CN114302897A - 唾液酸酶-her2抗体融合蛋白及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及重组唾液酸酶和抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域融合蛋白。本发明还提供了包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其部分的抗体偶联物。本发明还涉及使用所述唾液酸酶融合蛋白或抗体偶联物治疗癌症的方法。
Description
与相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月3日提交的美国临时专利申请系列号62/870,341和2020年1月3日提交的美国临时专利申请系列号62/957,041的利益和优先权，每个所述临时申请的全部内容整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及重组唾液酸酶融合蛋白和抗体偶联物以及它们在治疗癌症中的用途。
背景技术
越来越多的证据支持聚糖、特别是唾液酸聚糖在肿瘤进展的各个不同病理生理步骤中的作用。聚糖调节肿瘤的增殖、侵袭、血源性转移和血管生成(Fuster等，(2005)Nat.Rev.Cancer 5(7):526-42)。在癌症中细胞表面糖缀合物的唾液酸化经常被改变，导致唾液酸化肿瘤相关糖抗原的表达。肿瘤细胞中唾液酸化聚糖的表达通常伴有肿瘤的侵袭性和转移潜力的提高。
最近变得越来越明显的是，Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素)这种结合唾液酸的凝集素家族，通过与超唾液酸化的癌细胞结合并介导来自于活化的NK细胞受体的信号的抑制，从而抑制NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀，而在癌症免疫抑制中发挥作用(Jandus等，(2014)J.CLIN.INVEST.124:1810-1820；
等，(2014)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 111:14211-14216；Hudak等，(2014)NAT.CHEM.BIOL.10:69-75)。同样地，通过用唾液酸酶酶法去除唾液酸可以增强NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀(Jandus，同上；Hudak，同上；Xiao等，(2016)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 113(37):10304-9)。
编码HER2的基因位于17号染色体上，并且是EGF/erbB生长因子受体基因家族的成员，所述家族还包括表皮生长因子受体(EGFR或HER1)、HER3/erbB3和HER4/erbB4。所有这些基因都编码跨膜生长因子受体，它们是具有生长刺激潜力的1型酪氨酸激酶受体。HER家族成员的活化通常在配体和相同单体或HER家族的其他成员的二聚体结合在一起时发生。HER2没有已知的配体。一旦活化发生，胞质信号蛋白的酪氨酸自磷酸化将信号传递到细胞核，从而调节细胞生长、分裂、分化和迁移等各个方面。
HER2受体的过表达导致受体向细胞核传递过多的细胞增殖信号，这可能导致转化细胞更积极地生长。数据支持HER2的过表达直接促进肿瘤细胞的病理发生和临床侵袭性这一假设。这种过表达与不良预后、包括无复发生存率和总生存率的降低相关。抗HER2抗体包括被批准用于例如乳腺癌和胃或胃食管结合部腺癌的曲妥珠单抗以及被批准用于例如乳腺癌的帕妥珠单抗。
使用包括阻断PD-1/PD-L1途径的抗体在内的免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法改善了许多癌症患者的结果。然而，尽管到目前为止已取得进展，但许多患者对目前可用的免疫检查点抑制剂没有响应。因此，对克服免疫抑制性肿瘤微环境并用于治疗与超唾液酸化的癌细胞相关的癌症的有效干预手段，仍存在着需求。
发明内容
本发明部分是基于下述发现，即有可能产生含有唾液酸酶和抗HER2免疫球蛋白抗原结合的融合蛋白和/或包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其部分的抗体偶联物。所述融合蛋白和/或抗体偶联物具有适合的底物特异性和活性，可用于从癌细胞例如表达HER2的癌细胞表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子，和/或从肿瘤微环境除去唾液酸和/或含唾液酸分子，和/或降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
因此，一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含：(a)唾液酸酶；和(b)抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域，(或基本上由它们组成)。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶是人唾液酸酶，例如重组突变人唾液酸酶。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；或任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸替换(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸替换(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)替换；(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)替换；(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸替换(L54M)；(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)替换；(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q69H)；(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸替换(R78K)；(i)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸替换(D80P)；(j)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)替换；(k)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸替换(G107D)；(l)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q108H)；(m)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)替换；(n)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸替换(C125L)；(o)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)替换；(p)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸替换(A150V)；(q)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸替换(C164G)；(r)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R170P)；(s)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸替换(A171G)；(t)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸替换(Q188P)；(u)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R189P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；(w)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)替换；(x)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸替换(T249A)；(y)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸替换(D251G)；(z)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E225P)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸替换(H239P)；(bb)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；(cc)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；(dd)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；(ee)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)替换；(ff)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E257P)；(gg)对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸替换(S258C)；(hh)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸替换(V265F)；(jj)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)替换；(kk)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸替换(W292R)；(ll)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)替换；(mm)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)替换；(nn)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸替换(V363R)；或(oo)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)替换；或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R或L365I的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的替换；(c)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的替换；或(d)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：(a)所述对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸(M1A)替换或被天冬氨酸(M1D)替换；(b)所述对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸(V6Y)替换；(c)所述对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸(I187K)替换；或(d)所述对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸(C332A)替换；或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I替换；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A替换；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A替换；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A替换；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A替换；或(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A替换。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4，例如所述唾液酸酶是Neu2。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方式中，所述唾液酸酶可以切开α2,3、α2,6和/或α2,8连键。在某些实施方式中，所述唾液酸酶可以切开α2,3和α2,8连键。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-62、111、114、117或151中的任一者或与SEQ ID NO：48-62、111、114、117或151中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表5-12或14-27中的任一者中阐述的突变或突变的组合。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表1-4中的任一者中阐述的突变或突变的组合。
在某些实施方式中，所述融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgMFc结构域，例如所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域，例如所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
在某些实施方式中，所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域与第二抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域结合(例如共价或非共价结合)，以产生抗HER2抗原结合部位。
在某些实施方式中，所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、CT-P6、曲妥珠单抗-dkst、MGAH22(margetuximab)、PF-05280014、厄妥索单抗、甘妥单抗、替米妥珠单抗、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201的抗体，例如，所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于曲妥珠单抗。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域和/或抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸连接物相连。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：66-85、98-106、112、113、115、116、118、119、122-134、141、143、145、147或152-155中的任一者。
另一方面，本发明提供了一种抗体偶联物，其包含任何上述融合蛋白。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含单个唾液酸酶。在其他实施方式中，所述抗体偶联物包含两个可以相同或不同的唾液酸酶。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含两个相同的唾液酸酶。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含单个抗HER2抗原结合部位。在其他实施方式中，所述抗体偶联物包含两个可以相同或不同的抗HER2抗原结合部位。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含两个相同的抗HER2抗原结合部位。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物具有约135kDa至约165kDa的分子量，或所述抗体偶联物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。所述第三多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。所述第一多肽可以例如包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽可以例如包含SEQ ID NO：67或149中的任一者，和/或所述第三多肽可以例如包含SEQ ID NO：68-74、98-104、112、113、115、116、118、119、141、143、145、147、152或154中的任一者。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，所述第三和第四多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第三多肽和第四多肽一起定义了第二抗HER2抗原结合部位。所述第二和第三多肽可以例如分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一scFv定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第二scFv定义了第二抗HER2抗原结合部位。所述第一多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。所述第二多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二scFv。所述第一多肽可以例如包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者，和/或所述第二多肽可以例如包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽，其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述scFv定义了第二抗HER2抗原结合部位。所述第二多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和scFv。所述第三多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其包含编码任何上述融合蛋白或任何上述抗体偶联物的至少一部分的核苷酸序列。另一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含任何上述核酸。另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含任何上述表达载体。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何上述融合蛋白或任何上述抗体偶联物。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体偶联物或任何上述药物组合物。
在某些实施方式中，所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管和食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、不明原发癌(CUP)、结肠直肠腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞癌、胸腺癌、非黑素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮性卵巢癌(non-EOC)、葡萄膜黑素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌症、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。例如，在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌或黑素瘤。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体偶联物或任何上述药物组合物。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+T-细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+ T-细胞。在某些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体偶联物或任何上述药物组合物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加循环NK细胞的数目。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中增加引流淋巴结中的T-细胞数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体偶联物或任何上述药物组合物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加引流淋巴结中的T-细胞数目。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+ T-细胞。
另一方面，本发明提供了一种在细胞、组织或受试者中提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体偶联物或任何上述药物组合物相接触，以便相对于与所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
本发明的这些和其他方面和特点在下面的详细描述和权利要求书中描述。
附图说明
参考下述附图，本发明可以被更完全地理解。
图1描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组人类Neu1、Neu2、Neu3和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(St-唾液酸酶)。单体和二聚体物质被注明。
图2是示出了重组人类Neu1、Neu2和Neu3的酶活性的条形图。
图3是示出了在所指示的pH下重组人类Neu2和Neu3的酶活性随底物浓度而变的线图。
图4描绘了可用于Neu2变体的噬菌体展示或酵母展示筛选的唾液酸生物素化探针的示意图。
图5描绘了便于Neu2变体的噬菌体展示筛选的示例性流程。
图6描绘了便于Neu2变体的酵母展示筛选的示例性流程。
图7A描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组Neu2-Fc(野生型)和Neu2-M106-Fc。图7B是Neu2-Fc(野生型和Neu2-M106-Fc的SEC-HPLC迹线。单体物质具有21分钟的保留时间。
图8描绘了Neu2变体M106的酶活性的线图。
图9A描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的Neu2-M173-Fc。图9B是Neu2-M173-Fc的SEC-HPLC迹线。单体物质具有6.367分钟的保留时间。在通过蛋白A和CHT层析纯化后，单体物质具有大约90％的纯度。
图10描绘了Neu2-M173-Fc的酶活性，使用4-MU-Neu5Ac作为底物，并将酶浓度固定到2μg/孔。
图11A描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原(NR)和还原(R)条件下的Neu2-M106。图11B描绘了Neu2结构的示意图，R243切割位点的位置被注明。
图12描绘的还原SDS-PAGE凝胶示出了用(+)或未用(-)胰蛋白酶处理的通过大规模或小规模表达生产的Neu2-M106。
图13描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在与胰蛋白酶和指定浓度的蛋白酶抑制剂柠檬酸铁(Fe Cit)、抑肽酶、AEBSF、亮抑酶肽或E-64之一温育后的Neu2-M106。
图14的表格描绘了在Neu2中胰蛋白酶切割位点周围的不同突变和突变组合。
图15A描绘了用或未用胰蛋白酶处理的在A242位置处带有指定突变的Neu2变体的还原SDS-PAGE分析。胰蛋白酶消化使用胰蛋白酶的5,000％稀释液在4℃进行5分钟。通过添加SDS淬灭所述消化，并将2μg蛋白质载样到凝胶上。图15B描绘了在A242位置处带有指定突变的Neu2变体的酶活性。图15C是在A242位置处带有指定突变的Neu2变体的SEC-HPLC迹线。示出了Neu2-M106(在其中测试A242位置处的突变的突变背景)作为对照。
图16描绘了用或未用胰蛋白酶处理的指定Neu2变体的还原SDS-PAGE分析。示出了Neu2-M106作为对照。例如，显示出Neu2-M255相对于Neu2-M106具有提高超过10倍的胰蛋白酶抗性。
图17A-17I描绘了含有唾液酸酶例如人唾液酸酶和抗HER2抗原结合部位的某些抗体偶联物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)唾液酸酶的每种抗体偶联物构建物来说，每个唾液酸酶可以相同或不同。对于含有超过一个(例如两个)抗HER2抗原结合部位的每种抗体偶联物构建物来说，每个抗HER2抗原结合部位可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体偶联物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化改造的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化改造以含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化改造以含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图18描绘了含有唾液酸酶例如人唾液酸酶和抗原结合部位的某些抗体偶联物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)抗原结合部位的每种抗体偶联物构建物来说，每个抗原结合部位可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体偶联物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化改造的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化改造以含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化改造以含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图19A-19D是被称为Raptor抗体-唾液酸酶偶联物(图19A)、Janus抗体-唾液酸酶偶联物(图19B)、Lobster抗体-唾液酸酶偶联物(图19C)和Bunk抗体-唾液酸酶偶联物(图19D)的示例性融合蛋白偶联物的示意图。
图20描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的纯化的重组人类Janus曲妥珠单抗。
图21描绘了纯化的Janus曲妥珠单抗的SEC-HPLC迹线，显示出大约90％的单体纯度。
图22描绘了使用4-MU-Neu5Ac作为底物测定的Janus曲妥珠单抗的酶活性。
图23描绘了通过ForteBio Octet确定的Janus曲妥珠单抗(顶部)和曲妥珠单抗(底部)与HER2抗原的结合。平衡解离常数(KD)被注明。
图24A-D描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中抗体-唾液酸酶偶联物的各种不同配置的测试。在用黑色三角形标注的日期，通过腹膜内注射10mg/kg的每种测试物对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。每条线代表单个小鼠。将小鼠用曲妥珠单抗(图24A)、Raptor(图24B)、Janus(图24C)或Lobster(图24D)治疗。
图25A-D描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中Janus抗体-唾液酸酶偶联物的测试。在用黑色三角形标注的日期，通过腹膜内注射10mg/kg的Janus对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。在与Janus的同一天，小鼠也用抗小鼠NK1.1抗体(10mg/kg)处理以剥夺自然杀伤细胞(图25A)，用氯膦酸二钠脂质体(0.5mg/小鼠，每周三次共两周)处理以剥夺巨噬细胞(图25B)，或用抗小鼠CD8α抗体(10mg/kg)处理以剥夺CD8+ T细胞(图25C)。每条线代表单个小鼠。图25D描绘了来自于实施例7的所注明的治疗组的平均肿瘤体积和误差线。
图26A-B描绘了在利用第二种来源的被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因原位肿瘤模型中Janus抗体-唾液酸酶偶联物的测试。在用黑色三角形(▼)标注的日期，通过腹膜内注射10mg/kg的每种测试物对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。每条线代表单个小鼠。小鼠用介质、曲妥珠单抗、Janus或失去功能的Janus治疗(图26A)。图26B描绘了来自于图26A的用Janus治疗并且原始EMT6-Her2肿瘤完全消退的三只小鼠(治愈的小鼠)或空白(naive)小鼠的再激惹实验。将治愈的小鼠在左和右下胁区域用EMT6-Her2细胞或亲代EMT6细胞接种。将空白(naive)小鼠用EMT6-Her2细胞接种。
图27A-B描绘了在小鼠同基因原位肿瘤模型中与抗小鼠PD1抗体相组合的Janus抗体-唾液酸酶偶联物的测试。在用黑色三角形(▼)标注的日期，通过腹膜内注射10mg/kg单独的抗小鼠PD1抗体(图27A)或Janus和抗小鼠PD1抗体(各10mg/kg，图27B)对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。每条线代表单个小鼠。
图28描绘了在用表达人类Her2的B16黑素瘤细胞系注射的小鼠同基因肿瘤模型中各种不同测试物的测试。在用黑色三角形(▼)标注的日期，通过腹膜内注射10mg/kg的Janus、曲妥珠单抗或抗小鼠PD1抗体与抗小鼠CTLA4抗体(各10mg/kg)的组合对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。每条线代表单个小鼠。
图29描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中Janus曲妥珠单抗的测试。每条线代表单个小鼠。刻度标记指示给药频率(总共5剂，每两周一次)。小鼠用Janus曲妥珠单抗或同种型对照治疗。
图30描绘了Janus曲妥珠单抗对人类M2样巨噬细胞对BT-20肿瘤细胞(图30A)或HT29肿瘤细胞(图30B)的吞噬作用的影响的试验。将巨噬细胞(“Macro”)与肿瘤细胞(“肿瘤”)和曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗或Janus曲妥珠单抗LOF混合。
图31描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中Janus曲妥珠单抗2和曲妥珠单抗的试验。每条线代表单个小鼠。试验组包括介质(图31A)、10mg/kg的曲妥珠单抗(图31B)、1mg/kg的Janus曲妥珠单抗2(图31C)和10mg/kg的Janus曲妥珠单抗2(图31D)。刻度标记指示给药频率(总共5剂，每两周一次)。标注了具有部分响应(PR)和完全响应(CR)的小鼠数目。
图32描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2的试验。示出了每个治疗组中的平均肿瘤尺寸。刻度标记指示给药频率(总共5剂，每两周一次)。
图33描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗LOF的试验。每条线代表单个小鼠。试验组包括同种型对照(图33A)、Janus曲妥珠单抗LOF(图33B)和Janus曲妥珠单抗(图33C)。刻度标记指示给药频率(总共5剂，每两周一次)。标注了具有部分响应(PR)和完全响应(CR)的小鼠数目。
图34描绘了在用表达人类Her2的B16黑素瘤细胞系注射的小鼠同基因肿瘤模型中Janus曲妥珠单抗2、曲妥珠单抗和/或抗小鼠PD-1抗体(anti-mPD1)的试验。小鼠通过腹膜内注射10mg/kg的同种型对照(图34A)、曲妥珠单抗(图34B)、anti-mPD1(图34C)、Janus曲妥珠单抗2(图34D)、Janus曲妥珠单抗2与anti-mPD1的组合(10mg/kg每种药剂，图34E)或曲妥珠单抗与anti-mPD1的组合(10mg/kg每种药剂，图34F)进行治疗。小鼠在用黑色三角形(▼)标记的日期给药，并记录肿瘤体积(mm3)。每条线代表单个小鼠。标注了具有部分响应(PR)和完全响应(CR)的小鼠数目。
图35描绘了在利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6小鼠乳腺癌细胞的小鼠同基因肿瘤模型中体内药效学研究的设计。
