨基酸变体可以与本领域已知的多种重链恒定区序列共价连接。类似地，考虑了轻链可变区序列，例如，SEQ IDNO:167、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:182、SEQ IDNO:190、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:242、SEQ ID NO:243、SEQ ID NO:244、SEQ ID NO:245、SEQ ID NO:246、SEQ ID NO:247、SEQ ID NO:248或SEQ ID NO:249的VL，或它们的氨基酸变体可以与本领域已知的多种轻链恒定区序列共价连接。
例如，抗体分子可以具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区，具体地，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的(例如人类)重链恒定区的重链恒定区。在另一个实施方案中，抗体分子具有选自例如κ或λ的(例如人类)轻链恒定区的轻链恒定区。该恒定区可以被改变，例如突变，以修饰该抗体的特性(例如，以增加或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能和/或补体功能)。在一个实施方案中，该抗体具有效应子功能并且可以固定补体。在其他实施方案中，该抗体不募集效应细胞或固定补体。在另一个实施方案中，该抗体具有减少的结合Fc受体的能力或者没有结合Fc受体的能力。例如，它是不支持与Fc受体的结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，它具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。
在某些实施方案中，该抗体的重链恒定区是具有以下氨基酸序列的人类IgG1同种型：
在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区在氨基酸Asn297(其在前段中SEQ IDNO:227中被框出)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Gly(N297G)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Leu235(其在前段中的SEQ IDNO:227中被框出)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Leu234(其在前段中的SEQ IDNO:227中被框出)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Glu233(其在前段中的SEQ ID NO:227中被框出)处被修饰，例如Glu233Pro(E233P)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸234和235二者处均被改变，例如Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸233、234和235处被改变，例如Glu233Pro、Leu234Ala和Leu235Ala(E233PL234A/L235A)(ArmourKL.等(1999)EUR.J.IMMUNOL.29(8):2613-24)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸234、235和329处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala和Pro329Gly(参见例如美国专利号8,969,526)。所有残基编号都是根据EU编号(Kabat，E.A.等，同上)。
在某些实施方案中，该抗体的重链恒定区是具有以下氨基酸序列的人类IgG1同种型：
在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区在氨基酸Asn297(其在前段中SEQ IDNO:221中被框出)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Gly(N297G)。例如，在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区包含SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:225或SEQ ID NO:226。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Leu235(其在前段中的SEQ ID NO:221中被框出)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)或Leu235Ala(L235A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Leu234(其在前段中的SEQ ID NO:221中被框出)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu234Ala(L234A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸Glu233(其在前段中的SEQ ID NO:221中被框出)处被修饰，例如Glu233Pro(E233P)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸234和235二者处均被改变，例如Leu234Ala和Leu235Ala(L234A/L235A)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸233、234和234处被改变，例如Glu233Pro、Leu234Ala和Leu235Ala(E233P L234A/L235A)(Armour KL.等(1999)EUR.J.IMMUNOL.29(8):2613-24)。在某些实施方案中，所述抗体的恒定区在氨基酸234、235和329处被改变，例如Leu234Ala、Leu235Ala和Pro329Gl y(参见例如美国专利号8,969,526)。所有残基编号都是根据EU编号(Kabat，E.A.等，同上)。
在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区被修饰成包含“杵”突变(例如，T366Y)，或“臼”突变(例如，Y407T)，以用于与第二恒定区异二聚化(残基编号是根据EU编号(Kabat，E.A.等人，同上))。例如，在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区包含Y407T突变(例如，所述人类IgG1恒定区包含SEQ ID NO:223或SEQ ID NO:225)。在某些实施方案中，所述人类IgG1恒定区包含T366Y突变(例如，所述人类IgG1恒定区包含SEQ ID NO:224或SEQ IDNO226)。
在某些实施方案中，所述抗体的重链恒定区是人类IgG1同种型，例如人类IgG1同种型的同种异型，例如IgG1 G1m3同种异型。示例性的人类IgG1同种异型描述于Magdelaine-Beuzelin等(2009)PHARMACOGENET.GENOMICS19(5):383-7。
在某些实施方案中，所述抗体的重链恒定区是具有以下氨基酸序列的人类IgG2同种型：
在某些实施方案中，所述人类IgG2恒定区在氨基酸Asn297(其在前段中SEQ IDNO:228中被框出)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Gly(N297G)，其中残基编号是根据EU编号(Kabat,E.A.等,同上)。
在某些实施方案中，所述抗体的重链恒定区是具有以下氨基酸序列的人类IgG3同种型：
在某些实施方案中，所述人类IgG3恒定区在氨基酸Asn297(其在前段中SEQ IDNO:229中被框出)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Gly(N297G。在某些实施方案中，所述人类IgG3恒定区在氨基酸Arg435(其在前段中的SEQ IDNO:229中被框出)处被修饰以延长半衰期，例如Arg435H(R435H)。所有残基编号都是根据EU编号(Kabat，E.A.等，同上)。
在某些实施方案中，所述抗体的重链恒定区是具有以下氨基酸序列的人类IgG4同种型：
在某些实施方案中，所述人类IgG4恒定区在铰链区内被修饰以防止或减少链交换，例如，在某些实施方案中，人类IgG4恒定区在Ser228(其在前段中的SEQ ID NO:230中被框出)处被修饰，例如，Ser228Pro(S228P)。在其他实施方案中，所述人类IgG4恒定区在氨基酸Leu235(其在前段中的SEQ ID NO:230中被框出)处被修饰以改变Fc受体相互作用，例如Leu235Glu(L235E)。在某些实施方案中，所述人类IgG4恒定区在Ser228和Leu335处均被修饰，例如Ser228Pro和Leu235Glu(S228P/L235E)。在某些实施方案中，所述人类IgG4恒定区在氨基酸Asn297(其在前段中的SEQ ID NO:230中被框出)处被修饰以防止所述抗体的糖基化，例如Asn297Ala(N297A)或Asn297Gly(N297G)。所有残基编号都是根据EU编号(Kabat，E.A.等，同上)。
在某些实施方案中，所述人类IgG恒定区被修饰以增强FcRn结合。增强与FcRn的结合的Fc突变的实例是Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu(分别为M252Y、S254T、T256E)(Dall’Acqua等人(2006)J.BIOL.CHEM.281(33):23514-23524)，或Met428Leu和Asn434Ser(M428L,N434S)(Zalevsky等人(2010)NATURE BIOTECH.28(2):157-159)。所有残基编号都是根据EU编号(Kabat，E.A.等，同上)。
在某些实施方案中，所述人类IgG恒定区被修饰以改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如以下文献中描述的氨基酸修饰：Natsume等人(2008)CANCER RES.68(10):3863-72；Idusogie等人(2001)J.IMMUNOL.166(4):2571-5；Moore等人(2010)MABS2(2):181-189；Lazar等人(2006)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 103(11):4005-4010，Shields等人(2001)J.BIOL.CHEM.276(9):6591-6604；Stavenhagen等人(2007)CANCER RES.67(18):8882-8890；Stavenhagen等人(2008)ADVAN.ENZYME REGUL.48:152-164；Alegre等人(1992)J.IMMUNOL.148:3461-3468。
在某些实施方案中，所述人类IgG恒定区被修饰以诱导异二聚化。例如，在CH3结构域内的Thr366处具有氨基酸修饰(例如用更大体积的氨基酸例如Tyr进行的取代(T366W))的重链能够优先与具有分别在Thr366、Leu368和Tyr407位置对体积较小的氨基酸(例如Ser、Ala和Val)进行的氨基酸修饰(T366S/L368A/Y407V)的CH3结构域的第二重链配对。经由CH3修饰的异二聚化可以通过引入二硫键，例如通过在相反的CH3结构域上将Ser354改变为Cys(S354C)和将Y349改变为Cys(Y349C)来进一步稳定化(参见Carter(2001)J.IMMUNOL.METHODS248:7-15)。
在某些实施方案中，所述抗体的轻链恒定区是人类κ恒定区，例如具有以下氨基酸序列的人类κ恒定区：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:231)，
在某些实施方案中，所述抗体的轻链恒定区是人类κ恒定区，例如具有以下氨基酸序列的人类κ恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:232)。
在某些实施方案中，所述抗体的轻链恒定区是人类λ恒定区，例如具有以下氨基酸序列的人类λ恒定区：
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC(SEQ ID NO:233)。
在某些实施方案中，所述抗体包含免疫球蛋白重链，所述免疫球蛋白重链包含SEQID NO:235的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:235具有至少85％、90％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；和/或免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:205具有至少85％、90％、94.5％95％、95.5％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述抗体以20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.1nM、0.075nM，或0.05nM或更低的KD结合人类PD-L1，如使用标准结合测定，例如表面等离子体共振或生物层干涉测量法测量的。在某些实施方案中，所述抗体以约20nM至约0.05nM、约20nM至约0.075nM、约20nM至约0.1nM、约20nM至约0.5nM、约20nM至约1nM、约10nM至约0.05nM、约10nM至约0.075nM、约10nM至约0.1nM、约10nM至约0.5nM、约10nM至约1nM、约5nM至约0.05nM、约5nM至约0.075nM、约5nM至约0.1nM、约5nM至约0.5nM、约5nM至约1nM、约3nM至约0.05nM、约3nM至约0.075nM、约3nM至约0.1nM、约3nM至约0.5nM、约3nM至约1nM、约3nM至约2nM、约2nM至约0.05nM、约2nM至约0.075nM、约2nM至约0.1nM、约2nM至约0.5nM、约2nM至约1nM、约1nM至约0.05nM、约1nM至约0.075nM、约1nM至约0.1nM、约1nM至约0.5nM、约0.5nM至约0.05nM、约0.5nM至约0.075nM、约0.5nM至约0.1nM、约0.1nM至约0.05nM、约0.1nM至约0.075nM,或约0.075nM至约0.05nM，或约0.05nM至约0.035nM的KD结合人类PD-L1，如使用标准结合测定法，例如表面等离振子共振或生物层干涉测量法测量的。
在某些实施方案中，除了结合人类PD-L1之外，所公开的抗体还与食蟹猕猴(猕猴)PD-L1结合。例如，所述抗体以20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.75nM、0.5nM、0.1nM、0.075nM，或0.05nM或更低的KD结合猕猴PD-L1，如使用标准结合测定法，例如表面等离振子共振或生物层干涉测量法测量的。在某些实施方案中，所述抗体以约20nM至约0.05nM、约20nM至约0.075nM、约20nM至约0.1nM、约20nM至约0.5nM、约20nM至约1nM、约10nM至约0.05nM、约10nM至约0.075nM、约10nM至约0.1nM、约10nM至约0.5nM、约10nM至约1nM、约5nM至约0.05nM、约5nM至约0.075nM、约5nM至约0.1nM、约5nM至约0.5nM、约5nM至约1nM，约3nM至约0.05nM、约3nM至约0.075nM、约3nM至约0.1nM、约3nM至约0.5nM、约3nM至约1nM、约3nM至约2nM、约2nM至约0.05nM、约2nM至约0.075nM、约2nM至约0.1nM、约2nM至约0.5nM、约2nM至约1nM、约1nM至约0.05nM、约1nM至约0.075nM、约1nM至约0.1nM、约1nM至约0.5nM、约0.5nM至约0.05nM、约0.5nM至约0.075nM、约0.5nM至约0.1nM、约0.1nM至约0.05nM、约0.1nM至约0.075nM，或约0.075nM至约0.05nM的KD结合猕猴PD-L1，如使用标准结合测定法，例如表面等离振子共振或生物层干涉测量法测量的。
在某些实施方案中，所述抗体干扰PD-L1与PD-1的结合。
在某些实施方案中，本发明提供了与PD-L1中存在的与本文公开的抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。在某些实施方案中，本发明提供了与本文公开的抗体竞争与PD-L1结合的抗体。
用于确定抗体是否与所公开的抗体结合至相同表位或竞争结合的竞争测定法是本领域已知的。示例性竞争测定法包括免疫测定法(例如，ELISA测定法、RIA测定法)、表面等离子体共振(例如，BIAcore分析)、生物层干涉测量法和流式细胞术。
通常，竞争测定法涉及使用结合至固体表面或在细胞表面上表达的抗原(例如，人类PD-L1蛋白或其片段)、测试PD-L1结合抗体和参考抗体。参考抗体被标记，而测试抗体未被标记。通过确定在测试抗体存在的情况下结合至固体表面或细胞的经标记参考抗体的量来测量竞争性抑制。通常测试抗体以过量(例如1x、5x、10x、20x或100x)存在。通过竞争测定法鉴定的抗体(即，竞争性抗体)包括与参考抗体结合至相同表位或相似(例如，重叠)表位的抗体，以及与与参考抗体所结合的表位足够接近的相邻表位结合以便发生空间位阻的抗体。
可以在两个方向上进行竞争测定，以确保标记的存在不会干扰或以其他方式抑制结合。例如，在第一方向上，参考抗体被标记而测试抗体未被标记，而在第二方向上，测试抗体被标记而参考抗体未被标记。
如果如在竞争性结合测定中所测量的，过量的一种抗体(例如，1x、5x、10x、20x或100x)将另一种抗体的结合抑制了例如至少50％、75％、90％、95％或99％，则测试抗体与参考抗体竞争与抗原的特异性结合。
如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变都减少或消除另一种抗体的结合，则可以确定两种抗体与相同的表位结合。如果只有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则可以确定两种抗体与重叠的表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:164至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:167至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:199至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:200至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:199至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:199至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:202至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:199至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、89.5％、90％、90.5％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:204至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:132至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:136至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:140至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:144至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:148至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:152至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:156至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:160至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:170至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:174至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:178至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:182至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:186至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:190至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
在某些实施方案中，所述抗体(i)包含有包含与SEQ ID NO:194至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含与SEQ ID NO:198至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区，并且(ii)与包含有包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区的抗体竞争与人类PD-L1的结合并且/或者与人类PD-L1上的相同表位结合。
本文公开的抗体可以被进一步优化(例如，亲和力成熟)以改善包括亲和力和/或特异性在内的生化特征，改善包括聚集、稳定性、沉淀和/或非特异性相互作用在内的生物物理性质，并且/或者降低免疫原性。亲和力成熟程序在本领域普通技术范围内。例如，可以通过DNA改组、链改组、CDR改组、随机诱变和/或位点特异性诱变将多样性引入到免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链中。
在某些实施方案中，分离的人类抗体含有一种或多种体细胞突变。在这些情况下，可以将抗体修饰为人类种系序列以优化抗体(即，称为种系的过程)。
通常，经优化的抗体对抗原的亲和力与该经优化的抗体所源自的非经优化(或亲本)抗体至少相同或基本相同。优选地，当与亲本抗体相比时，经优化的抗体对抗原具有更高的亲和力。
如果该抗体被用作治疗剂，则可以使用标准体外缀合化学将该抗体缀合至效应剂，诸如小分子毒素或放射性核素。如果效应剂是多肽，则该抗体可以化学缀合至该效应物或者作为融合蛋白与效应物联接。融合蛋白的构建在本领域的普通技术范围内。
可以使用标准体外缀合化学将该抗体缀合至效应部分，诸如小分子毒素或放射性核素。如果该效应部分是多肽，则该抗体可以化学缀合至该效应物或者作为融合蛋白与效应物联接。融合蛋白的构建在本领域的普通技术范围内。
II.唾液酸酶抗PD-L1融合蛋白
为了促进超唾液酸化癌细胞(诸如表达PD-L1的癌细胞)上和/或肿瘤微环境中唾液酸的选择性去除，将如本文中所描述的唾液酸酶靶向此种细胞或此种肿瘤微环境可能是有帮助的。此外，为了在受试者中促进用唾液酸酶除去唾液酸，延长唾液酸酶在受试者中的血浆半衰期可能是有帮助的。这些可以通过将唾液酸酶包含在融合蛋白和/或抗体缀合物(例如化学缀合的缀合物)中来实现。
因此，本发明还提供了融合蛋白，其包含唾液酸酶或其功能性片段和抗PD-L1抗体的部分或片段诸如免疫球蛋白Fc结构域(在本文中也被称为Fc结构域)或免疫球蛋白抗原结合结构域(在本文中也被称为抗原结合结构域)。在某些实施方案中，所述唾液酸酶和所述抗PD-L1抗体或其部分(例如免疫球蛋白Fc结构域或抗原结合结构域)通过肽键或氨基酸接头连接。
当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“融合蛋白”被理解为是指包含基于两个或更多个分开的蛋白质或多肽链的氨基酸序列的单一多肽链，其中所述两个氨基酸序列可以直接地或经由居间的接头序列例如经由居间的氨基酸接头融合在一起。编码此种融合蛋白的核苷酸序列可以例如使用常规的重组DNA技术来产生。
在某些实施方案中，融合蛋白包含标签诸如Strep标签(例如Strep II标签)、His标签(例如10x His标签)、myc标签或FLAG标签。所述标签可以位于所述融合蛋白的C-端或N-端上。
a.唾液酸酶部分
当在本文中使用时，术语“唾液酸酶”是指从底物例如糖蛋白或糖脂切下末端唾液酸残基的任何酶或其功能性片段。术语唾液酸酶包括相对于野生型唾液酸酶序列具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的变体和/或包括唾液酸酶的融合蛋白或缀合物。唾液酸酶也被称为神经氨酸酶，并且除非另有指明，否则这两个术语在本文中可互换使用。当在本文中使用时，术语唾液酸酶的“功能性片段”是指全长唾液酸酶的片段，其保留了所述相应的全长、天然存在的唾液酸酶的例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的酶促活性。唾液酸酶的酶促活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放。在某些实施方案中，所述功能性片段包含在全长、天然存在的唾液酸酶中存在的至少100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360或370个连续氨基酸。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗PD-L1融合蛋白的唾液酸酶部分源自于真核唾液酸酶，例如哺乳动物唾液酸酶(例如人类或小鼠唾液酸酶)。
人类基因组中编码四种唾液酸酶：Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。人类Neu1是一种溶酶体神经氨酸酶，其在与β-半乳糖苷酶和组织蛋白酶A的复合物中发挥作用。人类Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:7中，编码人类Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:23中。
人类Neu2是一种胞浆唾液酸酶。人类Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:1中，编码人类Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:24中。当在本文中使用时，除非另有陈述，否则野生型人类Neu2是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人类Neu2。
人类Neu3是一种质膜唾液酸酶，具有特异性针对神经节苷脂的活性。人类Neu3具有两种同工型：同工型1和同工型2。人类Neu3同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:8中，编码人类Neu3同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:25中。人类Neu3同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:9中，编码人类Neu3同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:34中。
人类Neu4具有两种同工型：同工型1是一种外周膜蛋白，同工型2局限于溶酶体腔。人类Neu4同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:10中，编码人类Neu4同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:26中。人类Neu4同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:11中，编码人类Neu4同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:35中。
在小鼠基因组中也已发现四种唾液酸酶，它们被称为Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。小鼠Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:38中，编码小鼠Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ IDNO:42中。小鼠Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:39中，编码小鼠Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:43中。小鼠Neu3的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:40中，编码小鼠Neu3的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:44中。小鼠Neu4的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:41中，编码小鼠Neu4的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:45中。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗PD-L1融合蛋白的唾液酸酶部分源自于原核唾液酸酶。示例性的原核唾液酸酶包括来自于鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的唾液酸酶。鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶(St-唾液酸酶)的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:30中，编码鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:6中。霍乱弧菌唾液酸酶的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:36中，编码霍乱弧菌唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ IDNO:37中。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗PD-L1融合蛋白的唾液酸酶部分是突变唾液酸酶，例如重组突变人类唾液酸酶。在某些实施方案中，重组突变人类唾液酸酶具有相应(或模板)野生型人类唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％，或超过100％的酶促活性。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶具有与所述相应的野生型人类唾液酸酶相同的底物特异性。在其他实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶具有与所述相应的野生型人类唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶可以切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。在某些实施方案中，所述唾液酸酶可以切割α2,3和α2,8键联。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞、CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞(NS0、Sp2/0)或人纤维肉瘤细胞(HT-1080)，例如HEK293细胞中的表达产量，高于所述相应的野生型人类唾液酸酶的表达产量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶具有相应的野生型人类唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶促活性，并且所述重组突变人类唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞中的表达产量高于所述相应的野生型人类唾液酸酶的表达产量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶的氨基酸序列与相应的野生型人类唾液酸酶得氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
1.半胱氨酸残基的取代
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含至少一个半胱氨酸(cys，C)残基的取代。已发现，唾液酸酶中的某些半胱氨酸残基可能作为蛋白质聚集的结果而抑制有功能蛋白质的表达。因此，在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶含有至少一个突变以除去游离半胱氨酸(例如对于Neu1(SEQ ID NO:7)来说，例如C111、C117、C171、C183、C218、C240、C242和C252中的一者或多者的突变；对于Neu2(SEQ ID NO:1)来说，例如C125、C196、C219、C272、C332和C352中的一者或多者的突变；对于Neu3(SEQ ID NO:8)来说，例如C7、C90、C99、C106、C127、C136、C189、C194、C226、C242、C250、C273、C279、C295、C356、C365、C368、C384、C383、C394和C415中的一者或多者的突变；以及对于Neu4(SEQ ID NO:10)来说，C88、C125、C126、C186、C191、C211、C223、C239、C276、C437、C453、C480和C481中的一者或多者的突变)。游离半胱氨酸可以被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，所述游离半胱氨酸被丝氨酸(ser，S)、异亮氨酸(iso，I)、缬氨酸(val，V)、苯丙氨酸(phe，F)、亮氨酸(leu，L)或丙氨酸(ala，A)取代。Neu2中的示例性半胱氨酸取代包括C125A、C125I、C125S、C125V、C196A、C196L、C196V、C272S、C272V、C332A、C332S、C332V、C352L和C352V。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含两个或更多个半胱氨酸取代。Neu2中的示例性双重或三重半胱氨酸取代包括：C125S和C332S；C272V和C332A；C272V和C332S；C332A和C352L；C125S和C196L；C196L和C352L；C196L和C332A；C332A和C352L；以及C196L、C332A和C352L。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶是Neu2唾液酸酶并包含取代C322A和C352L。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶在人类唾液酸酶例如Neu2或Neu3中通常存在的2、3、4、5或6个半胱氨酸处含有氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表1中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表1
2.增加pI和/或降低疏水性的残基取代
蛋白质的等电点(pI)是净电荷为零时的pH。pI通常也指示了蛋白质可溶性最低时的pH，其可能影响表达和纯化所述蛋白质的能力。通常，如果蛋白质的pI比溶液的pH高超过2个单位，则它具有良好的溶解性。人类Neu2具有7.5的预测pI。因此，人类Neu2在中性pH附近溶解性最低，这是不合乎需要的，因为表达和生理体系在中性pH处。相反，表现出良好的溶解性和重组表达的来自于鼠伤寒沙门氏菌的唾液酸酶(St-唾液酸酶)具有9.6的pI。因此，为了增加人类Neu2或其他人类唾液酸酶的表达，可以将重组突变人类唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶增加所述唾液酸酶的pI。此外，减少唾液酸酶表面上疏水氨基酸的数目可能例如通过减少聚集而改进唾液酸酶的表达。因此，为了增加人类Neu2或其他人类唾液酸酶的表达，可以将重组突变人类唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶降低所述唾液酸酶表面的疏水性。
因此，在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶增加所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性。这可以通过将一个或多个带电荷的氨基酸例如带正或负电荷的氨基酸引入到所述重组唾液酸酶中来实现。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是取代成带电荷的氨基酸例如带正电荷的氨基酸如赖氨酸(lys，K)、组氨酸(his，H)或精氨酸(arg，R)或带负电荷的氨基酸如天冬氨酸(asp，D)或谷氨酸(glu，E)。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是取代成赖氨酸残基。在某些实施方案中，所述取代将所述唾液酸酶的pI增加到约7.75、约8、约8.25、约8.5、约8.75、约9、约9.25、约9.5或约9.75。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代发生在表面暴露的D或E氨基酸处，在螺旋或环中，或在St-唾液酸酶的相应位置中具有K或R的位置中。在某些实施方案中，所述氨基酸取代发生在远离催化位点或不参与催化的氨基酸、不与其他人类Neu蛋白或与St-唾液酸酶或梭菌属(Clostridium)NanH保守的氨基酸或不位于对功能重要的结构域(例如Asp-盒或β链)中的氨基酸处。
Neu2中相对于没有取代的唾液酸酶增加所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性的示例性氨基酸取代包括A2E、A2K、D215K、V325E、V325K、E257K和E319K。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含两个或更多个氨基酸取代，包括例如A2K和V325E、A2K和V325K、E257K和V325K、A2K和E257K以及E257K和A2K和V325K。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表2中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表2
| 取代 |
| A2K |
| E72K |
| D215K |
| E257K |
| V325K |
| A2K+E257K |
| A2K+V325E |
| A2K+V325K |
| E257K+V325K |
3.N-端肽的添加和N-端或C-端的取代
已发现，向人类唾液酸酶的N-端添加两个或更多个氨基酸的肽序列可以提高所述唾液酸酶的表达和/或活性。在某些实施方案中，所述肽的长度为至少2个氨基酸，例如长度为2至20、2至10、2至5或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽可以形成α-螺旋或具有形成α-螺旋的倾向性。
在小鼠中，在胸腺中发现的Neu2同工型(B型)含有在骨骼肌中发现的Neu2的经典同工型中不存在的6个氨基酸。在本文的某些实施方案中，可以将所述小鼠胸腺Neu2同工型的N-端6个氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO:4)或其变体添加到人类Neu例如人类Neu2上。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的长度为至少2个氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的肽MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ ID NO:3)。在某些实施方案中，所述唾液酸酶还可以包含位于所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ ID NO:3)与所述唾液酸酶的其余部分之间的切割位点，例如蛋白水解切割位点。在某些实施方案中，所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ ID NO:3)可以在翻译后从所述唾液酸酶的其余部分上切掉。
可替代地或与所述N-端添加相组合，可以移除所述重组突变人类唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸，例如可以移除N-端甲硫氨酸。在某些实施方案中，如果所述重组突变人类唾液酸酶是Neu2，则可以移除N-端甲硫氨酸，可以移除前5个氨基酸(MASLP；SEQ ID NO:12)，或者可以移除第二至第四个氨基酸(ASLP；SEQ ID NO:13)。
在某些实施方案中，将所述重组突变人类唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)取代。例如在某些实施方案中，如果所述重组突变人类唾液酸酶是Neu2，则将氨基酸MASLP(SEQ ID NO:12)、ASLP(SEQ ID NO:13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)取代。
人类唾液酸酶具有β-螺旋桨结构，其特征是围绕中心轴呈环形排列的6个叶片形β-片层。通常，β-螺旋桨的叶片之间、包括N-和C-端叶片之间的疏水相互作用增强稳定性。因此，为了增加人类Neu2或其他人类唾液酸酶的表达，可以将重组突变人类唾液酸酶设计成包含增加所述唾液酸酶的N-和C-端β-螺旋桨叶片之间的疏水相互作用和/或氢键结合的氨基酸取代。
因此，在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶增加所述唾液酸酶的N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合。在某些实施方案中，将所述野生型氨基酸用天冬酰胺(asn，N)、赖氨酸(lys，K)、酪氨酸(tyr，Y)、苯丙氨酸(phe，F)或色氨酸(trp，W)取代。Neu2中增加N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合的示例性取代包括L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含V6Y取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含上述取代的组合。例如，重组突变人类Neu2唾液酸酶可以在N-端处包含添加的氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)，并且相组合，可以包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W取代中的至少一者。在某些实施方案中，将重组突变人类Neu2唾液酸酶的氨基酸MASLP(SEQ ID NO:12)、ASLP(SEQ ID NO:13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)代替，并且所述重组突变人类Neu2唾液酸酶还包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W取代中的至少一者。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表3中列出的突变或突变组合的突变或突变组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表3
此外，在某些实施方案中，所述唾液酸酶在所述唾液酸酶的N-端处包含N-端甲硫氨酸的取代或缺失。例如，在某些实施方案中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQID NO:1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的取代，例如，所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸被丙氨酸(M1A)或天冬氨酸(M1D)取代。在其他实施方案中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的缺失(ΔM1)。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表4中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表4