图36描绘了Janus曲妥珠单抗2对EMT6-Her2肿瘤细胞的体内去唾液酸化，并与Janus曲妥珠单抗LOF、曲妥珠单抗或介质对照进行比较。如图35中所述，将Janus曲妥珠单抗2治疗的小鼠分成无响应者(NR)和响应者(R)。对CD45阴性肿瘤细胞的MALII(怀槐(Maackia amurensi)凝集素II)染色的降低指示去唾液酸化。由于肿瘤过小而无法回收或完全消失，响应者组仅有N＝3个数据点。
图37描绘了所指示的治疗组的肿瘤浸润性CD4+ T细胞(图37A)、CD8+ T细胞(图37B)、CD69+CD8+ T细胞(图37C)和GzmB+CD8+T细胞(图37D)的变化。
图38描绘了所指示的治疗组的肿瘤浸润性NK细胞(图38A)、循环NK细胞(图38B)和M2(CD206+MHC-II-)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)(图38C)的变化。
图39描绘了在所指示的治疗组中，小鼠的引流淋巴结中CD4+ T细胞(图39A)和CD8+ T细胞(图39B)的增加。
图40描绘了通过SNA凝集素染色确定的循环细胞RBC(图40A)、CD4+ T细胞(图40B)、CD8+ T细胞(图40C)、NK细胞(图40D)、髓系细胞(图40E)和嗜中性粒细胞(图40F)的唾液酸化状态。通过唾液酸酶切割而失去唾液酸导致SNA染色的提高。
详细描述
下面更详细地讨论本发明的各种不同特点和方面。
本发明涉及融合蛋白和/或抗体偶联物，其包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其部分例如免疫球蛋白Fc结构域和/或抗原结合结构域。所述融合蛋白和/或抗体偶联物的唾液酸酶部分相对于野生型唾液酸酶可以包含至少一个突变。所述突变或突变组合可以提高所述唾液酸酶的表达、活性或表达和活性两者，以改进它在癌症诊断和/或治疗中的用途。
本发明还涉及药物组合物和使用融合蛋白和/或抗体偶联物治疗癌症的方法。
I.唾液酸酶-抗HER2抗体融合蛋白
为了促进超唾液酸化癌细胞例如表达HER2的癌细胞上和/或肿瘤微环境中的唾液酸的选择性去除，将本文中所描述的唾液酸酶靶向这种细胞或这种肿瘤微环境可能是有帮助的。此外，为了促进在受试者中通过唾液酸酶去除唾液酸，延长所述唾液酸酶在所述受试者中的血浆半衰期可能是有帮助的。这些可以通过将所述唾液酸酶包含在融合蛋白和/或抗体偶联物(例如化学偶联的偶联物)中来实现。
因此，本发明还提供了融合蛋白，其包含唾液酸酶或其功能性片段和抗HER2抗体的一部分或片段例如免疫球蛋白Fc结构域(在本文中也被称为Fc结构域)或免疫球蛋白抗原结合结构域(在本文中也被称为抗原结合结构域)。在某些实施方式中，所述唾液酸酶和抗HER2抗体或其部分(例如免疫球蛋白Fc结构域或抗原结合结构域)通过肽键或氨基酸连接物相连。
当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“融合蛋白”被理解为是指包含基于两个或更多个分开的蛋白质或多肽链的氨基酸序列的单一多肽链，其中所述两个氨基酸序列可以直接地或通过居间的连接物序列例如通过居间的氨基酸连接物融合在一起。编码这种融合蛋白的核苷酸序列可以例如使用常规的重组DNA技术来产生。
在某些实施方式中，融合蛋白包含标签例如Strep标签(例如Strep II标签)、His标签(例如10x His标签)、myc标签或FLAG标签。所述标签可以位于所述融合蛋白的C-端或N-端上。
a.唾液酸酶部分
当在本文中使用时，术语“唾液酸酶”是指从底物例如糖蛋白或糖脂切下末端唾液酸残基的任何酶或其功能性片段。术语唾液酸酶包括相对于野生型唾液酸酶序列具有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的变体和/或包括唾液酸酶的融合蛋白或偶联物。唾液酸酶也被称为神经氨酸酶，并且除非另有指明，否则这两个术语在本文中可互换使用。当在本文中使用时，术语唾液酸酶的“功能性片段”是指全长唾液酸酶的片段，其保留了所述相应的全长、天然存在的唾液酸酶的例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的酶活性。唾液酸酶的酶活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放。在某些实施方式中，所述功能性片段包含在全长、天然存在的唾液酸酶中存在的至少100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360或370个连续氨基酸。
在某些实施方式中，唾液酸酶-抗HER2抗体融合蛋白的唾液酸酶部分源自于真核唾液酸酶，例如哺乳动物唾液酸酶，例如人类或小鼠唾液酸酶。
在人类基因组中编码四种唾液酸酶：Neu1，Neu2，Neu3和Neu4。人类Neu1是一种溶酶体神经氨酸酶，其在与β-半乳糖苷酶和组织蛋白酶A的复合物中发挥作用。人类Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：7中，编码人类Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：23中。
人类Neu2是一种胞浆唾液酸酶。人类Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：1中，编码人类Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：24中。当在本文中使用时，除非另有陈述，否则野生型人类Neu2是指具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的人类Neu2。
人类Neu3是一种质膜唾液酸酶，具有特异性针对神经节苷脂的活性。人类Neu3具有两种同工型：同工型1和同工型2。人类Neu3同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：8中，编码人类Neu3同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：25中。人类Neu3同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：9中，编码人类Neu3同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：34中。
人类Neu4具有两种同工型：同工型1是一种外周膜蛋白，同工型2局限于溶酶体腔。人类Neu4同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：10中，编码人类Neu4同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：26中。人类Neu4同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：11中，编码人类Neu4同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：35中。
在小鼠基因组中也已发现四种唾液酸酶，它们被称为Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。小鼠Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：38中，编码小鼠Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ IDNO：42中。小鼠Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：39中，编码小鼠Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：43中。小鼠Neu3的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：40中，编码小鼠Neu3的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：44中。小鼠Neu4的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：41中，编码小鼠Neu4的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：45中。
在某些实施方式中，唾液酸酶-抗HER2抗体融合蛋白的唾液酸酶部分源自于原核唾液酸酶。示例性的原核唾液酸酶包括来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的唾液酸酶。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)唾液酸酶(St-唾液酸酶)的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：30中，编码鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：6中。霍乱弧菌(Vibrio cholera)唾液酸酶的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：36中，编码霍乱弧菌(Vibriocholera)唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：37中。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-抗HER2抗体融合蛋白的唾液酸酶部分是突变唾液酸酶，例如重组突变人唾液酸酶。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应的(或模板)野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶活性。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶相同的底物特异性。在其他实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶可以切开α2,3、α2,6和/或α2,8连键。在某些实施方式中，所述唾液酸酶可以切开α2,3和α2,8连键。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞、CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞(NS0、Sp2/0)或人纤维肉瘤细胞(HT-1080)例如HEK293细胞中的表达量，高于所述相应的野生型人唾液酸酶的表达量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应的野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶活性，并且所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞中的表达量高于所述相应的野生型人唾液酸酶的表达量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶的氨基酸序列与相应的野生型人唾液酸酶得氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
1.半胱氨酸残基的替换
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个半胱氨酸(cys，C)残基的替换。已发现，唾液酸酶中的某些半胱氨酸残基可能作为蛋白质聚集的结果而抑制有功能蛋白质的表达。因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶含有至少一个突变以除去游离半胱氨酸(例如对于Neu1(SEQ ID NO：7)来说，例如C111、C117、C171、C183、C218、C240、C242和C252中的一者或多者的突变；对于Neu2(SEQ ID NO：1)来说，例如C125、C196、C219、C272、C332和C352中的一者或多者的突变；对于Neu3(SEQ ID NO：8)来说，例如C7、C90、C99、C106、C127、C136、C189、C194、C226、C242、C250、C273、C279、C295、C356、C365、C368、C384、C383、C394和C415中的一者或多者的突变；以及对于Neu4(SEQ ID NO：10)来说，C88、C125、C126、C186、C191、C211、C223、C239、C276、C437、C453、C480和C481中的一者或多者的突变)。游离半胱氨酸可以被任何氨基酸替换。在某些实施方式中，所述游离半胱氨酸被丝氨酸(ser，S)、异亮氨酸(iso，I)、缬氨酸(val，V)、苯丙氨酸(phe，F)、亮氨酸(leu，L)或丙氨酸(ala，A)替换。Neu2中的示例性半胱氨酸替换包括C125A、C125I、C125S、C125V、C196A、C196L、C196V、C272S、C272V、C332A、C332S、C332V、C352L和C352V。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个半胱氨酸替换。Neu2中的示例性双重或三重半胱氨酸替换包括：C125S和C332S；C272V和C332A；C272V和C332S；C332A和C352L；C125S和C196L；C196L和C352L；C196L和C332A；C332A和C352L；以及C196L、C332A和C352L。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶是Neu2唾液酸酶并包含替换C322A和C352L(SEQ ID NO：5)。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶在人唾液酸酶例如Neu2或Neu3中通常存在的2、3、4、5或6个半胱氨酸处含有氨基酸替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表1中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表1
| 替换 |
| C125A |
| C125I |
| C125S |
| C125V |
| C196A |
| C196L |
| C196V |
| C272S |
| C272V |
| C332A |
| C332S |
| C332V |
| C352L |
| C352V |
| C125S+C332S |
| C272V+C332A |
| C272V+C332S |
| C332A+C352L |
| C125S+C196L |
| C196L+C352L |
| C196L+C332A |
| C196L+C332A+C352L |
2.提高pI和/或降低疏水性的残基替换
蛋白质的等电点(pI)是净电荷为零时的pH。pI通常也指示了蛋白质可溶性最低时的pH，其可能影响表达和纯化所述蛋白质的能力。通常，如果蛋白质的pI比溶液的pH高超过2个单位，则它具有良好的溶解性。人类Neu2具有7.5的预测pI。因此，人类Neu2在中性pH附近溶解性最低，这是不合乎需要的，因为表达和生理体系在中性pH处。相反，表现出良好的溶解性和重组表达的来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的唾液酸酶(St-唾液酸酶)具有9.6的pI。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的pI。此外，减少唾液酸酶表面上疏水氨基酸的数目可能例如通过减少聚集而改进唾液酸酶的表达。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶降低所述唾液酸酶表面的疏水性。
因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性。这可以通过将一个或多个带电荷的氨基酸例如带正或负电荷的氨基酸引入到所述重组唾液酸酶中来实现。在某些实施方式中，所述氨基酸替换是替换成带电荷的氨基酸例如带正电荷的氨基酸如赖氨酸(lys，K)、组氨酸(his，H)或精氨酸(arg，R)或带负电荷的氨基酸如天冬氨酸(asp，D)或谷氨酸(glu，E)。在某些实施方式中，所述氨基酸替换是替换成赖氨酸残基。在某些实施方式中，所述替换将所述唾液酸酶的pI提高到约7.75、约8、约8.25、约8.5、约8.75、约9、约9.25、约9.5或约9.75。
在某些实施方式中，所述氨基酸替换发生在表面暴露的D或E氨基酸处，在螺旋或环中，或在St-唾液酸酶的相应位置中具有K或R的位置中。在某些实施方式中，所述氨基酸替换发生在远离催化位点或不参与催化的氨基酸、不与其他人类Neu蛋白或与St-唾液酸酶或梭菌(Clostridium)NanH保守的氨基酸或不位于对功能重要的结构域(例如Asp-盒或β链)中的氨基酸处。
Neu2中相对于没有替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性的示例性氨基酸替换包括A2E、A2K、D215K、V325E、V325K、E257K和E319K。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个氨基酸替换，包括例如A2K和V325E、A2K和V325K、E257K和V325K、A2K和E257K以及E257K和A2K和V325K。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表2中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表2
| 替换 |
| A2K |
| E72K |
| D215K |
| E257K |
| V325K |
| A2K+E257K |
| A2K+V325E |
| A2K+V325K |
| E257K+V325K |
3.N-端肽的添加和N-或C-端替换
已发现，向人唾液酸酶的N-端添加两个或更多个氨基酸的肽序列可以提高所述唾液酸酶的表达和/或活性。在某些实施方式中，所述肽的长度为至少2个氨基酸，例如长度为2至20、2至10、2至5或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽可以形成α-螺旋或具有形成α-螺旋的倾向性。
在小鼠中，在胸腺中发现的Neu2同工型(B型)含有在骨骼肌中发现的Neu2的经典同工型中不存在的6个氨基酸。在本文的某些实施方式中，可以将所述小鼠胸腺Neu2同工型的N-端6个氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO：4)或其变化形式添加到人类Neu例如人类Neu2上。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的长度为至少2个氨基酸残基的肽。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的肽MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)。在某些实施方式中，所述唾液酸酶还可以包含位于所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)与所述唾液酸酶的其余部分之间的切割位点，例如蛋白水解切割位点。在某些实施方式中，所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)可以在翻译后从所述唾液酸酶的其余部分上切掉。
可选地或与所述N-端添加相组合，可以移除所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸，例如可以移除N-端甲硫氨酸。在某些实施方式中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则可以移除N-端甲硫氨酸，可以移除前5个氨基酸(MASLP；SEQID NO：12)，或者可以移除第二至第四个氨基酸(ASLP；SEQ ID NO：13)。
在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)替换。例如在某些实施方式中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则将氨基酸MASLP(SEQ IDNO：12)、ASLP(SEQ ID NO：13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)替换。
人唾液酸酶具有β-螺旋桨结构，其特征是围绕中心轴呈环形排列的6个叶片形β-片层。通常，β-螺旋桨的叶片之间、包括N-和C-端叶片之间的疏水相互作用增强稳定性。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成包含提高所述唾液酸酶的N-和C-端β-螺旋桨叶片之间的疏水相互作用和/或氢键结合的氨基酸替换。
因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合。在某些实施方式中，将所述野生型氨基酸用天冬酰胺(asn，N)、赖氨酸(lys，K)、酪氨酸(tyr，Y)、苯丙氨酸(phe，F)或色氨酸(trp，W)替换。Neu2中提高N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合的示例性替换包括L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含V6Y替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含上述替换的组合。例如，重组突变人类Neu2唾液酸酶可以在N-端处包含添加的氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)，并且相组合，可以包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W替换中的至少一者。在某些实施方式中，将重组突变人类Neu2唾液酸酶的氨基酸MASLP(SEQ ID NO：12)、ASLP(SEQ ID NO：13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)代替，并且所述重组突变人类Neu2唾液酸酶还包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W替换中的至少一者。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表3中列出的突变或突变组合的突变或突变组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表3
此外，在某些实施方式中，所述唾液酸酶在所述唾液酸酶的N-端处包含N-端甲硫氨酸的替换或缺失。例如，在某些实施方式中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的替换，例如将所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸替换为丙氨酸(M1A)或天冬氨酸(M1D)。在其他实施方式中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的缺失(ΔM1)。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表4中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表4
| 突变 |
| M1的缺失，V6Y，I187K |
| M1R，V6Y，I187K |
| M1H，V6Y，I187K |
| M1K，V6Y，I187K |
| M1D，V6Y，I187K |
| M1T，V6Y，I187K |
| M1N，V6Y，I187K |
| M1Q，V6Y，I187K |
| M1G，V6Y，I187K |
| M1A，V6Y，I187K |
| M1V，V6Y，I187K |
| M1L，V6Y，I187K |
| M1F，V6Y，I187K |
| M1Y，V6Y，I187K |
4.降低蛋白水解切割的残基的替换
已发现，某些唾液酸酶(例如人类Neu2)易于被蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割。结果，所述唾液酸酶的蛋白水解切割可能在重组蛋白生产、收获、纯化或配制期间、向受试者给药期间或在给药到受试者之后发生。因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的替换，其中所述替换降低所述唾液酸酶相对于没有所述替换的唾液酸酶被蛋白酶(例如胰蛋白酶)的切割。
在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生约1％至约50％、约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％、约1％至约5％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约10％、约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约30％、约10％至约20％、约20％至约50％、约20％至约40％、约20％至约30％、约30％至约50％、约30％至约40％或约40％至约50％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生低于50％、低于40％、低于30％、低于10％、低于5％、低于3％、低于1％或低于0.5％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。蛋白水解切割可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括例如通过在本文实施例4中所描述的SDS-PAGE。
提高对蛋白水解切割的抗性的示例性替换包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第242位的位置处丙氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第243位的位置处精氨酸残基的替换，例如被谷氨酸(R243E)、组氨酸(R243H)、天冬酰胺(R243N)、谷氨酰胺(R243Q)或赖氨酸(R243K)替换；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第244位的位置处缬氨酸残基的替换，例如被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)替换；或(iv)任何上述替换的组合。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含选自A242C、A242F、A242Y和A242W的替换。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于在表5中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表5
提高对蛋白水解切割的抗性(和/或提高表达量和/或酶活性)的另外的示例性替换包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第240位的位置处亮氨酸残基的替换，例如被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第213位的位置处丙氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ IDNO：1)的第241位的位置处精氨酸残基的替换，例如被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；(iv)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第258位的位置处丝氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(S258C)替换；(v)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第260位的位置处亮氨酸残基的替换，例如被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；(vi)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第265位的位置处缬氨酸残基的替换，例如被苯丙氨酸替换(V265F)；或(vii)任何上述替换的组合。设想了在某些实施方式中，在这些位置处的替换或替换组合可以改善所述唾液酸酶中二级结构元件之间(例如α-螺旋与最近的β-片层之间)的疏水和/或芳香性相互作用，从而使所述结构稳定并提高对蛋白水解切割的抗性。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含在L240位置处的突变。在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含在下述位置处的突变的组合：(i)A213和A242；(ii)A213、A242和S258；(iii)L240和L260；(iv)R241和A242；(v)A242和L260；(vi)A242和V265；或(vii)L240和A242。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含选自下述的替换组合：(i)A213C、A242F和S258C；(ii)A213C和A242F；(iii)A213T和A242F；(iv)R241Y和A242F；和(v)L240Y和A242F。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于在表6中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表6
| 替换 |
| A242C，V244P |
| A242R，V244R |
| A242R，V244H |
| A242Y，V244P |
| A242T，V244P |
| A242N，V244P |
| A213C，A242F |
| A213S，A242F |
| A213T，A242F |
| A213N，A242F |
| A213C，A242F，S258C |
| A242F，L260F |
| A242F，V265F |
| L240Y |
| L240Y，L260F |
| L240D，L260T |
| L240N，L260T |
| L240N，L260D |
| L240N，L260Q |
| L240Y，A242F |
| R241A，A242F |
| R241Y，A242F |
5.其他替换
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含下述替换中的至少一者：I187K，A328E，K370N或H210N。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸GDYDAPTHQVQW(SEQ ID NO：15)被氨基酸SMDQGSTW(SEQ ID NO：16)或STDGGKTW(SEQ ID NO：17)的替换。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸PRPPAPEA(SEQ ID NO：18)被氨基酸QTPLEAAC(SEQ ID NO：19)的替换。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸NPRPPAPEA(SEQ ID NO：20)被氨基酸SQNDGES(SEQ ID NO：21)的替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于V212、A213、Q214、D215、T216、L217、E218、C219、Q220、V221、A222、E223、V224、E225或T225的位置处的至少一个替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶在表7中鉴定到的位置处包含氨基酸替换(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表7中鉴定的氨基酸替换。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表7中鉴定的任何氨基酸替换的组合。
表7