4.减少蛋白水解切割的残基取代
已发现，某些唾液酸酶(例如人类Neu2)易于被蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割。结果，所述唾液酸酶的蛋白水解切割可能在重组蛋白生产、收获、纯化或配制期间、向受试者施用期间或在施用到受试者之后发生。因此，在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的取代，其中所述取代降低所述唾液酸酶相对于没有所述取代的唾液酸酶被蛋白酶(例如胰蛋白酶)的切割。
在某些实施方案中，将所述重组突变唾液酸酶人类唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)孵育，产生约1％至约50％、约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％、约1％至约5％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约10％、约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约30％、约10％至约20％、约20％至约50％、约20％至约40％、约20％至约30％、约30％至约50％、约30％至约40％或约40％至约50％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下孵育时的蛋白水解切割。在某些实施方案中，将所述重组突变人类唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)孵育，产生低于50％、低于40％、低于30％、低于10％、低于5％、低于3％、低于1％或低于0.5％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下孵育时的蛋白水解切割。蛋白水解切割可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括例如通过在本文实施例4中所描述的SDS-PAGE。
增加对蛋白水解切割的抗性的示例性取代包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO:1)的第242位的位置处丙氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第243位的位置处精氨酸残基的取代，例如被谷氨酸(R243E)、组氨酸(R243H)、天冬酰胺(R243N)、谷氨酰胺(R243Q)或赖氨酸(R243K)取代；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第244位的位置处缬氨酸残基的取代，例如被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；或(iv)任何前述取代的组合。在某些实施方案中，重组突变人类唾液酸酶包含选自A242C、A242F、A242Y和A242W的取代。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表5中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表5
增加对蛋白水解切割的抗性(和/或增加表达产量和/或酶促活性)的另外的示例性取代包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第240位的位置处亮氨酸残基的取代，例如被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第213位的位置处丙氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第241位的位置处精氨酸残基的取代，例如被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(iv)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第258位的位置处丝氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸取代(S258C)；(v)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第260位的位置处亮氨酸残基的取代，例如被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(vi)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第265位的位置处缬氨酸残基的取代，例如被苯丙氨酸取代(V265F)；或(vii)任何前述取代的组合。设想了在某些实施方案中，在这些位置处的取代或取代组合可以改善所述唾液酸酶中二级结构元件之间(例如α-螺旋与最近的β-片层之间)的疏水和/或芳香性相互作用，从而使所述结构稳定并提高对蛋白水解切割的抗性。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含在L240位置处的突变。在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含在下述位置处的突变的组合：(i)A213和A242；(ii)A213、A242和S258；(iii)L240和L260；(iv)R241和A242；(v)A242和L260；(vi)A242和V265；或(vii)L240和A242。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含选自下述的取代组合：(i)A213C、A242F和S258C；(ii)A213C和A242F；(iii)A213T和A242F；(iv)R241Y和A242F；和(v)L240Y和A242F。在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表6中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表6
5.其他取代
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含以下取代中的至少一者：I187K、A328E、K370N或H210N。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸GDYDAPTHQVQW(SEQ ID NO:15)被氨基酸SMDQGSTW(SEQ ID NO:16)或STDGGKTW(SEQ ID NO:17)的取代。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸PRPPAPEA(SEQ ID NO:18)被氨基酸QTPLEAAC(SEQ ID NO:19)的取代。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸NPRPPAPEA(SEQ ID NO:20)被氨基酸SQNDGES(SEQ ID NO:21)的取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含在对应于V212、A213、Q214、D215、T216、L217、E218、C219、Q220、V221、A222、E223、V224、E225或T225的位置处的至少一个取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶在表7中标识的位置处包含氨基酸取代(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含在表7中标识的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含在表7中标识的任何氨基酸取代的组合。
表7
例如，在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基(A42)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；(j)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；(k)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；(l)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；(m)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；(n)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；(o)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；(p)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(q)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；(r)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；(s)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；(t)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；(u)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；(v)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；(w)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(x)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；(y)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；(z)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；(oo)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或(pp)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；或任何前述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、A42、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何前述取代的组合。
在某些实施方案中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被精氨酸(A42R)或天冬氨酸(A42D)取代；(d)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；(g)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q69H)；(i)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸取代(R78K)；(j)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸取代(D80P)；(k)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸取代(G107D)；(m)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q108H)；(n)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)取代；(o)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸取代(C125L)；(p)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯基丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；(q)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸取代(A150V)；(r)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸取代(C164G)；(s)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R170P)；(t)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸取代(A171G)；(u)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸取代(Q188P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R189P)；(w)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(x)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)取代；(y)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸取代(T249A)；(z)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸取代(D251G)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸(E225P)取代；(bb)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸取代(H239P)；(cc)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(dd)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(ee)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(ff)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I),赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；(gg)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E257P)；(hh)对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S258C)；(ii)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(jj)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸取代(V265F)；(kk)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；(ll)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸(W292R)取代。(mm)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、甘氨酸(S301G)、组氨酸(S301H)、异亮氨酸(S301I)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；(nn)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、谷氨酸(W302E)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；(oo)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或(pp)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；或者所述唾液酸酶包含任何前述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、A42R、P62G、P62N、P62S、P62T、D80P、A93E、Q126H、Q126Y、R189P、H239P、A242T、Q270A、Q270S、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I的取代或任何前述取代的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的亮氨酸残基的缺失(ΔL184)、对应于野生型人类Neu2的第185位的位置处的组氨酸残基的缺失(ΔH185)、对应于野生型人类Neu2的第186位的位置处的脯氨酸残基的缺失(ΔP186)、对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基的缺失(ΔI187)和对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的谷氨酰胺残基的缺失(ΔQ188)，或任何前述缺失的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第216位的位置处的苏氨酸残基与对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基之间的插入，例如选自S、T、Y、L、F、A、P、V、I、N、D和H的氨基酸的插入。
另外的示例性唾液酸酶突变和唾液酸酶突变的组合描述在2019年1月3日提交的国际(PCT)专利申请公布号WO 2019/136167中，包括在详细描述中题为“I.重组人类唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例1、2、3、4、5和6中；并且描述在国际(PCT)专利申请公布号WO 2021/003469中，包括在详细描述中题为“I.重组人类唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例2、3、4和5中；并且描述在2021年7月2日提交的国际(PCT)专利申请号PCT/US2021/040240中，包括在详细描述中题为“I.重组人类唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例2、3、4和5中。
6.取代的组合
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶，其包含本文中设想的任何突变的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个本文中设想的突变的组合。设想了所述重组突变唾液酸酶可以包含1-15、1-10、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-10、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-10、3-7、3-6、3-5或3-4个本文中设想的突变。
例如，重组突变唾液酸酶可包含M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、K9D取代、P62G取代、P62N取代、P62S取代、P62T取代、A93E取代、I187K取代、Q270A取代、S301R取代、W302K取代、C332A取代、V363R取代、L365I取代，或任何前述的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、I187K取代、C332A取代，或任何前述的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含选自以下的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含：(i)表7中标识的氨基酸取代或表7中标识的任何氨基酸取代的组合，和(ii)M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、I187K取代、C332A取代或任何前述缺失和取代的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含：(i)表7中标识的氨基酸取代或表7中标识的任何氨基酸取代的组合，和(ii)选自以下的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A取代；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I取代；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A取代；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A取代；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A取代；(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；或(l)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代与在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代的组合。例如，所述重组突变人类唾液酸酶可以包含对应于表8的行中列出的取代组合的取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。例如，所述重组突变人类唾液酸酶可以包含：S301K和W302R取代；S301K和W302K取代；或S301A和W302S取代。
表8
| 取代 |
| S301A、W302R |
| S301A、W302S |
| S301A、W302T |
| S301K、W302S |
| S301N、W302S |
| S301T、W302S |
| S301T、W302T |
| S301T、W302R |
| S301A、W302A |
| S301K、W302R |
| S301K、W302T |
| S301N、W302T |
| S301K、W302K |
| S301P、W302R |
| S301P、W302S |
| S301P、W302T |
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含对应于表9的行中列出的取代组合的取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ IDNO:1)的氨基酸位置)。
表9
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含SEQ ID NO:48-62、94、97、100、126，或234中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48-62、94、97、100、126，或234中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRANVTRLX19X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO:238),
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val，或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Ala或Arg，X8是Lys、Arg，或Glu，X9是Lys、Ala、Arg，或Glu，X10是Leu或Met，X11是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X12是Gln或His，X13是Arg或Lys，X14是Asp或Pro，X15是Ala、Glu或Lys，X16是Gly或Asp，X17是Gln或His，X18是Gln、Arg，或Lys，X19是Ala、Cys、Ile、Ser、Val，或Leu，X20是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X21是Ala或Val，X22是Cys或Gly，X23是Arg或Pro，X24是Ala或Gly，X25是Arg、Ile，或Lys，X26是Gln或Pro，X27是Arg或Pro，X28是Ala、Cys、Leu，或Val，X29是Ala、Cys、Asn、Ser，或Thr，X30是Leu、Ala，或Val，X31是Glu或Pro，X32是His或Pro，X33是Leu、Asp、Asn，或Tyr，X34是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln，或Tyr，X35是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X36是Val、Ile，或Lys，X37是Thr或Ala，X38是Asp或Gly，X39是Glu、Lys，或Pro，X40是Ser或Cys，X41是Leu、Asp、Phe、Gln，或Thr，X42是Val或Phe，X43是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X44是Cys或Val，X45是Trp或Arg，X46是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X47是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X48是Lys或Val，X49是Ala、Cys、Ser，或Val，X50是Cys、Leu，或Val，X51是Val或Arg，并且X52是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)包含至少一个突变。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SK KDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTD HGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVV PAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQV AEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLV EPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLG AYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGC LYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO:239),
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X6是Ala、Glu或Lys，X7是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X8是Arg、Ile或Lys，X9是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X10是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X11是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X12是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X13是Ala、Cys、Ser或Val，X14为Val或Arg，并且X15为Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ IDNO:1)包含至少一个突变。在某些实施方案中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X6是Ala或Glu，X7是Gln或Tyr，X8是Ile或Lys，X9是Ala或Thr，X10是Gln、Ala或Thr，X11是Ser、Arg或Ala，X12是Trp、Lys或Arg，X13是Ala或Cys，X14是Val或Arg，并且X15是Leu或Ile。
在某些实施方案中，所述重组突变人类唾液酸酶相对于本文中公开的重组突变人类唾液酸酶序列包含保守取代。当在本文中使用时，术语“保守取代”是指使用结构上相似的氨基酸的取代。例如，保守取代可以包括以下组内的取代：Ser和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；以及Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守取代也可以由BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法、BLOSUM取代矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM取代:p矩阵(例如PAM 250矩阵)定义。
b.抗体部分
在某些实施方案中，融合蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白Fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的一个片段，其单独地或与第二免疫球蛋白Fc结构域相组合能够结合到Fc受体。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域和免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的，并且可以在例如PROSITE数据库(可以在www.prosite.expasy.org处获得)中找到。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。可以引入单个氨基酸取代(根据Kabat编号系统S228P；被称为IgG4Pro)以废除在重组IgG4抗体中观察到的非均质性。参见Angal,S等，(1993)MOL.IMMUNOL.30:105-108。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1同种型或引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1同种型(例如SEQ ID NO:31或SEQID NO:5)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG4同种型或很少或不引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG4同种型。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与第二多肽的异二聚化(残基号码根据EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST第五版，U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。例如，在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域并且包含Y407T突变(例如，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:92)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域并且包含T366Y突变(例如，所述第二多肽包含SEQ ID NO:33或SEQID NO:93)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域被修饰成防止Fc结构域的糖基化。例如，在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域并且包含N297位的突变，例如N297A或N297G突变(残基编号是根据EU编号，Kabat，E.A.，等人，同上)。例如，在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:225或SEQ ID NO:226。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白抗原结合结构域。这个结构域的包含可以改进融合蛋白向唾液酸化癌细胞(例如，表达PD-L1的癌细胞)和/或肿瘤微环境的靶向。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白抗原结合结构域”是指单独地或与另一个免疫球蛋白抗原结合结构域相组合限定了抗原结合位点的多肽。示例性的免疫球蛋白抗原结合结构域包括例如免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述可变区一起限定了抗原结合位点(例如，抗PD-L1抗原结合位点)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于抗PD-L1抗体。示例性抗PD-L1抗体描述于例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括来自Bristol-Myers Squibb的阿特珠单抗(atezolizumab)(Genentech)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗(avelumab)、CS1001(CStone Therapeutics)、KL-A167、CK-301(Checkpoint Therapeutics)、TQB2450、KN035、SHR-1316、STI-A1014、BGB-A333、MSB2311、HLX-20和BMS-936559。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于阿维单抗。阿维单抗重链氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:63中，并且阿维单抗轻链氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:64中。源自于阿维单抗的示例性scFv的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:125中。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于本文公开的抗PD-L1抗体，例如包含以下的抗体：(i)包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL769-VH)，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL769-VL)；(ii)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769VH)，和包含SEQID NO:200的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-IF3-VL)；(iii)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769-VH)，和包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm2-VL)；(iv)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm3-VL)；(v)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769VH)，和包含SEQ ID NO:204的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769.T-VL)；(vi)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL752-VH)，和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL752-VL)；(vii)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL759-VH)，和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL759-VL)；(viii)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL760-VH)，和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL760-VL)；(ix)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL767-VH)，和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL767-VL)；(x)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL771-VH)，和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL771-VL)；(xi)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL785-VH)，和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL785-VL)；(xii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL787-VH)，和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL787-VL)；或者(xiii)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL788-VH)，和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL788-VL)；
c.接头
在某些实施方案中，所述融合蛋白的唾液酸酶部分可以被直接连接或融合到所述融合蛋白的抗PD-L1抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)。在其他实施方案中，所述唾液酸酶部分可以通过接头共价结合至所述抗PD-L1抗体部分。
所述接头可以与一个或多个天然氨基酸、所述唾液酸酶或其功能性片段，及所述抗体部分或片段缀合，其中所述氨基酸(例如半胱氨酸氨基酸)可以通过定点突变引入。所述接头可以包括一个或多个非天然氨基酸。设想了在某些情况下，含有例如一个或多个巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的接头可以共价连接所述唾液酸酶部分或抗体部分中的半胱氨酸，其是天然存在的半胱氨酸残基或者是位点特异性突变的产物。
所述接头可以是可切断的接头或不可切断的接头。任选地或此外，所述接头可以是柔性接头或非柔性接头。
所述接头应该具有足够长的长度，以允许所述唾液酸酶和抗体部分没有空间位阻地彼此连接，并且应该足够短，以保留所述融合蛋白的目标活性。所述接头优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不稳定性。所述接头优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不溶性。所述接头应该在体内足够稳定(例如它不被血清、酶等切断)，以允许在体内操作所述融合蛋白。
所述接头可以具有约至约的长度或约至约 的长度或约至约的长度或约至约的长度。所述接头可以具有大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更大的长度和/或小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、或更小的长度。此外，所述接头可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和的长度。
在某些实施方案中，所述接头包含将所述融合蛋白的唾液酸酶部分连接或融合到所述融合蛋白的抗PD-L1抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)的多肽接头。例如，设想了编码直接或间接(例如通过含有氨基酸的接头)连接到抗体部分的唾液酸酶部分的基因，可以使用常规重组DNA技术来产生和表达。例如，唾液酸酶部分的氨基端可以被连接到抗体部分的轻链或重链的羧基端。例如，对于Fab片段来说，可以将所述唾液酸酶的氨基端或羧基端连接到抗体重链的第一恒定结构域(CH1)。当使用接头时，所述接头可以包含亲水性氨基酸残基例如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。在某些实施方案中，所述接头是含有1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、2-15个氨基酸残基、3-10个氨基酸残基、3-7个氨基酸残基、4-25个氨基酸残基、4-20个氨基酸残基、4-15个氨基酸残基、4-10个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基或5-10个氨基酸残基的肽。示例性接头包括富含甘氨酸和丝氨酸的接头例如(GlyGlyPro)n或(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n是1-5。在某些实施方案中，所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:121)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述接头包含GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:90)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述接头包含EPKSS(SEQ ID NO:91)、由其组成或基本上由其组成。另外的示例性接头序列被公开在例如George等，(2003)PROTEIN ENGINEERING 15:871-879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:65-75、78、81-89、95、96、98、99、101、102、104、106、108、110、112、114、122-124、127、128、205-207、211、213、214或219中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:65-75、78、81-89、95、96、98、99、101、102、104、106、108、110、112、114、122-124、127、128、205-207、211、213、214或219中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
d.抗体缀合物
本发明还提供了含有一个或多个本文中公开的融合蛋白的抗体缀合物。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“抗体缀合物”被理解为是指缀合(例如共价偶联)到另外的有功能的部分的抗体或其包含抗原结合活性(例如，抗PD-L1抗原结合活性)和/或Fc受体结合活性的功能性片段。在某些实施方案中，所述抗体或功能性抗体片段被缀合到唾液酸酶，例如本文中公开的重组突变人类唾液酸酶。在某些实施方案中，抗体缀合物包含单一多肽链。在某些实施方案中，抗体缀合物包含共价或非共价缔合在一起的2、3、4个或更多个多肽链，以产生多聚体复合物，例如二聚体、三聚体或四聚体复合物。例如，抗体缀合物可以包含含有重组突变人类唾液酸酶和免疫球蛋白重链的第一多肽(融合蛋白)和含有免疫球蛋白轻链的第二多肽，其中例如所述免疫球蛋白重链和轻链一起限定了单个抗原结合位点，例如抗PD-L1抗原结合位点。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物可以包括单一唾液酸酶。在其他实施方案中，所述抗体缀合物可以包括超过一种(例如两种)唾液酸酶。如果包括超过一种唾液酸酶，则所述唾液酸酶可以相同或不同。在某些实施方案中，所述抗体缀合物可以包含单个抗PD-L1抗原结合位点。在其他实施方案中，所述抗体缀合物可以包含超过一个(例如两个)抗PD-L1抗原结合位点。如果使用两个抗原结合位点，则它们可以相同或不同。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含免疫球蛋白Fc片段。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含一个或两个免疫球蛋白重链或其功能性片段。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含一个或两个免疫球蛋白轻链或其功能性片段。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含融合到免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的N-或C-端的唾液酸酶。
图4描绘了含有一个或多个唾液酸酶的示例性抗体缀合物构建物。例如，在图4A中，第一抗PD-L1抗原结合位点(例如，由VH混合VL结构域限定)被描绘为10，第二抗PD-L1抗原结合位点被描绘为20，唾液酸酶被描绘为30，Fc被描绘为40。在图4A-4I中描绘的每个构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某些方式被修饰，例如使用杵臼(Knobs-into-Holes)类型的技术，例如由图4B中的50所示。在整个图4中，相似的结构用相似的示意图描绘。
图4A描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了被描绘为10的第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了被描绘为20的第二抗PD-L1抗原结合位点。被描绘为30的唾液酸酶可以缀合到所述第一和第二免疫球蛋白轻链或所述第一和第二免疫球蛋白重链的的N-或C-端。
图4B描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图4C描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图4D描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图4E描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图4F描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。
图4G描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；和包含免疫球蛋白重链可变区的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。所述唾液酸酶可以缀合到所述免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链可变区的N-或C-端。
图4H描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别缀合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。单链可变区片段(scFv)可以被缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二单链可变区片段(scFv)可以被分别缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。
图4I描绘了与图4H中描绘的相似的抗体缀合物构建物，区别在于每个scFv被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab代替。例如，图4I描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别缀合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。抗体片段(Fab)可以被缀合或融合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二抗体片段(Fab)可以被分别缀合或融合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的C-端。在融合的情况下，所述Fc结构域的C端被连接(通过键或氨基酸接头)到限定抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链。在具有由单个可变区限定的抗原结合位点的抗体的情况下，这可能足以赋予对靶抗原(例如，PD-L1)的结合亲和性。在其他情况下，例如在人类抗体的情况下，所述限定了免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链可以被缀合(例如共价缀合，例如通过二硫键)到限定了免疫球蛋白抗原结合片段的第二多肽链，所述两个抗原结合片段一起限定了用于结合所述靶抗原(例如，PD-L1)的抗原结合位点。
图5描绘了另外的抗体缀合物构建物。例如图5描绘了抗体缀合物构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和scFv的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述重链和scFv。所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗原结合位点。在某些实施方案中，所述scFv限定了第二抗原结合位点。图5描绘了另外的抗体构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽，其中Fab片段被缀合到所述免疫球蛋白重链的N-端。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗原结合位点。在某些实施方案中，所述Fab片段限定了第二抗原结合位点。在图5中描绘的每种构建物中，应该理解scFv在存在时可以被Fab片段代替，或者Fab片段在存在时可以被scFv代替。在图5中描绘的每种构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某些方式被修饰。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。这个实施方案的实例示出在图6A中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二和第三多肽分别以N-端至C-端的取向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第二和第三多肽分别以N-端至C-端的取向包含所述第一和第二唾液酸酶和所述第一和第二免疫球蛋白重链。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。这个实施方案的实例示出在图6B中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或以N-端至C-端的取向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。
在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65或205中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:65或205中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第二多肽包含SEQ ID NO:66、104、124、206，或213中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:66、104、124、206，或213中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第三多肽包含SEQ ID NO:67-73、78、81-87、95、96、98、99、101、102、106、108、112、122、123、127、128、207、211、214或219中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:67-73、78、81-87、95、96、98、99、101、102、106、108、112、122、123、127、128、207、211、214或219中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第三多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX 14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRAN VTRLX19X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPG HX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHD HGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRP PAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEAN DYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQX53DKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:240)，
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Ala或Arg，X8是Lys、Arg，或Glu，X9是Lys、Ala、Arg，或Glu，X10是Leu或Met，X11是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X12是Gln或His，X13是Arg或Lys，X14是Asp或Pro，X15是Ala、Glu或Lys，X16是Gly或Asp，X17是Gln或His，X18是Gln、Arg，或Lys，X19是Ala、Cys、Ile、Ser、Val，或Leu，X20是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X21是Ala或Val，X22是Cys或Gly，X23是Arg或Pro，X24是Ala或Gly，X25是Arg、Ile，或Lys，X26是Gln或Pro，X27是Arg或Pro，X28是Ala、Cys、Leu，或Val，X29是Ala、Cys、Asn、Ser，或Thr，X30是Leu、Ala，或Val，X31是Glu或Pro，X32是His或Pro，X33是Leu、Asp、Asn，或Tyr，X34是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln，或Tyr，X35是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X36是Val、Ile，或Lys，X37是Thr或Ala，X38是Asp或Gly，X39是Glu、Lys，或Pro，X40是Ser或Cys，X41是Leu、Asp、Phe、Gln，或Thr，X42是Val或Phe，X43是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X44是Cys或Val，X45是Trp或Arg，X46是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X47是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X48是Lys或Val，X49是Ala、Cys、Ser，或Val，X50是Cys、Leu，或Val，X51是Val或Arg，X52是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser并且X53是GGGGS(SEQ ID NO:121)、GGGGSGGGGS(SEQID NO:90)，或EPKSS(SEQ ID NO:91)，并且所述唾液酸酶包含至少一个相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的突变。
在某些实施方案中，第三多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SK KDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMN PCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTD HGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVV PAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQV AEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLV EPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLG AYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGC LYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQX16DKTHTCPPCPAPEL LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO:241),
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X6是Ala、Glu或Lys，X7是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X8是Arg、Ile或Lys，X9是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X10是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X11是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X12是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X13是Ala、Cys、Ser或Val，X14为Val或Arg，X15为Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且X16是GGGGS(SEQ ID NO:121)、GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:90)或EPKSS(SEQ ID NO:91)，所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)包含至少一个突变。在某些实施方案中，X1是Ala、Asp、Met,或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X6是Ala或Glu，X7是Gln或Tyr，X8是Ile或Lys，X9是Ala或Thr，X10是Gln、Ala，或Thr，X11是Ser、Arg,或Ala，X12是Trp、Lys,或Arg，X13是Ala或Cys，X14是Val或Arg，并且X15是Leu或Ile。
在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:67。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:68。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:69。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQID NO:70。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:71。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:72。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQID NO:78。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:81。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:82。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:83。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQID NO:84。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:85。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:86。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:87。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQID NO:95。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:96。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:98。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:99。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQID NO:101。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:102。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:106。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:112。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:127。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ IDNO:66，并且第三多肽包含SEQ ID NO:128。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:104，并且第三多肽包含SEQ ID NO:108。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:124，并且第三多肽包含SEQ ID NO:122。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:65，第二多肽包含SEQ ID NO:124，并且第三多肽包含SEQ ID NO:123。
在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:205，第二多肽包含SEQ ID NO:206，并且第三多肽包含SEQ ID NO:207。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:205，第二多肽包含SEQ ID NO:206，并且第三多肽包含SEQ ID NO:211。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:205，第二多肽包含SEQ ID NO:213，并且第三多肽包含SEQ ID NO:214。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:205，第二多肽包含SEQ ID NO:213，并且第三多肽包含SEQ ID NO:219。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)的第一多肽；和包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第二多肽链代替)的第二多肽。这个实施方案的实例示出在图6C中(在图6C所描绘的构建物中，应当理解scFv在存在时可以被Fab片段代替，或者Fab片段在存在时可以被scFv代替)。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一scFv限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第二scFv限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第一多肽以N-端至C-端的取向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。在某些实施方案中，所述第一多肽以N-端至C-端的取向包含所述第一scFv、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二scFv。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述第二scFv、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二唾液酸酶。
在某些实施方案中，抗体缀合物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。还可以理解免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链可变区可以互换。这个实施方案的实例示出在图6D中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点(即所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点)。在某些实施方案中，所述scFv限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述免疫球蛋白重链和scFv，或者以N-端至C-端的取向包含所述scFv和免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或者以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一免疫球蛋白重链可变区的第二多肽；包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二免疫球蛋白重链可变区的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。还应当理解，免疫球蛋白轻链可以被免疫球蛋白重链可变区代替，并且免疫球蛋白重链可变区可以被免疫球蛋白轻链代替(例如，所述抗体缀合物可以包含：包含免疫球蛋白重链链可变区的第一多肽；包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一免疫球蛋白轻链的第二多肽；包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二免疫球蛋白轻链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白重链可变区的第四多肽)。这个实施方案的实例示出在图6E中。所述第二多肽和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽限定了第一抗-PD-1抗原结合位点，而所述第三多肽和第四多肽限定了第二抗-PD-1抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述第一唾液酸酶、所述第一免疫球蛋白Fc结构域和所述第一免疫球蛋白重链可变区。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述第二唾液酸酶、所述第二免疫球蛋白Fc结构域和所述第二免疫球蛋白重链可变区。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa(例如约140kDa)的分子量。在其他实施方案中，所述抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa(例如约230kDa)的分子量。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含各自包含免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽具有“杵”突变(例如T366Y)或“臼”突变(例如Y407T)，以用于与所述第二多肽异二聚化，并且所述第二多肽具有“杵”突变(例如T366Y)或“臼”突变(例如Y407T)，以用于与所述第一多肽异二聚化(残基编号根据EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)同上)。例如，在某些实施方案中，所述抗体包含各自包含源自于人类IgG1 Fc结构域的免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽包含Y407T突变(例如所述第一多肽包含SEQ ID NO:32,或SEQ ID NO:92)，并且所述第二多肽包含T366Y突变(例如所述第二多肽包含SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:93)。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含被修饰成防止Fc结构域的糖基化的免疫球蛋白Fc结构域。例如，在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域并且包含N297位的突变，例如N297A或N297G突变(残基编号是根据EU编号，Kabat，E.A.，等人，同上)。例如，在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含SEQ ID NO:222、SEQ IDNO:225或SEQ ID NO:226。
当在本文中使用时，术语“多特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到至少两种不同抗原的抗体，即包含至少两个抗原结合位点、结合到至少两种不同抗原的抗体。当在本文中使用时，术语“双特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到两种不同抗原的抗体，即包含两个抗原结合位点的抗体，每个所述抗原结合位点结合到分开且不同的抗原。换句话说，第一结合位点结合第一抗原，并且第二结合位点结合第二种不同抗原。多特异性或双特异性抗体可以是例如人类或人源化抗体，和/或可以是全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
本发明涵盖了包含抗体片段的抗体缀合物，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，(2003)，同上。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物或融合蛋白可以与生物修饰剂共价或非共价结合，所述生物修饰剂可用于增强所述抗体的溶解性，增加结合特异性，降低免疫原性或毒性，或改变所述抗体的药物动力学特性。例如，所述生物修饰剂可用于增加所述抗体的分子量以增加其循环半衰期。
设想了所述抗体缀合物或融合蛋白可以被共价结合至一个或多个(例如2、3、4、5、6、8、9、10个或更多个)生物修饰剂，所述生物修饰剂可以包含直链或支链聚合物。示例性的生物修饰剂可以包括例如各种聚合物，诸如在美国专利号7,842,789中所描述的。特别有用的是聚亚烷基醚例如聚乙二醇(PEG)及其衍生物(例如烷氧基聚乙二醇，例如甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二醇等)，聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)，聚甲基丙烯酸酯，卡波姆，以及包含糖单体例如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸的支链或直链多糖。
在其他实施方案中，所述生物修饰剂可以是亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)类型的聚合物。所述生物修饰剂可以是官能化的聚乙烯吡咯烷酮，例如在所述聚合物的一个(或两个)末端上羧基或胺官能化(正如可以从PolymerSource获得的)。可替代地，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。可替代地，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。所述修饰剂在缀合之前不必须但优选是水溶性的，但所述最终缀合物应该是水溶性的。
通常，所述生物修饰剂可以具有约2kDa至约5kDa、约2kDa至约10kDa、约2kDa至约20kDa、约2kDa至约30kDa、约2kDa至约40kDa、约2kDa至约50kDa、约2kDa至约60kDa、约2kDa至约70kDa、约2kDa至约80kDa、约2kDa至约90kDa、约2kDa至约100kDa、约2kDa至约150kDa、约5kDa至约10kDa、约5kDa至约20kDa、约5kDa至约30kDa、约5kDa至约40kDa、约5kDa至约50kDa、约5kDa至约60kDa、约5kDa至约70kDa、约5kDa至约80kDa、约5kDa至约90kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约150kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约40kDa、约10kDa至约50kDa、约10kDa至约60kDa、约10kDa至约70kDa、约10kDa至约80kDa、约10kDa至约90kDa、约10kDa至约100kDa、约10kDa至约150kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约40kDa、约20kDa至约50kDa、约20kDa至约60kDa、约20kDa至约70kDa、约20kDa至约80kDa、约20kDa至约90kDa、约20kDa至约100kDa、约20kDa至约150kDa、约30kDa至约40kDa、约30kDa至约50kDa、约30kDa至约60kDa、约30kDa至约70kDa、约30kDa至约80kDa、约30kDa至约90kDa、约30kDa至约100kDa、约30kDa至约150kDa、约40kDa至约50kDa、约40kDa至约60kDa、约40kDa至约70kDa、约40kDa至约80kDa、约40kDa至约90kDa、约40kDa至约100kDa、约40kDa至约150kDa、约50kDa至约60kDa、约50kDa至约70kDa、约50kDa至约80kDa、约50kDa至约90kDa、约50kDa至约100kDa、约50kDa至约150kDa、约60kDa至约70kDa、约60kDa至约80kDa、约60kDa至约90kDa、约60kDa至约100kDa、约60kDa至约150kDa、约70kDa至约80kDa、约70kDa至约90kDa、约70kDa至约100kDa、约70kDa至约150kDa、约80kDa至约90kDa、约80kDa至约100kDa、约80kDa至约150kDa、约90kDa至约100kDa、约90kDa至约150kDa或约100kDa至约150kDa的分子量。
设想了将所述抗体缀合物或融合蛋白附连到约10个或更少的聚合物分子(例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个)，每个聚合物分子具有至少约20,000D或至少约30,000D或至少约40,000D的分子量。
尽管各种聚合物可用作生物修饰剂，但设想了可以将本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白附连到聚乙二醇(PEG)聚合物。在一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约20,000D的PEG。在另一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约30,000D的PEG。在另一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约40,000D的PEG。在某些实施方案中，所述PEG是甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)。此类PEG可以从Nektar Therapeutics或SunBiowest商购获得。
抗体缀合物或融合蛋白上用于生物修饰剂的附连位点包括N-端氨基和赖氨酸残基上存在的ε氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。利用或不利用本领域中已知并使用的利用化学原理的多功能(通常为双功能)交联剂，可以将所述聚合物直接共价键合到所述抗体缀合物或融合蛋白。例如，巯基可以通过缀合到马来酰亚胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯或可以从Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Ala.商购获得的PEG-马来酰亚胺)进行衍生化。
II.制造抗体、融合蛋白或抗体缀合物的方法
用于生产抗体、融合蛋白或抗体缀合物(例如本文共公开的那些)的方法在本领域中是已知的。例如，编码轻链可变区和/或重链可变区的DNA分子可以通过化学法或通过重组DNA方法合成。例如，通过常规的杂交技术或聚合酶链反应(PCR)技术，使用适合的合成核酸引物，可以从杂交瘤克隆所述抗体的序列。得到的编码感兴趣的可变区的DNA分子可以被连结到其他适合的核苷酸序列(包括例如恒定区编码序列和表达控制序列)，以产生编码所需抗体的常规基因表达构建物(即表达载体)。确定的基因构建物的产生在本领域的常规技术之内。
编码所需抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物的核酸可以被并入(连结)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是原本不产生IgG蛋白的大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以使转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达编码所述免疫球蛋白轻链和/或重链可变区的基因的条件下生长。
具体表达和纯化条件将随着使用的表达系统而变。例如，如果将要在大肠杆菌中表达基因，该基因首先通过将经工程化的基因放置在适合的细菌启动子(例如Trp或Tac和原核信号序列)的下游来克隆到表达载体中。所表达的蛋白可能被分泌。所表达的蛋白可能积累在折光体或包含体中，该折光体或包含体可以在通过弗氏压碎器或超声破碎细胞后收获。然后将所述折光体溶解，并且可以通过本领域中已知的方法重新折叠和/或切割所述蛋白质。
如果将要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达经工程化的基因，则首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、聚腺苷酸序列和终止密码子的表达载体中。任选地，所述载体或基因构建物可能含有增强子和内含子。在涉及抗体或包含抗体或其部分的融合蛋白的实施方案中，所述表达载体任选地含有编码全部或一部分恒定区的序列，使得能够表达整个或一部分重链或轻链。可以使用常规技术将所述基因构建物引入到真核宿主细胞中。
在某些实施方案中，所述宿主细胞表达抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物，其包含唾液酸酶和VL或VH片段、VL-VH异二聚体、VH-VL或VL-VH单链多肽、完整的免疫球蛋白重链或轻链或其部分(这些中的每一者均可以被附连到具有另一种功能(例如细胞毒性)的部分)。在涉及抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物的一些实施方案中，将宿主细胞用单一载体转染，该单一载体表达：表达唾液酸酶和整个或一部分重链(例如重链可变区)或唾液酸酶和轻链(例如轻链可变区)的多肽或表达整个或一部分重链(例如重链可变区)或轻链(例如轻链可变区)的多肽。在一些实施方案中，将宿主细胞用单一载体转染，该载体编码(a)包含重链可变区的多肽和包含轻链可变区的多肽，或(b)整个免疫球蛋白重链和整个免疫球蛋白轻链，其中在(a)中或(b)中，所述多肽还可以包含唾液酸酶。在一些实施方案中，将宿主细胞用超过一个表达载体共转染(例如一个表达载体表达包含整个或一部分重链或重链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶，并且另一个表达载体表达包含整个或一部分轻链或轻链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶)。
包含抗体或融合蛋白(例如抗体或包含免疫球蛋白重链可变区和/或轻链可变区的融合蛋白)的多肽可以通过将用编码此种可变区的表达载体转染的宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后，所述多肽可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如亲和标签(例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签)来纯化或分离。
在某些实施方案中，抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物可以通过将用(a)编码完整或部分免疫球蛋白重链的表达载体，和编码完整或部分免疫球蛋白轻链的分开的表达载体；或(b)编码这两条链(例如完整或部分重链和轻链)的单一表达载体转染的宿主细胞在允许这两条链表达的条件下生长(培养)来生产。在生产融合蛋白和/或抗体缀合物的实施方案中，所述唾液酸酶被融合到所述链中的一者或多者。完整的抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如蛋白A、蛋白G、亲和标签(例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签)来纯化或分离。从单一表达载体或两个分开的表达载体表达重链和轻链在本领域的常规技术范围之内。
在某些实施方案中，为了将蛋白质例如抗体和/或融合蛋白作为分泌蛋白表达，将所述蛋白质的原生N-端信号序列用例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:28)代替。在某些实施方案中，为了将蛋白质例如抗体和/或融合蛋白作为分泌蛋白表达，添加N-端信号序列例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:28)。另外的示例性的N-端信号序列包括来自于白介素-2、CD-5、IgGκ轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素的信号序列。在某些实施方案中，为了将蛋白质例如抗体和/或融合蛋白作为分泌蛋白表达，将C端溶酶体信号基序例如YGTL(SEQ ID NO:29)移除。
用于降低或消除抗体和抗体片段的抗原性的方法在本领域中是已知的。当所述抗体将要施用到人类时，优选地将所述抗体“人源化”以降低或消除在人类中的抗原性。优选地，每个人源化抗体与它所源自的非人源化小鼠抗体对所述抗原具有相同或基本上相同的亲和性。
在一种人源化方法中，产生了其中将小鼠免疫球蛋白恒定区用人类免疫球蛋白恒定区代替的嵌合蛋白。参见例如Morrison等，1984,PROC.NAT.ACAD.SCI.81:6851-6855；Neuberger等，1984,NATURE 312:604-608；美国专利号6,893,625(Robinson)；5,500,362(Robinson)；和4,816,567(Cabilly)。
在被称为CDR嫁接的方法中，将轻链和重链可变区的CDR嫁接到来自于另一个物种的构架中。例如，可以将鼠类CDR嫁接到人类FR中。在某些实施方案中，将抗体的轻链和重链可变区的CDR嫁接到人类FR或共有人类FR中。为了产生共有人类FR，对来自于几个人类重链或轻链氨基酸序列的FR进行比对以鉴定共有氨基酸序列。CDR嫁接被描述在美国专利号7,022,500(Queen)；6,982,321(Winter)；6,180,370(Queen)；6,054,297(Carter)；5,693,762(Queen)；5,859,205(Adair)；5,693,761(Queen)；5,565,332(Hoogenboom)；5,585,089(Queen)；5,530,101(Queen)；Jones等，(1986)NATURE 321:522-525；Riechmann等，(1988)NATURE 332:323-327；Verhoeyen等，(1988)SCIENCE 239:1534-1536；和Winter(1998)FEBS LETT430:92-94中。
在被称为“超级人源化(SUPERHUMANIZATIONTM)”的方法中，在人类CDR与待人源化的小鼠抗体的CDR的结构相似性的基础上，从人类胚系基因选择人类CDR序列。参见例如美国专利号6,881,557(Foote)；和Tan等，2002,J.IMMUNOL.169:1119-1125。
降低免疫原性的其他方法包括“重塑”、“过度嵌合”和“镶饰/表面重修”。参见例如Vaswami等，1998,ANNALS OF ALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.81:105；Roguska等，1996,PROT.ENGINEER 9:895-904；和美国专利号6,072,035(Hardman)。在镶饰/表面重修方法中，将鼠类抗体中表面可接近的氨基酸残基用在人类抗体中在相同位置处更频繁存在的氨基酸残基代替。这种类型的抗体表面重修被描述在例如美国专利号5,639,641(Pedersen)中。
用于将小鼠抗体转变成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法被称为ACTIVMABTM技术(Vaccinex,Inc.,Rochester,NY)，其涉及基于痘苗病毒的载体以在哺乳动物细胞中表达抗体。可以产生高水平的IgG重链和轻链的组合多样性。参见例如美国专利号6,706,477(Zauderer)；6,800,442(Zauderer)；和6,872,518(Zauderer)。用于将小鼠抗体转变成适合于人类使用的形式的另一种方法是一种在由KaloBios Pharmaceuticals,Inc.(Palo Alto,CA)商业实践的技术。这种技术涉及使用专有的人类“受体”文库来生产“聚焦于表位的”文库用于抗体选择。用于将小鼠抗体修改成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法是“人类工程”(HUMAN ENGINEERINGTM)技术，其由XOMA(US)LLC商业实践。参见例如国际(PCT)公布号WO 93/11794和美国专利号5,766,886(Studnicka)；5,770,196(Studnicka)；5,821,123(Studnicka)；5,869,619(Studnicka)。
任何适合的方法(包括任何前述方法)可用于降低或消除抗体的人类免疫原性。
此外，可以在小鼠中产生全人类抗体。缺少任何非人类序列的全人类mAb可以从人类免疫球蛋白转基因小鼠，通过在例如Lonberg等，NATURE 368:856-859,1994；Fishwild等，NATURE BIOTECHNOLOGY 14:845-851,1996；和Mendez等，NATURE GENETICS 15:146-156,1997中参考的技术来制备。全人类单克隆抗体也可以从噬菌体展示文库，通过在例如Knappik等，J.MOL.BIOL.296:57-86,2000；和Krebs等，J.IMMUNOL.METH.254:67-84 2001中参考的技术来制备和优化。
本发明涵盖了抗体片段，或包含抗体片段的融合蛋白，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术来产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，(2003)NAT.MED.9:129-134。