例如，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；或任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸替换(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸替换(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)替换；(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)替换；(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸替换(L54M)；(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)替换；(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q69H)；(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸替换(R78K)；(i)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸替换(D80P)；(j)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)替换；(k)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸替换(G107D)；(l)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q108H)；(m)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)替换；(n)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸替换(C125L)；(o)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)替换；(p)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸替换(A150V)；(q)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸替换(C164G)；(r)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R170P)；(s)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸替换(A171G)；(t)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸替换(Q188P)；(u)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R189P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；(w)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)替换；(x)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸替换(T249A)；(y)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸替换(D251G)；(z)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E225P)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸替换(H239P)；(bb)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；(cc)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；(dd)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；(ee)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I),赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)替换；(ff)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E257P)；(gg)对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸替换(S258C)；(hh)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸替换(V265F)；(jj)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)替换；(kk)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸替换(W292R)；(ll)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、甘氨酸(S301G)、组氨酸(S301H)、异亮氨酸(S301I)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)替换；(mm)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、谷氨酸(W302E)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)替换；(nn)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸替换(V363R)；或(oo)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)替换；或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、D80P、A93E、Q126H、Q126Y、R189P、H239P、A242T、Q270A、Q270S、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R或L365I的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的亮氨酸残基的缺失(ΔL184)、对应于野生型人类Neu2的第185位的位置处的组氨酸残基的缺失(ΔH185)、对应于野生型人类Neu2的第186位的位置处的脯氨酸残基的缺失(ΔP186)、对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基的缺失(ΔI187)和对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的谷氨酰胺残基的缺失(ΔQ188)，或任何上述缺失的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第216位的位置处的苏氨酸残基与对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基之间的插入，例如选自S、T、Y、L、F、A、P、V、I、N、D、和H的氨基酸的插入。
其他的示例性唾液酸酶突变和唾液酸酶突变的组合描述在2019年1月3日提交的国际(PCT)专利申请号PCT/US2019/012207中，包括在详细描述中题为“I.重组人唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例1、2、3、4、5和6中。
6.替换的组合
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含本文中设想的任何突变的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个本文中设想的突变的组合。设想了所述重组突变唾液酸酶可以包含1-15、1-10、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-10、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-10、3-7、3-6、3-5或3-4个本文中设想的突变。
例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、K9D替换、P62G替换、P62N替换、P62S替换、P62T替换、A93E替换、I187K替换、Q270A替换、S301R替换、W302K替换、C332A替换、V363R替换、L365I替换或任何上述缺失和替换的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、I187K替换、C332A替换或任何上述缺失和替换的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含：(i)表7中鉴定的氨基酸替换或表7中鉴定的任何氨基酸替换的组合，和(ii)M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、I187K替换、C332A替换或任何上述缺失和替换的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含：(i)表7中鉴定的氨基酸替换或表7中鉴定的任何氨基酸替换的组合，和(ii)选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I替换；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A替换；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A替换；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A替换；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A替换；或(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换与在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换的组合。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含对应于表8的行中列出的替换组合的替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含：S301K和W302R替换；S301K和W302K替换；或S301A和W302S替换。
表8
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表9的行中列出的替换组合的替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表9
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-62、111、114、117或151中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48-62、111、114、117或151中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGH RSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQL HDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGH FVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLY THPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDL QSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO：47)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，并且X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCP LYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAP EAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO：46)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，并且X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LX1 3GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRL X18X19VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQ LHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTW ARGHFVX28QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPS PRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEP X47LLAKGSX4 8AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO：139)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Asp或Pro，X14是Ala、Glu或Lys，X15是Gly或Asp，X16是Gln或His，X17是Gln、Arg或Lys，X18是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X19是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X20是Ala或Val，X21是Cys或Gly，X22是Arg或Pro，X23是Ala或Gly，X24是Arg、Ile或Lys，X25是Gln或Pro，X26是Arg或Pro，X27是Ala、Cys、Leu或Val，X28是Ala、Cys、Asn、Ser或Thr，X29是Leu、Ala或Val，X30是Glu或Pro，X31是His或Pro，X32是Leu、Asp、Asn或Tyr，X33是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln或Tyr，X34是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X35是Val、Ile或Lys，X36是Thr或Ala，X37是Asp或Gly，X38是Glu、Lys或Pro，X39是Ser或Cys，X40是Leu、Asp、Phe、Gln或Thr，X41是Val或Phe，X42是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X43是Cys或Val，X44是Trp或Arg，X45是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X46是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X47是Lys或Val，X48是Ala、Cys、Ser或Val，X49是Cys、Leu或Val，X50是Val或Arg，并且X51是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCP LYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPA PEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX13FX14MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO：138)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X7是Arg、Ile或Lys，X8是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X9是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X10是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X11是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X12是Ala、Cys、Ser或Val，X13是Val或Arg，并且X14是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Gln或Tyr，X7是Ile或Lys，X8是Ala或Thr，X9是Gln、Ala或Thr，X10是Ser、Arg或Ala，X11是Trp、Lys或Arg，X12是Ala或Cys，X13是Val或Arg，并且X14是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶相对于本文中公开的重组突变人唾液酸酶序列包含保守替换。当在本文中使用时，术语“保守替换”是指使用结构上相似的氨基酸的替换。例如，保守替换可以包括下述组内的替换：Ser和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；以及Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守替换也可以由BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法、BLOSUM替换矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM替换:p矩阵(例如PAM 250矩阵)定义。
序列同一性可以以本领域技术人员的技术范围之内的各种不同方式确定，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL.36:290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402，其通过引用并入本文)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS6:119-129，其整体通过引用并入本文。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合的参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大对齐所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于报告与数据库序列匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA89:10915-10919，其整体通过引用并入本文)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙延伸罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生单词命中)；和gapw＝16(设置在其中生成带间隙的对齐的窗口宽度)。等效的blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information))的BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，开放间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延伸间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[整数]：默认值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[整数]：默认值＝1；-e，预期值[实数]：默认值＝10；-W，词长[整数]：默认值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast延伸的衰减(X)：默认值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：默认值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和–Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。用于逐对蛋白质比对的ClustalW也可以使用(默认参数可以包括例如Blosum62矩阵和间隙开放罚分＝10和间隙延伸罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙延伸罚分)。Bestfit蛋白质比较中的等效设置是GAP＝8和LEN＝2。
b.抗体部分
当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“抗体”被理解为意味着完整抗体(例如完整单克隆抗体)或其片段，例如抗体的Fc片段(例如单克隆抗体的Fc片段)或抗体的抗原结合片段(例如单克隆抗体的抗原结合片段)，包括完整抗体、已被修饰、工程化改造或化学偶联的抗原结合片段或Fc片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链抗体(例如scFv)、微型抗体和双体抗体。已被修饰或工程化改造的抗体的实例包括嵌合抗体、人源化抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。化学偶联的抗体的实例是偶联到毒素组成部分的抗体。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白Fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的一个片段，其单独地或与第二免疫球蛋白Fc结构域相组合能够结合到Fc受体。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域和免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的，并且可以在例如PROSITE数据库(可以在万维网网址prosite.expasy.org处获得)中找到。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。可以引入单个氨基酸替换(根据Kabat编号系统S228P；被称为IgG4Pro)以消除在重组IgG4抗体中观察到的异质性。参见Angal,S等，(1993)MOL.IMMUNOL.30:105-108。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型或引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型(例如SEQ ID NO：31或SEQ IDNO：5)。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型或很少或不引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与第二多肽的异二聚化(残基号码根据EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)《免疫学重要的蛋白质的序列》(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICALINTEREST)第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白抗原结合结构域。这个结构域的包含可以改进融合蛋白向唾液酸化癌细胞例如表达HER2的癌细胞和/或肿瘤微环境的靶向。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白抗原结合结构域”是指单独地或与另一个免疫球蛋白抗原结合结构域相组合定义了抗原结合部位的多肽。示例性的免疫球蛋白抗原结合结构域包括例如免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述可变区一起定义了抗原结合部位，例如抗HER2抗原结合部位。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于抗HER2抗体。示例性的抗HER2抗体包括曲妥珠单抗
帕妥珠单抗
CT-P6
曲妥珠单抗-dkst(OgivriTM)、MGAH22(margetuximab)、PF-05280014、厄妥索单抗、甘妥单抗、替米妥珠单抗、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于曲妥珠单抗。曲妥珠单抗重链氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：63中，并且曲妥珠单抗轻链氨基酸序列描绘在SEQID NO：64中。源自于曲妥珠单抗的示例性scFv的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：65中。
c.连接物
在某些实施方式中，所述融合蛋白的唾液酸酶部分可以被直接连接或融合到所述融合蛋白的抗HER2抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)。在其他实施方式中，所述唾液酸酶部分可以通过连接物共价结合到所述抗HER2抗体部分。
所述连接物可以与一个或多个天然氨基酸、所述唾液酸酶或其功能性片段、所述抗体部分或片段偶联，其中所述氨基酸(例如半胱氨酸氨基酸)可以通过定点突变引入。所述连接物可以包括一个或多个非天然氨基酸。设想了在某些情况下，含有例如一个或多个巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的连接物可以共价连接所述唾液酸酶部分或抗体部分中的半胱氨酸，其是天然存在的半胱氨酸残基或者是位点特异性突变的产物。
所述连接物可以是可切断的连接物或不可切断的连接物。任选地或此外，所述连接物可以是柔性连接物或非柔性连接物。
所述连接物应该具有足够长的长度，以允许所述唾液酸酶和抗体部分没有空间位阻地彼此连接，并且应该足够短，以保留所述融合蛋白的目标活性。所述连接物优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不稳定性。所述连接物优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不溶性。所述连接物应该在体内足够稳定(例如它不被血清、酶等切断)，以允许在体内操作所述融合蛋白。
所述连接物可以具有约1埃
至约
的长度或约
至约
的长度或约
至约
的长度或约
至约
的长度。所述连接物可以具有大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更大的长度和/或小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、
或更小的长度。此外，所述连接物可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和
的长度。
在某些实施方式中，所述连接物包含将所述融合蛋白的唾液酸酶部分连接或融合到所述融合蛋白的抗HER2抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)的多肽连接物。例如，设想了编码直接或间接(例如通过含有氨基酸的连接物)连接到抗体部分的唾液酸酶部分的基因，可以使用常规重组DNA技术来产生和表达。例如，唾液酸酶部分的氨基端可以被连接到抗体部分的轻链或重链的羧基端。例如，对于Fab片段来说，可以将所述唾液酸酶的氨基端或羧基端连接到抗体重链的第一恒定结构域(CH1)。当使用连接物时，所述连接物可以包含亲水性氨基酸残基例如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。在某些实施方式中，所述连接物是含有1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、2-15个氨基酸残基、3-10个氨基酸残基、3-7个氨基酸残基、4-25个氨基酸残基、4-20个氨基酸残基、4-15个氨基酸残基、4-10个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基或5-10个氨基酸残基的肽。示例性连接物包括富含甘氨酸和丝氨酸的连接物例如(GlyGlyPro)n或(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n是1-5。在某些实施方式中，所述连接物包含GGGGS(SEQ ID NO：140)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方式中，所述连接物包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方式中，所述连接物包含EPKSS(SEQ ID NO：108)、由其组成或基本上由其组成。其他示例性连接物序列被公开在例如George等，(2003)PROTEIN ENGINEERING 15:871–879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO：66-85、98-106、112、113、115、116、118、119、122-134、141、143、145、147或152-155中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO：66-85、98-106、112、113、115、116、118、119、122-134、141、143、145、147或152-155中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
d.抗体偶联物
本发明还提供了含有本文中公开的一种或多种融合蛋白的抗体偶联物。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“抗体偶联物”被理解为是指与另外的功能性组成部分偶联(例如共价偶联)的抗体或其包含抗原结合活性(例如抗HER2抗原结合活性)和/或Fc受体结合活性的功能性片段。在某些实施方式中，所述抗体或功能性抗体片段被偶联到唾液酸酶，例如本文中公开的重组突变人唾液酸酶。在某些实施方式中，抗体偶联物包含单个多肽链。在某些实施方式中，抗体偶联物包含共价或非共价结合在一起的2、3、4条或更多条多肽链，以产生多聚体复合物，例如二聚体、三聚体或四聚体复合物。例如，抗体偶联物可以包含：包含重组突变人唾液酸酶和免疫球蛋白重链的第一多肽(融合蛋白)，和包含免疫球蛋白轻链的第二多肽，其中例如所述免疫球蛋白重链和轻链一起定义了单个抗原结合部位，例如抗HER2抗原结合部位。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物可以包括单个唾液酸酶。在其他实施方式中，所述抗体偶联物可以包括超过一个(例如两个)唾液酸酶。如果包括超过一个唾液酸酶，则所述唾液酸酶可以相同或不同。在某些实施方式中，所述抗体偶联物可以包括单个抗HER2抗原结合部位。在其他实施方式中，所述抗体偶联物可以包括超过一个(例如两个)抗HER2抗原结合部位。如果使用两个抗原结合部位，则它们可以相同或不同。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含免疫球蛋白Fc片段。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含一个或两个免疫球蛋白重链或其功能性片段。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含一个或两个免疫球蛋白轻链或其功能性片段。在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含融合到免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的N-或C-端的唾液酸酶。
图17描绘了含有一个或多个唾液酸酶的示例性抗体偶联物构建物。例如，在图17A中，第一抗HER2抗原结合部位被描绘为10，第二抗HER2抗原结合部位被描绘为20，唾液酸酶被描绘为30，Fab被描绘为40。在图17A-17I中描绘的每个构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某些方式修饰，例如使用杵臼(Knobs-into-Holes)类型的技术，例如由图17B中的50所示。在整个图17中，相似的结构用相似的示意图描绘。
图17A描绘的抗体偶联物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了被描绘为10的第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第三多肽和第四多肽一起定义了被描绘为20的第二抗HER2抗原结合部位。被描绘为30的唾液酸酶可以被偶联到所述第一和第二免疫球蛋白轻链或所述第一和第二免疫球蛋白重链的的N-或C-端。
图17B描绘的抗体偶联物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第三多肽和第四多肽一起定义了第二抗HER2抗原结合部位。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图17C描绘的抗体偶联物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图17D描绘的抗体偶联物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。任选的第二唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图17E描绘的抗体偶联物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。任选的第二唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图17F描绘的抗体偶联物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。任选的第二唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。
图17G描绘的抗体偶联物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；和包含免疫球蛋白重链可变区的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。所述唾液酸酶可以被偶联到所述免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链可变区的N-或C-端。
图17H描绘的抗体偶联物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别偶联到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。单链可变区片段(scFv)可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二单链可变区片段(scFv)可以被分别偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。
图17I描绘了与图17H中描绘的相似的抗体偶联物构建物，区别在于每个scFv被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab代替。例如，图17I描绘的抗体偶联物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别偶联到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。抗体片段(Fab)可以被偶联或融合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二抗体片段(Fab)可以被分别偶联或融合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的C-端。在融合的情况下，所述Fc结构域的C端被连接(通过键或氨基酸连接物)到定义了抗HER2免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链。在具有由单个可变区定义的抗原结合部位的抗体的情况下，这可能足以提供对靶抗原例如HER2的结合亲和性。在其他情况下，例如在人类抗体的情况下，所述定义了免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链可以被偶联(例如共价偶联，例如通过二硫键)到定义了免疫球蛋白抗原结合片段的第二多肽链，所述两个抗原结合片段一起定义了用于结合所述靶抗原例如HER2的抗原结合部位。
图18描绘了另外的抗体偶联物构建物。例如图18描绘了能够抗体偶联物构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和scFv的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述重链和scFv。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗原结合部位。在某些实施方式中，所述scFv定义了第二抗原结合部位。图18描绘了一种另外的抗体构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽，其中Fab片段被偶联到所述免疫球蛋白重链的N-端。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗原结合部位。在某些实施方式中，所述Fab片段定义了第二抗原结合部位。在图18中描绘的每种构建物中，应该理解scFv在存在时可以被Fab片段代替，或者Fab片段在存在时可以被scFv代替。在图18中描绘的每种构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某种方式被修饰。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。这个实施方式的实例示出在图19A中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第三多肽和第四多肽一起定义了第二抗HER2抗原结合部位。在某些实施方式中，所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。在某些实施方式中，所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二唾液酸酶和所述第一和第二免疫球蛋白重链。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。这个实施方式的实例示出在图19B中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了抗HER2抗原结合部位。在某些实施方式中，所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66的氨基酸序列或与SEQ IDNO：66具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67或149中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO：67或149中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第三多肽包含SEQ ID NO：68-74、98-104、112、113、115、116、118、119、141、143、145、147、152或154中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：68-74、98-104、112、113、115、116、118、119、141、143、145、147、152或154中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGH RSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQL HDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGH FVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX3 0LLY THPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDL QSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ GGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：76)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，并且X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCP LYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：75)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，并且X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGH RSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQL HDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGH FVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX3 0LLY THPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDL QSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ X38DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：106)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu.X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且X38是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCP LYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQX13DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：105)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且X13是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LX13GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRL X18X19VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQ LHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTW ARGHFVX28QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPS PRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEP X47LLAKGSX48AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQX52DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：121)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Asp或Pro，X14是Ala、Glu或Lys，X15是Gly或Asp，X16是Gln或His，X17是Gln、Arg或Lys，X18是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X19是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X20是Ala或Val，X21是Cys或Gly，X22是Arg或Pro，X23是Ala或Gly，X24是Arg、Ile或Lys，X25是Gln或Pro，X26是Arg或Pro，X27是Ala、Cys、Leu或Val，X28是Ala、Cys、Asn、Ser或Thr，X29是Leu、Ala或Val，X30是Glu或Pro，X31是His或Pro，X32是Leu、Asp、Asn或Tyr，X33是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln或Tyr，X34是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X35是Val、Ile或Lys，X36是Thr或Ala，X37是Asp或Gly，X38是Glu、Lys或Pro，X39是Ser或Cys，X40是Leu、Asp、Phe、Gln或Thr，X41是Val或Phe，X42是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X43是Cys或Val，X44是Trp或Arg，X45是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X46是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X47是Lys或Val，X48是Ala、Cys、Ser或Val，X49是Cys、Leu或Val，X50是Val或Arg，X51是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X52是GGGGS(SEQ IDNO：140)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述第三多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCP LYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPA PEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEI X13FX14MFTLKQAFPAEYLPQX15DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：120)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X7是Arg、Ile或Lys，X8是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X9是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X10是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X11是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X12是Ala、Cys、Ser或Val，X13是Val或Arg，X14是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X15是GGGGS(SEQ ID NO：140)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Gln或Tyr，X7是Ile或Lys，X8是Ala或Thr，X9是Gln、Ala或Thr，X10是Ser、Arg或Ala，X11是Trp、Lys或Arg，X12是Ala或Cys，X13是Val或Arg，并且X14是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ IDNO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：68。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：69。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：70。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：71。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQID NO：72。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ IDNO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：73。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：74。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：98。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：99。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQID NO：100。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：101。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：102。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：103。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：104。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：112。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：113。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQID NO：115。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：116。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：118。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：119。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：141。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：152。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：154。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：149，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：143。在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：66，所述第二多肽包含SEQ ID NO：149，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO：145。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)的第一多肽；和包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第二多肽链代替)的第二多肽。这个实施方式的实例示出在图19C中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一scFv定义了第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第二scFv定义了第二抗HER2抗原结合部位。在某些实施方式中，所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。在某些实施方式中，所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一scFv、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶。在某些实施方式中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二scFv。在某些实施方式中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二scFv、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二唾液酸酶。
在某些实施方式中，所述第一多肽包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述第二多肽包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO：77-83、122-134、153或155中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX1 9YREWSTFAVGPGHX20LQL HDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGH FVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLY THPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDL QSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ GGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ IDNO：85)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，并且X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAP EAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：84)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，并且X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRAS X7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LX13GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRL X18X19VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQ LHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTW ARGHFVX28QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPS PRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEP X47LLAKGSX48AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQX52DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：136)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Asp或Pro，X14是Ala、Glu或Lys，X15是Gly或Asp，X16是Gln或His，X17是Gln、Arg或Lys，X18是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X19是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X20是Ala或Val，X21是Cys或Gly，X22是Arg或Pro，X23是Ala或Gly，X24是Arg、Ile或Lys，X25是Gln或Pro，X26是Arg或Pro，X27是Ala、Cys、Leu或Val，X28是Ala、Cys、Asn、Ser或Thr，X29是Leu、Ala或Val，X30是Glu或Pro，X31是His或Pro，X32是Leu、Asp、Asn或Tyr，X33是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln或Tyr，X34是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X35是Val、Ile或Lys，X36是Thr或Ala，X37是Asp或Gly，X38是Glu、Lys或Pro，X39是Ser或Cys，X40是Leu、Asp、Phe、Gln或Thr，X41是Val或Phe，X42是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X43是Cys或Val，X44是Trp或Arg，X45是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X46是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X47是Lys或Val，X48是Ala、Cys、Ser或Val，X49是Cys、Leu或Val，X50是Val或Arg，X51是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X52是GGGGS(SEQ ID NO：140)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKK DEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRT WSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAY RKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETG EQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GC QGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPA PEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEI X13FX14MFTLKQAFPAEYLPQX15DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：135)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X7是Arg、Ile或Lys，X8是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X9是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X10是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X11是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X12是Ala、Cys、Ser或Val，X13是Val或Arg，X14是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X15是GGGGS(SEQ IDNO：140)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：107)或EPKSS(SEQ ID NO：108)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Gln或Tyr，X7是Ile或Lys，X8是Ala或Thr，X9是Gln、Ala或Thr，X10是Ser、Arg或Ala，X11是Trp、Lys或Arg，X12是Ala或Cys，X13是Val或Arg，并且X14是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：77。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：78。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQID NO：79。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：80。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：81。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：82。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：83。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：122。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：123。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：124。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：125。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：126。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：127。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：128。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：129。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ IDNO：130。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：131。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：132。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：133。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：134。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：153。在某些实施方式中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO：155。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。这个实施方式的实例示出在图19D中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。在某些实施方式中，所述第一多肽和第二多肽一起定义了第一抗HER2抗原结合部位(即所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起定义了第一抗HER2抗原结合部位)。在某些实施方式中，所述scFv定义了第二抗HER2抗原结合部位。在某些实施方式中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和scFv，或者以N-至C-端的方向包含所述scFv和免疫球蛋白重链。在某些实施方式中，所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或者以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物具有约135kDa至约165kDa例如约140kDa的分子量。在其他实施方式中，所述抗体偶联物具有约215kDa至约245kDa例如约230kDa的分子量。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物包含各自包含免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽具有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与所述第二多肽异二聚化，并且所述第二多肽具有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与所述第一多肽异二聚化(残基编号根据EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)同上)。例如，在某些实施方式中，所述抗体包含各自包含源自于人IgG1 Fc结构域的免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽包含Y407T突变(例如所述第一多肽包含SEQ ID NO：32或109)，并且所述第二多肽包含T366Y突变(例如所述第二多肽包含SEQ ID NO：33或110)。
当在本文中使用时，术语“多特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到至少两种不同抗原的抗体，即包含至少两个抗原结合部位、结合到至少两种不同抗原的抗体。当在本文中使用时，术语“双特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到两种不同抗原的抗体，即包含两个抗原结合部位的抗体，每个所述抗原结合部位结合到分开且不同的抗原。换句话说，第一结合位点结合第一抗原，并且第二结合位点结合第二种不同抗原。多特异性或双特异性抗体可以是例如人类或人源化抗体，和/或可以是全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
本发明涵盖了包含抗体片段的抗体偶联物，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，(2003)，同上。
在某些实施方式中，所述抗体偶联物或融合蛋白可以与生物修饰剂共价或非共价结合，所述生物修饰剂可用于增强所述抗体的溶解性，提高结合特异性，降低免疫原性或毒性，或改变所述抗体的药物动力学特性。例如，所述生物修饰剂可用于提高所述抗体的分子量以增加其循环半衰期。
设想了所述抗体偶联物或融合蛋白可以被共价键合到一个或多个(例如2、3、4、5、6、8、9、10个或更多个)生物修饰剂，所述生物修饰剂可以包含直链或支链聚合物。示例性的生物修饰剂可以包括例如各种不同的聚合物，例如在美国专利号7,842,789中所描述的。特别有用的是聚亚烷基醚例如聚乙二醇(PEG)及其衍生物(例如烷氧基聚乙二醇，例如甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二醇等)，聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)，聚甲基丙烯酸酯，卡波姆，以及包含糖单体例如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸的支链或非支链链多糖。
在其他实施方式中，所述生物修饰剂可以是亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)类型的聚合物。所述生物修饰剂可以是官能化的聚乙烯吡咯烷酮，例如在所述聚合物的一个(或两个)末端上羧基或胺官能化(正如可以从PolymerSource获得的)。或者，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。或者，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。所述修饰剂在偶联之前不必须但优选是水溶性的，但所述最终偶联物应该是水溶性的。