已开发了各种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生化(参见例如Morimoto等，(1992)JOURNAL OF BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL METHODS 24:107-117；和Brennan等，(1985)SCIENCE 229:81)。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并从其分泌，从而允许容易地生产大量这些片段。抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离。可替代地，可以将Fab’-SH片段从大肠杆菌直接回收并化学偶联，以形成F(ab’)2片段(Carter等，(1992)BIO/TECHNOLOGY 10:163-167)。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。包含援救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段被描述在美国专利号5,869,046中。用于生产抗体片段的其他技术对于专业技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见美国专利号5,571,894和5,587,458。
用于制造双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。参见Milstein和Cuello(1983)NATURE 305:537，国际(PCT)公布号WO93/08829，和Traunecker等，(1991)EMBO J.,10:3655。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等，(1986)METHODS ENZYMOL.121:210。双特异性抗体包括交联的或“异体缀合的”或“异二聚体”抗体。例如，所述异二聚体中的抗体之一可以被偶联到亲和素，另一者被偶联到生物素。异二聚体抗体可以使用任何方便的交联方法来制造。适合的交联剂在本领域中是公知的，并与大量交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。
异二聚体或不对称IgG样分子的实例包括但不限于使用以下技术获得会使用以下格式获得的那些：Triomab/Quadroma、杵臼、CrossMabs、静电匹配的抗体、LUZ-Y、链交换工程化结构域体、Biclonic和DuoBody。
使用抗体片段(例如F(ab)和F(ab’)2片段)的优点包括消除抗体的Fc部分与细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞和B细胞)上的Fc受体之间的非特异性结合。此外，由于它们更小的尺寸，它们可能能够更高效地穿透组织。
异二聚体抗体或不对称抗体允许更大的灵活性和新的格式，以用于将各种药物附连到抗体臂。用于产生异二聚体抗体的通用格式之一是“杵臼”格式。这种格式对抗体中恒定区的重链部分具有特异性。“杵”部分是通过将小的氨基酸用更大的氨基酸代替来工程化，该更大的氨基酸可以装配到通过将大的氨基酸用更小的氨基酸代替来工程化的“臼”中。将所述“杵”连接到“臼”的是每条链之间的二硫键。所述“杵臼”形状促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。将单链可变区片段(scFv)通过短的接头肽连接到所述重链和轻链的可变结构域。所述接头富含提供更大柔性的甘氨酸和提供特异性的丝氨酸/苏氨酸。两个不同的scFv片段可以通过铰链区一起连接到重链的恒定结构域或轻链的恒定结构域。这使得所述抗体具有双特异性，允许两种不同抗原的结合特异性。“杵臼”格式加强异二聚体形成但不压制同二聚体形成。
几种支持异二聚化的方法已被描述在例如国际(PCT)公布号WO96/27011、WO98/050431、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO2013/096291以及欧洲专利公布号EP1870459中。通常，在本领域中已知的方法中，将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域两者以互补的方式工程化，使得包含一个工程化的CH3结构域的重链不再能够与另一个具有相同结构的重链同二聚化(例如CH3工程化的第一重链不再能够与另一个CH3工程化的第一重链同二聚化；并且CH3工程化的第二重链不再能够与另一个CH3工程化的第二重链同二聚化)。由此迫使包含一个工程化的CH3结构域的重链与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一个重链异二聚化。作为结果，所述第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补的方式被工程化，使得所述第一重链和第二重链被迫异二聚化，而所述第一重链和第二重链不再能够同二聚化(例如由于空间位阻的原因)。
III.药物组合物
对于治疗使用来说，优选地将抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物与可药用载体组合。当在本文中使用时，术语“可药用”是指那些在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏响应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏响应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药载体例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型的润湿剂。所述组合物也可以包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin,Remington’s PharmaceuticalSciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。此类介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的配制材料。在此类实施方案中，适合的配制材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色、调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醇)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)，递送媒介物，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂(参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,1990)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有纳米粒子例如聚合物纳米粒子、脂质体或胶束(参见Anselmo等，(2016)BIOENG.TRANSL.MED.1:10-29)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有持续或受控递送配制剂。用于配制持续或受控递送手段例如脂质体载体、可生物侵蚀的微粒或多孔珠和储库注射剂的技术，对于本领域技术人员来说也是已知的。持续释放制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或采取塑形制品例如薄膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一种来制备。
含有本文中公开的抗体、唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其打算的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜、鞘内和直肠施用。在某些实施方案中，本文中公开的抗体、唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过IV输注施用。在某些实施方案中，本文中公开的抗体、唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过肿瘤内注射施用。有用的配制剂可以通过制药领域中已知的方法来制备。例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company,1990)。适合于肠胃外施用的配制组分包括无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如EDTA；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗涨度的试剂诸如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内施用来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存的条件下应该稳定，并且应该针对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及它们的适合的混合物的溶剂或分散介质。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有稳定剂。在某些实施方案中，所述稳定剂是阳离子，诸如二价阳离子。在某些实施方案中，所述阳离子是钙或镁。所述阳离子可以采取盐，诸如氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)的形式。
在某些实施方案中，所述稳定剂以约0.05mM至约5mM的量存在。例如，所述稳定剂可以以约0.05mM至约4mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、约0.05mM至约1mM、约0.05mM至约0.5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM或约1mM至约2mM的量存在。
药物配制剂优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法，例如通过无菌滤膜过滤来实现。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，可以在冷冻干燥和复溶之前或之后进行过滤除菌。
本文描述的组合物可以局部或全身地施用。施用将通常是肠胃外施用。在优选实施方案中，所述药物组合物被皮下施用，并且在甚至更优选实施方案中被静脉内施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。
通常，活性组分例如抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。所述施用的量将取决于变量，诸如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、所述抗体的体内效能、药物配制剂和施用途径。可以将初始剂量增加到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。可替代地，初始剂量可以低于最佳剂量，并且可以在治疗过程中逐渐增加每日剂量。人类剂量可以例如在被设计为从0.5mg/kg至20mg/kg运行的常规I期剂量递增研究中优化。给药频率可以根据诸如施用途径，剂量，所述抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物的血清半衰期，及被治疗的疾病的因素而变化。示例性的给药频率是每日一次、每周一次和每两周一次。优选的施用途径是肠胃外，例如静脉内输注。在某些实施方案中，将抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物冷冻干燥，并然后在施用时在缓冲盐水中复溶。
IV.治疗用途
本文中公开的组合物和方法可用于治疗受试者中的各种形式的癌症或者抑制受试者中的癌症生长。本发明提供了一种治疗受试者中的癌症的方法。所述方法包括将有效量的抗PD-L1抗体、唾液酸酶抗PD-L1融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文中公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)单独地或与另一种治疗剂组合施用给所述受试者，以治疗所述受试者中的癌症。当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性剂(例如根据本发明的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)的量。有效量可以以一次或多次施用、施涂或剂量施用，并且不打算限于特定配制剂或施用途径。
当在本文中使用时，“治疗”意味着治疗受试者例如人类中的疾病。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的减退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿类、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，并且更优选地包括人类。
癌症的实例包括实体瘤、软组织肿瘤、血液肿瘤和转移性病变。血液肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或里克特氏综合征(里克特氏转化)。实体瘤的实例包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和恶性上皮肿瘤，诸如那些影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、泌尿上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或胶质细胞，例如成神经细胞瘤或胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤和转移性默克尔细胞癌(MCC))的恶性肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是上皮癌，例如上调唾液酸化聚糖的表达的上皮癌。示例性上皮癌包括但不限于子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌或输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。上皮癌还包括恶性上皮肿瘤，例如腺泡癌、腺癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌、基底类癌、基底、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、癌样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维状癌，胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛发基质癌、多血癌、、肝细胞癌、嗜酸细胞癌、玻璃样癌、肾上腺样癌、婴儿期胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、类骨癌、乳头状癌、门周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯性癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、纺锤细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、串状癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性癌、结节性癌、疣状癌和绒毛状癌。
在某些实施方案中，所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如，子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如，卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管和食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、原发性不明癌(CUP)、结直肠腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、头颈鳞癌、胸腺癌、非黑色素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮性卵巢癌(非EOC)、转移性尿路上皮癌(UC)、葡萄膜黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌症、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或肾癌。
在某些实施方案中，所述癌症是腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在某些实施方案中，所述癌症是难治性癌症。
在某些实施方案中，所述癌症对用抗体(例如具有ADCC活性的抗体，例如阿维单抗)进行的治疗具有抗性或无响应。
在某些实施方案中，所述癌症是表达PD-L1的癌症，例如，所述癌症包含表达PD-L1的细胞。对196份来自患有肾细胞癌的患者的肿瘤标本的分析发现，PD-L1的高肿瘤表达与肿瘤侵袭性增加以及死亡风险增加4.5倍相关联。PD-L1的高表达与肿瘤浸润淋巴细胞数目减少和预后不良相关联。在某些实施方案中，癌症的PD-L1状态可以使用免疫组织化学染色方案来确定，该方案诸如FDA批准的DAKO 22C3和VENTANA SP142方案，其用作抗PD-L1抗体派姆单抗(pembrolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)和阿维单抗的伴随诊断。
本文描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或方式相组合使用。当在本文中使用时，术语“相组合”施用被理解为意味着在所述受试者患有病症的过程中向所述受试者递送两种(或更多种)不同治疗物，使得对所述患者的治疗效果在时间点上交叠。在某些实施方案中，在一种治疗物的递送仍在进行时开始第二种治疗物的递送，使得在施用方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗物的递送在另一种治疗物的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方案中，由于组合的施用，所述治疗物更加有效。例如，与在不存在第一种治疗物的情况下施用第二种治疗物时将观察到的相比，所述第二种治疗物更加有效，例如在用更少的第二种治疗物时看到等同的效果或者所述第二种治疗物在更大的程度上减轻症状，或者在使用第一种治疗物时观察到类似的情况。在某些实施方案中，递送使得症状或与所述病症相关的其他参数的降低大于在不存在一种治疗物的情况下递送另一种治疗物时将观察到的降低。所述两种治疗物的效果可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得在递送第二种治疗物时递送的第一种治疗物的效果仍然可检测。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法例如手术、放疗或另一种治疗制剂的施用相组合施用。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括化疗例如细胞毒性剂。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括靶向疗法，例如酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增殖化合物，例如甾类、生物免疫调节剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀类、抗炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括不同类别的治疗剂的组合。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与第二检查点抑制剂相组合施用。所述检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、第二PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂或TIGIT拮抗剂。
在某些实施方案中，所述检查点抑制剂是PD-1或第二PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T-细胞表面上的一种充当免疫系统检查点的受体，其在适合的时间抑制或以其他方式调节T-细胞活性以防止免疫系统过度活化。然而，癌细胞可以通过表达配体例如与T-细胞表面上的PD-1相互作用的PD-L1来利用这个检查点，以关闭或调节T-细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。利用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性的治疗方法被描述在美国专利号8,728,474和9,073,994以及欧洲专利号1537878B1中，并且包括例如使用抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体被描述在例如美国专利号8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性抗PD-L1抗体描述于例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括阿特珠单抗(Genentech)、德瓦鲁单抗(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂相组合施用。在CTLA-4途径中，T-细胞上的CTLA-4与其在抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面上的配体(例如也被称为B7-1的CD80和CD86)的相互作用导致T-细胞抑制。示例性的基于CTLA-4的免疫检查点抑制方法被描述在美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性的抗CTLA-4抗体被描述在美国专利号6,984,720、6,682,736、7,311,910、7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984、国际(PCT)公布号WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424以及欧洲专利号EP 1212422 B1中。示例性的CTLA-4抗体包括伊匹单抗或曲美单抗。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂例如本文中公开的CTLA-4抑制剂相组合施用。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与IDO抑制剂相组合施用。示例性的IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(被称为indoximod)、epacadostat(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)和BMS-986205。
可以与本文中描述的方法或组合物相组合施用的示例性细胞毒性剂包括例如抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、含铂剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC抑制剂例如伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古柳菌素A(TSA)、mocetinostat(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228、缩酚酸肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类、埃博霉素、插层剂、能够干扰信号转导途径的剂、促进凋亡的剂和辐射或结合表面蛋白以递送毒性剂的抗体分子缀合物。在一个实施方案中，可以与本文中描述的方法或组合物一起施用的细胞毒性剂是基于铂的剂(例如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、拓扑替康、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙素、蒽环类抗生素(例如多柔比星或表柔比星)、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒素或美登素类化合物。
本发明还提供了一种增加细胞、组织或受试者中的HLA-DR、CD86、CD83、IFN-γ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文中公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)相接触。在某些实施方案中，所述细胞选自树突状细胞和外周血单核细胞(PBMC)。
在某些实施方案中，所述细胞、组织或受试者中HLA-DR、CD86、CD83、IFN-γ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达相对于尚未与所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物接触的相似或在其他方面同一的细胞或组织被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法，例如通过ELISA或通过Luminex多重测定法来测量。
本发明还提供了一种促进有需要的受试者中的免疫细胞向肿瘤中的浸润的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物，例如本文中公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T-细胞例如CD4+和/或CD8+T-细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T-细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方案中，所述受试者中免疫细胞向肿瘤中的浸润相对于尚未施用所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物的相似或在其他方面同一的肿瘤和/或受试者被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。免疫细胞向肿瘤中的浸润可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种增加有需要的受试者中的循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物，例如本文中公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物，以便使循环NK细胞的数目相对于所述抗体、融合蛋白、抗体缀合物，或药物组合物施用之前增加。
在某些实施方案中，所述受试者中循环NK细胞的数目相对于尚未施用所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物的相似或在其他方面同一的受试者被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中的循环NK细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种增加有需要的受试者中的引流淋巴结中T-细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗体、融合蛋白，和/或抗体缀合物(例如本文中公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)，以便使引流淋巴结中T-细胞的数目相对于所述抗体、所述融合蛋白、抗体缀合物，或药物组合物施用之前增加。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+T-细胞。
在某些实施方案中，所述受试者中的引流淋巴结中的T-细胞的数目相对于尚未施用所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物或药物组合物的相似或在其他方面同一的受试者被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中的引流淋巴结中的T-细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种增加细胞、组织或受试者中的Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)接触，以便使所述Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达相对于与所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物接触之前的所述细胞、组织或受试者相比增加。
在某些实施方案中，所述细胞、组织或受试者中Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达相对于尚未与所述抗体、融合蛋白或抗体缀合物接触的相似或在其他方面同一的细胞、组织或受试者被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或Nanostring技术来测量。
本发明还提供了一种从细胞或组织除去唾液酸的方法。所述方法包括将所述细胞或组织与有效量的融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)接触。本发明还提供了一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)的药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子(例如HLA-DR)的表达增加。在某些实施方案中，所述细胞或组织中MHC-II分子的表达相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体缀合物接触的相似或在其他方面同一的细胞或组织增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或流式细胞术来测量。
本发明还提供了一种增强肿瘤细胞的吞噬作用的方法。所述方法包括将所述肿瘤细胞与有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)接触，从而增强所述肿瘤细胞的吞噬作用。在某些实施方案中，本公开涉及一种增加受试者中的肿瘤细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)的药物组合物，从而增加所述肿瘤细胞的吞噬作用。
在某些实施方案中，吞噬作用相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体缀合物接触的相似或在其他方面同一的肿瘤细胞或肿瘤细胞群体被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。吞噬作用可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种活化树突状细胞(DC)的方法。所述方法包括将所述DC与已用融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)处理的肿瘤细胞接触。在某些实施方案中，本公开涉及一种活化受试者中的树突状细胞(DC)或DC群体的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量的包含融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物)的药物组合物，由此活化所述受试者中的DC或DC群体。
在某些实施方案中，所述DC或DC群体的活化相对于尚未与已用所述融合蛋白和/或抗体缀合物处理的肿瘤细胞接触的相似或在其他方面同一的DC或DC群体被增加了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。活化可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种降低Siglec-15结合活性，从而增加肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括将T细胞与抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)接触。在某些实施方案中，本公开涉及一种降低患者的Siglec-15结合活性，从而增加肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含抗体、融合蛋白和/或抗体缀合物(例如本文公开的抗体、融合蛋白或抗体缀合物)的药物组合物，从而增加所述受试者中的抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
在某些实施方案中，Siglec-15结合活性相对于尚未与所述抗体、融合蛋白、抗体缀合物和/或药物组合物接触的Siglec-15被降低了至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％或约100％。结合可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
在整个本说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为是包括在所叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所述叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自所述叙述的要素或组分中的两者或更多者。
进一步地，应该理解，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以在不背离本发明的精神和范围的情况下以各种方式组合，不论在本文中是明示还是暗示。例如，在提及特定化合物的情况下，该化合物可用于本发明的组合物的各种实施方案中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，实施方案以能够书写和绘制清楚简明的申请的方式进行描述和描绘，但打算并且应该认识到实施方案可以进行各种组合或分离，而不背离本文的教授和发明。例如应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点均可适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”包括在所述表述后的单独的每个叙述的受试者以及所述叙述的受试者中的两者或更多者的各种组合，除非从上下文和使用中另有理解。与三个或更多个叙述的受试者相关联的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括(include，includes，including)”、“具有(have，has，having)”、“含有(contain，containing)”、包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除另外的未叙述的要素或步骤，除非从上下文另有具体陈述或理解。
在将术语“约”用于定量值之前的情况下，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从标称值偏差±10％，除非另有指示或推测。
应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中任何和所有实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用，仅打算更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外提出权利要求。本说明书中的任何语言均不应被解释为表明任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不意在以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1
本实施例描述了重组人类唾液酸酶(Neu1、Neu2和Neu3)的构建。
将人类唾液酸酶Neu1、Neu2、Neu3(同工型1)和Neu4(同工型1)表达成带有10хHis标签的分泌蛋白。为了将Neu1表达为分泌蛋白，将原生N端信号肽(MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKA；SEQ ID NO:27)用MDMRVPAQLLGLLLL WLPGARC(SEQ ID NO:28)代替，并移除C端溶酶体信号基序(YGTL；SEQ ID NO:29)。为了将Neu2、Neu3和Neu4表达为分泌蛋白，向每一者中添加N端信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:28)。
唾液酸酶在24孔板中，在200mL使用带有N-端6xHis标签的pCEP4哺乳动物表达载体转染的HEK293F人类细胞中表达。唾液酸酶使用Ni-NTA柱纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)定量，并如图1中所示通过SDS-PAGE检查。Neu1表达良好，具有约3μg/ml的产量，并且主要以单体形式存在。Neu2和Neu3表达各自得到约0.15μg/mL的产量，并且各自主要以二聚体形式存在。当通过NanoDrop测量时，Neu4没有可检测到的表达产量。用作表达的阳性对照的来自于鼠伤寒沙门氏菌的细菌唾液酸酶(St-唾液酸酶；SEQ ID NO:30)得到与Neu1可比的产量，并主要以单体形式存在。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定所述重组表达的唾液酸酶的活性。如图2中所示，Neu1不具有高于无酶对照的可检测的活性，这与以前的报道相一致，所述以前的报道表明除非与β-半乳糖苷酶和保护性蛋白质/组织蛋白酶A(PPCA)复合，否则Neu1是无活性的。Neu2和Neu3有活性。使用Neu2和Neu3进行了酶动力学测定。将1nM的固定浓度的酶与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc一起孵育。测定在酸性(pH 5.6)和中性(pH 7)两种条件下进行。如图3中所示，Neu2和Neu3两者在酸性和中性条件下均有活性，并显示出与以前报道的酶动力学可比的酶动力学。
大多数重组表达的唾液酸酶在非还原SDS-PAGE凝胶上作为聚集体或二聚体迁移。随后使用还原剂二硫苏糖醇(DTT)的处理产生所述酶的单体形式，其在还原SDS-PAGE凝胶上迁移到42kDa处(图1)。
实施例2
该实施例描述了PD-L1抗体发现和杂交瘤筛选。
使用两种不同的方法产生抗体。在第一种方法(Green Mountain Antibody，Vermont)中，按照28天的RIMMS方案使用hPD-L1-hFc对3只SJL/J小鼠和BALB/cJ小鼠进行免疫。对来自高滴度小鼠的脾细胞和淋巴细胞与NS1骨髓瘤细胞执行PEG融合以产生杂交瘤。
在第二种方法(Aldevron，WI)中，将人类PD-L1胞外结构域(ECD)克隆到还含有用于免疫和控制的检测标签的载体质粒中。将质粒构建物转染至哺乳动物细胞中。使用流式细胞术用hPD-L1抗体和抗标签抗体验证hPD-L1表达，载体对照使用不相关的抗标签抗体。用经过验证的PD-L1 ECD质粒DNA对五只小鼠进行了免疫。使用流式细胞术用小鼠血清对用hPD-L1转染的细胞检查免疫响应。对来自高滴度小鼠的脾细胞和淋巴细胞与NS1骨髓瘤细胞执行PEG融合以产生杂交瘤。
使用ELISA筛选杂交瘤上清液，以确定与人类PD-L1(hPD-L1)以及猕猴PD-L1(cPD-L1)的结合。将杂交瘤上清液在ELISA结合缓冲液中稀释10倍，然后加载到hPD-L1-his标记或cPD-L1-his标记的包被的ELISA孔中。使用HRP缀合的山羊抗小鼠多克隆抗体检测小鼠IgG的结合。将该板用TMB和终止缓冲液显色，使用SpectraMax读板仪读取450nm处的吸光度。
还利用了第二测定，其中筛选杂交瘤上清液阻断生物素化的hPD-1-Fc与hPD-L1结合的能力。将杂交瘤上清液在ELISA结合缓冲液中稀释3倍，并且以1μg/mL终浓度与生物素-hPD-1-Fc混合。将混合物加载到hPD-L1-Fc包被的ELISA孔中以进行结合。识别hPD-1/hPD-L1表位箱的抗体竞争结合并且减少hPD-1-Fc结合信号。用HRP缀合的链霉亲和素检测生物素-hPD-1-Fc与hPD-L1-Fc的残余结合。将该板用TMB和终止缓冲液显色，并且使用SpectraMax读板仪读取450nm处的吸光度。将A450吸光度针对杂交瘤条件培养基对照作归一化。
表10是代表性杂交瘤上清液筛选结果的总结。进一步表征了具有良好的与hPD-L1和cPD-L1的结合且具有低残余结合的所选克隆。
表10杂交瘤上清液筛选的总结
功能阻断测定.在含有(i)表达人类PD-L1和TCR激活蛋白的工程化CHO-K1细胞和(ii)表达人类PD-1、TCR和由NFAT响应元件驱动的荧光素酶报告子的Jurkat T细胞的共培养物中测试来自所选的产生PD-L1抗体的杂交瘤的上清液。如果不进行干预，PD-L1与PD-1相互作用会抑制TCR介导的发光。例如使用阿维单抗或含有PD-L1抗体的上清液对PD-L1/PD-1相互作用的阻断会产生发光信号。孵育6小时后添加荧光素酶底物并且测量发光。通过从测定孔中减去本底(仅底物和培养基)来计算相对光单位(RLU)。通过将经诱导细胞的RLU减去本底的RLU除以无抗体对照的RLU减去本底的RLU来计算诱导倍数。如图7所示，鉴定出能够破坏PD-L1/PD-1相互作用，从而导致发光的剂量依赖性增加的杂交瘤上清液。图7A、7B和7C代表三个批次的抗体的测试。在该测定中，阿维单抗被用作阳性对照，其在0.1μg/mL至10μg/mL范围内产生4至5的诱导倍数(数据未示出)。诱导倍数＝RLU(经诱导-本底)/RLU(无抗体对照-本底)。所指示的PD-L1抗体的EC50与阿维单抗的EC50相当。
经纯化的杂交瘤抗体的筛选.测量了经纯化的抗体与重组hPD-L1-his和cPD-L1-his的ForteBio octet结合。从杂交瘤上清液中纯化的小鼠IgG被捕获在AMC(Anti-mouseIgG-Capture)生物传感器上。将hPD-L1-his或cPD-L1-his分析物以2倍系列稀释从100nM开始滴定。将信号与缓冲液参考相减并且与基线对齐。使用1:1拟合模型生成KD、Kon和Koff值。所选的经纯化杂交瘤的结合动力学对于hPD-L1示出在图8A、图8B、图8C和图8D中，并且对于cPD-L1示出在图9A、图9B、图9C和图9D中。X轴代表以秒为单位的测定时间，并且Y轴代表生物传感器上的结合信号。每条线均代表测定中给定抗原浓度下抗原缔合和解离的实时信号(例如，顶线代表测定中的最高抗原浓度的信号，第二顶线代表测定中的第二最高浓度)。垂直虚线代表测定从缔合步骤转移到解离步骤的时间点。所有ForteBio/Octet测定均使用标准/常规设置并且本领域技术人员将理解附图中提供的图表。hPD-L1和cPD-L1的计算出的KD示于表11中。
测试经纯化的杂交瘤抗体阻断生物素化的hPD-1-Fc与hPD-L1结合的能力。对抗体进行3倍滴定，并且将其以1μg/mL的最终浓度与生物素化hPD-1-Fc混合。将抗体和生物素-hPD-1-Fc的混合物加载到hPD-L1-Fc包被的ELISA孔中以进行结合。识别hPD-1/hPD-L1表位箱的抗体将竞争结合并且导致hPD-1-Fc结合信号减少。用HRP缀合的链霉亲和素检测生物素-hPD-1-Fc与hPD-L1-Fc的残余结合。将该板用TMB和终止缓冲液显色，使用SpectraMax读板仪读取450nm处的吸光度。将A450吸光度针对没有抗体的对照的百分比值作归一化。使用GraphPad Prism软件生成曲线和IC50。如图10所示，抗体展现出对hPD-1与hPD-L1的完全(C)或部分(P)阻断。根据数据确定的IC50示于图10中，其中许多值处于低个位nM范围或更低的nM范围，并且还示于表11中。
表11抗hPD-L1杂交瘤抗体的总结
实施例3
该实施例描述了嵌合PD-L1抗体的生成和表征。分离杂交瘤抗体的VH和VL基因序列并且对其进行测序。VL序列示于表12中，VH序列示于表13中，并且轻链和重链CDR示于表14中。编码目标V基因的DNA片段是通过传统供应商合成的。将VH和VL序列分别克隆到人类IgG1恒定重链主链和人类恒定κ轻链主链中。将重链和轻链DNA质粒在HEK293细胞中瞬时共转染以表达完整的IgG。
表12.编码的可变轻序列
表13.编码的可变重序列
表14.轻链和重链CDR
嵌合抗PD-L1抗体的表征.测量了经纯化的嵌合抗体与重组hPD-L1-his和cPD-L1-his的ForteBio octet结合。在AHC(抗人类IgG捕获)生物传感器上捕获嵌合人类抗体，将hPD-L1-his或cPD-L1-his分析物以2倍系列稀释从100nM开始滴定。从信号中减去缓冲液参考，并且将该信号与基线对齐。如上文所描述使用1:1拟合模型生成KD，Kon和Koff值。所选的嵌合抗体的结合动力学对于hPD-L1在图11A和图11B中示出，并且对于cPD-L1在图11C和图11D中示出。hPD-L1和cPD-L1的计算出的KD示于表15中。