通常，所述生物修饰剂可以具有约2kDa至约5kDa、约2kDa至约10kDa、约2kDa至约20kDa、约2kDa至约30kDa、约2kDa至约40kDa、约2kDa至约50kDa、约2kDa至约60kDa、约2kDa至约70kDa、约2kDa至约80kDa、约2kDa至约90kDa、约2kDa至约100kDa、约2kDa至约150kDa、约5kDa至约10kDa、约5kDa至约20kDa、约5kDa至约30kDa、约5kDa至约40kDa、约5kDa至约50kDa、约5kDa至约60kDa、约5kDa至约70kDa、约5kDa至约80kDa、约5kDa至约90kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约150kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约40kDa、约10kDa至约50kDa、约10kDa至约60kDa、约10kDa至约70kDa、约10kDa至约80kDa、约10kDa至约90kDa、约10kDa至约100kDa、约10kDa至约150kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约40kDa、约20kDa至约50kDa、约20kDa至约60kDa、约20kDa至约70kDa、约20kDa至约80kDa、约20kDa至约90kDa、约20kDa至约100kDa、约20kDa至约150kDa、约30kDa至约40kDa、约30kDa至约50kDa、约30kDa至约60kDa、约30kDa至约70kDa、约30kDa至约80kDa、约30kDa至约90kDa、约30kDa至约100kDa、约30kDa至约150kDa、约40kDa至约50kDa、约40kDa至约60kDa、约40kDa至约70kDa、约40kDa至约80kDa、约40kDa至约90kDa、约40kDa至约100kDa、约40kDa至约150kDa、约50kDa至约60kDa、约50kDa至约70kDa、约50kDa至约80kDa、约50kDa至约90kDa、约50kDa至约100kDa、约50kDa至约150kDa、约60kDa至约70kDa、约60kDa至约80kDa、约60kDa至约90kDa、约60kDa至约100kDa、约60kDa至约150kDa、约70kDa至约80kDa、约70kDa至约90kDa、约70kDa至约100kDa、约70kDa至约150kDa、约80kDa至约90kDa、约80kDa至约100kDa、约80kDa至约150kDa、约90kDa至约100kDa、约90kDa至约150kDa或约100kDa至约150kDa的分子量。
设想了将所述抗体偶联物或融合蛋白附连到约10个或更少的聚合物分子(例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个)，每个聚合物分子具有至少约20,000D或至少约30,000D或至少约40,000D的分子量。
尽管各种不同的聚合物可用作生物修饰剂，但设想了可以将本文中描述的抗体偶联物或融合蛋白附连到聚乙二醇(PEG)聚合物。在一个实施方式中，本文中描述的抗体偶联物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约20,000D的PEG。在另一个实施方式中，本文中描述的抗体偶联物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约30,000D的PEG。在另一个实施方式中，本文中描述的抗体偶联物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约40,000D的PEG。在某些实施方式中，所述PEG是甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)。这些PEG可以从Nektar Therapeutics或SunBiowest商购。
抗体偶联物或融合蛋白上用于生物修饰剂的附连位点包括N-端氨基和赖氨酸残基上存在的ε氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。利用或不利用本领域中已知并使用的利用化学原理的多功能(通常为双功能)交联剂，可以将所述聚合物直接共价键合到所述抗体偶联物或融合蛋白。例如，巯基可以通过偶联到马来酰亚胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯或可以从Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Ala.商购的PEG-马来酰亚胺)进行衍生。
III.制造融合蛋白或抗体偶联物的方法
用于生产融合蛋白例如本文中公开的融合蛋白、抗体或抗体偶联物例如本文共公开的抗体偶联物的方法，在本领域中是已知的。例如，编码轻链可变区和/或重链可变区的DNA分子可以通过化学法或通过重组DNA方法合成。例如，通过常规的杂交技术或聚合酶链反应(PCR)技术，使用适合的合成核酸引物，可以从杂交瘤克隆所述抗体的序列。得到的编码感兴趣的可变区的DNA分子可以被连接到其他适合的核苷酸序列包括例如恒定区编码序列和表达控制序列，以产生编码所需抗体的常规基因表达构建物(即表达载体)。确定基因构建物的产生在本领域的常规技术之内。
编码所需融合蛋白和/或抗体偶联物的核酸可以被并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是原本不产生IgG蛋白的大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以将转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达编码所述免疫球蛋白轻链和/或重链可变区的基因的条件下生长。
具体表达和纯化条件将随着使用的表达系统而变。例如，如果将要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将所述工程化改造的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游，将它克隆到表达载体中。所述表达的蛋白可能被分泌。所述表达的蛋白可能积累在折光体或包含体中，其可以在通过弗氏压碎器或超声破碎细胞后收获。然后将所述折光体溶解，并且可以通过本领域中已知的方法将所述蛋白质重新折叠和/或切断。
如果将要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达所述工程化改造的基因，则首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、poly A序列和终止密码子的表达载体中。任选地，所述载体或基因构建物可能含有增强子和内含子。在涉及包含抗体或其部分的融合蛋白的实施方式中，所述表达载体任选地含有编码全部或一部分恒定区的序列，使得能够表达整个或一部分重链或轻链。可以使用常规技术将所述基因构建物引入到真核宿主细胞中。
所述宿主细胞表达融合蛋白和/或包含唾液酸酶和VL或VH片段、VL-VH异二聚体、VH-VL或VL-VH单链多肽、完整的免疫球蛋白重链或轻链或其部分(其各自可以被附连到具有另一种功能(例如细胞毒性)的组成部分)的抗体偶联物。在涉及融合蛋白和/或抗体偶联物的某些实施方式中，将宿主细胞用表达编码唾液酸酶和整个或一部分重链(例如重链可变区)或唾液酸酶和轻链(例如轻链可变区)的多肽或编码完整或一部分重链(例如重链可变区)或轻链(例如轻链可变区)的多肽的单一载体转染。在某些实施方式中，将宿主细胞用单一载体转染，所述载体编码(a)包含重链可变区的多肽和包含轻链可变区的多肽，或(b)完整免疫球蛋白重链和完整免疫球蛋白轻链，其中在(a)中或(b)中，所述多肽还可以包含唾液酸酶。在某些实施方式中，将宿主细胞用超过一个表达载体共转染(例如一个表达载体表达包含完整或一部分重链或重链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶，并且另一个表达载体表达包含完整或一部分轻链或轻链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶)。
包含融合蛋白例如包含免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区的融合蛋白的多肽，可以通过将用编码这种可变区的表达载体转染的宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后，所述多肽可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。
在生产融合蛋白和/或抗体偶联物的实施方式中，融合到单克隆抗体、抗体的Fc结构域或抗原结合结构域的唾液酸酶，可以通过将宿主细胞在允许两条链表达的条件下生长(培养)来生产，所述宿主细胞用下述表达载体转染：(a)编码完整或部分免疫球蛋白重链的表达载体，和编码完整或部分免疫球蛋白轻链的分开的表达载体；或(b)编码两条链(例如完整或部分重链和轻链)的单一表达载体。所述唾液酸酶将被融合到所述链中的一者或多者。所述完整的融合蛋白和/或抗体偶联物可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如蛋白A、蛋白G、亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。从单一表达载体或两个分开的表达载体表达重链和轻链，在本领域的常规技术之内。
在某些实施方式中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，将所述蛋白质的本源N-端信号序列用例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)代替。在某些实施方式中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，添加N-端信号序列例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)。其他示例性的N-端信号序列包括来自于白介素-2、CD-5、IgGκ轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素的信号序列。在某些实施方式中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，将C端溶酶体信号基序例如YGTL(SEQ IDNO：29)移除。
用于降低或消除抗体和抗体片段的抗原性的方法在本领域中是已知的。当所述抗体将要给药到人类时，优选地将所述抗体“人源化”以降低或消除在人类中的抗原性。优选地，每个人源化抗体与它所源自的非人源化小鼠抗体对所述抗原具有相同或基本上相同的亲和性。
在一种人源化方法中，产生了其中将小鼠免疫球蛋白恒定区用人类免疫球蛋白恒定区代替的嵌合蛋白。参见例如Morrison等，1984,PROC.NAT.ACAD.SCI.81:6851-6855；Neuberger等，1984,NATURE312:604-608；美国专利号6,893,625(Robinson)；5,500,362(Robinson)；和4,816,567(Cabilly)。
在被称为CDR嫁接的方法中，将轻链和重链可变区的CDR嫁接刀来自于另一个物种的构架中。例如，可以将鼠类CDR嫁接到人类FR中。在某些实施方式中，将抗体的轻链和重链可变区的CDR嫁接到人类FR或共有人类FR中。为了产生共有人类FR，将来自于几个人类重链或轻链氨基酸序列的FR比对以鉴定共有氨基酸序列。CDR嫁接被描述在美国专利号7,022,500(Queen)；6,982,321(Winter)；6,180,370(Queen)；6,054,297(Carter)；5,693,762(Queen)；5,859,205(Adair)；5,693,761(Queen)；5,565,332(Hoogenboom)；5,585,089(Queen)；5,530,101(Queen)；Jones等，(1986)NATURE 321:522-525；Riechmann等，(1988)NATURE 332:323-327；Verhoeyen等，(1988)SCIENCE239:1534-1536；和Winter(1998)FEBSLETT 430:92-94中。
在被称为“超级人源化(SUPERHUMANIZATIONTM)”的方法中，在人类CDR与待人源化的小鼠抗体的CDR的结构相似性的基础上，从人类胚系基因选择人类CDR序列。参见例如美国专利号6,881,557(Foote)；和Tan等，2002,J.IMMUNOL.169:1119-1125。
降低免疫原性的其他方法包括“重塑”、“过度嵌合”和“镶饰/表面重修”。参见例如Vaswami等，1998,ANNALS OF ALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.81:105；Roguska等，1996,PROT.ENGINEER 9:895-904；和美国专利号6,072,035(Hardman)。在镶饰/表面重修方法中，将鼠类抗体中表面可接近的氨基酸残基用在人类抗体中在相同位置处更频繁存在的氨基酸残基代替。这种类型的抗体表面重修被描述在例如美国专利号5,639,641(Pedersen)中。
用于将小鼠抗体转变成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法被称为ACTIVMABTM技术(Vaccinex,Inc.,Rochester,NY)，其涉及基于痘苗病毒的载体以在哺乳动物细胞中表达抗体。可以产生高水平的IgG重链和轻链的组合多样性。参见例如美国专利号6,706,477(Zauderer)；6,800,442(Zauderer)；和6,872,518(Zauderer)。用于将小鼠抗体转变成适合于人类使用的形式的另一种方法是一种在由KaloBios Pharmaceuticals,Inc.(Palo Alto,CA)商业实践的技术。这种技术涉及使用专有的人类“受体”文库来生产“聚焦于表位的”文库用于抗体选择。用于将小鼠抗体修改成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法是“人类工程”(HUMAN ENGINEERINGTM)技术，其由XOMA(US)LLC商业实践。参见例如国际(PCT)公布号WO93/11794和美国专利号5,766,886(Studnicka)；5,770,196(Studnicka)；5,821,123(Studnicka)；和5,869,619(Studnicka)。
任何适合的方法，包括任何上述方法，可用于降低或消除抗体的人类免疫原性。
此外，可以在小鼠中产生全人抗体。缺少任何非人类序列的全人mAb可以从人免疫球蛋白转基因小鼠，通过在例如Lonberg等，NATURE 368:856-859,1994；Fishwild等，NATURE BIOTECHNOLOGY14:845-851,1996；和Mendez等，NATURE GENETICS 15:146-156,1997中参考的技术来制备。全人单克隆抗体也可以从噬菌体展示文库，通过在例如Knappik等，J.MOL.BIOL.296:57-86,2000；和Krebs等，J.IMMUNOL.METH.254:67-84 2001中参考的技术来制备和优化。
本发明涵盖了包含抗体片段的融合蛋白，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术来产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等，(2003)NAT.MED.9:129-134。
已开发了各种不同的技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生(参见例如Morimoto等，(1992)JOURNAL OF BIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICAL METHODS 24:107-117；和Brennan等，(1985)SCIENCE 229:81)。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并从其分泌，从而允许容易地生产大量这些片段。抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离。或者，可以将Fab’-SH片段从大肠杆菌直接回收并化学偶联，以形成F(ab’)2片段(Carter等，(1992)BIO/TECHNOLOGY10:163-167)。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。包含援救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段，被描述在美国专利号5,869,046中。用于生产抗体片段的其他技术对于专业技术人员来说是显而易见的。在某些实施方式中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见美国专利号5,571,894和5,587,458。
用于制造双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。参见Milstein和Cuello(1983)NATURE 305:537，国际(PCT)公布号WO93/08829，和Traunecker等，(1991)EMBO J.,10:3655。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等，(1986)METHODSENZYMOL.121:210。双特异性抗体包括交联的或“异体偶联的”或“异二聚体”抗体。例如，所述异二聚体中的抗体之一可以被偶联到亲和素，另一者被偶联到生物素。异二聚体抗体可以使用任何方便的交联方法来制造。适合的交联剂在本领域中是公知的，并与大量交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。
异二聚体或不对称IgG样分子的实例包括但不限于使用下述技术获得会使用下述格式的分子：Triomab/Quadroma，杵臼(Knobs-into-Holes)，CrossMabs，静电匹配的抗体，LUZ-Y，链交换工程化结构域体，Biclonic和DuoBody。
使用抗体片段(例如F(ab)和F(ab’)2片段)的优点包括消除抗体的Fc部分与细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞和B细胞)上的Fc受体之间的非特异性结合。此外，由于它们更小的尺寸，它们可能能够更高效地穿透组织。
异二聚体抗体或不对称抗体允许更大的灵活性和新的格式，用于将各种不同药物附连到抗体臂。用于产生异二聚体抗体的通用格式之一是“杵臼”(knobs-into-holes)格式。这种格式特异性针对抗体中恒定区的重链部分。所述“杵”部分通过将小的氨基酸用更大的氨基酸代替来构造，其适合被纳入“臼”中，所述臼通过将大的氨基酸用更小的氨基酸代替来构造。将所述“杵”连接到“臼”的是每条链之间的二硫键。所述“杵臼”形状促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。将单链可变区片段(scFv)通过短的连接物肽连接到所述重链和轻链的可变结构域。所述连接物富含提供更大柔性的甘氨酸和提供特异性的丝氨酸/苏氨酸。两个不同的scFv片段可以通过铰链区一起连接到重链的恒定结构域或轻链的恒定结构域。这为所述抗体提供了双特异性，允许两种不同抗原的结合特异性。所述“杵臼”格式加强异二聚体形成但不抑制同二聚体形成。
几种支持异二聚化的方法已被描述在例如国际(PCT)公布号WO96/27011、WO98/050431、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO2013/096291以及欧洲专利公布号EP1870459中。通常，在本领域中已知的方法中，将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域两者以互补的方式工程化，使得包含一个工程化的CH3结构域的重链不再能够与另一个具有相同结构的重链同二聚化(例如CH3工程化的第一重链不再能够与另一个CH3工程化的第一重链同二聚化；并且CH3工程化的第二重链不再能够与另一个CH3工程化的第二重链同二聚化)。由此迫使包含一个工程化的CH3结构域的重链与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一个重链异二聚化。作为结果，所述第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸替换以互补的方式工程化，使得所述第一重链和第二重链被迫异二聚化，而所述第一重链和第二重链不再能够同二聚化(例如由于空间位阻的原因)。
IV.药物组合物
对于治疗使用来说，优选地将融合蛋白和/或抗体偶联物与可药用载体组合。当在本文中使用时，术语“可药用”是指那些在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药载体例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在这些实施方式中，适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色、调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醇)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)，递送介质，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂(参见《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack Publishing Company,1990)。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有纳米粒子例如聚合物纳米粒子、脂质体或胶束(参见Anselmo等，(2016)BIOENG.TRANSL.MED.1:10-29)。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有持续或受控递送配方。用于配制持续或受控递送手段例如脂质体载体、可生物侵蚀的微粒或多孔珠和储库注射剂的技术，对于本领域技术人员来说也是已知的。持续释放制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或采取塑形制品例如薄膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一种来制备。
含有本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体偶联物的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其打算的给药途径相容。给药途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜、鞘内和直肠给药。在某些实施方式中，本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体偶联物通过IV输注给药。在某些实施方式中，本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体偶联物通过肿瘤内注射给药。有用的剂型可以通过制药领域中已知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，第18版，(Mack Publishing Company,1990)。适合于肠胃外给药的剂型组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内给药来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存的条件下应该稳定，并且应该针对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有稳定剂。在某些实施方式中，所述稳定剂是阳离子，例如二价阳离子。在某些实施方式中，所述阳离子是钙或镁。所述阳离子可以采取盐的形式，例如氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)。
在某些实施方式中，所述稳定剂以约0.05mM至约5mM的量存在。例如，所述稳定剂可以以约0.05mM至约4mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、约0.05mM至约1mM、约0.05mM至约0.5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM或约1mM至约2mM的量存在。
药物制剂优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法来实现，例如通过无菌滤膜过滤。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行过滤除菌。
本文描述的组合物可以局部或系统性给药。给药通常是肠胃外给药。在优选实施方式中，所述药物组合物被皮下给药，并且在甚至更优选实施方式中被静脉内给药。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。
通常，活性组分例如融合蛋白和/或抗体偶联物的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。所述给药的量将取决于变量例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、所述抗体的体内效能、药物配方和给药途径。可以将初始剂量提高到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最佳剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计在0.5mg/kg至20mg/kg运行的常规I期剂量递增研究中优化。给药频率可以随着多种因素而变，例如给药途径、剂量、所述融合蛋白和/或抗体偶联物的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的给药频率是每日一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是肠胃外，例如静脉内输注。在某些实施方式中，将融合蛋白和/或抗体偶联物冷冻干燥，然后在给药时在缓冲盐水中重构。
V.治疗用途
本文中公开的组合物和方法可用于在受试者中治疗各种不同形式的癌症或在受试者中抑制癌生长。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括单独地或与另一种治疗剂相组合向所述受试者给药有效量的唾液酸酶-抗HER2抗体融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文中公开的融合蛋白或抗体偶联物，以在所述受试者中治疗所述癌症。当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性药剂(例如根据本发明的融合蛋白)的量。有效量可以在一次或多次给药、施用或剂量中给药，并且不打算限于特定制剂或给药途径。
当在本文中使用时，“治疗”意味着在受试者例如人类中治疗疾病。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的减退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿类、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，并且更优选地包括人类。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、血液肿瘤和转移性病变。血液肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter's综合征(Richter's转化)。实体肿瘤的例子包括各种不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和恶性上皮肿瘤，例如那些影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、泌尿上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞，例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤)的恶性肿瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，例如上调唾液酸化聚糖的表达的上皮癌。上皮癌的实例包括但不限于子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌或输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。上皮癌还包括恶性上皮肿瘤，例如腺泡癌、腺癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌、基底类癌、基底、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、癌样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维状癌，胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛发基质癌、多血癌、、肝细胞癌、嗜酸细胞癌、玻璃样癌、肾上腺样癌、婴儿期胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、类骨癌、乳头状癌、门周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯性癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、纺锤细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、串状癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性癌、结节性癌、疣状癌和绒毛状癌。
在某些实施方式中，所述能够选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管和食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、不明原发癌(CUP)、结肠直肠腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞癌、胸腺癌、非黑素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮性卵巢癌(non-EOC)、葡萄膜黑素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌症、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是黑素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或肾癌。
在某些实施方式中，所述癌症是腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是转移性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是难治性癌症。
在某些实施方式中，所述癌症对使用抗体例如具有ADCC活性的抗体例如曲妥珠单抗的治疗具有抗性或无反应。
本文描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或方式相组合使用。当在本文中使用时，术语“相组合”给药被理解为意味着在所述受试者患有障碍的过程中向所述受试者递送两种(或更多种)不同治疗，使得对所述患者的治疗效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，在一种治疗的递送仍在进行时开始第二种治疗的递送，使得在给药方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，由于组合给药，所述治疗更加有效。例如，所述第二种治疗更加有效，例如使用更少的第二种治疗看到等同的效果，或者所述第二种治疗以比在不存在第一种治疗的情况下给药所述第二种治疗时观察到的更大的程度减轻症状，或者在使用第一种治疗时观察到类似的情况。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的降低大于在不存在一种治疗的情况下递送另一种治疗时观察到的降低。所述两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得在递送第二种治疗时递送的第一种治疗的效果仍然可检测。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法例如手术、放疗或另一种化学制剂的给药相组合给药。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括化疗例如细胞毒性药剂。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括靶向疗法，例如酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增殖化合物，例如甾类、生物免疫调节剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀类、抗炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括不同类别治疗剂的组合。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与检查点抑制剂相组合给药。所述检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂或TIGIT拮抗剂。
在某些实施方式中，所述检查点抑制剂是PD-1或PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T-细胞表面上的一种充当免疫系统检查点的受体，其在适合的时间抑制或以其他方式调节T-细胞活性以防止免疫系统过度活化。然而，癌细胞可以通过表达配体例如与T-细胞表面上的PD-1相互作用的PD-L1来利用这个检查点，以关闭或调节T-细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。利用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性的治疗方法被描述在美国专利号8,728,474和9,073,994以及欧洲专利号1537878B1中，并且包括例如使用抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体被描述在例如美国专利号8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(
Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(
Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性的抗PD-L1抗体被描述在例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(
Genentech)、德瓦鲁单抗(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗和BMS936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂相组合给药。在CTLA-4途径中，T-细胞上的CTLA-4与其在抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面上的配体(例如也被称为B7-1的CD80和CD86)的相互作用导致T-细胞抑制。示例性的基于CTLA-4的免疫检查点抑制方法被描述在美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性的抗CTLA-4抗体被描述在美国专利号6,984,720、6,682,736、7,311,910、7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984、国际(PCT)公开号WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424以及欧洲专利号EP 1212422 B1中。示例性的CTLA-4抗体包括伊匹单抗或曲美单抗。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与(i)PD-1或PD-L1抑制剂例如本文中公开的PD-1或PD-L1抑制剂和(ii)CTLA-4抑制剂例如本文中公开的CTLA-4抑制剂相组合给药。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与IDO抑制剂相组合给药。示例性的IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(被称为indoximod)、epacadostat(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)和BMS-986205。
可以与本文中描述的方法或组合物相组合给药的示例性细胞毒性药剂包括例如抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、含铂药剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC抑制剂例如伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古柳菌素A(TSA)、mocetinostat(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228、缩酚酸肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类、埃博霉素、插层剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进凋亡的药剂和辐射或结合表面蛋白以递送有毒药剂的抗体分子偶联物。在一个实施方式中，可以与本文中描述的方法或组合物一起给药的细胞毒性药剂是基于铂的药剂(例如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、拓扑替康、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙素、蒽环类抗生素(例如多柔比星或表柔比星)、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒素或美登素类化合物。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文中公开的融合蛋白或抗体偶联物相接触。在某些实施方式中，所述细胞选自树突状细胞和外周血单核细胞(PBMC)。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述融合蛋白或抗体偶联物相接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞、组织或受试者中HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA或通过Luminex多重测定法。
本发明还提供了一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的融合蛋白和/或抗体偶联物，例如本文中公开的融合蛋白或抗体偶联物。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞例如CD4+和/或CD8+ T-细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+ T-细胞。在某些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述融合蛋白或抗体偶联物的相似或在其他方面相同的肿瘤和/或受试者，在所述受试者中免疫细胞在所述肿瘤中的浸润被提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。免疫细胞在肿瘤中的浸润可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如在本文实施例12中所描述的抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的融合蛋白和/或抗体偶联物，例如本文中公开的融合蛋白或抗体偶联物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加循环NK细胞的数目。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述融合蛋白或抗体偶联物的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中循环NK细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中的循环NK细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如本文实施例12中所描述的抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中提高引流淋巴结中T-细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的融合蛋白和/或抗体偶联物，例如本文中公开的融合蛋白或抗体偶联物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加引流淋巴结中T-细胞的数目。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+ T-细胞。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述融合蛋白或抗体偶联物的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中所述引流淋巴结中T-细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中引流淋巴结中的T-细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如本文实施例12中所描述的抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物相接触，以便相对于与所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者提高所述Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述融合蛋白或抗体偶联物接触的相似或在其他方面相同的细胞、组织或受试者，在所述细胞、组织或受试者中Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或本文实施例12中所描述的Nanostring技术。
本发明还提供了一种从细胞或组织除去唾液酸的方法。所述方法包括将所述细胞或组织与有效量融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物相接触。本发明还提供了一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物的药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。在某些实施方式中，所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子(例如HLA-DR)的表达提高。在某些实施方式中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体偶联物接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞或组织中MHC-II分子的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或流式细胞术。
本发明还提供了一种增强肿瘤细胞的吞噬作用的方法。所述方法包括将所述肿瘤细胞与有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物相接触，从而增强所述肿瘤细胞的吞噬作用。在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中提高肿瘤细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的药物组合物，所述药物组合物以有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量包含融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬作用。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体偶联物接触的相似或在其他方面相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞群体，吞噬作用提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。吞噬作用可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种活化树突状细胞(DC)的方法。所述方法包括将所述DC与已用融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物处理的肿瘤细胞相接触。在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中活化树突状细胞(DC)或DC群体的方法，所述方法包括以有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者给药包含融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开融合蛋白或抗体偶联物的药物组合物，由此在所述受试者中活化所述DC或DC群体。
在某些实施方式中，相对于尚未与已用所述融合蛋白和/或抗体偶联物处理的肿瘤细胞接触的相似或在其他方面相同的DC或DC群体，所述DC或DC群体的活化提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。活化可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种降低Siglec-15结合活性，从而提高肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括将T细胞与融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物相接触。在某些实施方式中，本公开涉及一种降低患者的Siglec-15结合活性，从而提高肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含融合蛋白和/或抗体偶联物例如本文公开的融合蛋白或抗体偶联物的药物组合物，从而在所述受试者中提高抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体偶联物接触的Siglec-15，Siglec-15结合活性降低至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％或约100％。结合可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
在整个本说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为是包括在所叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所述叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自所述叙述的要素或组分中的两者或更多者。
此外应该理解，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以在不背离本发明的精神和范围的情况下以各种不同方式组合，不论在本文中是明示还是暗示。例如，在提及特定化合物的情况下，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，实施方式以能够书写和绘制清楚简明的申请的方式进行描述和描绘，但打算并且应该认识到实施方式可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本文的教授和发明。例如应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点均可适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”包括在所述表述后的单独的每个叙述的受试者以及所述叙述的受试者中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和使用中另有理解。与三个或更多个叙述的受试者相关联的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”、“含义”、包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除另外的未叙述的要素或步骤，除非从上下文另有具体陈述或理解。
在将术语“约”用于定量值之前的情况下，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从标称值偏差±10％，除非另有指示或推测。
应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中任何和所有实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用，仅打算更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外提出权利要求。本说明书中的任何语言均不应被解释为表明任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1
本实施例描述了重组人唾液酸酶(Neu1、Neu2和Neu3)的构建。
将人唾液酸酶Neu1、Neu2、Neu3(同工型1)和Neu4(同工型1)表达成带有10хHis标签的分泌蛋白。为了将Neu1表达为分泌蛋白，将本源N端信号肽(MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFA AIFLLLSLAASWSKA；SEQ ID NO：27)用MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)代替，并移除C端溶酶体信号基序(YGTL；SEQ ID NO：29)。为了将Neu2、Neu3和Neu4表达为分泌蛋白，向每一者添加N端信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)。
唾液酸酶在24孔板中，在200mL使用带有N-端6xHis标签的pCEP4哺乳动物表达载体转染的HEK293F人类细胞中表达。唾液酸酶使用Ni-NTA柱纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)定量，并如图1中所示通过SDS-PAGE检查。Neu1表达良好，具有～3μg/ml的产量，并且主要以单体形式存在。Neu2和Neu3表达各自给出～0.15μg/mL的产量，并且各自主要以二聚体形式存在。当通过NanoDrop测量时，Neu4没有可检测的表达量。用作表达的阳性对照的来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的细菌唾液酸酶(St-唾液酸酶；SEQID NO：30)给出与Neu1可比的产量，并主要以单体形式存在。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定所述重组表达的唾液酸酶的活性。如图2中所示，Neu1不具有高于无酶对照的可检测的活性，这与以前的报道相一致，所述报道表明除非与β-半乳糖苷酶和保护性蛋白质/组织蛋白酶A(PPCA)复合，否则Neu1是无活性的。Neu2和Neu3有活性。使用Neu2和Neu3进行了酶动力学测定。将1nM的固定浓度的酶与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。测定在酸性(pH 5.6)和中性(pH 7)两种条件下进行。如图3中所示，Neu2和Neu3两者在酸性和中性条件下均有活性，并显示出与以前报道的可比的酶动力学。
大多数重组表达的唾液酸酶在非还原SDS-PAGE凝胶上作为聚集体或二聚体迁移。随后使用还原剂二硫苏糖醇(DTT)的处理产生所述酶的单体形式，其在还原SDS-PAGE凝胶上迁移到42kDa处(图1)。
实施例2
本实施例描述了带有提高唾液酸酶的表达和/或活性的突变的重组人唾液酸酶的构建。
A.合理设计
结构和序列分析将Neu2的残基A93和P62鉴定为用于替换以提高溶解性和/或表达的候选物。具体来说，同源唾液酸酶序列的比较显示出在对应于Neu2的第93位的位置处偏好D或E氨基酸残基，并且在对应于Neu2的第62位的位置处偏好G氨基酸残基。
β-螺旋桨家族的蛋白质通常通过所述蛋白质的N-和C-端处的广泛氢键相互作用来稳定。结构分析显示，作为β-螺旋桨家族成员的Neu2似乎缺乏这些稳定化相互作用。相比之下，来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和绿色小单孢菌的唾液酸酶(Micromonospora viridifaciens)(与人类Neu2最同源的细菌唾液酸酶)在其N-和C-端处具有广泛的氢键相互作用。因此，将Neu2的残基K9、V363和L365突变以促进Neu2的N-端与C-端之间的氢键形成。
B.噬菌体展示
将Neu2在噬菌体展示系统中表达，允许筛选Neu2变体的表达水平和对热变性的抗性两者。使用具有V6Y和I187K替换的Neu2作为用于文库制备的模板。设计的噬菌体展示文库1、2和3分别描绘在表10-12中。每个文库包括所描绘的突变的所有可能的组合。第四个文库包括通过易错PCR产生的随机突变。
表10-噬菌体文库1
表11–噬菌体文库2
表12–噬菌体文库3
表10-12中的密码子使用列表示在文库的设计中使用的简并密码子编码，其中编码氨基酸的给定密码子的第一、第二和第三位示出在表13中，并如Mena等，(2005)PROTEINENG DES SEL.18(12):559-61中所述。
表13
| 简并密码子编码 | 混合碱基 |
| R | A、G |
| Y | C、T/U |
| M | A、C |
| K | G、T/U |
| S | G、C |
| W | A、T |
| H | A、C、T/U |
| B | G、C、T(或U) |
| V | A、C、G |
| D | A、G、T/U |
| N | A、C、G、T/U |
在加热以富集热稳定性和表达后，筛选所述噬菌体展示文库与构象特异性抗体和/或唾液酸生物素化探针的结合。所述唾液酸生物素化探针及其合成描绘在图4中。示例性的噬菌体展示筛选程序描绘在图5中。简单来说，产生表达所需Neu2变体的噬菌体文库。筛选噬菌体与固定化的抗Neu2抗体和/或唾液酸生物素化探针的结合。在清洗以除去未结合的噬菌体后，将结合的噬菌体从所述抗体或探针上洗脱并酌情进行分析。
C.酵母展示
也将Neu2在酵母展示系统中表达，允许筛选Neu2变体的表达水平和对热变性的抗性两者。使用具有V6Y和I187K替换的Neu2作为用于文库制备的模板。设计的酵母展示文库1a、1b、1c、1d、2a、2b、2c、3a、3b和3c分别描绘在表14-23中。每个文库包括所描绘的突变的所有可能的组合。通过易错PCR，以每个酶1、2、3、4和5个替换的近似平均比率产生了5个另外的子文库。
表14-酵母文库1a
总多样性：2.30E+07
表15-酵母文库1b
总多样性：4.11E+07
表16-酵母文库1c
总多样性：4.53E+07
表17-酵母文库1d
总多样性：4.30E+07
表18-酵母文库2a
总多样性：3.22E+08
表19-酵母文库2b
总多样性：3.22E+08
表20-酵母文库2c
总多样性：3.49E+09
表21-酵母文库3a
总多样性：3.63E+08
表22-酵母文库3b
总多样性：2.72E+08
表23-酵母文库3c
总多样性：2.72E+08
表14-23中的密码子使用列表示在所述文库的设计中使用的简并密码子编码，其中编码氨基酸的给定密码子的第一、第二和第三位示出在表13中，并如Mena等，(2005)PROTEIN ENG DES SEL.18(12):559-61中所述。
在加热以富集热稳定性和表达后，筛选所述酵母展示文库与构象特异性抗体和/或唾液酸生物素化探针的结合。示例性的酵母展示筛选程序描绘在图6中。简单来说，产生编码所需Neu2变体的质粒文库和在表面上表达所需Neu2变体的酵母细胞。对酵母细胞进行热冲击，然后筛选与磁珠上的抗Neu2抗体和/或唾液酸生物素化探针的结合。分离所述磁珠以除去未结合的细胞，并酌情进一步分析结合的细胞的Neu2亲和性、活性和稳定性。
D.结果
使用pCEP4哺乳动物表达载体，将包含使用本实施例中描述的合理设计、噬菌体展示和酵母展示方法鉴定到的突变的突变唾液酸酶表达成带有C-端人类Fc标签的分泌蛋白。表达使用带有抗人类Fc抗体传感器的ForteBio Octet和Western印迹来测定，并且酶活性如上所述使用产荧光底物4MU-NeuAc来测定。
所述突变唾液酸酶的表达和活性水平示出在表24中。在表24中，酶活性被标注为：“+++”，其表示活性比野生型Neu2高>2倍；“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。
表24
为了确认这些结果，将Neu2-M106(具有氨基酸序列SEQ ID NO：48，由核苷酸序列SEQ ID NO：89编码)表达并使用蛋白A柱进行纯化。图7A是SDS-PAGE凝胶图像，示出了在非还原和还原条件下的重组野生型人类Neu2和Neu2变体M106(各自带有C-端人类Fc标签)。图7B是重组野生型人类Neu2和Neu2变体M106(各自带有C-端人类Fc标签)的SEC-HPLC迹线。尽管Neu2-Fc在蛋白A纯化后具有0.3mg/升的产率并且通过SEC确定的单体含量为7％，但Neu2-M106具有20mg/升的得率和85％的单体含量。
通过如上所述测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放，测定了Neu2-M106的酶动力学。将2μg/孔的固定浓度的酶与浓度在4mM至0.03μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。图8描绘了Neu2变体M106的酶活性。Neu2-M106的酶活性与野生型Neu2相当，确定的KM为230μM。
合在一起，这些结果显示，通过本文中描述的合理设计、噬菌体展示和/或酵母展示方法鉴定到的突变可以提高唾液酸酶的稳定性和/或表达。
实施例3
本实施例描述了具有提高唾液酸酶的表达和/或活性的突变的重组人唾液酸酶的构建。
除非另有指明，否则本实施例中的突变唾液酸酶使用pCEP4哺乳动物表达载体，在Expi293F细胞中作为带有C-端人类Fc标签的分泌蛋白表达。表达使用带有抗人类Fc抗体传感器的ForteBio Octet和Western印迹来测定，并且酶活性如上所述使用产荧光底物4MU-NeuAc来测定。
构建了在Q126位处包含合理设计的替换的突变Neu2唾液酸酶。所述Neu2晶体结构的检查揭示出Q126的突变可以增加与邻近氨基酸残基的相互作用。
还构建了在Q270位置处包含合理设计的替换的另外的突变Neu2唾液酸酶。所述Neu2晶体结构的检查揭示出Q270向某些氨基酸的突变可以稳定与R237的相互作用并稳定在底物口袋中的结合。
还构建了另外的突变Neu2唾液酸酶，其包括β转角中的氨基酸残基被脯氨酸的替换(例如D80P、R189P和/或H239P替换)。在这些位置处用脯氨酸替换可以例如通过影响局部蛋白质折叠而使蛋白质稳定。
得到的突变唾液酸酶的表达和活性水平示出在表25中。在表25中，酶活性被标注为：“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“+++++”，其表示表达比野生型Neu2高>40倍；“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。
表25
为了确认这些结果，将Neu2-M173(具有氨基酸序列SEQ ID NO：117，由核苷酸序列SEQ ID NO：137编码)表达成带有C-端人类Fc标签，并使用蛋白A和陶瓷羟基磷灰石(CHT)柱进行纯化。图9A是SDS-PAGE凝胶的图像，示出了在非还原和还原条件下的Neu2-M173-Fc(带有C-端人类Fc标签)。图9B是Neu2-M173-Fc(带有C-端人类Fc标签)的SEC-HPLC迹线。Neu2-M173-Fc具有120mg/升的得率，并且单体含量为90％。
通过如上所述测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放，来测定Neu2-M173-Fc的酶动力学。将2μg/孔的固定浓度的酶与浓度在4mM至0.03μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。图10描绘了Neu2-M173-Fc的酶活性。Neu2-M173-Fc的酶活性与野生型Neu2相当，KM被确定为230μM。
还构建了在S301和/或W302位置处包含合理设计的替换的另外的突变Neu2唾液酸酶。S301和/或W302的突变可能影响与邻近氨基酸残基和/或底物的相互作用。
所述突变唾液酸酶的表达和酶活性示出在表26中。在表26中，酶活性被标注为：“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“+++++”，其表示表达比野生型Neu2高>40倍；“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。
表26
实施例4
本实施例描述了带有降低蛋白水解切割的突变的重组人唾液酸酶的构建。
使用CHO细胞表达系统，在大规模(10L)高细胞密度生产中将Neu2-M106(如实施例2中所述并具有氨基酸序列SEQ ID NO：48)表达成融合有Fc的单链蛋白，并使用蛋白A柱进行纯化。将得到的蛋白质用过SDS-PAGE进行分析。结果示出在图11中。在还原条件下，所述蛋白质包括全长(70kDa，大约50％)和切割的(40kDa和30kDa，大约50％)级分的混合物。然而，在非还原条件下没有切割，所述蛋白质保持为单链(图11)。另外，当在较小规模上表达Neu2-M106时(使用较短的细胞培养持续时间和较低的细胞密度)，没有切割，并且蛋白质保持为单链。初步的质谱分析显示，在大规模生产后在还原条件下观察到的40kDa和30kDa分子量级分是在唾液酸酶的氨基酸残基R243与V244之间切割的结果。切割的Neu2-M106的酶活性与未切割的Neu2-M106相近。
推测所述Neu2-M106的切割可能是由作为蛋白质生产、收获和/或纯化期间细胞裂解的结果而释放出的细胞内蛋白酶的活性造成的。为了试验这种假设，将切割的Neu2-M106(使用上述引起切割的大规模生产制备的)和未切割的Neu2-M106(使用上述不引起切割的较小规模生产制备的)两者与胰蛋白酶温育，并在还原条件下通过SDS-PAGE进行分析(图12)。简单来说，胰蛋白酶消化反应通过将胰蛋白酶(5μL，在PBS中的0.005％溶液)与Neu2-M106(25μL，0.25mg/mL，在PBS pH 8.0中)在冰上温育5分钟来进行。通过添加LDS凝胶载样缓冲液(5μL)终止反应，并在还原SDS-PAGE凝胶上运行，以观察胰蛋白酶介导的切割。所述SDS-PAGE分析显示，未切割的Neu2-M106与胰蛋白酶的温育产生与切割的Neu2-M106相同的切割模式。此外，切割的Neu2-M106与胰蛋白酶的温育导致对应于切割产物的条带的强度增加。
也在各种不同的蛋白酶抑制剂存在下将Neu2-M106与胰蛋白酶温育。简单来说，胰蛋白酶消化反应通过将胰蛋白酶(0.005％)与Neu2-M106(0.5mg/mL)和蛋白酶抑制剂在冰上温育5分钟来进行。通过添加LDS凝胶载样缓冲液终止反应，并在还原SDS-PAGE凝胶上运行，以观察胰蛋白酶介导的切割。使用的抑制剂包括柠檬酸铁(0.3和5mM)、抑肽酶(5,000和20,000U/mL)、AEBSF(0.1和1mM)、亮抑酶肽(1和10μM)或E-64(1和10μM)。正如在图13中看到的，蛋白酶抑制剂降低胰蛋白酶切割的程度。
合在一起，这些结果证实了在大规模生产后Neu2-M106的切割是由胰蛋白酶或相似蛋白酶类别的成员造成的。
接下来，我们试图合理设计带有提高对胰蛋白酶切割的抗性的突变的重组人唾液酸酶。
除非另有指明，否则在本实施例的剩余部分中，使用pCEP4哺乳动物表达载体将突变唾液酸酶在Expi293F细胞中(在50mL规模上)表达成带有C-端人类Fc标签的分泌蛋白。将得到的蛋白质使用蛋白A柱进行纯化。表达使用带有抗人类Fc抗体传感器的ForteBioOctet和Western印迹来测定，并且酶活性如上所述使用产荧光底物4MU-NeuAc来测定。蛋白酶切割通过如上所述的SDS-PAGE来测定。
首先，将R243突变成不同的极性/带电荷氨基酸例如K、E、H、N和Q。然而，R243的这些突变导致活性的完全丧失和表达量的降低(在类似的唾液酸酶中R243也是保守氨基酸)。
接下来，对切割位点周围的各个不同氨基酸残基进行突变，并测试表达、活性和胰蛋白酶切割抗性。测试的替换和替换组合示出在图14中。所有突变在Neu2-M106背景(即包含M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换)中测试。
图14中描绘的大多数突变唾液酸酶表达良好，然而只有两种突变唾液酸酶(包含V244I或A242C突变)有活性。A242C突变导致胰蛋白酶抗性提高超过10倍和略微更低的活性(均相对于Neu2-M106)。然而，具有未配对的半胱氨酸可能是潜在不稳定的，因此将A242突变成所有19种其他氨基酸，并测定活性和胰蛋白酶抗性。如图15中所示，将A242突变成芳香族氨基酸例如F、W和Y导致与Neu2-M106相比胰蛋白酶切割抗性的急剧提高(图15A)和与Neu2-M106相近的酶活性(图15B)。SEC分析显示，含有每个这些突变的蛋白质具有与Neu2-M106相似的模式和高于95％的单体含量(图15C)。
结构分析显示，用芳香族氨基酸代替A242可以为L260和V265(位于A242附近的非极性氨基酸)提供额外的疏水或堆积相互作用。因此，也将L260和V265突变成苯丙氨酸。与这些突变一起，也测试了可以例如通过提高堆积相互作用而提供额外稳定性的几种其他合理设计的突变体的表达、活性和蛋白酶抗性。
选择结果示出在图16中。如图16中所示，R241Y和A242F突变的组合(Neu2-M255)产生对胰蛋白酶切割的最大抗性(胰蛋白酶抗性相对于Neu2-M106提高超过10倍)。