如本文所描述测试经纯化的嵌合抗体阻断生物素化的hPD-1-Fc与hPD-L1结合的能力。图12描绘了结果和计算出的IC50，所有这些都处于个位数nM范围内。将蛋白A纯化的嵌合抗体通过尺寸排阻色谱法检查，并且使用UV-Vis分光光度计(NanoDrop；mAU＝毫吸光度单位)进行定量。图13描绘了尺寸排阻色谱的UV迹线，其中在预期滞留时间处具有指示量的单体峰。
评价了经纯化的嵌合抗体与两种人类癌细胞系上表达的PD-L1结合的能力。将HCC827和NCI-292细胞与经滴定抗体一起在4℃下孵育30分钟。洗涤细胞并且将该细胞与AF647标记的山羊抗人类IgG(H+L)一起在4℃下孵育30分钟。将细胞洗涤、固定并且在FACSCelesta上进行分析。图14描绘了所选嵌合抗体对HCC827细胞(图14A)和NCI-292细胞(图14B)的结合曲线和计算出的Kd。
评估经纯化的嵌合抗体结合人类树突状细胞(DC)并且被人类树突状细胞(DC)内化的能力。单核细胞来源的DC(moDC)要么(1)在实验日前用250ng/ml的Pam3CSK4刺激，要么(2)不被刺激。将细胞在室温下阻断30分钟，并且与1nM或10nM抗体一起在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤并且分成两等份，以用于在冰上或在37℃下孵育2小时。将细胞洗涤并且与山羊抗人类IgG(H+L)一起在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤、固定并且在FACSCelesta上进行分析。内化百分比被确定为与4℃相比在37℃下孵育2小时后细胞上被结合的抗体的减少。图15描绘了所指示的嵌合抗体在不同条件下的内化％。2小时后，包括受刺激的细胞在内，所有抗体的内化率相对有限，在20％至30％之间。
如上所述，评价经纯化的嵌合抗体在功能上阻断PD-1与PD-L1结合的能力。在含有(i)表达人类PD-L1和TCR激活蛋白的工程化CHO-K1细胞和(ii)表达人类PD-1、TCR和由NFAT响应元件驱动的荧光素酶报告子的Jurkat T细胞的共培养物中测试经纯化的嵌合PD-L1抗体。如图16所示，测试的嵌合抗体破坏了PD-L1/PD-1的相互作用，从而导致发光的剂量依赖性增加。PD-L1抗体的Kd均为个位数nM或亚nM。
通过将该抗体与表达hPD-L1的CHO细胞的结合与野生型CHO细胞进行比较，证实了该抗体对细胞表面表达的hPD-L1的特异性。将CHO细胞与100nM抗体一起以及将CHO-PD-L1细胞(来自Bioassay)与10nM抗体一起在4℃下孵育30分钟。将细胞洗涤并且与山羊抗人类IgG(H+L)一起在4℃下孵育30in。将经洗涤的细胞固定并且在FACSCelesta上运行。图17描绘了所指示的嵌合抗体与同种型和其他阴性对照以及阿维单抗相比的平均荧光强度(MFI)。观察到PD-L1抗体对CHO-PD-L1细胞的特异性染色，即使在高抗体浓度下，该抗体对CHO细胞的非特异性结合也非常少。
测试了嵌合PD-L1抗体调节T细胞功能的能力。将单核细胞来源的树突细胞(moDC)与CellTrace Violet(CTV)标记的同种异体T细胞一起在抗体存在下孵育5天。通过FACSCelesta测量增殖。通过基于多重珠的测定分析上清液中的细胞因子和溶细胞颗粒。图18-图20的每个子图均示出了两个实验：左侧5个条显示出供体1的T细胞对供体2的moDC作出的响应，而右边的5个条则显示出供体2的T细胞对供体1的moDC作出的响应。
图18描绘了在所指示的PD-L1抗体存在下T细胞增殖和细胞因子对同种异体moDC的响应与同种型对照(001-1)相比增强。图18示出CD4 T细胞增殖(图18A)、CD8 T细胞增殖(图18B)、TNFα(图18C)和IFN-γ水平(图18D)。
图19描绘了在所指示的PD-L1抗体存在下细胞因子对同种异体moDC的响应与同种型对照(001-1)相比增强。图19示出IL-2(图19A)、IL-4(图19B)、IL-6(图19C)和IL-10水平(图19D)。
图20描绘了在所指示的PD-L1抗体的存在下moDC-T细胞MLR的脱粒化与同种型对照(001-1)相比增强。图20示出可溶性Fas配体(图20A)、颗粒酶A(图20B)、穿孔素(图20C)和颗粒溶素(图20D)。
表15是嵌合PD-L1抗体的生化和细胞活性的总结。
表15抗PD-L1嵌合IgG表征总结
实施例4
该实施例描述了PD-L1抗体人源化。图21A描绘了小鼠框架中的PAL769 VH序列(769VH-wt；SEQ ID NO:164)与人类框架中的VH序列(h769VH-mF0；SEQ ID NO:199)的比较。通过IMGT鉴定的CDR以红色示出(GFNIKDTY(SEQ ID NO:161；IDPANDNT(SEQ ID NO:162；和AREGYGGSYGEGY(SEQ ID NO:164的氨基酸97-109)。请注意，本申请中其他地方提供的CDR可通过其他定义(例如Kabat)来鉴定，并且可能会改变。图21B描绘了与人类框架中的VL序列(h769Vk-mF0；SEQ ID NO:242)比较，小鼠框架中的PAL769 VL序列(769Vk-wt；SEQ ID NO:167)。769Vk-wt中突出显示的氨基酸经受了回复突变并且测试了它们的活性(数据未示出)。还示出了被选择用于进一步研究的一系列单一回复突变(h769Vk-T53I(SEQ ID NO:243)；h769Vk-A55F(SEQ ID NO:244)；h769Vk-S67Y(SEQ ID NO:245)；h769Vk-Y87F(SEQ IDNO:246))。图21C描绘了CDR-L3上的一系列2或3个回复突变以及潜在的脱酰胺基序(h769Vk-IY(SEQ ID NO:247)；h769Vk-IF2(SEQ ID NO:248)；h769Vk-tm1(SEQ ID NO:249)；h769Vk-IF3(SEQ ID NO:200)；h769Vk-tm2(SEQ ID NO:201)；h769Vk-tm3(SEQ IDNO:202))。
产生并纯化了所选的h769突变。图22描绘了所选的一组人源化PD-L1抗体的尺寸排阻色谱的UV迹线，该抗体在预期滞留时间处具有单体峰。如上所描述，测量经纯化的人源化抗体与重组hPD-L1-his和cPD-L1-his的ForteBio octet结合，其中hPD-L1曲线示于图23A中，且cPD-L1曲线示于图23B中。人类和猕猴PD-L1的KD、Kon和Kdis值示于表16中。
表16
如本文实施例3中所述，在阻断ELISA中测试所选h769抗体。结果示于图24中并且指示出计算出的IC50(nM)。在去除CDR-L3中的脱酰胺基序后，对所选的h769人源化PD-L1抗体进行了表征。图25描绘了测量的经纯化的人源化抗体和重组hPD-L1-his的ForteBiooctet结合。人类PD-L1的KD、Kon和Kdis值示于表17中。图26描绘了位于预期滞留时间处的单体峰的尺寸排阻色谱的UV迹线。
表17
| 克隆ID | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| h769-N93 | 1.98x10-09 | 2.92x105 | 5.80x10-04 |
| h769-N93A | 1.46x10-09 | 2.84x105 | 4.14x10-04 |
| h769-N93T | 1.82x10-09 | 3.28x105 | 5.97x10-04 |
图27显示所选的769-hIgG1人源化变体增强T细胞对同种异体moDC的响应。阿维单抗还以IgG1格式以及IgG1 N297G格式被测试。PAL-767-1也用作对照(图中标记为设盲(blind))。图27示出CD4T细胞增殖(图27A)、颗粒酶B(图27B)和IFN-γ(图27C)以及CD8 T细胞增殖(图27D)、颗粒酶A(图27E)和TNFα水平(图27F)。
图28显示所选的769-hIgG1人源化变体增强T细胞对同种异体moDC的响应。图28示出穿孔素(图28A)、可溶性Fas(图28B)、IL-6(图28C)、颗粒溶素(图28D)、可溶性Fas配体(图28E)和IL-10水平(图28F)。
测试了所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC细胞因子对CMV pp65响应的能力。在抗体的存在下在有或没有CMV pp65蛋白刺激的情况下将PBMC孵育4天。通过基于多重珠的测定分析上清液中的细胞因子和溶细胞颗粒。
图29-图33显示所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC细胞因子对CMV pp65的响应(包括通过提高IL2、TNFα、IL-6、IL-17A、颗粒酶A、颗粒溶素和IFN-γ的水平)。这些结果表明769-hIgG1人源化变体可能能够增强PBMC中的免疫响应。具体而言，图29显示，所选的769-hIgG1人源化变体增强了PBMC细胞因子对CMV pp65的响应。示出了IL-2(图29A)和TNFα(图29B)的水平。图30显示所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC细胞因子对CMV pp65的响应。示出了IL-6(图30A)和IL-17A(图30B)的水平。图31显示所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC细胞因子对CMV pp65的响应。示出了颗粒酶A(图31A)和颗粒酶B(图31B)的水平。图32显示所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC细胞因子对CMV pp65的响应。示出了穿孔素(图32A)和颗粒溶素(图32B)的水平。图33显示所选的769-hIgG1人源化变体增强PBMC IFN-γ对CMV pp65的响应。
接下来，开发了表位分箱夹心测定法以确定h769.T-1A的表位是否与PAL-752、PAL-767、PAL-769、PAL-771、PAL-785或PAL-788重叠。h769.T-1A包括：可变区h769.T(也称为h769-N93T)，其包括SEQ ID NO:199的重链可变区和SEQ ID NO:204的轻链可变区；和包含N297A突变的人类IgG1恒定区。测试了每种抗体的小鼠IgG杂交瘤型式。测定如下执行：
步骤1：在AMC生物传感器上捕获小鼠IgG的一抗；
步骤2：与hPD-L1-his抗原结合；和
步骤3：与h769.T-1A结合。
如图34所示，结合至PAL752(排在第二位)和PAL788(顶线)的hPD-L1-his仍然可以与h769.T-1A结合，这表明这两个抗体表位不与表位重叠h769.T-1A的表位重叠，并且PAL767、PAL769、PAL771和PAL785与h769.T-1A具有共享或重叠的表位。
实施例5
该实施例描述了PD-L1抗体唾液酸酶缀合物的构建。
抗PD-L1抗体ASC的示例性配置被称为“Janus”，并且含有一个抗体臂(具有一条重链和一条轻链)和一个唾液酸酶-Fc融合体，其中唾液酸酶融合在Fc的一个臂的N-端处。Janus ASC中的每个Fc结构域多肽均含有用于异二聚化的“杵”(T366Y)或“臼”(Y407T)突变(残基编号是根据EU编号，Kabat，E.A.等人(1991)同上)(参见，例如，图6B)。
使用具有M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A突变的Neu2，抗PD-L1抗体h769.T的可变区(如本文实施例4中所描述，并且也称为h769-N93T)，以及包含N297A突变的人类IgG1Fc结构域构建Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物。如下所述使该Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(称为ASC1，并且包含由核苷酸序列SEQ ID NO:208编码的具有氨基酸序列SEQ IDNO:205的第一多肽链、由核苷酸序列SEQ ID NO:209编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:206的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO:210编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:207的第三条多肽链)表达，并且使用SDS-PAGE表征该缀合物的纯度，并且使用4MU-NeuAc表征酶促活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将ASC1在Expi293人类细胞的1,000mL转染中表达。将PD-L1抗体唾液酸酶缀合物使用蛋白A并随后使用陶瓷羟基磷灰石层析进行纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查，如图35A中所示。ASC1表达良好，纯化后的纯度为89％(图35B)。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定ASC1的活性。具体地，通过将1nM的固定浓度的酶与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc一起孵育来执行酶动力学测定。ASC1具有活性(Vmax为5.5x107)，导致产生荧光的唾液酸释放。测定在pH 5.6下进行。
图36示出阿特珠单抗、h769 hIgG1、h769-N93T或ASC1与重组人类PD-L1之间的结合测定(ForteBio octet结合)。表18具有展现出在1-2nM范围内的非常相似的KD的四种测试品的结合动力学。
表18
| 克隆 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| 阿特珠单抗 | 1.61x10-09 | 3.02x105 | 4.87x10-04 |
| h769 | 1.78x10-09 | 3.53x105 | 6.23x10-04 |
| h769.T | 1.76x10-09 | 3.57x105 | 6.29x10-04 |
| ASC1 | 1.72x10-09 | 4.56x105 | 7.66x10-04 |
使用具有M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变的Neu2，抗PD-L1抗体h769.T的可变区(如本文实施例4中所描述，并且也称为h769-N93T)，以及包含N297A突变的人类IgG1 Fc结构域构建第二Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物。如下所述使该Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(称为ASC3，并且包含由核苷酸序列SEQ ID NO:208编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:205的第一多肽链、由核苷酸序列SEQ ID NO:215编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:213的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO:216编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:214的第三条多肽链)表达，并且使用SDS-PAGE表征该缀合物的纯度，并且使用4MU-NeuAc表征该缀合物的酶促活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将ASC3在Expi293人类细胞的2,000mL转染中表达。将PD-L1抗体唾液酸酶缀合物使用蛋白A并随后使用阳离子交换和陶瓷羟基磷灰石层析进行纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。ASC3表达良好，纯化后根据SEC的纯度为97％(图37A)。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定ASC3的活性。具体地，通过将1nM的固定浓度的酶与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc一起孵育来执行酶动力学测定。数个批次的ASC3具有活性(Vmax为1.15x108)，导致产生荧光的唾液酸释放，如图37B所示。测定在pH 5.6下进行。
制备了一系列额外的PD-L1抗体唾液酸酶缀合物。使用具有M1D、V6Y、K9D、I187K、C332A、A93E、V363R、L365R、E218A和C219N突变的Neu2，抗PD-L1抗体h769.T的可变区(如本文实施例4中所描述，并且也称为h769-N93T)，以及包含N297A突变的人类IgG1 Fc结构域构建第三。如上所述使该Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(称为ASC4功能丧失(LOF)，并且包含由核苷酸序列SEQ ID NO:208编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:205的第一多肽链、由核苷酸序列SEQ ID NO:215编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:213的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO:218编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:217的第三条多肽链)表达，并且使用SDS-PAGE表征该缀合物的纯度，并且使用4MU-NeuAc表征该缀合物的酶促活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将ASC4 LOF在Expi293人类细胞的1,000mL转染中表达。将PD-L1抗体唾液酸酶缀合物使用蛋白A并随后使用阳离子交换和CHT陶瓷羟基磷灰石层析进行纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。ASC4-LOF表达良好，纯化后根据SEC的纯度为65％(图38)。正如预期的那样，使用4MU-NeuAc作为底物，ASC4 LOF没有可检测到的活性。
使用具有M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变的Neu2，抗PD-L1抗体h769.T的可变区(如本文实施例4中所描述，并且也称为h769-N93T)，以及包含N297A突变的人类IgG1 Fc结构域构建第四PD-L1抗体唾液酸酶缀合物。如上所述使该Janus PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(称为ASC5，并且包含由核苷酸序列SEQ ID NO:208编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:205的第一多肽链、由核苷酸序列SEQ ID NO:215编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:213的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO:220编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:219的第三条多肽链)表达，并且使用SDS-PAGE表征该缀合物的纯度，并且使用4MU-NeuAc表征该缀合物的酶促活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将ASC5在Expi293人类细胞的1,000mL转染中表达。将PD-L1抗体唾液酸酶缀合物使用蛋白A并随后使用阳离子交换和陶瓷羟基磷灰石层析进行纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。ASC5表达良好，根据SEC的纯度为98％的单体异二聚体(图39A)。ASC5具有活性(Vmax为1.4x108)，导致产生荧光的唾液酸释放，如图39B所示。
使用具有M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变的Neu2，抗PD-L1抗体h769.T的可变区(如本文实施例4中所描述，并且也称为h769-N93T)，以及包含N297A突变的人类IgG1 Fc结构域构建第五PD-L1抗体唾液酸酶缀合物。如上所述使该JanusPD-L1抗体唾液酸酶缀合物(称为ASC2，并且包含由核苷酸序列SEQ ID NO:208编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:205的第一多肽链、由核苷酸序列SEQ ID NO:209编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:206的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO:212编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO:211的第三条多肽链)表达，并且使用SDS-PAGE表征该缀合物的纯度，并且使用4MU-NeuAc表征该缀合物的酶促活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将ASC2在Expi293人类细胞的1,000mL转染中表达。将PD-L1抗体唾液酸酶缀合物使用蛋白A并随后使用阳离子交换和陶瓷羟基磷灰石层析进行纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。ASC2表达良好，根据SEC的纯度为90％，如图40A所示。ASC2具有活性(Vmax为6.05x107)，导致产生荧光的唾液酸释放。图40B描绘了蛋白A纯化(ProA)之后、阳离子交换(SP)之后和陶瓷羟基磷灰石层析(CHT)之后ASC2的活性。为了进行比较，对于ASC3也示出了相同的结果。这两种PD-L1抗体唾液酸酶缀合物都随着该分子被纯化至均质而展现出改善的活性。
PD-L1抗体唾液酸酶缀合物结合人类和猕猴PD-L1的能力得到证实。图41描绘了与h769.T-1A(如上文实施例4中所述)相比，人类PD-L1(图41A)和猕猴PD-L1(图41B)与所选的PD-L1抗体唾液酸酶缀合物的结合动力学。PD-L1抗体唾液酸酶缀合物的人类和猕猴PD-L1的KD、Kon和Kdis值与h769.T-1A的所述值的比较示于表19中。
表19
| hPD-L1 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) | cPD-L1 | KD(M) | kon(1/Ms) | kdis(1/s) |
| ASC3 | 1.73x10-09 | 4.36x105 | 7.51x10-04 | ASC3 | 2.26x10-09 | 3.67x105 | 8.21x10-04 |
| ASC4 LOF | 1.79x10-09 | 4.49x105 | 7.55x10-04 | ASC4 LOF | 1.04x10-09 | 4.23x105 | 3.90x10-04 |
| ASC5 | 1.66x10-09 | 4.33x105 | 7.21x10-04 | ASC5 | 1.23x10-09 | 3.69x105 | 4.38x10-04 |
| h769.T-1A | 2.13x10-09 | 3.46x105 | 7.28x10-04 | h769.T-1A | 1.53x10-09 | 2.97x105 | 4.43x10-04 |
接下来检查PD-L1抗体唾液酸酶缀合物在HCC827和NCI-H292细胞上结合PD-L1的能力。将细胞与抗体(h769.T-1A和阿特珠单抗)以及ASC3、ASC4 LOF和ASC5分子一起在4℃下孵育30分钟。在用染色缓冲液洗涤后，将细胞与AF647山羊抗人类IgG(H+L)一起在染色缓冲液中在4℃下孵育30分钟。用染色缓冲液洗涤2次后，将细胞固定并且在FACSCelesta上运行。图42描绘PD-L1抗体唾液酸酶缀合物与HCC827(图42A)和NCI-H292(图42B)肺上皮细胞系的结合。每种抗体的表观Kd(nM)描绘于表20中。
表20
*＝使用高达11nM的数据点计算
**＝使用高达3.7nM的数据点计算
检测了PD-L1抗体唾液酸酶缀合物对K562和HT-29细胞去唾液酸化的能力。在37℃下过夜(17小时)，将细胞与ASC5一起孵育并且与ASC4 LOF进行比较。在37℃下将Ht-29细胞提取在细胞消化液中，持续10min。在染色缓冲液中洗涤后，将细胞在含生物素-PNA和活/死的PBS中于4℃孵育30分钟。在用PBS洗涤后，将细胞与AF647-Strep在染色缓冲液中于4℃孵育20分钟。将细胞用染色缓冲液洗涤两次并且立即运行。图43描绘了PD-L1抗体唾液酸酶缀合物对K562细胞(图43A)和HT-29细胞(图43B)的去唾液酸化。
实施例6
本实施例描述了含有人类唾液酸酶的抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的体内施用。
在转基因小鼠中测试了抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物，该转基因小鼠被工程化成表达人类PD-L1和人类PD-1，其中小鼠PD-L1和小鼠PD-1已被破坏(Biocytogen Inc.)。给此种双敲入、敲除小鼠注射被工程化成表达人类PD-L1的MC38鼠癌细胞系。在6-8周龄的小鼠右下腹区域皮下接种亲代鼠细胞系或表达人类PD-L1的肿瘤细胞以促进肿瘤发育。当肿瘤达到50-100mm3，平均约75-100mm3时，将小鼠随机分配至4组，每组8只动物，并如表21中所示对小鼠进行治疗。
表21
经由腹膜内注射10mg/kg的ASC5或ASC4 LOF(各自如上面在本文实施例5中所描述)、10mg/kg同种型对照或5mg/kg h769.T-1A(如上面在本文实施例4中所描述)治疗小鼠，并且记录肿瘤体积(mm3)。确定了用于所指示治疗的单个小鼠的平均肿瘤体积。
如图44A所示，与用对照或ASC4 LOF PD-L1抗体唾液酸酶缀合物治疗的小鼠相比，用ASC5治疗的小鼠表现出统计学上有意义的肿瘤体积减小。相对于ASC4 LOF治疗后，用ASC5治疗后肿瘤体积减小，这证明了唾液酸酶活性在肿瘤减小中的重要性。用于所指示治疗的单个小鼠的肿瘤体积示于图44B中。
实施例7
本实施例证明了抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC)阻断PD-1PD-L1相互作用的能力。
测试两个批号的ASC5(如上面在实施例5中所描述)阻断生物素化人类PD-1Fc融合体(hPD-1-Fc)与人类PD-L1(hPD-L1)结合的能力。将ASC5以及阿特珠单抗和h769.T-1A(如上面在实施例4中所描述)进行3倍滴定并且以1μg/mL的最终浓度与hPD-1-Fc混合。将抗体和hPD-1-Fc的混合物加载到hPD-L1包被的ELISA孔上以进行结合。结合hPD-L1上的hPD-1结合表位的ASC或抗体将竞争结合并且导致hPD-1-Fc结合信号的减少。用HRP缀合的链霉亲和素检测残余的hPD-1-Fc与hPD-L1的结合。将该板用TMB和终止缓冲液显色，并且使用SpectraMax读板仪读取450nm处的吸光度。使用GraphPad Prism软件生成A450吸光度曲线和IC50。使用仅hPD-1-Fc(无抗体)和仅缓冲液(无抗体或hPD-1-Fc)作为对照。如图45所描绘，ASC5阻断hPD-1-Fc与hPD-L1的结合。该两个批号的ASC5的IC50分别为3.319nM和3.134nM，相对于阿特珠单抗(IC50为1.305nM)或h769.T-1A(IC50为1.444nM)略有降低。据认为，IC50值的差异是由于抗体和ASC格式之间的差异造成的(例如，ASC5仅具有单个PD-L1结合位点，而阿特珠单抗和h769.T-1A各自具有两个PD-L1结合位点)。
还将ASC5与(i)表达人类PD-L1和TCR激活蛋白的工程化CHO-K1细胞和(ii)表达人类PD-1、TCR和由NFAT响应元件驱动的荧光素酶报告子的Jurkat T细胞一起孵育。如果不进行干预，PD-L1与PD-1相互作用会抑制TCR介导的发光，而PD-L1/PD-1相互作用的阻断会导致发光信号。孵育6小时后添加荧光素酶底物并且测量发光。通过从测定孔中减去本底(仅底物和培养基)来计算相对光单位(RLU)。通过将经诱导细胞的RLU减去本底的RLU除以无抗体对照的RLU减去本底的RLU来计算诱导倍数(诱导倍数＝RLU(经诱导-本底)/RLU(无抗体对照-本底))。阿特珠单抗和h769.T-1A被用作阳性对照，并且各自在该测定中在0.1μg/mL至10μg/mL范围内产生4至5的诱导倍数。如图46所示，三个不同批号的ASC5引起发光的剂量依赖性增加，表明ASC能够破坏PD-L1/PD-1相互作用。三个批号的ASC5的EC50分别为11.54nM、11.59nM和12.71nM。阿特珠单抗和h769.T-1A的EC50分别为0.474nM和0.5596nM。据认为，EC50值的差异是由于抗体和ASC格式之间的差异造成的(例如，ASC5仅具有单个PD-L1结合位点，而阿特珠单抗和h769.T-1A各自具有两个PD-L1结合位点)。
实施例8
本实施例证明了抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC)从人类肿瘤细胞系和初级免疫细胞的表面去除唾液酸的能力。
与ASC一起孵育后，各种细胞类型用α2,3SiaFind(Lectenz)和PNA凝集素进行染色。唾液酸酶活性和α2,3唾液酸键联从细胞表面的去除导致α2,3SiaFind的染色减少。唾液酸酶活性和唾液酸裂解后潜在半乳糖的暴露导致PNA凝集素的染色增加。
在(i)BT-20、HT-29和SK-BR-3肿瘤细胞系，(ii)通过用50ng/ml GM-CSF和IL-4处理经分离的CD14+单核细胞而从两个单独健康供体产生的单核细胞来源的树突状细胞(mDC)，以及(iii)从冷冻储备液解冻的来自两个单独健康供体的PBMC上测试ASC。对于仅mDC和PBMC，细胞要么用300ng/ml Pam3CSK4刺激，要么不被刺激。对于肿瘤细胞，不添加刺激。将细胞用所制备的ASC5或ASC4 LOF(各自如上面在实施例5中所描述)的1:3系列稀释液或具有从2,000μg/ml开始的最高浓度的同种型对照处理过夜(约15小时)。为每个细胞在每种条件下生成18点曲线，并且用于每种细胞条件的每个ASC或同种型浓度均一式两份完成。过夜处理后，仅肿瘤细胞用细胞消化液在37℃下处理15分钟，以使细胞从板上脱落。所有细胞均用PBS洗涤，并用Zombie Aqua细胞存活力试剂盒以1:1000稀释度在PBS中在冰上染色15分钟，以鉴定活细胞群。在每个阻断和染色步骤之间(包括在细胞存活力染色之后)完成使用细胞染色缓冲液(Biolegend)进行的后续细胞洗涤。此外，还使用细胞染色缓冲液完成染色和重悬步骤。仅原代免疫细胞用Fc受体阻断剂FcX(Biolegend)以1:20稀释度在冰上处理15分钟。所有细胞都用PNA-AF647(15μg/ml)和SureLight488-α2,3SiaFind(30μg/ml；Lectenz)的混合物在冰上染色30分钟。将肿瘤细胞重悬并且立即经由BD Diva软件在BDFACS Celesta上读取。
单核细胞DC用BV421-CD11c和PE-DC-Sign染色，而PBMC用PE-CD8、PercpCy5.5-CD56、BV421-CD14、BV650-CD19和BV785-CD3(Biolegend)在冰上染色30分钟，所有染色抗体均采用1:40稀释度(Biolegend)。将原代免疫细胞重新悬浮并且立即经由BD Diva软件在BDFACS Celesta上读取。FloJo软件被用于排除无碎片、单个和活细胞。此外，mDC被门控为CD11c+/DC-Sign+，而PBMC群体被分离为CD56hi和CD56int NK细胞、CD14hi和CD14int单核细胞以及CD3/CD8 T细胞。将每个群体的α2,3SiaFind(Lectenz)和PNA的gMFI输入到GraphPad Prism软件中以分别生成IC50(表22)和EC50(表23)值。
如通过α2,3SiaFind染色的减少所测量的，ASC5对肿瘤细胞和原代人类细胞进行了去唾液酸化，IC50在10μg/mL与100μg/mL之间。在原代人类细胞群的Pam3K刺激后，观察到来自两个不同供体的mDC中的IC50明显降低了3个数量级，并且CD14hi和CD14int单核细胞中的IC50降低(表22)。Pam3K刺激还被证明可以增加这些细胞类型中的PD-L1表达，这与IC50降低相关。PD-L1表达增加导致ASC5的去唾液酸化效率增加。
同样，如通过PNA染色的增加所测量的，ASC5对肿瘤细胞和原代人类细胞进行了去唾液酸化，EC50在约100μg/mL与1,000μg/mL之间。在原代人类细胞群的Pam3K刺激后，观察到来自两个不同供体的mDC中的EC50明显降低(表23)。Pam3K刺激还被证明可以增加这些细胞类型中的PD-L1表达，这似乎与EC50的降低相关。PD-L1表达增加似乎导致ASC5的去唾液酸化效率增加。
表22-通过α2,3SiaFind-SL488染色测量的IC50
表23-通过PNA-AF647染色测量的EC50
实施例9
本实施例证明了在人类树突细胞和T细胞共培养实验中抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC)对细胞因子释放的影响。
CD14+单核细胞来源的树突状细胞通过在GM-CSF和IL-4(各50ng/ml)中培养6天而产生，并且在存在测试品的情况下以1:2DC:T比率与同种异体T细胞共孵育3天。收集上清液，以通过LEGENDplex13-plex板进行细胞因子分析。每个数据点均代表单独的DC-T供体对(对于每个测试条件，进行两个独立的实验，每个实验包括四个重复)。ASC5(如上面在实施例5中所描述)以700nM(100mg/mL)使用，h769.T-1A(如上面在实施例4中所描述)和阿特珠单抗以70nM(10mg/mL)使用，并且同种型对照以100mg/mL使用。图47A描绘了与同种型对照相比，在用ASC5、h769.T-1A和阿特珠单抗治疗后IL-2的倍数变化。图47B、图47C和图47D分别示出了IFN-γ、IL-8和MCP1的类似数据。ASC5治疗后所有四种细胞因子均增加了超过2倍，并且该增加至少与用h769.T-1A或阿特珠单抗治疗后一样多。
实施例10
本实施例描述了含有人类唾液酸酶的抗PD-L1抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的体内施用。
在转基因C57BL6小鼠中测试了ASC5(如上面在实施例5中所描述)，该小鼠被工程化成表达人类PD-L1和人类PD-1，其中小鼠PD-L1和小鼠PD-1已被破坏(Biocytogen Inc.)。给小鼠注射被工程化成表达人类PD-L1的MC38鼠癌细胞系。在6-9周龄的小鼠右下腹区域皮下接种肿瘤细胞以促进肿瘤发育。当肿瘤达到90-136mm3，平均约109mm3时，将小鼠随机分配至各8只动物的组。
经由腹膜内注射1、3、10或30mg/kg的ASC5，0.5或5mg/kg的阿特珠单抗，5mg/kg的h769.T-1A(如上面在实施例4中所描述)，或30mg/kg的同型对照对小鼠进行治疗，并且记录肿瘤体积(mm3)。图48A示出了直至第18天的肿瘤生长。图48B是第18天数据的分析，该分析展现出30mg/kg的ASC5施用后肿瘤生长的显著减少，该减少与5mg/kg的阿特珠单抗和h769.T-1A的响应相当。表24描绘了针对每种治疗在第18天计算的肿瘤生长抑制(TGITV)。TGITV＝{1-(TV测试组–TV第0天测试组)/(TV对照组–TV第0天对照组)}x 100％。
表24
使被工程化成表达人类PD-L1的CT26小鼠肿瘤系在被工程化成表达人类PD-L1和人类PD-1并且其中小鼠PD-L1和小鼠PD-1已被破坏的转基因BALB/c小鼠中作为同基因皮下肿瘤生长(Gempharmatech Inc.)。在8-9周龄的小鼠右下腹区域皮下接种肿瘤细胞以用于肿瘤发育。当肿瘤达到90-120mm3(组平均值为104.06至104.36mm3)时，将小鼠随机分配到三组(每组六只动物)。
经由腹膜内注射ASC5(如上面在实施例5中所描述；10mg/kg)、h769.T-1A(如上面在实施例4中所描述；5mg/kg)，或同种型对照(10mg/kg)对小鼠进行治疗，并且记录肿瘤体积(mm3)。图49A示出了直至第18天的肿瘤生长抑制(TGI)百分比。图49B是对第18天数据的分析，该分析展现出ASC5施用后肿瘤生长的显著减少，该减少大于h769.T-1A的减少。
在CT26小鼠模型中进行了利用ASC5的剂量响应实验。经由腹膜内注射3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg ASC5，10mg/kg ASC4(LOF)，5mg/kg阿特珠单抗和30mg/kg同种型对照治疗小鼠。当肿瘤达到76-125mm3(组平均102-103mm3)时，每组6只小鼠(接种时7-9周龄)被随机分组。人道终点是肿瘤体积为3,000mm3。图50A示出了直至第16天的肿瘤生长抑制(TGI)。图50B是第16天数据的分析，该分析展现出ASC5施用后肿瘤生长的显著剂量依赖性减少。
通过引用并入
出于所有目的，本文引用的每个专利和科学文献的全部公开内容均通过引用并入。
等效方案
本发明可以以其他特定方式实施，而不背离其精神或本质特征。因此，前述实施方案在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求而不是由前述描述指明，并且所有落入权利要求的等同性意义和范围之内的变化都意图涵盖在其中。
序列表
SEQ ID NO:1:
MASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:2:
MEDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO:3:
EDLRP
SEQ ID NO:4:
MEDLRP
SEQ ID NO:5:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:6:
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAAC
SEQ ID NO:7:
ENDFGLVQPLVTMEQLLWVSGRQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKMSSSDEGAKFIALRRSMDQGSTWSPTAFIVNDGDVPDGLNLGAVVSDVETGVVFLFYSLCAHKAGCQVASTMLVWSKDDGVSWSTPRNLSLDIGTEVFAPGPGSGIQKQREPRKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWRYGSGVSGIPYGQPKQENDFNPDECQPYELPDGSVVINARNQNNYHCHCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGAVVTSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWRKETVQLWPGPSGYSSLATLEGSMDGEEQAPQLYVLYEKGRNHYTESISVAKISV
SEQ ID NO:8:
MEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO:9:
MRPADLPPRPMEESPASSSAPTETEEPGSSAEVMEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO:10:
MGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO:11:
MMSSAAFPRWLSMGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO:12:
MASLP
SEQ ID NO:13:
ASLP
SEQ ID NO:14:
TVEKSVVF
SEQ ID NO:15:
GDYDAPTHQVQW
SEQ ID NO:16:
SMDQGSTW
SEQ ID NO:17:
STDGGKTW
SEQ ID NO:18:
PRPPAPEA
SEQ ID NO:19:
QTPLEAAC
SEQ ID NO:20:
NPRPPAPEA
SEQ ID NO:21:
SQNDGES
SEQ ID NO:22:
LSHSLST
SEQ ID NO:23:
GAGAACGACTTTGGACTGGTGCAGCCTCTGGTCACCATGGAACAGCTGCTGTGGGTTTCCGGCAGACAGATCGGCAGCGTGGACACCTTCAGAATCCCTCTGATCACCGCCACACCTAGAGGCACCCTGCTGGCCTTTGCCGAGGCCAGAAAGATGAGCAGCTCTGACGAGGGCGCCAAGTTTATTGCCCTGAGGCGGTCTATGGACCAGGGCTCTACATGGTCCCCTACCGCCTTCATCGTGAACGATGGCGACGTGCCCGATGGCCTGAATCTGGGAGCTGTGGTGTCCGATGTGGAAACCGGCGTGGTGTTCCTGTTCTACAGCCTGTGTGCCCACAAGGCCGGTTGTCAGGTGGCCAGCACAATGCTCGTGTGGTCCAAGGACGACGGCGTGTCCTGGTCTACCCCTAGAAACCTGAGCCTGGACATCGGCACCGAAGTGTTTGCTCCAGGACCTGGCTCTGGCATCCAGAAGCAGAGAGAGCCCAGAAAGGGCAGACTGATCGTGTGTGGCCACGGCACCCTTGAGAGAGATGGCGTTTTCTGCCTGCTGAGCGACGATCATGGCGCCTCTTGGAGATACGGCAGCGGAGTGTCTGGAATCCCTTACGGCCAGCCTAAGCAAGAGAACGATTTCAACCCCGACGAGTGCCAGCCTTACGAGCTGCCTGATGGCAGCGTCGTGATCAACGCCCGGAACCAGAACAACTACCACTGCCACTGCCGGATCGTGCTGAGAAGCTACGACGCCTGCGATACCCTGCGGCCTAGAGATGTGACCTTCGATCCTGAGCTGGTGGACCCTGTTGTTGCCGCTGGTGCCGTCGTGACATCTAGCGGCATCGTGTTCTTCAGCAACCCTGCTCACCCCGAGTTCAGAGTGAATCTGACCCTGCGGTGGTCCTTCAGCAATGGCACAAGCTGGCGGAAAGAAACCGTGCAGCTTTGGCCTGGACCTAGCGGCTACTCTTCTCTGGCTACACTGGAAGGCAGCATGGACGGCGAAGAACAGGCCCCTCAGCTGTACGTGCTGTACGAGAAGGGCAGAAACCACTACACCGAGAGCATCAGCGTGGCCAAGATCAGCGTT
SEQ ID NO:24:
ATGGCCAGCCTGCCTGTGCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCCCTACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGCCCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCATCCAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCTGTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAA
SEQ ID NO:25:
ATGGAGGAAGTGACCACCTGTAGCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAAGAGGACGACCGGGGCATCACCTACAGAATCCCTGCTCTGCTGTACATCCCTCCTACACACACCTTTCTGGCCTTCGCCGAGAAGCGGAGCACCAGACGAGATGAAGATGCCCTGCACCTGGTGCTGAGAAGAGGCCTGAGAATCGGACAGCTGGTGCAGTGGGGACCTCTGAAGCCTCTGATGGAAGCCACACTGCCCGGCCACAGAACCATGAATCCTTGTCCTGTGTGGGAGCAGAAAAGCGGCTGCGTGTTCCTGTTCTTCATCTGCGTGCGGGGCCACGTGACCGAGAGACAGCAAATCGTGTCCGGCAGAAACGCCGCCAGACTGTGCTTCATCTACAGCCAGGATGCCGGCTGCTCTTGGAGCGAAGTTCGGGATCTGACCGAAGAAGTGATCGGCAGCGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTTGGCCCTGGCCACGGAATCCAGCTGCAATCTGGCAGACTGGTCATCCCCGCCTACACCTACTATATCCCCAGCTGGTTCTTCTGCTTCCAACTGCCTTGCAAGACCCGGCCTCACAGCCTGATGATCTACAGCGACGATCTGGGCGTGACATGGCACCACGGCAGACTGATCAGACCCATGGTCACCGTGGAATGCGAGGTGGCCGAAGTGACAGGCAGAGCTGGACACCCTGTGCTGTACTGCTCTGCCAGAACACCCAACCGGTGTAGAGCCGAGGCTCTGTCTACAGATCACGGCGAGGGCTTTCAGAGACTGGCCCTCTCTAGACAGCTGTGCGAACCTCCTCATGGCTGTCAGGGCAGCGTGGTGTCCTTCAGACCTCTGGAAATCCCTCACCGGTGCCAGGACAGCAGCTCTAAGGATGCCCCTACCATCCAGCAGTCTAGCCCTGGCAGCAGCCTGAGACTGGAAGAGGAAGCCGGAACACCTAGCGAGAGCTGGCTGCTGTACTCTCACCCCACCAGCAGAAAGCAGAGAGTGGACCTGGGCATCTACCTGAATCAGACCCCTCTGGAAGCCGCCTGTTGGAGCAGACCTTGGATTCTGCACTGTGGCCCTTGCGGCTACTCTGATCTGGCCGCTCTGGAAGAAGAGGGCCTGTTCGGCTGCCTGTTTGAGTGCGGCACAAAGCAAGAGTGCGAGCAGATCGCCTTCCGGCTGTTCACCCACAGAGAGATCCTGAGCCATCTGCAGGGCGACTGCACAAGCCCAGGCAGAAATCCCAGCCAGTTCAAGAGCAAC