所述突变唾液酸酶的表达、活性和蛋白酶抗性水平示出在表27中。在表27中，酶活性被标注为：“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“+++++”，其表示表达比野生型Neu2高>40倍；“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。蛋白酶/胰蛋白酶抗性被标注为：“+++”，其表示抗性比Neu2-M106高>10倍；“++”，其表示抗性比Neu2-M106高≥5倍；“+”，其表示抗性与Neu2-M106相当；或“–”，其表示抗性低于Neu2-M106。NT＝未测试。
表27
实施例5
本实施例描述了使用突变的人唾液酸酶构建并表达抗体-唾液酸酶遗传融合蛋白和含有所述融合蛋白的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)。
四种类型的示例性ASC的结构体系描绘在图19中。第一种类型的ASC被称为“Raptor”，包括抗体(具有两条重链和两条轻链)和融合在所述抗体的每条重链的C-端处的唾液酸酶(图19A)。第二种类型的ASC被称为“Janus”，含有一条抗体臂(具有一条重链和一条轻链)和一个唾液酸酶-Fc融合体，后者具有融合在Fc的一条臂的N-端处的唾液酸酶。所述Janus ASC中的每个Fc结构域多肽含有用于异二聚化的“杵”(T366Y)或“臼”(Y407T)突变(残基编号按照EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)，同上)(图19B)。第三种类型的ASC被称为“Lobster”，含有两个Fc结构域多肽，每个所述多肽具有融合在Fc的N-端处的唾液酸酶和融合在Fc的C-端处的scFv(图19C)。第四种类型的ASC被称为“Bunk”，含有一条抗体臂(具有一条重链和一条轻链)，其具有融合在Fc的一条臂的C-端处的scFv，和一个唾液酸酶-Fc融合体，其具有融合在Fc的另一条臂的N-端处的唾液酸酶。Bunk ASC中的每个Fc结构域多肽含有用于异二聚化的“杵”(T366Y)或“臼”(Y407T)突变(残基编号按照EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)，同上)(图19D)。
制造了包含实施例2中描述的Neu2变体和曲妥珠单抗的Janus ASC，并测试其活性和表达。表达使用带有抗人类Fc抗体传感器的ForteBio Octet和Western印迹来测定，并且酶活性如上所述使用产荧光底物4MU-NeuAc来测定。Janus ASC的表达和活性水平示出在表28中。在表28中，酶活性被标注为：“+++”，其表示活性比野生型Neu2高>2倍；“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。
表28
制造了包含实施例2中描述的Neu2变体和曲妥珠单抗的另外的Janus ASC，并测试了它们的活性和表达。将Janus ASC在Expi293F细胞中在500mL培养物中表达，并使用蛋白A和离子交换层析纯化。表达使用带有抗人类Fc抗体传感器的ForteBio Octet和Western印迹来测定，并且酶活性如上所述使用产荧光底物4MU-NeuAc来测定。Janus ASC的表达和活性水平示出在表29中。在表29中，酶活性被标注为：“+++”，其表示活性比野生型Neu2高>2倍；“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；“+”，其表示活性低于野生型Neu2；或“–”，其表示没有可检测的活性；并且表达被标注为：“++++”，其表示表达比野生型Neu2高>15倍；“+++”，其表示表达比野生型Neu2高>6倍；“++”，其表示表达比野生型Neu2高2-5倍；“+”，其表示表达与野生型Neu2相当；或“–”，其表示没有可检测的表达。
表29
实施例6
本实施例描述了使用突变的人唾液酸酶构建并表达抗体-唾液酸酶遗传融合蛋白和含有所述融合蛋白的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)。
使用带有M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗制造了在本实施例中被称为“Janus曲妥珠单抗”的Janus抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)。如下所述将这种Janus曲妥珠单抗(包含由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO：88编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：68的第三多肽链)表达，并使用SDS-PAGE表征纯度且使用4MU-NeuAc表征酶活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体将Janus曲妥珠单抗在Expi293人类细胞的1L转染中表达。使用蛋白A，然后是阳离子交换层析(Hitrap SP-HP，GE Lifesciences)纯化Janus曲妥珠单抗。将纯化的蛋白质通过SDS-PAGE(图20)和SEC-HPLC(图21)进行分析。表达量为30mg/L，通过SEC-HPLC确定的单体纯度为90％。
所述重组表达的Janus曲妥珠单抗的酶活性通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定。具体来说，使用2μg/孔的固定浓度的酶，将其与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育，来进行酶动力学测定。如图22中所示，Janus曲妥珠单抗具有酶活性，Km为0.48mM。
使用ForteBio Octet来测试Janus曲妥珠单抗的抗原(Her2)结合，将ASC捕获在抗Fc抗体传感器上并浸泡在带有His标签的Her2的连续稀释液中(50至0.78nM，1:2稀释)。Janus曲妥珠单抗以与曲妥珠单抗相当的结合亲和性结合到Her2(图23)。
使用带有M1D、V6Y、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗制造了在本实施例中被称为“Janus曲妥珠单抗2”的另一个Janus ASC。Janus曲妥珠单抗2包含由核苷酸序列SEQID NO：86编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO：142编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：141的第三多肽链。在所述Janus曲妥珠单抗2的第三多肽链中，唾液酸酶和Fc结构域被基于(G4S)2的连接物隔开。将Janus曲妥珠单抗2表达，并使用SDS-PAGE表征纯度。Janus曲妥珠单抗2具有20mg/L的起始滴度(30至55％的异二聚体)，并且在SEC-HPLC后具有5至10mg/L的得率和80-93％的纯度。
使用带有M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗制造了在本实施例中被称为“Janus曲妥珠单抗3”的另一个Janus ASC。Janus曲妥珠单抗3包含由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，由核苷酸序列SEQ ID NO：150编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：149的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO：144编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：143的第三多肽链。在所述Janus曲妥珠单抗3的第三多肽链中，唾液酸酶和Fc结构域被基于IgG的铰链区隔开。将Janus曲妥珠单抗3表达，如上所述使用SDS-PAGE表征纯度并使用4MU-NeuAc表征酶活性。Janus曲妥珠单抗3具有150mg/L的起始滴度，并且在SEC-HPLC后具有40至77mg/L的得率和92％的纯度。Janus曲妥珠单抗3具有与Janus曲妥珠单抗等同的酶活性(0.52mM KM，1.96x106Vmax)。
使用带有M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗制造了在本实施例中被称为“Janus曲妥珠单抗4”的另一个Janus ASC。Janus曲妥珠单抗4包含由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，由核苷酸序列SEQ ID NO：150编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：149的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO：146编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：145的第三多肽链。在所述Janus曲妥珠单抗4的第三多肽链中，唾液酸酶和Fc结构域被基于IgG的铰链区隔开。将Janus曲妥珠单抗4表达，如上所述使用SDS-PAGE表征纯度并使用4MU-NeuAc表征酶活性。Janus曲妥珠单抗4在SEC-HPLC后具有132mg/L的得率和87％的纯度以及与Janus曲妥珠单抗可比的酶活性(0.45mM KM，1.6x 106Vmax)。
使用带有M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、E218A、C219N、C332A、V363R和L365R替换的Neu2和曲妥珠单抗制造了在本实施例中被称为“Janus曲妥珠单抗LOF”的另一个JanusASC。Janus曲妥珠单抗LOF包含由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的具有氨基酸序列SEQ IDNO：66的第一多肽链，由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和由核苷酸序列SEQ ID NO：148编码的具有氨基酸序列SEQ ID NO：147的第三多肽链。在所述Janus曲妥珠单抗LOF的第三多肽链中，唾液酸酶和Fc结构域被基于(G4S)2的连接物隔开。将Janus曲妥珠单抗LOF表达并使用SDS-PAGE表征纯度，并确认了它在使用4MU-NeuAc时失去酶活性。
如上所述使用4MU-NeuAc测量Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2的酶活性。Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2分别具有0.49mM KM、2.1x 106Vmax和0.15mM KM、1.8x106 Vmax的酶活性。使用曲妥珠单抗(没有任何偶联的唾液酸酶)作为对照，测量了与HER2阳性SKBR3细胞的结合。Janus曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗2和曲妥珠单分别以1.0、1.3和1.0μg/ml的EC50结合SKBR3细胞。通过PNA或花生凝集素的凝集素染色的增加来测量SKBR-3细胞的去唾液酸化。Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2分别以0.5和0.8μg/ml的EC50将SKBR3细胞去唾液酸化。正如预期，对于曲妥珠单抗没有观察到可测量的去唾液酸化。
通过将ASC以1mg/mL悬浮在PCC缓冲液(PBS+25mM柠檬酸盐+4mM CaCl2)中并在37℃温育7天，测量了Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2的稳定性。使用SEC-HPLC监测单体含量。在37℃下7天后，Janus曲妥珠单抗维持高于75％的单体百分率。由于聚集，Janus曲妥珠单抗2的单体百分率从80％下降到第7天为止的33％。酶活性如上所述使用4MU-NeuAc来测量。在整个研究期间两种ASC均维持酶活性。
测定了Janus曲妥珠单抗对M2样巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的影响。简单来说，将50,000M2样巨噬细胞接种在24孔板中，并供应低水平的M-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)。将HT-29或BT-20肿瘤细胞用CFSE染料标记，用Janus曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗LOF或曲妥珠单抗(50μg/ml)预处理并温育4小时。4小时后将细胞清洗，并将250,000个肿瘤细胞添加到巨噬细胞板(1:5的巨噬细胞与肿瘤细胞比率)。在温育2小时后，使用CD11b、CD45和CFSE+肿瘤细胞的标志物通过流式细胞术测量吞噬百分数。如图30中所描绘，Janus曲妥珠单抗诱导BT-20肿瘤细胞(图30A)或HT-29肿瘤细胞(图30B)的吞噬作用的大约3倍的提高。
实施例7
本实施例描述了含有细菌唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)在小鼠同基因乳腺癌模型中的体内给药。
在本实施例中制造并测试了下述ASC：(i)包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)唾液酸酶(St-唾液酸酶)和曲妥珠单抗的Janus ASC(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ IDNO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：91编码的氨基酸序列SEQ ID NO：90的第三多肽链)；(ii)包括St-唾液酸酶和曲妥珠单抗的Raptor ASC(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一和第四多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：93编码的氨基酸序列SEQ ID NO：92的第二和第三多肽链)；和(iii)包括St-唾液酸酶和源自于曲妥珠单抗的scFv的Lobster ASC(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：95编码的氨基酸序列SEQ ID NO：94的第一和第二多肽链)。
在用表达人Her2的鼠类乳腺癌细胞系(EMT6-hHer2细胞)注射的小鼠同基因肿瘤模型中，将这些ASC与曲妥珠单抗进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用0.1ml PBS中的EMT6-Her2肿瘤细胞(5x 105)皮下接种，用于肿瘤发生。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到8个组。治疗组描述在表30中，并注明了随机分组后的给药时间表。正如指示的，将抗小鼠NK1.1抗体(克隆：PK136；BioXcell,621717N1)、抗小鼠CD8α抗体(克隆：53-6.7；BioXcell,BE0004-1)和氯膦酸二钠脂质体(FormuMax Scientific,Inc.)包括在治疗组中。
表30
来自于使用曲妥珠单抗以及Raptor、Janus和Lobster ASC的治疗结果分别示出在图24A、24B、24C和24D中。正如可以看到的，曲妥珠单抗在所治疗的8只个体小鼠中不引起完全响应(被定义为在研究过程中的任何时间点减退到低于触诊极限，图24A)。与此形成对比的是，Raptor表现出8只动物中的2只具有完全响应(图24B)，Janus表现出8只动物中的3只具有完全响应(图24C)，并且Lobster表现出8只动物中的2只具有完全响应(图24D)。
与NK剥夺(抗小鼠NK1.1抗体)、巨噬细胞剥夺(氯膦酸二钠脂质体)和CD8 T细胞剥夺(抗小鼠CD8α抗体)一起给药Janus的结果示出在图25中。正如可以看到的，与在8只动物中的3只中存在完全响应的单独的Janus治疗(图24C)相比，NK剥夺将完全响应的数目减少到8只动物中的1只(图25A)。巨噬细胞剥夺也将完全响应的数目减少到8只动物中的1只(图25B)。CD8 T细胞剥夺完全逆转了Janus的效果，没有动物显示出完全响应(图25C)。图25D示出了介质、单独的Janus、单独的曲妥珠单抗和与NK、巨噬细胞和CD8 T细胞剥夺一起的Janus的平均肿瘤体积。这些结果证实先天性免疫(NK和巨噬细胞依赖性)和获得性免疫(CD8 T细胞)对体内ASC活性有贡献。
实施例8
本实施例描述了具有细菌唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)在小鼠同基因乳腺癌模型中的体内给药和ASC对长期抗肿瘤免疫记忆的诱导。
在本实施例中制造并测试了下述ASC：(i)包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)唾液酸酶(St-唾液酸酶)和曲妥珠单抗的Janus ASC(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ IDNO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：91编码的氨基酸序列SEQ ID NO：90的第三多肽链)；和(ii)包括具有两个功能丧失突变D100V和G231V的St-唾液酸酶和曲妥珠单抗的Janus ASC(“Janus-LOF”，包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ IDNO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：97编码的氨基酸序列SEQ ID NO：96的第三多肽链)。
正如在D'Amico等，(2016)ANNALS OF ONCOLOGY,Volume 27,Issue suppl_8,41P中所描述的，在用表达人Her2的独立的EMT6细胞系(EMT6-hHer2细胞)注射的小鼠同基因原位肿瘤模型中对这些ASC进行测试。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠通过用EMT6-Her2肿瘤细胞(5x 106)乳腺内移植进行接种。当肿瘤达到约250mm3时，将小鼠随机分派到6个组。治疗组描述在表31中，并注明了随机分组后的给药时间表。抗小鼠PD1抗体从BioXcell获得(RMP1-14，目录号665418F1)。
表31
第1至4组(介质、曲妥珠单抗、Janus和Janus LOF)的结果示出在图26A中。正如可以看到的，用Janus治疗的6只动物中的3只具有肿瘤生长的完全消退。值得注意的是，JanusLOF和曲妥珠单抗两者与介质治疗的动物相当。
将所述具有完全消退的3只小鼠(“治愈的小鼠”)用与最初使用的相同的EMT6-Her2细胞或亲代EMT6细胞(缺少工程化改造的人Her2表达)再激惹。将0.1ml PBS中的EMT6细胞和EMT6-Her2细胞(5x 105)分别皮下接种在右或左下胁区域中，用于所有3只治愈的小鼠的肿瘤发生。也将EMT6-Her2细胞皮下接种到空白(naive)小鼠中作为对照。正如可以在图26B中看到的，EMT6-Her2细胞和亲代EMT6细胞都不能在治愈的小鼠中引起肿瘤生长，而正如预期的，EMT6-Her2细胞在空白(naive)小鼠中发展成肿瘤。这些结果表明本发明的抗体-唾液酸酶偶联物能够诱导针对肿瘤的长期记忆。此外，所述长期记忆针对所述肿瘤细胞，并且独立于最初靶向的癌抗原(在这种情况下是Her2)。
第1、5和6组(介质、抗小鼠PD1抗体和与Janus组合的抗小鼠PD1抗体)的结果示出在图27A和图27B中。尽管抗小鼠PD1抗体具有良好活性，其中6只小鼠中的4只表现出完全消退(与单独的Janus相似，其中6只小鼠中的3只表现出完全消退，参见图26A)，但抗小鼠PD1抗体与Janus的组合在所有6只小鼠中表现出肿瘤生长的完全消退(图27B)。在给药这种组合的动物中，没有任一只体重减轻。
实施例9
本实施例描述了具有细菌唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)在小鼠同基因黑素瘤模型中的体内给药。
在本实施例中，制造并测试了一种包括鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)唾液酸酶(St-唾液酸酶)和曲妥珠单抗的Janus ASC(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ IDNO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：91编码的氨基酸序列SEQ ID NO：90的第三多肽链)。
将所述ASC在用表达人Her2的B16黑素瘤细胞系(B16D5-Her2，Surana等，CANCERIMMUNOL RES,2(11):1103–1112)注射的小鼠同基因肿瘤模型中进行测试。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠在右下胁区域中用B16D5-Her2肿瘤细胞(5x 105)皮下接种。当肿瘤达到50至100mm3时，将小鼠随机分派到3个组。治疗组描述在表32中，并注明了随机分组后的给药时间表。从BioXcell获得的抗小鼠PD1抗体(RMP1-14，目录号665418F1)和从BioXcell获得的抗小鼠CTLA4抗体(9D9，目录号BE0164)被组合使用。
表32
所述B16黑素瘤小鼠模型被认为是一种难以使用免疫肿瘤学方法治疗的肿瘤模型。将Janus与抗小鼠PD1抗体和抗小鼠CTLA4抗体的组合进行比较。结果示出在图28中。与抗小鼠CTLA4抗体组合的抗小鼠PD1抗体对B16D5-Her2肿瘤生长具有影响，但这种组合在被治疗的动物中也表现出显著的体重减轻。作为比较，Janus表现出更鲁棒的抗肿瘤活性并且没有显著的体重减轻。单独的曲妥珠单抗在这种模型中表现出边缘活性。
实施例10
本实施例描述了含有人唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)在小鼠同基因乳腺癌模型中的体内给药。
在本实施例中，制造并测试了下述ASC：(i)如实施例6中所述的Janus曲妥珠单抗，其包含具有M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ IDNO：88编码的氨基酸序列SEQ ID NO：68的第三多肽链)；(ii)如实施例6中所述的Janus曲妥珠单抗2，其包含具有M1D、V6Y、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQID NO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：142编码的氨基酸序列SEQ ID NO：141的第三多肽链)；和(iii)如实施例6中所述的Janus曲妥珠单抗LOF，其包含具有M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、E218A、C219N、C332A、V363R和L365R替换的Neu2和曲妥珠单抗(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ IDNO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：148编码的氨基酸序列SEQ ID NO：147的第三多肽链)。
在用稳定表达人HER2的鼠类乳腺癌细胞系(EMT6-HER2)注射的小鼠同基因肿瘤模型中，将Janus曲妥珠单抗与同种型对照抗体进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用EMT6-HER2肿瘤细胞(5x 105)皮下接种。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到8只动物的组中。
小鼠通过10mg/kg的腹膜内注射进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。图29示出了接受Janus曲妥珠单抗或对照治疗的小鼠的个体肿瘤生长。在这个实验中，在用Janus曲妥珠单抗治疗后观察到显著的肿瘤生长延迟。
在用稳定表达人HER2的鼠类乳腺癌细胞系(EMT6-HER2)注射的小鼠同基因肿瘤模型中，将Janus曲妥珠单抗2与曲妥珠单抗或同种型对照进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用EMT6-HER2肿瘤细胞(5x 105)皮下接种用于肿瘤发展。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到8只动物的组中。
小鼠通过1.0或10mg/kg的Janus曲妥珠单抗2或10mg/kg的曲妥珠单抗的腹膜内注射进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。图31示出了接受同种型(图31A)、曲妥珠单抗(图31B)、1.0mg/kg的Janus曲妥珠单抗2(图31C)或10mg/kg的Janus曲妥珠单抗2(图31D)治疗的个体小鼠的肿瘤生长。在这个实验中，在用10mg/kg(8只小鼠中的3只具有完全响应，1只部分响应)和1mg/kg(1只完全响应)的Janus曲妥珠单抗治疗后，观察到显著的肿瘤生长延迟。
进行了另一项研究以在EMT6-HER2同基因模型中将Janus曲妥珠单抗与Janus曲妥珠单抗2进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用EMT6-HER2肿瘤细胞(5x105)皮下接种用于肿瘤发展。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到8只动物的组中。小鼠通过Janus曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗2或同种型对照的腹膜内注射(均以10mg/kg给药)进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。图32示出了在这个模型中Janus曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗2的效能。
进行了另一项研究以在EMT6-HER2同基因模型中将Janus曲妥珠单抗与Janus曲妥珠单抗LOF进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用EMT6-HER2肿瘤细胞(5x 105)皮下接种用于肿瘤发展。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到8只动物的组中。小鼠通过Janus曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗LOF或同种型对照的腹膜内注射(均以10mg/kg给药)进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。图33示出了在这个模型中，与Janus曲妥珠单抗LOF(图33B)或同种型对照(图33A)相比Janus曲妥珠单抗的优越活性(8只动物中的3只完全响应，2只部分响应，图33C)。这些结果证实了唾液酸酶活性对抗体-唾液酸酶偶联物的体内效能的重要性。
实施例11
本实施例描述了含有人唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物(ASC)在小鼠同基因黑素瘤模型中的体内给药。
在本实施例中，制造并测试了如实施例3中所述的包含具有M1D、V6Y、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗的Janus曲妥珠单抗2(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：142编码的氨基酸序列SEQ ID NO：141的第三多肽链)。
如实施例9中所述，将Janus曲妥珠单抗2在用表达人Her2的B16黑素瘤细胞系注射的小鼠同基因肿瘤模型中进行测试。所述B16黑素瘤小鼠模型认为是难以用免疫肿瘤学方法治疗的模型。将6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠在右下胁区域中用B16D5-Her2肿瘤细胞(5x105)皮下接种。当肿瘤达到50至100mm3时，将小鼠随机分派到6个8只小鼠的组。下述用下述药剂治疗：(i)Janus曲妥珠单抗2，(ii)曲妥珠单抗，(iii)抗小鼠PD-1抗体(anti-mPD1)，(iv)Janus曲妥珠单抗2与anti-mPD1的组合，(v)曲妥珠单抗与anti-mPD1的组合，或(vi)同种型对照，每种药剂均为10mg/kg。结果示出在图34中。与曲妥珠单抗(图25B)或同种型(图34A)相比，Janus曲妥珠单抗2(图34D)表现出更高的抗肿瘤活性。Janus曲妥珠单抗2与anti-mPD1的组合(图34E)在该模型中表现出鲁棒的活性，8只小鼠中的4只表现出完全响应。这个组合比单独的anti-mPD1(图34C)或anti-mPD1与曲妥珠单抗的组合(图34F)活性更高。
实施例12
本实施例描述了含有人唾液酸酶的抗体-唾液酸酶偶联物的体内给药和机制评估。
在本实施例中，制造并测试了下述ASC：(i)如实施例6中所述的Janus曲妥珠单抗2，其包含具有M1D、V6Y、I187K和C332A替换的Neu2和曲妥珠单抗(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ IDNO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：142编码的氨基酸序列SEQ ID NO：141的第三多肽链)；和(ii)如实施例6中所述的Janus曲妥珠单抗LOF，其包含具有M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、E218A、C219N、C332A、V363R和L365R替换的Neu2和曲妥珠单抗(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：86编码的氨基酸序列SEQ ID NO：66的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ ID NO：87编码的氨基酸序列SEQ ID NO：67的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：148编码的氨基酸序列SEQ ID NO：147的第三多肽链)。
为了进一步表征Janus曲妥珠单抗2肿瘤生长抑制的机制，通过用5种剂量的Janus曲妥珠单抗2或对照(PBS、曲妥珠单抗和Janus曲妥珠单抗LOF)治疗带有已建立的皮下EMT6-HER2肿瘤的小鼠，并在第五和最后一次给药后4小时评估肿瘤、引流淋巴结以及循环中的免疫应答，进行了药效学(PD)研究。实验设计示出在图35中。
与Janus曲妥珠单抗LOF和其他对照相比，肿瘤生长被Janus曲妥珠单抗2抑制。然而，由于肿瘤的非均质性，我们在Janus曲妥珠单抗2治疗后观察到各种不同的肿瘤尺寸/响应。为了更好地评估Janus曲妥珠单抗2治疗与肿瘤生长和免疫应答之间的关系，将体积大于500mm3的肿瘤分类为潜在的非响应者即“Janus曲妥珠单抗2-NR”，并将体积小于350mm3的肿瘤分类为潜在的响应者即“Janus曲妥珠单抗2-R”。Janus曲妥珠单抗2-R组中的肿瘤尺寸显著小于Janus曲妥珠单抗2-NR组中的肿瘤尺寸。
在带有加热器的gentleMACSTM Octo解离器(Miltenyi)上，使用小鼠肿瘤解离试剂盒(Miltenyi#130-096-730)，按照制造商的说明书对收集到的肿瘤进行处理。将悬液中的细胞(1.5x106)用TruStain FcX Plus(BioLegend#156604)在4℃阻断5分钟。将细胞清洗，并用PBS中的生物素化的MAL II(Vector Labs#B-1265)在4℃染色30分钟。在用PBS清洗后，添加AF647链亲合素(Invitrogen#21374)，在4℃温育30分钟。在清洗后，将细胞用活/死近IR(Molecular Probes#L34976)和针对CD45(克隆30-F11)、CD3(克隆17A2)、CD4(克隆RM4-5)、CD8(克隆53-6.7)、CD19(克隆6D5)、NKp46(克隆29A1.4)、CD11c(克隆N418)、CD11b(克隆M1/70)、F4/80(克隆BM8)、Ly6C(克隆HK1.4)、Ly6G(克隆1A8)、CD206(克隆MR6F3)、I-A/I-E(克隆M5/114.15.2)、CD69(克隆H1.2F3)、PD-L1(克隆10F.9G2)和人类HER-2(克隆24D2)的表面抗体在TruStain FcX存在下，在PBS中在4℃染色20分钟。在肿瘤组中使用BV421山羊抗人类IgG Fc(Jackson ImunoResearch#109-675-098)来检测治疗抗体。然后将细胞用CytoFixTM(BD#554655)固定。在固定并用Foxp3/转录因子染色缓冲液(eBioscience#00-5523-00)通透化后，使用Foxp3(克隆FJK-16s)和颗粒酶B(克隆GB11)进行细胞内染色。在BD FACSCelesta上获取数据并使用Flowjo和GraphPad Prism进行分析。肿瘤细胞染色组的详细情况如下：(i)T细胞组包括CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD69、Foxp3、颗粒酶B、PD-L1、PNA和活/死，(ii)髓系组包括CD45、CD11c、CD11b、Ly6G、Ly6C、F4/80、CD206、I-A/I-E、PNA和活/死，并且(iii)肿瘤组包括CD45、CD3、CD11b、NKp46、CD19、人类HER-2、抗人类IgG Fc、活/死和MAL II。