SEQ ID NO:26:
ATGGGCGTGCCCAGAACACCCAGCAGAACCGTGCTGTTCGAGAGAGAGAGGACCGGCCTGACCTACAGAGTGCCTTCTCTGCTGCCTGTGCCTCCTGGACCTACACTGCTGGCCTTCGTGGAACAGAGACTGAGCCCCGATGATTCTCACGCCCACAGACTGGTGCTGAGAAGAGGAACACTGGCTGGCGGCTCTGTTAGATGGGGAGCACT
GCATGTGCTGGGCACAGCTGCTCTTGCCGAGCACAGATCCATG
AATCCCTGTCCTGTGCACGACGCCGGAACCGGCACAGTGTTTC
TGTTCTTTATCGCCGTGCTGGGCCACACACCTGAGGCCGTTCAA
ATTGCCACCGGCAGAAATGCCGCCAGACTGTGTTGTGTGGCCT
CCAGAGATGCCGGCCTGTCTTGGGGATCTGCCAGAGATCTGAC
CGAGGAAGCCATTGGCGGAGCCGTTCAGGATTGGGCCACATTT
GCTGTTGGACCTGGACACGGCGTGCAGCTGCCAAGTGGTAGAC
TGCTGGTGCCTGCCTACACATACAGAGTGGATCGGAGAGAGTG
CTTCGGAAAGATCTGCCGGACAAGCCCTCACAGCTTCGCCTTCT
ACTCCGACGATCACGGCCGGACTTGGAGATGTGGTGGCCTGGT
GCCTAATCTGAGAAGCGGCGAATGTCAACTGGCCGCCGTTGAT
GGTGGACAGGCTGGCAGCTTCCTGTACTGCAACGCCAGATCTC
CTCTGGGCTCTAGAGTGCAGGCCCTGTCTACCGATGAGGGCAC
CAGTTTTCTGCCCGCCGAAAGAGTTGCCTCTCTGCCTGAAACA
GCCTGGGGCTGTCAGGGCTCTATCGTGGGATTTCCTGCTCCTGC
TCCAAACAGACCCCGGGACGATTCTTGGAGTGTCGGCCCTGGA
TCTCCACTGCAGCCTCCATTGCTTGGACCAGGCGTTCACGAGCC
ACCTGAAGAGGCTGCCGTTGATCCTAGAGGCGGACAAGTTCCT
GGCGGCCCTTTTAGCAGACTGCAGCCAAGAGGCGACGGCCCTA
GACAACCTGGACCAAGACCTGGCGTCAGCGGAGATGTTGGCTC
TTGGACACTGGCCCTGCCTATGCCTTTTGCCGCTCCTCCTCAGT
CTCCTACCTGGCTGCTGTACTCTCACCCTGTTGGCAGACGGGCC
AGACTGCACATGGGCATCAGACTGTCTCAGAGCCCTCTGGACC
CCAGAAGCTGGACAGAGCCTTGGGTCATCTATGAGGGCCCTAG
CGGCTACAGCGATCTGGCCTCTATTGGCCCAGCTCCTGAAGGCG
GACTGGTGTTCGCTTGTCTGTATGAGAGCGGCGCCAGAACCAG
CTACGACGAGATCAGCTTCTGCACCTTCAGCCTGCGCGAGGTG
CTGGAAAATGTGCCCGCCTCTCCTAAGCCTCCTAACCTGGGCGA
TAAGCCTAGAGGCTGTTGCTGGCCATCT
SEQ ID NO:27:
MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKA
SEQ ID NO:28:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC
SEQ ID NO:29:
YGTL
SEQ ID NO:30:
MTVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN
SEQ ID NO:31:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:32:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:33:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:34:
ATGAGACCTGCGGACCTGCCCCCGCGCCCCATGGAAGAATCCCCGGCGTCCAGCTCTGCCCCGACAGAGACGGAGGAGCCGGGGTCCAGTGCAGAGGTCATGGAAGAAGTGACAACATGCTCCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAGGAAGATGACAGAGGGATTACCTACCGGATCCCAGCCCTGCTCTACATACCCCCCACCCACACCTTCCTGGCCTTTGCAGAGAAGCGTTCTACGAGGAGAGATGAGGATGCTCTCCACCTGGTGCTGAGGCGAGGGTTGAGGATTGGGCAGTTGGTACAGTGGGGGCCCCTGAAGCCACTGATGGAAGCCACACTACCGGGGCATCGGACCATGAACCCCTGTCCTGTATGGGAGCAGAAGAGTGGTTGTGTGTTCCTGTTCTTCATCTGTGTGCGGGGCCATGTCACAGAGCGTCAACAGATTGTGTCAGGCAGGAATGCTGCCCGCCTTTGCTTCATCTACAGTCAGGATGCTGGATGTTCATGGAGTGAGGTGAGGGACTTGACTGAGGAGGTCATTGGCTCAGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTGGGCCCAGGTCATGGCATCCAGCTGCAGTCAGGGAGACTGGTCATCCCTGCGTATACCTACTACATCCCTTCCTGGTTCTTTTGCTTCCAGCTACCATGTAAAACCAGGCCTCATTCTCTGATGATCTACAGTGATGACCTAGGGGTCACATGGCACCATGGTAGACTCATTAGGCCCATGGTTACAGTAGAATGTGAAGTGGCAGAGGTGACTGGGAGGGCTGGCCACCCTGTGCTATATTGCAGTGCCCGGACACCAAACAGGTGCCGGGCAGAGGCGCTCAGCACTGACCATGGTGAAGGCTTTCAGAGACTGGCCCTGAGTCGACAGCTCTGTGAGCCCCCACATGGTTGCCAAGGGAGTGTGGTAAGTTTCCGGCCCCTGGAGATCCCACATAGGTGCCAGGACTCTAGCAGCAAAGATGCACCCACCATTCAGCAGAGCTCTCCAGGCAGTTCACTGAGGCTGGAGGAGGAAGCTGGAACACCGTCAGAATCATGGCTCTTGTACTCACACCCAACCAGTAGGAAACAGAGGGTTGACCTAGGTATCTATCTCAACCAGACCCCCTTGGAGGCTGCCTGCTGGTCCCGCCCCTGGATCTTGCACTGTGGGCCCTGTGGCTACTCTGATCTGGCTGCTCTGGAGGAGGAGGGCTTGTTTGGGTGTTTGTTTGAATGTGGGACCAAGCAAGAGTGTGAGCAGATTGCCTTCCGCCTGTTTACACACCGGGAGATCCTGAGTCACCTGCAGGGGGACTGCACCAGCCCTGGTAGGAACCCAAGCCAATTCAAAAGCAATSEQ ID NO:35:
ATGATGAGCTCTGCAGCCTTCCCAAGGTGGCTGAGCATGGGGGTCCCTCGTACCCCTTCACGGACAGTGCTCTTCGAGCGGGAGAGGACGGGCCTGACCTACCGCGTGCCCTCGCTGCTCCCCGTGCCCCCCGGGCCCACCCTGCTGGCCTTTGTGGAGCAGCGGCTCAGCCCTGACGACTCCCACGCCCACCGCCTGGTGCTGAGGAGGGGCACGCTGGCCGGGGGCTCCGTGCGGTGGGGTGCCCTGCACGTGCTGGGGACAGCAGCCCTGGCGGAGCACCGGTCCATGAACCCCTGCCCTGTGCACGATGCTGGCACGGGCACCGTCTTCCTCTTCTTCATCGCGGTGCTGGGCCACACGCCTGAGGCCGTGCAGATCGCCACGGGAAGGAACGCCGCGCGCCTCTGCTGTGTGGCCAGCCGTGACGCCGGCCTCTCGTGGGGCAGCGCCCGGGACCTCACCGAGGAGGCCATCGGTGGTGCCGTGCAGGACTGGGCCACATTCGCTGTGGGTCCCGGCCACGGTGTGCAGCTGCCCTCAGGCCGCCTGCTGGTACCCGCCTACACCTACCGCGTGGACCGCCGAGAGTGTTTTGGCAAGATCTGCCGGACCAGCCCTCACTCCTTCGCCTTCTACAGCGATGACCACGGCCGCACCTGGCGCTGTGGAGGCCTCGTGCCCAACCTGCGCTCAGGCGAGTGCCAGCTGGCAGCGGTGGACGGTGGGCAGGCCGGCAGCTTCCTCTACTGCAATGCCCGGAGCCCACTGGGCAGCCGTGTGCAGGCGCTCAGCACTGACGAGGGCACCTCCTTCCTGCCCGCAGAGCGCGTGGCTTCCCTGCCCGAGACTGCCTGGGGCTGCCAGGGCAGCATCGTGGGCTTCCCAGCCCCCGCCCCCAACAGGCCACGGGATGACAGTTGGTCAGTGGGCCCCGGGAGTCCCCTCCAGCCTCCACTCCTCGGTCCTGGAGTCCACGAACCCCCAGAGGAGGCTGCTGTAGACCCCCGTGGAGGCCAGGTGCCTGGTGGGCCCTTCAGCCGTCTGCAGCCTCGGGGGGATGGCCCCAGGCAGCCTGGCCCCAGGCCTGGGGTCAGTGGGGATGTGGGGTCCTGGACCCTGGCACTCCCCATGCCCTTTGCTGCCCCGCCCCAGAGCCCCACGTGGCTGCTGTACTCCCACCCAGTGGGGCGCAGGGCTCGGCTACACATGGGTATCCGCCTGAGCCAGTCCCCGCTGGACCCGCGCAGCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTACGAGGGCCCCAGCGGCTACTCCGACCTGGCGTCCATCGGGCCGGCCCCTGAGGGGGGCCTGGTTTTTGCCTGCCTGTACGAGAGCGGGGCCAGGACCTCCTATGATGAGATTTCCTTTTGTACATTCTCCCTGCGTGAGGTCCTGGAGAACGTGCCCGCCAGCCCCAAACCGCCCAACCTTGGGGACAAGCCTCGGGGGTGCTGCTGGCCCTCC
SEQ ID NO:36:
MRFKNVKKTALMLAMFGMATSSNAALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDVIFRGPDRIPSIVASSVTPGVVTAFAEKRVGGGDPGALSNTNDIITRTSRDGGITWDTELNLTEQINVSDEFDFSDPRPIYDPSSNTVLVSYARWPTDAAQNGDRIKPWMPNGIFYSVYDVASGNWQAPIDVTDQVKERSFQIAGWGGSELYRRNTSLNSQQDWQSNAKIRIVDGAANQIQVADGSRKYVVTLSIDESGGLVANLNGVSAPIILQSEHAKVHSFHDYELQYSALNHTTTLFVDGQQITTWAGEVSQENNIQFGNADAQIDGRLHVQKIVLTQQGHNLVEFDAFYLAQQTPEVEKDLEKLGWTKIKTGNTMSLYGNASVNPGPGHGITLTRQQNISGSQNGRLIYPAIVLDRFFLNVMSIYSDDGGSNWQTGSTLPIPFRWKSSSILETLEPSEADMVELQNGDLLLTARLDFNQIVNGVNYSPRQQFLSKDGGITWSLLEANNANVFSNISTGTVDASITRFEQSDGSHFLLFTNPQGNPAGTNGRQNLGLWFSFDEGVTWKGPIQLVNGASAYSDIYQLDSENAIVIVETDNSNMRILRMPITLLKQKLTLSQN
SEQ ID NO:37:
TTGTCAATCAAGATGACTTCACAACGAAGAAGAGCATCGATTCACAAGGAAACAGATTCTAATATAAAGGGAGTAGATATGCGTTTCAAAAACGTAAAGAAAACCGCTTTAATGCTTGCAATGTTCGGTATGGCGACAAGCTCAAACGCCGCACTTTTTGACTATAACGCAACGGGTGACACTGAGTTTGACAGTCCAGCCAAACAGGGATGGATGCAAGACAACACGAATAATGGCAGCGGCGTTTTAACCAATGCAGATGGAATGCCCGCTTGGTTGGTGCAAGGTATTGGAGGGAGAGCTCAATGGACATATTCTCTCTCTACTAATCAACATGCCCAAGCATCAAGTTTCGGTTGGCGAATGACGACAGAAATGAAAGTGCTCAGTGGTGGAATGATCACAAACTACTACGCCAACGGCACTCAGCGTGTCTTACCCATCATTTCATTAGATAGCAGTGGTAAC
TTAGTTGTTGAGTTTGAAGGGCAAACTGGACGCACCGTTTTGG
CAACCGGCACAGCAGCAACGGAATATCATAAATTTGAATTGGT
ATTCCTTCCTGGAAGTAACCCATCCGCTAGCTTTTACTTCGATG
GCAAACTCATTCGTGACAACATCCAGCCGACTGCATCAAAACA
AAATATGATCGTATGGGGGAATGGCTCATCAAATACGGATGGT
GTCGCCGCTTATCGTGATATTAAGTTTGAAATTCAAGGCGACG
TCATCTTCAGAGGCCCAGACCGTATACCGTCCATTGTAGCAAG
TAGCGTAACACCAGGGGTGGTAACCGCATTTGCAGAGAAACGT
GTGGGGGGAGGAGATCCCGGTGCTCTGAGTAATACCAATGAC
ATAATCACTCGTACCTCACGAGATGGCGGTATAACTTGGGATA
CCGAGCTCAACCTCACTGAGCAAATCAATGTCAGTGATGAGTT
TGATTTCTCCGATCCTCGGCCTATCTATGATCCTTCCTCCAATA
CGGTTCTTGTCTCTTATGCTCGATGGCCGACCGATGCCGCTCAA
AACGGAGATCGAATAAAACCATGGATGCCAAACGGTATTTTTT
ACAGCGTCTATGATGTTGCATCAGGGAACTGGCAAGCGCCTAT
CGATGTTACCGATCAGGTGAAAGAACGCAGTTTCCAAATCGCT
GGTTGGGGTGGTTCAGAGCTGTATCGCCGAAATACCAGCCTAA
ATAGCCAGCAAGACTGGCAATCAAACGCTAAGATCCGAATTGT
TGATGGTGCAGCGAACCAGATACAAGTTGCCGATGGTAGCCGA
AAATATGTTGTCACACTGAGTATTGATGAATCAGGTGGTCTAG
TCGCTAATCTAAACGGTGTTAGTGCTCCGATTATCCTGCAATCT
GAACACGCAAAGGTACACTCTTTCCATGACTACGAACTTCAAT
ATTCGGCGTTAAACCACACCACAACGTTATTCGTGGATGGTCA
GCAAATCACAACTTGGGCTGGCGAAGTATCGCAGGAGAACAA
CATTCAGTTTGGTAATGCGGATGCCCAAATTGACGGCAGACTG
CATGTGCAAAAAATTGTTCTCACACAGCAAGGCCATAACCTCG
TGGAGTTTGATGCTTTCTATTTAGCACAGCAAACCCCTGAAGT
AGAGAAAGACCTTGAAAAGCTTGGTTGGACAAAAATTAAAAC
GGGCAACACCATGAGTTTGTATGGAAATGCCAGTGTCAACCCA
GGACCGGGTCATGGCATCACCCTTACTCGACAACAAAATATCA
GTGGCAGCCAAAACGGCCGCTTGATCTACCCAGCGATTGTGCT
TGATCGTTTCTTCTTGAACGTCATGTCTATTTACAGTGATGATG
GCGGTTCAAACTGGCAAACCGGTTCAACACTCCCTATCCCCTTT
CGCTGGAAGAGTTCGAGTATCCTAGAAACTCTCGAACCTAGTG
AAGCTGATATGGTTGAACTCCAAAACGGTGATCTACTCCTTAC
TGCACGCCTTGATTTTAACCAAATCGTTAATGGTGTGAACTATA
GCCCACGCCAGCAATTTTTGAGTAAAGATGGTGGAATCACGTG
GAGCCTACTTGAGGCTAACAACGCTAACGTCTTTAGCAATATC
AGTACTGGTACCGTTGATGCTTCTATTACTCGGTTCGAGCAAA
GTGACGGTAGCCATTTCTTACTCTTTACTAACCCACAAGGAAA
CCCTGCGGGGACAAATGGCAGGCAAAATCTAGGCTTATGGTTT
AGCTTCGATGAAGGGGTGACATGGAAAGGACCAATTCAACTTG
TTAATGGTGCATCGGCATATTCTGATATTTATCAATTGGATTCG
GAAAATGCGATTGTCATTGTTGAAACGGATAATTCAAATATGC
GAATTCTTCGTATGCCTATCACATTGCTAAAACAGAAGCTGAC
CTTATCGCAAAACTAA
SEQ ID NO:38:
MVGADPTRPRGPLSYWAGRRGQGLAAIFLLLVSAAESEARAEDDFSLVQPLVTMEQLLWVSGKQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKKSASDEGAKFIAMRRSTDQGSTWSSTAFIVDDGEASDGLNLGAVVNDVDTGIVFLIYTLCAHKVNCQVASTMLVWSKDDGISWSPPRNLSVDIGTEMFAPGPGSGIQKQREPGKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWHYGTGVSGIPFGQPKHDHDFNPDECQPYELPDGSVIINARNQNNYHCRCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGALATSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWLKERVQVWPGPSGYSSLTALENSTDGKKQPPQLFVLYEKGLNRYTESISMVKISVYGTL
SEQ ID NO:39:
MTVQPSPWFSDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO:40:
MEEVPPYSLSSTLFQQEEQSGVTYRIPALLYLPPTHTFLAFAEKRTSVRDEDAACLVLRRGLMKGRSVQWGPQRLLMEATLPGHRTMNPCPVWEKNTGRVYLFFICVRGHVTERCQIVWGKNAARLCFLCSEDAGCSWGEVKDLTEEVIGSEVKRWATFAVGPGHGIQLHSGRLIIPAYAYYVSRWFLCFACSVKPHSLMIYSDDFGVTWHHGKFIEPQVTGECQVAEVAGTAGNPVLYCSARTPSRFRAEAFSTDSGGCFQKPTLNPQLHEPRTGCQGSVVSFRPLKMPNTYQDSIGKGAPATQKCPLLDSPLEVEKGAETPSATWLLYSHPTSKRKRINLGIYYNRNPLEVNCWSRPWILNRGPSGYSDLAVVEEQDLVACLFECGEKNEYERIDFCLFSDHEVLSCEDCTSPSSD
SEQ ID NO:41:
METAGAPFCFHVDSLVPCSYWKVMGPTRVPRRTVLFQRERTGLTYRVPALLCVPPRPTLLAFAEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLTRGSVRWGTLSVLETAVLEEHRSMNPCPVLDEHSGTIFLFFIAVLGHTPEAVQIATGKNAARLCCVTSCDAGLTWGSVRDLTEEAIGAALQDWATFAVGPGHGVQLRSGRLLVPAYTYHVDRRECFGKICWTSPHSLAFYSDDHGISWHCGGLVPNLRSGECQLAAVDGDFLYCNARSPLGNRVQALSADEGTSFLPGELVPTLAETARGCQGSIVGFLAPPSIEPQDDRWTGSPRNTPHSPCFNLRVQESSGEGARGLLERWMPRLPLCYPQSRSPENHGLEPGSDGDKTSWTPECPMSSDSMLQSPTWLLYSHPAGRRARLHMGIYLSRSPLDPHSWTEPWVIYEGPSGYSDLAFLGPMPGASLVFACLFESGTRTSYEDISFCLFSLADVLENVPTGLEMLSLRDKAQGHCWPS
SEQ ID NO:42:
GGGTCACATGCTGATGGACTAATTGGAGTCGCGGCAGCGCGGGCTGCGGCCCCCAAGGGGAGGGGTCGGAGTGACGTGCGCGCTTTTAAAGGGCCGAGGTCAGCTGACGGCTTGCCACCGGTGACCAGTTCCTGGACAGGGATCGCCGGGAGCTATGGTGGGGGCAGACCCGACCAGACCCCGGGGACCGCTGAGCTATTGGGCGGGCCGTCGGGGTCAGGGGCTCGCAGCGATCTTCCTGCTCCTGGTGTCCGCGGCGGAATCCGAGGCCAGGGCAGAGGATGACTTCAGCCTGGTGCAGCCGCTGGTGACCATGGAGCAGCTGCTGTGGGTGAGCGGGAAGCAGATCGGCTCTGTAGACACTTTCCGCATCCCGCTCATCACAGCCACCCCTCGGGGCACGCTCCTGGCCTTCGCTGAGGCCAGGAAAAAATCTGCATCCGATGAGGGGGCCAAGTTCATCGCCATGAGGAGGTCCACGGACCAGGGTAGCACGTGGTCCTCTACAGCCTTCATCGTAGACGATGGGGAGGCCTCCGATGGCCTGAACCTGGGCGCTGTGGTGAACGATGTAGACACAGGGATAGTGTTCCTTATCTATACCCTCTGTGCTCACAAGGTCAACTGCCAGGTGGCCTCTACCATGTTGGTTTGGAGTAAGGACGACGGCATTTCCTGGAGCCCACCCCGGAATCTCTCTGTGGATATTGGCACAGAGATGTTTGCCCCTGGACCTGGCTCAGGCATTCAGAAACAGCGGGAGCCTGGGAAGGGCCGGCTCATTGTGTGTGGACACGGGACGCTGGAGCGAGATGGGGTCTTCTGTCTCCTCAGTGATGACCACGGTGCCTCCTGGCACTACGGCACTGGAGTGAGCGGCATTCCCTTTGGCCAGCCCAAACACGATCACGATTTCAACCCCGACGAGTGCCAGCCCTACGAGCTTC
CAGATGGCTCGGTCATCATCAACGCCCGGAACCAGAATAACTAC
CATTGCCGCTGCAGGATCGTCCTCCGCAGCTATGACGCCTGTGA
CACCCTCAGGCCCCGGGATGTGACCTTCGACCCTGAGCTCGTG
GACCCTGTGGTAGCTGCAGGAGCACTAGCCACCAGCTCCGGCA
TTGTCTTCTTCTCCAATCCAGCCCACCCTGAGTTCCGAGTGAAC
CTGACCCTGCGCTGGAGTTTCAGCAATGGTACATCCTGGCAGA
AGGAGAGGGTCCAGGTGTGGCCGGGACCCAGCGGCTACTCGTC
CCTGACAGCCCTGGAAAACAGCACGGATGGAAAGAAGCAGCC
CCCGCAGCTGTTCGTTCTGTACGAGAAAGGCCTGAACCGGTAC
ACCGAGAGCATCTCCATGGTCAAAATCAGCGTCTACGGCACGC
TCTGAGCCCCGTGCCCAAAGGACACCAAGTCCTGGTCGCTGAC
TTCACAGCTCTCTGGACCATCTGCAGAGGGTGCCTGAAACACA
GCTCTTCCTCTGAACTCTGACCTTTTGCAACTTCTCATCAACAG
GGAAGTCTCTTCGTTATGACTTAACACCCAGCTTCCTCTCGGGG
CAGGAAGTCCCTCCGTCACCAAGAGCACTTTTTTCCAGTATGCT
GGGGATGGCCCCTGTCCATTCTCTTCCAGGACAACGGAGCTGT
GCCTTTCTGGGACAGGATGGGGGAGGGGCTCCCCCTGGAGAGA
TGAACAGATACGAACTCAGGGAACTGAGAAGGCCCGGTGTCCT
AGGGTACAAAGGCAGGTACTAGATGTGATTGCTGAAAGTCCCC
AGGGCAGAGTGTCCTTTCAGAGCAAGGATAAGCACACCTACGT
GTGCACCTTTGATTATTTATGAATCGAAATATTTGTAACTTAAAAT
TTTTGATGCAGAAAAAGCGTTTGTGGAGTCTGTGGTTCTGTCTG
CTCACGCCTTCCCAATTGCCTCCTGGAGAGACAGGAAGGCAGC
TGGAAGAGGAGCCGATGTACTTACTGGGAAGCAGAAACCCCTA
GATTCCATCCTGGCTGCTGCTGTTTGCAAGTGTCAAAGATGGGG
GGGCGTGTTTATATTTTATATTTCTAAGATGGGGTGGCATAGGAA
ATAGGGAACAGATGTGTAAAACCAGATGGGAAGGACAGTCTGT
GAGAAAGGAGCAAGCAGTTGCTGCAGGTGTGGGAGAGCAAAG
CCCTTCTCCACGTGGAAAGAGCCCAGATGGACGCTAAGCATGT
TGGGCACCTGTAACCCCGCACTCGCTGGACTGACGGTGTAGCT
CAGTGGTGGAGCTAGTACTTGGAACGCCTAAGACTCTGGGTTC
AGTCCTTGGGGGGGGGGGTATGTGTTTATTGAGAGGAAGGTGT
ACGTACTGTAGGTCAGAGGACAGCTTACTGGAGTTGTCTCTCTC
CTTCACGCTGTGAGTCCTGTGGAATGACCTCAGGTGTCAGAGTT
GGGGGCAGGTGCCTTTGCCAGCTGAGCCATCTTGCTGTCTCTGC
TTTAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAATATTAAGGTCTGAG
GGATTCGGGCTGCGTTCATTTCAATTAGAGGGTCATATTTCTTTT
GACATTTCTTCTCTAAGAAATGTTAAGATCATTTGTTCTGTGTGA
TAGAGGTATAGCTCCATTGTATGTCAGCAGTGAGGGATCCTGTG
CATTTTATCCAGAGTTTGTACGGTGTTCTAGGGGCTGCTAGTGC
AGCCCAGTGCTAAACACTTCAGCATGCACAAGGCCTCAATCAG
TGCATGCATGTGCACACACACACAGACACACACGTACACACTG
ACACAGGTACACAAATACACACTGGCCCACATGTACACATCGA
CTCACAGGTACACAGACCCACTTTGACACACATATACACAGAC
ACAAACGCACTGGCACACACATATACACAGGCACACATGGATA
GATGGACACACGTGTACACATACACACACACACAGAAATACAA
ATGTTCAGGTTTTCTAAAAAAAAAAAAATTAGAGACGTGTTGA
CTTCATTTTTAGCAAAAATCCTGTCATGTATCTTAAAGTGGATTG
AACCCACTATGTAGCCCAGGCTGGCCTCCAAATGGGCATCCTTC
TGCCTCAGTCTCCCGAGGGCTAGGATAACAGGAGTATGCCATCA
CACCTGGCTAATAGAAATTTTCAAAATTGTTTGTTTGAAGGTGA
CTCTTACTATATTGCCTAACTGATCTCCAGTTCGTGAAATCCTCC
TGCCTCAGAACCAGGACTGTCAATATAACCCACCAAGACAGGC
CAACATTCACAATTGATTGTTAGTTTGTGGTCTGAATCAAGGTC
TTATACTGTAGCCCAGGCTAGCCCGGAATACACGATATCTCCAGT
GCTTCAGATCCTCAGTTCTAACTAAGCATGGCCACATCCATGTTT
AACTGCAAATTTGATGTTACCATGGTTTGGTTTGGTTTGGTTTGG
TTTGGTTTGGTTTGGTTTGGTTTTTTGGCCATTTTTTTTTTCTCAT
GCTGAGGCCTTGTGCTCTCAAGTTGGGGAGACAGCATGGAGGG
TAGCTGCAACTGTAACCCCAGTTCCAGGGGACCTGACACCCTC
TGGCCTCCACAAGTATTAGGCACATCTGTGGTGCACAGACATAC
AATCAGGCAAAATATTCATACACATAAAATAAAATAATTTAAAAC
AAAAGCAAAAATCAGGACCTAAGAAAAAAATCTATTCCTGATT
CTTTTATGTTTTGTTTGTATTTTATCAAGACAGGGTTGTTTCTCTG
TATAGCCCTGGCTGTCTTGGAATTCACTCTGTAGACCAGGCTGG
CCTCAAACTCAGAAATCCTCCTGCCTTTGCCTTCCAAGTGCTGG
AATTAAAGGCATGCGCCACC
SEQ ID NO:43:
GACATGACCCAAACGGCCCCTGGCTGCAAGGTAATATCGGAAGTTGACTAAGAATGGACGCCCCACCACTGACTGACCCGCCCCCTGAGTCTGAGATTGGACTTGTCTCTGGATACAGTCATACTTTGAGGTACTACAAGTTAGAAACTGTTAGGTTACTCAGTTCAGTCCATGACAGTCCAACCTTCTCCATGGTTTTCCGATCTCAGGCCCATGGCGACCTGCCCTGTCCTGCAGAAGGAGACACTGTTCCGCACAGGCGTCCATGCTTACAGAATCCCTGCTCTGCTCTACCTGAAGAAGCAGAAGACCCTGCTGGCCTTTGCGGAAAAGCGAGCCAGCAAGACGGATGAGCACGCAGAGTTGATTGTCCTGAGAAGAGGAAGCTACAACGAAGCCACCAACCGTGTCAAGTGGCAGCCTGAGGAAGTGGTGACCCAAGCCCAGCTGGAAGGCCACCGCTCCATGAATCCATGTCCCTTGTATGACAAGCAAACAAAGACCCTCTTCCTTTTCTTCATCGCTGTCCCTGGGCGTGTATCAGAACATCATCAGCTCCACACTAAGGTTAATGTCACACGGCTGTGCTGTGTCAGCAGCACTGACCATGGGAGGACCTGGAGCCCCATCCAGGACCTCACAGAGACCACCATTGGCAGCACTCATCAGGAATGGGCCACATTTGCTGTGGGTCCTGGGCATTGTCTGCAGCTGCGGAACCCAGCTGGGAGCCTGCTGGTACCTGCTTATGCCTACCGGAAACTGCACCCTGCTCAGAAGCCTACCCCCTTTGCCTTCTGCTTCATCAGCCTTGACCATGGGCACACATGGAAACTAGGCAACTTTGTGGCTGAAAACTCACTGGAGTGCCAGGTGGCTGAGGTTGGCACTGGAGCTCAGAGGATGGTATATCTCAATGCTAGGAGCTTCCTGGGAGCCAGGGTCCAGGCACAAAGTCCTAATGATGGTCTGGATTTCCAGGACAACCGGGTAGTGAGTAAGCTTGTAGAGCCCCCCCACGGGTGTCATGGAAGTGTGGTTGCCTTCCACAACCCCATCTCTAAGCCACATGCCTTAGACACATGGCTTCTTTATACACACCCTACAGACTCCAGGAATAGAACCAACCTGGGTGTGTACCTAAACCAGATGCCACTAGATCCCACAGCCTGGTCAGAGCCCACCCTGCTGGCCATGGGCATCTGTGCCTACTCAGACTTACAGAACATGGGGCAAGGCCCTGATGGCTCCCCACAGTTTGGGTGTCTGTATGAATCAGGTAACTATGAAGAGATCATTTTCCTCATATTCACCCTGAAGCAAGCTTTCCCCACTGTATTTGATGCCCAGTGATCTCAGTGCACGTGGCCCAAAGGGCTTCCTTGTGCTTCAAAACACCCATCTCTCTTTGCTTCCAGCATCCTCTGGACTCTTGAGTCCAGCTCTTGGGTAACTTCCTCAGGAGGATGCAGAGAATTTGGTCTCTTGACTCTCTGCAGGCCTTATTGTTTCAGCCTCTGGTTCTCTTTTCAGCCCAGAAATCAAAGGAGCCTGGCTTTCCTCAGCCTGTTGGCAGGGCAGGTGGGGACAGTATATATAGAGGCTGCCATTCTGCATGTCGGTTGTCACTATGCTAGTTTAACCTGCCTGTTTCCCCATGCCTAGTGTTTGAATGAGTATTAATAAAATATCCAACCCAGCCCATTTCTTCCTGGAAAAAAA
SEQ ID NO:44:
ACTGCGCGGTGAAGGGGCGTGGCCTGGCCGGGGAGGTTGACACCCAGACGCTGCTCTCAGTCCTCTGGCGCCTGCTCCCCAGCGCATTCCTTCTGCTCCTGGGATATTTGTCTCATTACTGCCAGTTCTTGCGCAGCGGTCACTGGGTTCGTTTCAGCGTCTGTGGTTTCTGTCGCTGTTATCCAGTCTCCATCGCCCCAGCTCAGCTTCAGGCCTTCTTCCGAGACTCCACGGGAGAGCCCAGAGAGCCTCCGGAGCCGAAGCCATGGAGGAAGTCCCACCCTACTCCCTCAGCAGCACCCTGTTCCAGCAGGAAGAACAGAGTGGGGTGACCTACCGGATCCCAGCCCTGCTGTACCTTCCTCCCACCCACACCTTCCTGGCCTTT
GCAGAGAAGCGGACCTCAGTCAGAGATGAGGATGCTGCCTGCC
TGGTGCTCAGACGAGGGCTGATGAAGGGGCGCTCTGTACAGTG
GGGCCCCCAACGGCTACTGATGGAGGCCACATTACCTGGGCATC
GCACCATGAACCCCTGCCCTGTGTGGGAGAAAAATACTGGCCG
TGTGTACCTGTTTTTCATCTGTGTGCGGGGCCATGTTACTGAGA
GGTGCCAGATTGTGTGGGGCAAAAATGCCGCCCGTCTCTGCTTC
CTTTGCAGTGAAGATGCCGGCTGCTCTTGGGGTGAAGTGAAAG
ACTTGACCGAGGAGGTCATTGGCTCAGAGGTGAAGCGCTGGGC
CACATTTGCTGTGGGCCCAGGTCATGGCATCCAGCTACACTCGG
GAAGGCTGATCATCCCCGCCTATGCCTACTATGTCTCACGTTGGT
TTCTCTGCTTTGCGTGTTCAGTCAAGCCCCATTCCCTGATGATCT
ACAGTGATGACTTTGGAGTCACATGGCACCATGGCAAGTTCATT
GAGCCCCAGGTGACAGGGGAGTGCCAAGTGGCCGAAGTGGCT
GGGACGGCTGGTAACCCTGTGCTCACTGCAGTGCCCGAACACC
AAGCCGATTTCGAGCAGAGGCTTTTAGTACTGATAGTGGTGGCT
GCTTTCAGAAGCCAACCCTGAACCCACAACTCCATGAGCCTCG
AACCGGCTGCCAAGGTAGTGTAGTGAGCTTCCGGCCTTTGAAG
ATGCCAAATACCTATCAAGACTCAATTGGCAAAGGTGCTCCCGC
TACTCAGAAGTGCCCTCTGCTGGACAGTCCTCTGGAGGTGGAG
AAAGGAGCTGAAACACCATCAGCAACATGGCTCTTGTACTCAC
ATCCAACTAGCAAGAGGAAGAGGATTAACCTAGGCATCTACTAC
AACCGGAACCCCTTGGAGGTGAACTGCTGGTCCCGCCCGTGGA
TCTTGAACCGTGGGCCCAGTGGCTACTCTGATCTGGCTGTTGTG
GAAGAACAGGACTTGGTGGCGTGTTTGTTTGAGTGTGGGGAGA
AGAATGAGTATGAGCGGATTGACTTCTGTCTGTTTTCAGACCAT
GAGGTCCTGAGCTGTGAAGACTGTACCAGCCCTAGTAGCGACT
AAAGCCAAATCAAGACGGATGAGTGAGGCCCAGCTTCCCACAG
AAAGGAATGGCAGCTACAGCCAGGGTAACAGAGGTCTCTGATG
TCTAGAGAAAACTCTAAAAACTAATAATCTGCTCCTTGAATTTTT
TCACTTTTCCCTTCAATGAGCATGGTGAAAATTGTGCCATATCTT
ACATAACGAGGCTCTTGAACTGGGAGTTTGAATCTCTTCTCTTC
CCATTAAAAGGAGAGGCCATGTGCTCGCTTCGCGTTCGACAAA
GCCTGGATTCTGATCTTGAGTGGAAGCCACAGGCTTGTCTTTTC
CAATGGTTCACTGCTCACCTGAGTATTAGGTGATGTGTAGGTGC
CTTGGCCAGAAGAAAGATCTGTGTTGTTGTATTTTTTTAAATTTA
TTTATTTACTATATGTAAGTACACTGCAGCTGTCTTCAGACACAC
CAGAAGAGGGCGTCAGATCTCATTAGAGATGGTTGTGAGCCAC
CATGTGGTTGCTGGGATTTGAACTCAGGACCTTCAGAAGAGCA
GTCAGTGCTCTTAACTACTGAGCCATCTCTCAAGCCCCGCATTG
CTGTATTTTTAATAAGAAAAATGCCCTTATCCTTCCAATAATGCC
TGGAGCTGTACAAATTCTCTGTCTTAGAAGACTTGAGAAAGCA
GAACTGTAAGGTCAGATGCTTTCTCCAGCCTTGATGCTGTGTTC
CACCTTCCCTTCCTCATCCAGAAAACAGTTACTAGGGAGAAAAT
GAGAAACCCATGCCAGCTGCCCTTGATGATGGTTGATAACGGTG
CTTATTGCTTTTGATGTCATTACCTCTGTTAGAGATGAATCAGAG
TCAGAGGTCCTTAGCTGCATCCACCCATTTCCAGGGGGACATTC
TAACACTGCTGAACAGTCAGCTAAAATGAGAGCTGTGTGTCCT
AGCCTGATTCCAGGTTAGTCATGATGCTTCCTGGAGCTGGGCTT
TTATCTAATCCCAGGAGCCATCTAGGGGAGGCTCAGAGCTAGCA
GGTGATCTTCCTGAGATGGTTTCACCGTGACAGGTGAACCATGA
GCCCTTCCAAGCAAGGCCAAAGGACAACATTATAGGAAAGATT
TCTAGTATTAATATGCCTTTTCTCTGTGTGTGTACTGTCTTGTAGT
GATGCTATATAGACAAATAGATGATTTCTTATTTTTTGTTTGTTTG
TTTGTTTTTTTGTTTTTCTGTAGCCCTAGCTGTCCTGGAACTCAC
TTTGTAAACCAGGCTGGCCTCGATCTCAGAAATCCGCCTGCCTC
TGCCTCCCGAGTGCTGGGATTAAAGGTGTGCACCACCACACCTT
AATGATGATCCTATAAGTATTCCTAAAATTATACTAGTAATTATTA
ACTCCTTTATAATAGGACTGCTATTAAAGCCCTCGCTGATATGAA
AACTACAGTGAGAACTCTGCCAGTCTTCACATGTCATAATTACT
TCTGAGATAGAAAGCAGGCATTTACAACTTAGAACACATTTCTT
AGAGCTGTAAAACAATTAACTAGAGGTCATAAAAGGGAATGAA
AGATTTATTGTAGGTGCTAGGACAGAACATAAAATATTGACTGG
GCTTATCTATATGAAACTTCATTGTTAACTTTTACACAAGAATTAT
GGTTTTTAACTTTCAGTGAACCTGCGGAGCTAGTGACAGAAGA
GAAATGTCTAGTTAGATAACTACTCTTAATGGAAATTCACATAAA
CATCTGTTGCCATCTTCTTTTTGAATTTATGTTTAAACTTGTGAAT
GTTTGAATTAGACACTACGCGAGCACATAGAAAATAAAGAACTA
AGCGTGAA
SEQ ID NO:45:
GGACAGTGTGCATCACGGAGCTTGTGGCCCAGACTGTGCCTGGCAGACCCAGAGGACCTAAGGCTTGGCTCTAGTGGTGGTCAGCACAGCCCTCGGTGGTCTGCGGAGCCTGATATTGCTTTACGTAAGGGCTGTTCTGCTGTGCATCTCCTGTGTCTGAAGCTATTCGCCATGGAGACTGCTGGAGCTCCCTTCTGCTTCCATGTGGACTCCCTGGTACCTTGCTCCTACTGGAAGGTTATGGGGCCCACGCGTGTTCCCAGGAGAACGGTGCTCTTCCAGAGGGAAAGGACGGGCCTGACCTACCGTGTGCCTGCGTTACTCTGTGTGCCTCCCAGGCCTACTCTGCTGGCCTTCGCGGAACAGCGACTTAGCCCTGATGACTCCCATGCCCACCGCCTGGTGCTACGGAGGGGCACGCTGACCAGGGGCTCAGTGCGGTGGGGCACTCTGAGTGTACTGGAGACTGCAGTACTGGAGGAGCACAGGTCTATGAACCCTTGCCCGGTGCTGGATGAGCACTCTGGTACCATCTTCCTCTTCTTCATTGCCGTGCTGGGCCACACACCGGAGGCCGTGCAAATCGCCACTGGCAAGAACGCTGCTCGCCTCTGCTGTGTGACCAGCTGTGACGCTGGCCTCACCTGGGGCAGTGTTCGAGATCTCACTGAGGAAGCCATTGGTGCTGCATTGCAGGACTGGGCCACCTTTGCTGTGGGTCCGGGCCATGGAGTTCAGCTGCGCTCGGGTCGCCTGCTTGTTCCTGCTTACACCTATCATGTGGACCGACGGGAATGTTTTGGCAAGATCTGCTGGACCAGTCCCCACTCCTTGGCATTCTACAGTGATGATCATGGGATCTCCTGGC
ATTGTGGAGGCCTTGTGCCCAACCTACGCTCTGGAGAGTGCCA
ACTGGCTGCGGTAGATGGAGACTTTCTCTACTGTAATGCTCGAA
GCCCTCTGGGTAACCGTGTGCAGGCACTGAGTGCTGATGAAGG
CACGTCCTTCCTACCAGGGGAGCTGGTGCCTACATTGGCAGAG
ACGGCTCGTGGTTGCCAGGGTAGCATTGTGGGCTTCCTAGCTCC
ACCCTCAATCGAGCCTCAGGATGACCGGTGGACAGGGAGTCCT
AGGAACACCCCACATTCCCCATGCTTCAATCTCAGAGTACAGGA
GTCTTCGGGGGAAGGTGCCAGAGGTCTTCTTGAACGTTGGATG
CCCAGGTTGCCTCTCTGCTACCCACAGTCCCGGAGCCCAGAGA
ATCATGGCCTAGAGCCTGGGTCAGATGGAGATAAGACATCCTGG
ACTCCGGAATGTCCTATGTCCTCTGATTCCATGCTTCAGAGCCCC
ACATGGCTACTATATTCCCACCCAGCAGGGCGTAGAGCTCGGCT
CCACATGGGAATCTACCTGAGCCGATCCCCCTTGGATCCCCACA
GCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTATGAGGGCCCCAGTGGCTA
CTCTGACCTTGCCTTTCTTGGGCCTATGCCTGGGGCATCCCTGG
TTTTTGCCTGTCTGTTTGAGAGCGGGACCAGGACTTCCTATGAA
GACATTTCTTTTTGCTTGTTCTCACTGGCGGATGTCCTGGAGAAT
GTGCCCACTGGCTTAGAGATGCTAAGTCTCAGGGATAAGGCTCA
GGGGCATTGCTGGCCCTCTTGATGGCCTCACCCTCTCGTAGCCG
CCTGGAGAGGAAGGGTAGACTATATAGAGGAGGTTAGGGGTAG
GTCAGCATGATGCTAGGATGGAGAGAGCTCTGTCCCCTCGTGGA
TGGTGGTGGTGACTCACCCGGGGGGCCAGCTGCTTTCTGAGTG
CAAATGAGAAAAATAAAGAGCTGCGCTGTGACTTTTCTTTCCAC
ATCAAAGCTTGGGTGTCAGTGCTTTAGCTTGATGCTCTGATCAC
CATGCAAATCTTCCACCGGCGCCTTGCTCAGCTTTCATATCCCA
AGGGTGCCTGGGAGGAAGGCAACAGGGACAGTGGACATCACT
GCACCACTTTCCACGACCCTGTGTGCCAACCTCAGCCACTTTGA
AACATGCTGATGACTGAGGTCTGTTCACTTTCTTAATTTCAAGC
AGGAGAAGCAGGTTGGGGAGCCAGCCTCCCCAGCTAGAGGGG
ACAGAACTTGACTTGAGCAGGGGGGTACCTCCTAGGACCTGCT
CCATGTGCCTACTTCTTTACCCTTCTCTAGAGAGGGCTCTTGTCC
TGTCAGAGCTGTTTTCTCCCTTCTCTTGTTTTTTCTTTTTCAAGA
CTGTTTCTCTGTGTTAGCCCTGGCTGTCCTGGATCTCACTCTGTA
GATCAGGCTGACCTTGAGTTCAAAGCTCCATCTGCCTCTACTTC
TCACATTACTGTGATTAAAGGCATATACTACCACTGCCTGGTGCC
CTTTTGTATTTCTTATTAAAGTCCTAATGTCTGATTATAAAAACAG
TCTGTGTGGGCTGGAGTGATGGCTTACTCAGTAAAGCACTTGCC
ATGGAATCTGGGCAATCTGAGTTTCATTTTTAGCATCCTGTAAAA
ATCCCAATTTGATGGTGTACTTGTAATGTCAGCATGGAGAGGCA
GAGATAGGTAAGTTCCCCAAGACTCTTTGAACCGACAGCTTGG
CCTCACTGGCACATTCCAGGTCTCAGTGAGAGACCCTGCCTCA
AAATACAAAGAAAGAGCTGCTGAAGAGTGGGTCAGAGTTGAC
CTCTGATCTCCGGAAGTATATGATACACACCCGTGCATGCACTCT
TCCTTACAAAATAAAAAGCAAAACAAAACCCCAACAGGTATAT
GGCCATTTTAGAAAAATTAGAAGATTTAGAAAGCTATACATAAA
AAAAAATGACCTAAAGAAAAATCTTTACTGTTCTGGGCACTATC
CCTATCAAACCACTGTGTTCTTTGGCCAAGCCTTGGGGTGGACA
CTGTTTTGAGGTGGGTCCTGTTATCTCCACTAGGTAGTGGAGTT
TTGTGTCAGACTAACTGGGTCTTAAAGCTGTCTTTAAGGCCATC
AGGAGCTACTGACTTGCCTGCCTCAGCAGAGCATATCCTGAAG
GTCGGGGTTAAGTCTCCTTCCCGAGCGAGTTGCCTTCCAGTGG
GCCCCTGGACTCCTAGGTCCTCAGCGCTCATCAGCTGCCAAGG
ACTCTGAGGGAATGTCCTCTGACTGTGGCCCCGAAAGGTAGGG
GAGGGGGATGTGCTTAGGCTTAGGACAGGGTCCTGTTTCAGTCT
GCCTTCACTGTTAGTAGCACTGTGCCACATGGCACAGACTGGGC
GAGCTTTAAAGGAAGGAGGTTGATATTGGTTCCCACTTCTGGGG
ATCATGGTTGAGCAGCCTTGTCTGATGATGGTTGTCTTGATGGTA
GATCGTGAGGTAGTTGATGAAGGTATGACATGGTGAGAAACTCT
GTGTGTGTGTGTTATTTTCTCTGTGTTCTACCTATACATCTATCTA
TGTATATATGTATCTATCTATCTACCTGGAGGCTGGAGAGATAGCT
TAGTGGTTAAGAACATTTGTTGTTCTTGCATAGTCCTGGATTTAAATTTTCAGCACCCACATGGCAGCTCACAACAACCCATAAATCCAGTTTCAGAGGATCCAACCTCTGATATACCATGTCAGCCAGAGCAGACACGGCTGAAGGTGGTTTGATCCCCGTATGGAGAGGTGACAATTGGGAAGAGAGAAAGATCAACTTAACCATGCAAGGAACAGGAAGTTAAATACTGAACAGGGAAGGTAAAGGCAGGAAGTAGATGTAGAGGGCAAATCAATGAAACCCAAACATACCCAAATTACGCTAAACACACACTGACATGCCAATTAAAAGGACAAATTGGCTCCACTGGCAAAACCAAAACAGACACTGAAGATCCAAACAGTCACATGCCAACTACCGCGGAGGGAGACAGACACAGAGAAGACCGTGACAGACACTTGGACACTCTTGAGAGTGGATGTGCAGGAAGAGAGCTCTGCCAGTGGAGAAGAAAGCACTCAGAAGAAAGTGACAGCAGCTGTAAATTTGTATTCTGCTAATGTTATGTTCCAAAGTTGAAAGCAAAATTGTACCAATTCATAAGAACAAACAGGCTGACTCTCAGTTGTGACTGAACGTCTCTCAGTAACTGACGGGGCGAGCAGGCCAAAGGAGAGTCGGCTCAGAAGGGTGCATAGCCACGCCAAATCAAATAAGCAAGTACAACCGGCAGGCTCTATTTCTAGCACAAAGGGGTCTGTGCCTCATTCTGTGCTTGGGTCAGAGCTTGGGTCTCTCATTTGGATGTAAGTGGTGTAGTGGAGAAGCAGGAAATAATCCGGAGCGCATATTTTGATTTTAACATAAGTGCTGATTTGGGAGGGAGTTTTGTCAAATTGTGTTTTTACAATGTTTTTTTTTTTTTAAATGATGCTTTTTTGTAAAGTGTACAAATGTGATATAAGATTGGTTCTGCTACATTCAGTTTCTATAAAAGTGGTTCTAAAATATTGTACTGTCAATCATCTCATGATTATTCTACTGTACACATTACTGACTTTGTATGTAATAATTAATATTAGAAGAAAATATAATTTATTTGAATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:46:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX1 1FX12MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:47:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX1 0THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:48:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:49:
DASLPYLQDESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIRFIMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:50:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDANTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:51:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:52:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDASTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:53:
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SEQ ID NO:54:
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SEQ ID NO:59:
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SEQ ID NO:64:
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SEQ ID NO:65:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:66:
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SEQ ID NO:68:
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SEQ ID NO:70:
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SEQ ID NO:73:
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SEQ ID NO:74:
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SEQ ID NO:76:
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SEQ ID NO:77:
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SEQ ID NO:78:
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SEQ ID NO:79:
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SEQ ID NO:80:
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SEQ ID NO:107:
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SEQ ID NO:108:
TVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYNGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGGSHHHHHHHH
SEQ ID NO:109:
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGAAGTACAGACGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTATAAGAGCACCGACGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAACATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACTCCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGATTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACTCCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAATGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGGTAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCACTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAGCGGCGGAGGCGGATCTCATCATCACCATCATCACCATCAC
SEQ ID NO:110:
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SEQ ID NO:111:
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TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC
CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC
CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA
TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCAC
GTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGG
CTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC
TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAG
GAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGTACTGCCTGGTCAAAG
GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGG
GCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAA
GAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG
CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTAAGCT
TGTCTCCGGGTAAAGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAA
GTGGCGGAGGCGGATCTCAATCTGCTCTTACACAGCCTGCCAG
CGTGTCCGGATCTCCTGGCCAGAGCATCACCATCAGCTGTACCG
GCACCAGCTCTGATGTCGGCGGCTACAATTACGTGTCCTGGTAT
CAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGATGATCTACGACG
TGTCCAACAGACCCAGCGGCGTGTCCAATAGATTCTCCGGCAG
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GCCGAGGACGAGGCCGATTACTACTGTAGCAGCTACACCAGCT
CCAGCACCAGAGTGTTTGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCT
GGGCCAGCCTAAGGCCGGTGGAGGTGGGTCTGGAGGGGGTGG
ATCTGGAGGTGGCGGATCGGAGGTGCAGCTGCTGGAATCTGGC
GGAGGACTTGTTCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTGTCTTGTG
CCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTATATCATGATGTGGGTC
CGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCAGCATCT
ATCCCAGCGGCGGCATCACCTTTTACGCCGACACAGTGAAGGG
CAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTAC
CTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACT
ACTGCGCCAGAATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGATTA
TTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCATCT
SEQ ID NO:112:
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SEQ ID NO:113:
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GCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCC
ACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCG
ACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCC
GTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGAT
CTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
CAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCA
CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACA
CTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGA
GTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGC
AGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCC
AGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCT
CTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGG
CAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGC
TCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGC
GCTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGG
CAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAA
GAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGC
CGAGTACCTGCCTCAAGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGG
ATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAA
CTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCA
AGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG
GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACT
GGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC
GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC
CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA
AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA
AACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT
CTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG
GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT
CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA
CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCC
TCACTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG
GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC
CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:114:
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SEQ ID NO:115:
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ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT
GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTA
CAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC
CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA
ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGC
CAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCA
TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC
TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA
GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCC
CGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCA
CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG
CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG
AGCCTAAGCTTGTCTCCGGGTAAAGGAGGCGGAGGATCTGGCG
GAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCTCAATCTGCTCTTACACA
GCCTGCCAGCGTGTCCGGATCTCCTGGCCAGAGCATCACCATCA
GCTGTACCGGCACCAGCTCTGATGTCGGCGGCTACAATTACGTG
TCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGATGAT
CTACGACGTGTCCAACAGACCCAGCGGCGTGTCCAATAGATTCT
CCGGCAGCAAGAGCGGCAACACCGCCAGCCTGACAATTAGCG
GACTGCAGGCCGAGGACGAGGCCGATTACTACTGTAGCAGCTA
CACCAGCTCCAGCACCAGAGTGTTTGGCACCGGCACAAAAGTG
ACCGTGCTGGGCCAGCCTAAGGCCGGTGGAGGTGGGTCTGGAG
GGGGTGGATCTGGAGGTGGCGGATCGGAGGTGCAGCTGCTGGA
ATCTGGCGGAGGACTTGTTCAGCCTGGCGGCTCTCTGAGACTG
TCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTATATCATGATG
TGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTGTCCA
GCATCTATCCCAGCGGCGGCATCACCTTTTACGCCGACACAGTG
AAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACC
CTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCG
TGTACTACTGCGCCAGAATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGATTATTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTGTCATCT
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SEQ ID NO:119:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX13FX14MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:120:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX1 0THQVQWX11AQEVVAQAX12LX13GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRLX18X1 9VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQLHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTWARGHFVX28QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPSPRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX47LLAKGSX48AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:121:
GGGGS
SEQ ID NO:122:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPTGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:123:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRFRVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPTGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:124:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:125:
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGQPKAGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:126:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:127:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:128:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:129:
GHAFTSDS
SEQ ID NO:130:
IYPRSGNP
SEQ ID NO:131:
DYYGRYFDV
SEQ ID NO:132:
EVQLQESGAELARPGASVKLSCKASGHAFTSDSINWVKQRIGQGLEWIGEIYPRSGNPYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCATDYYGRYFDVWGTGTTVTVSS
SEQ ID NO:133:
EDIYNR
SEQ ID NO:134:
GAT
SEQ ID NO:135:
QQYWSTPWT
SEQ ID NO:136:
DIQMTQSSFSFSVSLGDRVTIICKASEDIYNRLAWYQQKPGNTPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:137:
GYSFTDYY
SEQ ID NO:138:
IYPGSGNT
SEQ ID NO:139:
SYYYGSSYLFDY
SEQ ID NO:140:
EVQLQESGAELVRPGASVKLSCKASGYSFTDYYINWVKQRPGQGLEWIARIYPGSGNTYYNEKFKGKATLTAEKSSITAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSYYYGSSYLFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:141:
QSIGTS
SEQ ID NO:142:
YAS
SEQ ID NO:143:
QQSNNWPFT
SEQ ID NO:144:
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQSIGTSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIGDYYCQQSNNWPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO:145:
GYTFTDYY
SEQ ID NO:146:
INPNNGYT
SEQ ID NO:147:
SAAYYVLDD
SEQ ID NO:148:
EVQLQQSGPELVKPGALVKISCKASGYTFTDYYMNWVKKSHGRSLEWIGDINPNNGYTNYNQNFKGKATLTVDKSSSTVYMELRSLTSEDSAVYYCARSAAYYVLDDWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:149:
KKVTIFGSISV
SEQ ID NO:150:
NGA
SEQ ID NO:151:
LQNKEVPYT
SEQ ID NO:152:
DIVMTQSPASLAVSLGQKATISCKASKKVTIFGSISVLHWYQQKPGQPPKLIYNGAKLESGVSARFSDSGSQNRSPFGNQLNFTLTIDPVEADDAATYYCLQNKEVPYTFGGGTELEIK
SEQ ID NO:153:
GDSITSGY
SEQ ID NO:154:
ISYTGST
SEQ ID NO:155:
QGGWLQAMDY
SEQ ID NO:156:
EVQLQESGPSLVKPSQTLSLTCSVTGDSITSGYWNWIRKFPGNKLEYMGYISYTGSTYYNPSLKRRISITRDTSKNQYYLQLNSVTTEDTATYYCASQGGWLQAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:157:
QSLLYSSNQKNS
SEQ ID NO:158:
WAS
SEQ ID NO:159:
QQYYGYPWT
SEQ ID NO:160:
DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNSLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYGYPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:161:
GFNIKDTY
SEQ ID NO:162:
IDPANDNT
SEQ ID NO:163:
EGYGGSYGEGY
SEQ ID NO:164:
EVQLQESGAELVKPGASVTLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANDNTKYDPKFQDKATITADTSSDTAYLRLSSLTSEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:165:
QSVSND
SEQ ID NO:166:
QQDYNSPWT
SEQ ID NO:167:
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVIWYQQKPGQSPKLLIYYASIRFTGVPDRFAGSGYGTDFTFTINTVQAEDLAVYFCQQDYNSPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:168:
IDPANGNT
SEQ ID NO:169:
PFNYRFYDVYYFDY
SEQ ID NO:170:
EVQLQESGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFPGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDAAVYYCARPFNYRFYDVYYFDYWGQGTTLTVST
SEQ ID NO:171:
SSVSY
SEQ ID NO:172:
DTS
SEQ ID NO:173:
QQWSTYPLT
SEQ ID NO:174:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPLRFSGSGSGTSYSLTLSRMEAEDAATYYCQQWSTYPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:175:
GYTFTSYV
SEQ ID NO:176:
INPYNDGS
SEQ ID NO:177:
QTLDF
SEQ ID NO:178:
EVQLQESGPELVKPGTSVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQRPGQGLEWIGYINPYNDGSKYNEKFKGKATLTSDTSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAKQTLDFWGQGTSVTVST
SEQ ID NO:179:
ESVEFYGTTL
SEQ ID NO:180:
AAS
SEQ ID NO:181:
QQSRKVPYT
SEQ ID NO:182:
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEFYGTTLMQWYQQKPGQPPKLLIYAASNVESGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEGDIGMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:183:
GFSLSTYGLG
SEQ ID NO:184:
IWWNDDK
SEQ ID NO:185:
TLHYYDGIAWFAY
SEQ ID NO:186:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTYGLGVGWIRQPSGKGLEWLANIWWNDDKFYDSVLKSRLTISKDTSNNQVFLKISSVDTSETATYYCAQTLHYYDGIAWFAYWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:187:
HYVGTF
SEQ ID NO:188:
STS
SEQ ID NO:189:
QQYYNSPLT
SEQ ID NO:190:
DIVMTQSQNFMSTSVGDRVSVTCKASHYVGTFVAWYQQKPGQSPKALIFSTSYRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYYNSPLTFGAGTKLELK
SEQ ID NO:191:
GYTFTSNW
SEQ ID NO:192:
IHPSDSET
SEQ ID NO:193:
SSGDYGRDY
SEQ ID NO:194:
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSNWMNWVKQRPGRGLEWIGRIHPSDSETHYHQKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCAHSSGDYGRDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:195:
ESVDSYGNSF
SEQ ID NO:196:
LAS
SEQ ID NO:197:
QQNNEDPWT
SEQ ID NO:198:
NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLQSGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO:199:
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGLIDPANDNTIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:200:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:201:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRFTGIPARFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:202:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:203:
QQDYTSPWT
SEQ ID NO:204:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYTSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:205:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYTSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:206:
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGLIDPANDNTIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:207:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:208:
GAAATTGTGATGACACAGAGCCCTCCAACGCTGAGCCTGTCTCCTGGCGAAAGAGTGACCCTGAGCTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGTCCAACGACCTGAGCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACTACGCCAGCATCAGATTCACAGGCATCCCCGCCAGATTTTCCGGCAGCGGCTCTGGCACAGATTTCACCCTGACCATAAGCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGTCAGCAGGACTACactAGCCCCTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:209:
GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGCGCCACCGTGAAGATCAGCTGCAAGGTGTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCAGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGATGGGCCTGATCGACCCCGCCAACGACAATACCATCTACGCCGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCTCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGAAGGCTACGGCGGCAGCTACGGCGAAGGATATTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTTAGCTCTGCtagcACCAAGGGCCCATCcGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCcTGGAACTCAGGCGCtCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTAAGcTTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:210:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTcTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCaccAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:211:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRFRVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPTGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:212:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTcTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCaccAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:213:
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGLIDPANDNTIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:214:
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SEQ ID NO:215:
GAGGTGCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAAAAGCCTGGCGCCACCGTGAAGATCAGCTGCAAGGTGTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCAGCAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGATGGGCCTGATCGACCCCGCCAACGACAATACCATCTACGCCGAGAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCTCTACCGACACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGAAGGCTACGGCGGCAGCTACGGCGAAGGATATTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACCGTTAGCTCTGCtagcACCAAGGGCCCATCcGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCcTGGAACTCAGGCGCtCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCaccAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:216:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGA
ACCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGT
TCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCT
GCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCA
CCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGA
CGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCC
GTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGAT
CTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAA
ACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATC
ACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACA
CACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGA
GAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGT
GCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAG
CCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTC
AGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGG
CTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTcTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacT
GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG
GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC
TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGC
TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC
ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG
AAGAGCCTAAGcTTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:217:
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SEQ ID NO:218:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGgatGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCG
ATTACGACGCCcctACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAG
GTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACC
CCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCT
TTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCA
GACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACC
GACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACG
CCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGT
TGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCT
CTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAAC
AGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCAC
GGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACA
CTGgcgaatCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGT
CGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAG
GCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAG
CTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGG
GAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTC
TCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGG
CAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTG
CTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAG
CgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATG
GCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGA
AGAGATCcgtTTCcgtATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCC
GAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTcTGACAAAACTCACA
CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC
AGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCT
CCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCA
CGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC
gccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCA
GGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAA
CAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC
AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCAT
CCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacTGCCTG
GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA
GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCG
TGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACC
GTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCT
CCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG
CCTAAGcTTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:219:
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SEQ ID NO:220:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGC
CAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGcggAGC
AAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGC
GATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAG
AGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAA
CCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTT
CTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTG
CAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCAC
CGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGAC
GCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCG
TTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
CAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCA
CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTcTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACgccAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacT
GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTG
GGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC
TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGC
TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTC
ATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAG
AAGAGCCTAAGcTTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:221:
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SEQ ID NO:222:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:223:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:224:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:225:
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SEQ ID NO:226:
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SEQ ID NO:228:
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SEQ ID NO:229:
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SEQ ID NO:230:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO:231:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:232:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:233:
GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTEC
SEQ ID NO:234:
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SEQ ID NO:235:
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDTYMHWVQQAPGKGLEWMGLIDPANDNTIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:236:
EVQLX1X2SGAEX3X4KPGAX5VX6X7SCX8X9SGFNIKDTYMHWVX10QX11PX12X13GLEWX14GX15IDPANDNTX16YX17X18KFQX19X20X21TITADTSX22DTAYX23X24LSSLX25SEDTAVYYCAREGYGGSYGEGYWGQGTX2 6X27TVSS
SEQ ID NO:237:
X1IVMTQX2PX3X4LX5X6SX7GX8RVTX9X10CX11ASQSVSNDX12X13WYQQKPGQX14PX15LLIYYASIRFTGX16PX17RFX18GSGX19GTDFTX20TIX21X22X23QX24EDX25AVYX26CQQDYX27SPWTFGX28GTKX29EIK
SEQ ID NO:238:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRANVTRLX1 9X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:239:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:240:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRANVTRLX1 9X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQX53DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:241:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQX16DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:242:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:243:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:244:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASTRFTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:245:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASTRATGIPARFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:246:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASTRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:247:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRATGIPARFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:248:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:249:
EIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSVSNDLSWYQQKPGQAPRLLIYYASIRATGIPARFSGSGYGTDFTLTISSLQPEDFAVYFCQQDYNSPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:250:
DTYMH
SEQ ID NO:251:
RIDPANDNTKYDPKFQD
SEQ ID NO:252:
LIDPANDNTIYAEKFQG
SEQ ID NO:253:
KASQSVSNDVI
SEQ ID NO:254:
YASIRFT
SEQ ID NO:255:
RASQSVSNDLS
Claims (59)
1.一种结合人类PD-L1的经分离的抗体，其包含：
(i)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的CDRL3(PAL769-VL、h769-IF3-VL、h769-tm2-VL、h769-tm3-VL)；
(ii)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:162的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:163的氨基酸序列的CDRH3(PAL769-VH、h769-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列的CDRL3(h769.T-VL)；
(iii)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDRH3(PAL752-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的CDRL3(PAL752-VL)；
(iv)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:137的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的CDRH2和/或包含SEQ ID NO:139的氨基酸序列的CDRH3(PAL759-VH)；和免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:143的氨基酸序列的CDRL3(PAL759-VL)；
(v)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:145的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列的CDRH3(PAL760-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的CDRL3(PAL760-VL)；
(vi)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:155的氨基酸序列的CDRH3(PAL767-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列的CDRL3(PAL767-VL)；
(vii)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:161的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列的CDRH3(PAL771-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:172的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的CDRL3(PAL771-VL)；
(viii)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列的CDRH3(PAL785-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:180的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的CDRL3(PAL785-VL)；
(ix)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:183的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:184的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:185的氨基酸序列的CDRH3(PAL787-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:189的氨基酸序列的CDRL3(PAL787-VL)；或者
(x)免疫球蛋白重链可变区，所述免疫球蛋白重链可变区包含：包含SEQ ID NO:191的氨基酸序列的CDRH1、包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列的CDRH2和包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列的CDRH3(PAL788-VH)；和/或免疫球蛋白轻链可变区，所述免疫球蛋白轻链可变区包含：包含SEQ ID NO:195的氨基酸序列的CDRL1、包含SEQ ID NO:196的氨基酸序列的CDRL2和包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列的CDRL3(PAL788-VL)。
2.如权利要求1所述的经分离的抗体，其中所述CDR嵌插在人类或人源化免疫球蛋白框架区之间。
3.一种结合人类PD-L1的经分离的抗体，其包含：
(i)包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL769-VH)，和包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL769-VL)；
(ii)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-IF3-VL)；
(iii)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769-VH)，和包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm2-VL)；
(iv)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQ ID NO:202的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769-tm3-VL)；
(v)包含SEQ ID NO:199的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(h769 VH)，和包含SEQID NO:204的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(h769.T-VL)；
(vi)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL752-VH)，和包含SEQ ID NO:136的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL752-VL)；
(vii)包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL759-VH)，和包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL759-VL)；
(viii)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL760-VH)，和包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL760-VL)；
(ix)包含SEQ ID NO:156的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL767-VH)，和包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL767-VL)；
(x)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL771-VH)，和包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL771-VL)；
(xi)包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL785-VH)，和包含SEQ ID NO:182的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL785-VL)；
(xii)包含SEQ ID NO:186的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL787-VH)，和包含SEQ ID NO:190的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL787-VL)；或者
(xiii)包含SEQ ID NO:194的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变区(PAL788-VH)，和包含SEQ ID NO:198的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变区(PAL788-VL)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的经分离的抗体，其进一步包含重链和/或轻链恒定区。
5.如权利要求4所述的经分离的抗体，其中所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4重链恒定区。
6.如权利要求1-5中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体以5nM或更低、1nM或更低、0.75nM或更低、0.5nM或更低、0.1nM、0.075nM或0.05nM或更低的KD与人类PD-L1结合，如通过表面等离子体共振或生物层干涉测量法测量的。
7.如权利要求1-6中任一项所述的经分离的抗体，其中所述抗体还与食蟹猕猴(猕猴)PD-L1结合。
8.一种经分离的抗体，其与如权利要求1-7中任一项所述的抗体竞争与人类PD-L1的结合。
9.一种经分离的抗体，其与如权利要求1-8中任一项所述的抗体结合人类PD-L1上相同的表位。
10.一种经分离的核酸，其包含编码如权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列和/或编码如权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列。
11.一种表达载体，其包含：(i)包含编码如权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白重链可变区的核苷酸序列的核酸；和/或(ii)包含编码如权利要求1-7中任一项所述的免疫球蛋白轻链可变区的核苷酸序列的核酸。
12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的表达载体。
13.一种融合蛋白，其包含：
(a)唾液酸酶酶；和
(b)源自于如权利要求1-9中任一项所述的抗PD-L1抗体的抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域。
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是人类唾液酸酶。
15.如权利要求13或14所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是重组突变人类唾液酸酶。
16.如权利要求15所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的取代或缺失；
(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的取代；
(c)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基(K9)的取代；
(d)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基(A42)的取代；
(e)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基(P62)的取代；
(f)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基(A93)的取代；
(g)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基(Q126)的取代；
(h)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的取代；
(i)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基(A242)的取代；
(j)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基(Q270)的取代；
(k)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基(S301)的取代；
(l)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基(W302)的取代；
(m)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的取代；
(n)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基(V363)的取代；或者
(o)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基(L365)的取代；
或任何前述取代的组合。
17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中，在所述唾液酸酶中：
(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸取代(M1A)或被天冬氨酸取代(M1D)；
(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸取代(V6Y)；
(c)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被精氨酸取代(A42R)；
(d)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；
(e)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；
(f)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；
(g)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；
(h)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸取代(I187K)；
(i)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、蛋氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；
(j)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；
(k)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；
(l)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；
(m)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸取代(C332A)；
(n)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或者
(o)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；
或者所述唾液酸酶包含任何前述取代的组合。
18.如权利要求17所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含选自ΔM1、M1A、M1D、V6Y、K9D、A42R、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、I187K、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、C332A、V363R和L365I的取代，或任何前述取代的组合。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A取代；
(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I取代；
(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A取代；
(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；
(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；
(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；
(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；
(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A取代；
(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；
(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A取代；
(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；或者
(l)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A突变。
20.如权利要求13-19中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。
21.如权利要求20所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是Neu2。
22.如权利要求13-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。
23.如权利要求22所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶能够切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。
24.如权利要求23所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶能够切割α2,3和α2,8键联。
25.如权利要求13-24中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO48-62、94、97、100、126或234中的任一者。
26.如权利要求13-25中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含表1-9中任一者中所示的突变。
27.如权利要求13-26中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。
28.如权利要求27所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM Fc结构域。
29.如权利要求28所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
30.如权利要求29所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
31.如权利要求13-30中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域与源自于如权利要求1-9中任一项所述的抗PD-L1抗体的第二抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域缔合，以产生抗PD-L1抗原结合位点。
32.如权利要求13-31中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域和/或所述抗PD-L1免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸接头连接。
33.如权利要求13-32中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:205-207、211、213、214和219中的任一者。
34.一种抗体缀合物，其包含如权利要求13-33中任一项所述的融合蛋白。
35.如权利要求34所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含单一唾液酸酶。
36.如权利要求34所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含两种唾液酸酶。
37.如权利要求36所述的抗体缀合物，其中所述两种唾液酸酶是相同的。
38.如权利要求34-37中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含单个抗PD-L1抗原结合位点。
39.如权利要求34-37中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含两个抗PD-L1抗原结合位点。
40.如权利要求39所述的抗体缀合物，其中所述两个抗PD-L1抗原结合位点是相同的。
41.如权利要求34-40中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa的分子量。
42.如权利要求34-40中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
43.如权利要求34-42中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被连接在一起，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽一起限定了抗PD-L1抗原结合位点。
44.如权利要求43所述的抗体缀合物，其中所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域。
45.如权利要求43或44所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:205。
46.如权利要求43-45中任一项所述的抗体缀合物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:206或213。
47.如权利要求43-46中任一项所述的抗体缀合物，其中所述第三多肽包含SEQ ID NO:207、211、214或219。
48.如权利要求34-42中任一项所述的抗体缀合物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；
(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和
(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，所述第三和第四多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第三多肽和所述第四多肽一起限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。
49.如权利要求48所述的抗体缀合物，其中所述第二和第三多肽分别以N-端至C-端的取向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。
50.如权利要求34-42中任一项所述的抗体缀合物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和
(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一scFv限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述第二scFv限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。
51.如权利要求50所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽以N-端至C-端的取向包含所述第一唾液酸酶、所述第一免疫球蛋白Fc结构域和所述第一scFv，并且所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述第二唾液酸酶、所述第二免疫球蛋白Fc结构域和所述第二scFv。
52.如权利要求34-42中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗PD-L1抗原结合位点，并且所述scFv限定了第二抗PD-L1抗原结合位点。
53.如权利要求52所述的抗体缀合物，其中所述第二多肽以N-端至C-端的取向包含所述免疫球蛋白重链和所述scFv，并且所述第三多肽以N-端至C-端的取向包含所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域。
54.一种经分离的核酸，其包含编码如权利要求13-33中任一项所述的融合蛋白或如权利要求34-53中任一项所述的抗体缀合物的至少一部分的核苷酸序列。
55.一种表达载体，其包含如权利要求54所述的核酸。
56.一种宿主细胞，其包含如权利要求55所述的表达载体。
57.一种药物组合物，其包含如权利要求1-9中任一项所述的抗体、如权利要求13-33中任一项所述的融合蛋白或如权利要求34-53中任一项所述的抗体缀合物。
58.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-9中任一项所述的抗体、如权利要求13-33中任一项所述的融合蛋白、如权利要求34-53中任一项所述的抗体缀合物，或如权利要求57所述的药物组合物。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述癌症选自NSCLC、黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、食道癌、胃癌、肾癌、肺癌、卵巢癌、转移性默克尔细胞癌(MCC)、转移性尿路上皮癌(UC)和胰腺癌。
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