使用Ficoll-Paque白细胞分离方法，使用标准流程对血样进行分离。使用1ml移液管轻柔地收集白细胞，并用PBS(1％BSA)清洗。将细胞用TruStain FcX Plus(BioLegend，目录号：156604)阻断，并继续使用1μg/ml PNA(Vector Labs，目录号：B-1075)在冰上对去唾液酸化标志物PNA染色10分钟，然后与1:2000稀释的第二抗体链亲合素-AF647(Invitrogen，目录号：21374)在冰上温育10分钟。在PNA染色后，将细胞在冰上用包括CD11c-BV650(克隆N418)、CD11b-BV785(克隆M1/70)、CD3-PE-Cy-7(克隆500A2)、CD8-PE(克隆53-6.7)、NKp46-PerCP/花青素5.5(克隆29A1.4)、CD19-BV605(克隆6D5)、Ly-6G-APC-R-700(克隆1A8)、CD14-BV510(克隆Sa14-2)、活/死APC-Cy-7、F4/80-FITC(克隆BM8)和TER119-BV421(克隆TER11)的组染色15分钟。在染色后，将细胞用固定缓冲液(Biolegend，目录号：420801)固定，并在BD FACS Celesta机器上运行以获取数据。数据使用FlowJO软件加密狗独立地进行分析。
将引流淋巴结(dLN)用酶消化以从组织释放出细胞。更具体来说，将每个dLN置于1.5ml管中。向管添加250μl消化混合物(胶原酶-P(0.2mg/ml)、分散酶(0.8mg/ml)和DNase-I(0.1mg/ml)，在无血清RPMI培养基中)，并在37℃温育5分钟。5分钟后，通过经1ml移液器头吸打将组织破碎，并在37℃另外温育5分钟。在5分钟结束时，收集细胞悬液并转移到含有冷藏的完全培养基(10％FBS RPMI)的管中。使用管中的剩余组织将酶消化步骤再重复一次以便完全消化。最后，将细胞清洗两次以除去残留的酶混合物，然后进行接下来的细胞染色步骤。对于细胞染色来说，使用了两个不同的流式抗体组：(i)髓系组包括CD8-Alexa Fluor488、IA/IE-PE、CD45-PerCP-Cy5.5、CD3-PE-Cy7、PNA/Hydra-9 Alexa Fluor 647、LIVE/DEAD可固定近IR死细胞染色剂、CD11c-BV421、CD11b-BV650和CD86-BV785；并且(ii)T细胞组包括CD8-Alexa Fluor 488、CD62L-PE、CD45-PerCP-Cy5.5、CD3-PE-Cy7、PNA AlexaFluor 647、LIVE/DEAD可固定近IR死细胞染色剂、CD44-Alexa Fluor 700、CD19-BV605和CD4-BV785。
通过MAL II凝集素染色确认肿瘤细胞的去唾液酸化，其中对于Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤和Janus曲妥珠单抗2-NR肿瘤来说观察到等同的去唾液酸化(图36)。对于曲妥珠单抗或Janus曲妥珠单抗LOF肿瘤来说，与介质对照相比没有观察到显著的肿瘤去唾液酸化。
与Janus曲妥珠单抗2-NR和对照肿瘤相比，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中观察到CD4+和CD8+ T细胞的显著增加(图37A和37B)。此外，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中CD69+CD8+和GzmB+CD8+ T细胞也显著增加(图37C和37D)，表明活化的CD8+ T细胞浸润到肿瘤微环境中。NK细胞主要仅在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中浸润到肿瘤中(图38A)。
检查了循环免疫细胞的频率，其中仅在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中发现NK细胞的增加(图38B)。其他循环免疫细胞维持与对照相近的水平。与Janus曲妥珠单抗2-NR和其他对照相比，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中观察到M2(CD206+MHC-II-)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的显著下降(图38C)。相比较而言，在所有组中，对M1(CD206-MHC-II+)TAM以及包括G-MDSC和M-MDSC两者在内的骨髓来源的抑制细胞(MDSC)没有观察到变化。
与其他组相比，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中也观察到引流淋巴结(dLN)中CD8+和CD4+ T细胞频率的提高(图39A和39B)，表明使用Janus曲妥珠单抗2治疗时dLN中的T细胞应答被激活。
也评估了循环血细胞的去唾液酸化。Janus曲妥珠单抗2治疗对红细胞(RBC)唾液酸化状态没有影响(图40A)。相比较而言，Janus曲妥珠单抗2治疗使NK、髓系细胞和嗜中性粒细胞显著去唾液酸化，并对T细胞显示出去唾液酸化的趋势，特别是在Janus曲妥珠单抗2-R组中(图40B-40F)。
接下来，使用Nanostring技术评估了肿瘤基因表达情况。使用来自于MachereyNagel的RNA提取试剂盒处理冷冻的肿瘤组织以提取RNA。将样品定量，分成在最适所需浓度范围内的批样，并在nCounter Sprint分析仪上针对用于小鼠的PanCancer IO 360TM组运行。使用nanoString软件nSolver对数据进行采集、质量控制和分析。结果示出在表33中(其中值等于log2变化倍数)。与Janus曲妥珠单抗2-NR肿瘤相比，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中Janus曲妥珠单抗2治疗将CD3、CD4和CD8水平分别提高6、7和5倍(表33)。与Janus曲妥珠单抗2-NR肿瘤相比，在Janus曲妥珠单抗2-R肿瘤中观察到多种检查点基因(Cd274、Ctla4、Pdcd1、Icos和Lag3)以及细胞因子基因(Il-6、Il-2、Il-1β、Ifn-γ、Ifn-α1、Mx1和Gzmb)和趋化因子基因(Cxcl9、Cxcl12和CCL5)的上调(表33)。
表33-通过Nanostring表征的肿瘤基因表达情况
总而言之，这些结果证实，使用抗体-唾液酸酶偶联物例如抗HER2抗体-唾液酸酶偶联物如Janus曲妥珠单抗2的治疗，增强了肿瘤、引流淋巴结和循环中的免疫细胞浸润和活化。
通过引用并入
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等同性
本发明可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明，并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。
序列表
SEQ ID NO：1：
MASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO：2：
MEDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO：3：
EDLRP
SEQ ID NO：4：
MEDLRP
SEQ ID NO：5：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：6：
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAAC
SEQ ID NO：7：
ENDFGLVQPLVTMEQLLWVSGRQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKMSSSDEGAKFIALRRSMDQGSTWSPTAFIVNDGDVPDGLNLGAVVSDVETGVVFLFYSLCAHKAGCQVASTMLVWSKDDGVSWSTPRNLSLDIGTEVFAPGPGSGIQKQREPRKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWRYGSGVSGIPYGQPKQENDFNPDECQPYELPDGSVVINARNQNNYHCHCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGAVVTSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWRKETVQLWPGPSGYSSLATLEGSMDGEEQAPQLYVLYEKGRNHYTESISVAKISV
SEQ ID NO：8：
MEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO：9：
MRPADLPPRPMEESPASSSAPTETEEPGSSAEVMEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO：10：
MGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO：11：
MMSSAAFPRWLSMGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO：12：
MASLP
SEQ ID NO：13：
ASLP
SEQ ID NO：14：
TVEKSVVF
SEQ ID NO：15：
GDYDAPTHQVQW
SEQ ID NO：16：
SMDQGSTW
SEQ ID NO：17：
STDGGKTW
SEQ ID NO：18：
PRPPAPEA
SEQ ID NO：19：
QTPLEAAC
SEQ ID NO：20：
NPRPPAPEA
SEQ ID NO：21：
SQNDGES
SEQ ID NO：22：
LSHSLST
SEQ ID NO：23：
GAGAACGACTTTGGACTGGTGCAGCCTCTGGTCACCATGGAACAGCTGCTGTGGGTTTCCGGCAGACAGATCGGCAGCGTGGACACCTTCAGAATCCCTCTGATCACCGCCACACCTAGAGGCACCCTGCTGGCCTTTGCCGAGGCCAGAAAGATGAGCAGCTCTGACGAGGGCGCCAAGTTTATTGCCCTGAGGCGGTCTATGGACCAGGGCTCTACATGGTCCCCTACCGCCTTCATCGTGAACGATGGCGACGTGCCCGATGGCCTGAATCTGGGAGCTGTGGTGTCCGATGTGGAAACCGGCGTGGTGTTCCTGTTCTACAGCCTGTGTGCCCACAAGGCCGGTTGTCAGGTGGCCAGCACAATGCTCGTGTGGTCCAAGGACGACGGCGTGTCCTGGTCTACCCCTAGAAACCTGAGCCTGGACATCGGCACCGAAGTGTTTGCTCCAGGACCTGGCTCTGGCATCCAGAAGCAGAGAGAGCCCAGAAAGGGCAGACTGATCGTGTGTGGCCACGGCACCCTTGAGAGAGATGGCGTTTTCTGCCTGCTGAGCGACGATCATGGCGCCTCTTGGAGATACGGCAGCGGAGTGTCTGGAATCCCTTACGGCCAGCCTAAGCAAGAGAACGATTTCAACCCCGACGAGTGCCAGCCTTACGAGCTGCCTGATGGCAGCGTCGTGATCAACGCCCGGAACCAGAACAACTACCACTGCCACTGCCGGATCGTGCTGAGAAGCTACGACGCCTGCGATACCCTGCGGCCTAGAGATGTGACCTTCGATCCTGAGCTGGTGGACCCTGTTGTTGCCGCTGGTGCCGTCGTGACATCTAGCGGCATCGTGTTCTTCAGCAACCCTGCTCACCCCGAGTTCAGAGTGAATCTGACCCTGCGGTGGTCCTTCAGCAATGGCACAAGCTGGCGGAAAGAAACCGTGCAGCTTTGGCCTGGACCTAGCGGCTACTCTTCTCTGGCTACACTGGAAGGCAGCATGGACGGCGAAGAACAGGCCCCTCAGCTGTACGTGCTGTACGAGAAGGGCAGAAACCACTACACCGAGAGCATCAGCGTGGCCAAGATCAGCGTT
SEQ ID NO：24：
ATGGCCAGCCTGCCTGTGCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCCCTACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGCCCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCATCCAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCTGTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAA
SEQ ID NO：25：
ATGGAGGAAGTGACCACCTGTAGCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAAGAGGACGACCGGGGCATCACCTACAGAATCCCTGCTCTGCTGTACATCCCTCCTACACACACCTTTCTGGCCTTCGCCGAGAAGCGGAGCACCAGACGAGATGAAGATGCCCTGCACCTGGTGCTGAGAAGAGGCCTGAGAATCGGACAGCTGGTGCAGTGGGGACCTCTGAAGCCTCTGATGGAAGCCACACTGCCCGGCCACAGAACCATGAATCCTTGTCCTGTGTGGGAGCAGAAAAGCGGCTGCGTGTTCCTGTTCTTCATCTGCGTGCGGGGCCACGTGACCGAGAGACAGCAAATCGTGTCCGGCAGAAACGCCGCCAGACTGTGCTTCATCTACAGCCAGGATGCCGGCTGCTCTTGGAGCGAAGTTCGGGATCTGACCGAAGAAGTGATCGGCAGCGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTTGGCCCTGGCCACGGAATCCAGCTGCAATCTGGCAGACTGGTCATCCCCGCCTACACCTACTATATCCCCAGCTGGTTCTTCTGCTTCCAACTGCCTTGCAAGACCCGGCCTCACAGCCTGATGATCTACAGCGACGATCTGGGCGTGACATGGCACCACGGCAGACTGATCAGACCCATGGTCACCGTGGAATGCGAGGTGGCCGAAGTGACAGGCAGAGCTGGACACCCTGTGCTGTACTGCTCTGCCAGAACACCCAACCGGTGTAGAGCCGAGGCTCTGTCTACAGATCACGGCGAGGGCTTTCAGAGACTGGCCCTCTCTAGACAGCTGTGCGAACCTCCTCATGGCTGTCAGGGCAGCGTGGTGTCCTTCAGACCTCTGGAAATCCCTCACCGGTGCCAGGACAGCAGCTCTAAGGATGCCCCTACCATCCAGCAGTCTAGCCCTGGCAGCAGCCTGAGACTGGAAGAGGAAGCCGGAACACCTAGCGAGAGCTGGCTGCTGTACTCTCACCCCACCAGCAGAAAGCAGAGAGTGGACCTGGGCATCTACCTGAATCAGACCCCTCTGGAAGCCGCCTGTTGGAGCAGACCTTGGATTCTGCACTGTGGCCCTTGCGGCTACTCTGATCTGGCCGCTCTGGAAGAAGAGGGCCTGTTCGGCTGCCTGTTTGAGTGCGGCACAAAGCAAGAGTGCGAGCAGATCGCCTTCCGGCTGTTCACCCACAGAGAGATCCTGAGCCATCTGCAGGGCGACTGCACAAGCCCAGGCAGAAATCCCAGCCAGTTCAAGAGCAAC
SEQ ID NO：26：
ATGGGCGTGCCCAGAACACCCAGCAGAACCGTGCTGTTCGAGAGAGAGAGGACCGGCCTGACCTACAGAGTGCCTTCTCTGCTGCCTGTGCCTCCTGGACCTACACTGCTGGCCTTCGTGGAACAGAGACTGAGCCCCGATGATTCTCACGCCCACAGACTGGTGCTGAGAAGAGGAACACTGGCTGGCGGCTCTGTTAGATGGGGAGCACTGCATGTGCTGGGCACAGCTGCTCTTGCCGAGCACAGATCCATGAATCCCTGTCCTGTGCACGACGCCGGAACCGGCACAGTGTTTCTGTTCTTTATCGCCGTGCTGGGCCACACACCTGAGGCCGTTCAAATTGCCACCGGCAGAAATGCCGCCAGACTGTGTTGTGTGGCCTCCAGAGATGCCGGCCTGTCTTGGGGATCTGCCAGAGATCTGACCGAGGAAGCCATTGGCGGAGCCGTTCAGGATTGGGCCACATTTGCTGTTGGACCTGGACACGGCGTGCAGCTGCCAAGTGGTAGACTGCTGGTGCCTGCCTACACATACAGAGTGGATCGGAGAGAGTGCTTCGGAAAGATCTGCCGGACAAGCCCTCACAGCTTCGCCTTCTACTCCGACGATCACGGCCGGACTTGGAGATGTGGTGGCCTGGTGCCTAATCTGAGAAGCGGCGAATGTCAACTGGCCGCCGTTGATGGTGGACAGGCTGGCAGCTTCCTGTACTGCAACGCCAGATCTCCTCTGGGCTCTAGAGTGCAGGCCCTGTCTACCGATGAGGGCACCAGTTTTCTGCCCGCCGAAAGAGTTGCCTCTCTGCCTGAAACAGCCTGGGGCTGTCAGGGCTCTATCGTGGGATTTCCTGCTCCTGCTCCAAACAGACCCCGGGACGATTCTTGGAGTGTCGGCCCTGGATCTCCACTGCAGCCTCCATTGCTTGGACCAGGCGTTCACGAGCCACCTGAAGAGGCTGCCGTTGATCCTAGAGGCGGACAAGTTCCTGGCGGCCCTTTTAGCAGACTGCAGCCAAGAGGCGACGGCCCTAGACAACCTGGACCAAGACCTGGCGTCAGCGGAGATGTTGGCTCTTGGACACTGGCCCTGCCTATGCCTTTTGCCGCTCCTCCTCAGTCTCCTACCTGGCTGCTGTACTCTCACCCTGTTGGCAGACGGGCCAGACTGCACATGGGCATCAGACTGTCTCAGAGCCCTCTGGACCCCAGAAGCTGGACAGAGCCTTGGGTCATCTATGAGGGCCCTAGCGGCTACAGCGATCTGGCCTCTATTGGCCCAGCTCCTGAAGGCGGACTGGTGTTCGCTTGTCTGTATGAGAGCGGCGCCAGAACCAGCTACGACGAGATCAGCTTCTGCACCTTCAGCCTGCGCGAGGTGCTGGAAAATGTGCCCGCCTCTCCTAAGCCTCCTAACCTGGGCGATAAGCCTAGAGGCTGTTGCTGGCCATCT
SEQ ID NO：27：
MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKA
SEQ ID NO：28：
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC
SEQ ID NO：29：
YGTL
SEQ ID NO：30：
MTVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN
SEQ ID NO：31：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：32：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：33：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：34：
ATGAGACCTGCGGACCTGCCCCCGCGCCCCATGGAAGAATCCCCGGCGTCCAGCTCTGCCCCGACAGAGACGGAGGAGCCGGGGTCCAGTGCAGAGGTCATGGAAGAAGTGACAACATGCTCCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAGGAAGATGACAGAGGGATTACCTACCGGATCCCAGCCCTGCTCTACATACCCCCCACCCACACCTTCCTGGCCTTTGCAGAGAAGCGTTCTACGAGGAGAGATGAGGATGCTCTCCACCTGGTGCTGAGGCGAGGGTTGAGGATTGGGCAGTTGGTACAGTGGGGGCCCCTGAAGCCACTGATGGAAGCCACACTACCGGGGCATCGGACCATGAACCCCTGTCCTGTATGGGAGCAGAAGAGTGGTTGTGTGTTCCTGTTCTTCATCTGTGTGCGGGGCCATGTCACAGAGCGTCAACAGATTGTGTCAGGCAGGAATGCTGCCCGCCTTTGCTTCATCTACAGTCAGGATGCTGGATGTTCATGGAGTGAGGTGAGGGACTTGACTGAGGAGGTCATTGGCTCAGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTGGGCCCAGGTCATGGCATCCAGCTGCAGTCAGGGAGACTGGTCATCCCTGCGTATACCTACTACATCCCTTCCTGGTTCTTTTGCTTCCAGCTACCATGTAAAACCAGGCCTCATTCTCTGATGATCTACAGTGATGACCTAGGGGTCACATGGCACCATGGTAGACTCATTAGGCCCATGGTTACAGTAGAATGTGAAGTGGCAGAGGTGACTGGGAGGGCTGGCCACCCTGTGCTATATTGCAGTGCCCGGACACCAAACAGGTGCCGGGCAGAGGCGCTCAGCACTGACCATGGTGAAGGCTTTCAGAGACTGGCCCTGAGTCGACAGCTCTGTGAGCCCCCACATGGTTGCCAAGGGAGTGTGGTAAGTTTCCGGCCCCTGGAGATCCCACATAGGTGCCAGGACTCTAGCAGCAAAGATGCACCCACCATTCAGCAGAGCTCTCCAGGCAGTTCACTGAGGCTGGAGGAGGAAGCTGGAACACCGTCAGAATCATGGCTCTTGTACTCACACCCAACCAGTAGGAAACAGAGGGTTGACCTAGGTATCTATCTCAACCAGACCCCCTTGGAGGCTGCCTGCTGGTCCCGCCCCTGGATCTTGCACTGTGGGCCCTGTGGCTACTCTGATCTGGCTGCTCTGGAGGAGGAGGGCTTGTTTGGGTGTTTGTTTGAATGTGGGACCAAGCAAGAGTGTGAGCAGATTGCCTTCCGCCTGTTTACACACCGGGAGATCCTGAGTCACCTGCAGGGGGACTGCACCAGCCCTGGTAGGAACCCAAGCCAATTCAAAAGCAAT
SEQ ID NO：35：
ATGATGAGCTCTGCAGCCTTCCCAAGGTGGCTGAGCATGGGGGTCCCTCGTACCCCTTCACGGACAGTGCTCTTCGAGCGGGAGAGGACGGGCCTGACCTACCGCGTGCCCTCGCTGCTCCCCGTGCCCCCCGGGCCCACCCTGCTGGCCTTTGTGGAGCAGCGGCTCAGCCCTGACGACTCCCACGCCCACCGCCTGGTGCTGAGGAGGGGCACGCTGGCCGGGGGCTCCGTGCGGTGGGGTGCCCTGCACGTGCTGGGGACAGCAGCCCTGGCGGAGCACCGGTCCATGAACCCCTGCCCTGTGCACGATGCTGGCACGGGCACCGTCTTCCTCTTCTTCATCGCGGTGCTGGGCCACACGCCTGAGGCCGTGCAGATCGCCACGGGAAGGAACGCCGCGCGCCTCTGCTGTGTGGCCAGCCGTGACGCCGGCCTCTCGTGGGGCAGCGCCCGGGACCTCACCGAGGAGGCCATCGGTGGTGCCGTGCAGGACTGGGCCACATTCGCTGTGGGTCCCGGCCACGGTGTGCAGCTGCCCTCAGGCCGCCTGCTGGTACCCGCCTACACCTACCGCGTGGACCGCCGAGAGTGTTTTGGCAAGATCTGCCGGACCAGCCCTCACTCCTTCGCCTTCTACAGCGATGACCACGGCCGCACCTGGCGCTGTGGAGGCCTCGTGCCCAACCTGCGCTCAGGCGAGTGCCAGCTGGCAGCGGTGGACGGTGGGCAGGCCGGCAGCTTCCTCTACTGCAATGCCCGGAGCCCACTGGGCAGCCGTGTGCAGGCGCTCAGCACTGACGAGGGCACCTCCTTCCTGCCCGCAGAGCGCGTGGCTTCCCTGCCCGAGACTGCCTGGGGCTGCCAGGGCAGCATCGTGGGCTTCCCAGCCCCCGCCCCCAACAGGCCACGGGATGACAGTTGGTCAGTGGGCCCCGGGAGTCCCCTCCAGCCTCCACTCCTCGGTCCTGGAGTCCACGAACCCCCAGAGGAGGCTGCTGTAGACCCCCGTGGAGGCCAGGTGCCTGGTGGGCCCTTCAGCCGTCTGCAGCCTCGGGGGGATGGCCCCAGGCAGCCTGGCCCCAGGCCTGGGGTCAGTGGGGATGTGGGGTCCTGGACCCTGGCACTCCCCATGCCCTTTGCTGCCCCGCCCCAGAGCCCCACGTGGCTGCTGTACTCCCACCCAGTGGGGCGCAGGGCTCGGCTACACATGGGTATCCGCCTGAGCCAGTCCCCGCTGGACCCGCGCAGCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTACGAGGGCCCCAGCGGCTACTCCGACCTGGCGTCCATCGGGCCGGCCCCTGAGGGGGGCCTGGTTTTTGCCTGCCTGTACGAGAGCGGGGCCAGGACCTCCTATGATGAGATTTCCTTTTGTACATTCTCCCTGCGTGAGGTCCTGGAGAACGTGCCCGCCAGCCCCAAACCGCCCAACCTTGGGGACAAGCCTCGGGGGTGCTGCTGGCCCTCC
SEQ ID NO：36：
MRFKNVKKTALMLAMFGMATSSNAALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDVIFRGPDRIPSIVASSVTPGVVTAFAEKRVGGGDPGALSNTNDIITRTSRDGGITWDTELNLTEQINVSDEFDFSDPRPIYDPSSNTVLVSYARWPTDAAQNGDRIKPWMPNGIFYSVYDVASGNWQAPIDVTDQVKERSFQIAGWGGSELYRRNTSLNSQQDWQSNAKIRIVDGAANQIQVADGSRKYVVTLSIDESGGLVANLNGVSAPIILQSEHAKVHSFHDYELQYSALNHTTTLFVDGQQITTWAGEVSQENNIQFGNADAQIDGRLHVQKIVLTQQGHNLVEFDAFYLAQQTPEVEKDLEKLGWTKIKTGNTMSLYGNASVNPGPGHGITLTRQQNISGSQNGRLIYPAIVLDRFFLNVMSIYSDDGGSNWQTGSTLPIPFRWKSSSILETLEPSEADMVELQNGDLLLTARLDFNQIVNGVNYSPRQQFLSKDGGITWSLLEANNANVFSNISTGTVDASITRFEQSDGSHFLLFTNPQGNPAGTNGRQNLGLWFSFDEGVTWKGPIQLVNGASAYSDIYQLDSENAIVIVETDNSNMRILRMPITLLKQKLTLSQN
SEQ ID NO：37：
TTGTCAATCAAGATGACTTCACAACGAAGAAGAGCATCGATTCACAAGGAAACAGATTCTAATATAAAGGGAGTAGATATGCGTTTCAAAAACGTAAAGAAAACCGCTTTAATGCTTGCAATGTTCGGTATGGCGACAAGCTCAAACGCCGCACTTTTTGACTATAACGCAACGGGTGACACTGAGTTTGACAGTCCAGCCAAACAGGGATGGATGCAAGACAACACGAATAATGGCAGCGGCGTTTTAACCAATGCAGATGGAATGCCCGCTTGGTTGGTGCAAGGTATTGGAGGGAGAGCTCAATGGACATATTCTCTCTCTACTAATCAACATGCCCAAGCATCAAGTTTCGGTTGGCGAATGACGACAGAAATGAAAGTGCTCAGTGGTGGAATGATCACAAACTACTACGCCAACGGCACTCAGCGTGTCTTACCCATCATTTCATTAGATAGCAGTGGTAACTTAGTTGTTGAGTTTGAAGGGCAAACTGGACGCACCGTTTTGGCAACCGGCACAGCAGCAACGGAATATCATAAATTTGAATTGGTATTCCTTCCTGGAAGTAACCCATCCGCTAGCTTTTACTTCGATGGCAAACTCATTCGTGACAACATCCAGCCGACTGCATCAAAACAAAATATGATCGTATGGGGGAATGGCTCATCAAATACGGATGGTGTCGCCGCTTATCGTGATATTAAGTTTGAAATTCAAGGCGACGTCATCTTCAGAGGCCCAGACCGTATACCGTCCATTGTAGCAAGTAGCGTAACACCAGGGGTGGTAACCGCATTTGCAGAGAAACGTGTGGGGGGAGGAGATCCCGGTGCTCTGAGTAATACCAATGACATAATCACTCGTACCTCACGAGATGGCGGTATAACTTGGGATACCGAGCTCAACCTCACTGAGCAAATCAATGTCAGTGATGAGTTTGATTTCTCCGATCCTCGGCCTATCTATGATCCTTCCTCCAATACGGTTCTTGTCTCTTATGCTCGATGGCCGACCGATGCCGCTCAAAACGGAGATCGAATAAAACCATGGATGCCAAACGGTATTTTTTACAGCGTCTATGATGTTGCATCAGGGAACTGGCAAGCGCCTATCGATGTTACCGATCAGGTGAAAGAACGCAGTTTCCAAATCGCTGGTTGGGGTGGTTCAGAGCTGTATCGCCGAAATACCAGCCTAAATAGCCAGCAAGACTGGCAATCAAACGCTAAGATCCGAATTGTTGATGGTGCAGCGAACCAGATACAAGTTGCCGATGGTAGCCGAAAATATGTTGTCACACTGAGTATTGATGAATCAGGTGGTCTAGTCGCTAATCTAAACGGTGTTAGTGCTCCGATTATCCTGCAATCTGAACACGCAAAGGTACACTCTTTCCATGACTACGAACTTCAATATTCGGCGTTAAACCACACCACAACGTTATTCGTGGATGGTCAGCAAATCACAACTTGGGCTGGCGAAGTATCGCAGGAGAACAACATTCAGTTTGGTAATGCGGATGCCCAAATTGACGGCAGACTGCATGTGCAAAAAATTGTTCTCACACAGCAAGGCCATAACCTCGTGGAGTTTGATGCTTTCTATTTAGCACAGCAAACCCCTGAAGTAGAGAAAGACCTTGAAAAGCTTGGTTGGACAAAAATTAAAACGGGCAACACCATGAGTTTGTATGGAAATGCCAGTGTCAACCCAGGACCGGGTCATGGCATCACCCTTACTCGACAACAAAATATCAGTGGCAGCCAAAACGGCCGCTTGATCTACCCAGCGATTGTGCTTGATCGTTTCTTCTTGAACGTCATGTCTATTTACAGTGATGATGGCGGTTCAAACTGGCAAACCGGTTCAACACTCCCTATCCCCTTTCGCTGGAAGAGTTCGAGTATCCTAGAAACTCTCGAACCTAGTGAAGCTGATATGGTTGAACTCCAAAACGGTGATCTACTCCTTACTGCACGCCTTGATTTTAACCAAATCGTTAATGGTGTGAACTATAGCCCACGCCAGCAATTTTTGAGTAAAGATGGTGGAATCACGTGGAGCCTACTTGAGGCTAACAACGCTAACGTCTTTAGCAATATCAGTACTGGTACCGTTGATGCTTCTATTACTCGGTTCGAGCAAAGTGACGGTAGCCATTTCTTACTCTTTACTAACCCACAAGGAAACCCTGCGGGGACAAATGGCAGGCAAAATCTAGGCTTATGGTTTAGCTTCGATGAAGGGGTGACATGGAAAGGACCAATTCAACTTGTTAATGGTGCATCGGCATATTCTGATATTTATCAATTGGATTCGGAAAATGCGATTGTCATTGTTGAAACGGATAATTCAAATATGCGAATTCTTCGTATGCCTATCACATTGCTAAAACAGAAGCTGACCTTATCGCAAAACTAA
SEQ ID NO：38：
MVGADPTRPRGPLSYWAGRRGQGLAAIFLLLVSAAESEARAEDDFSLVQPLVTMEQLLWVSGKQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKKSASDEGAKFIAMRRSTDQGSTWSSTAFIVDDGEASDGLNLGAVVNDVDTGIVFLIYTLCAHKVNCQVASTMLVWSKDDGISWSPPRNLSVDIGTEMFAPGPGSGIQKQREPGKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWHYGTGVSGIPFGQPKHDHDFNPDECQPYELPDGSVIINARNQNNYHCRCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGALATSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWLKERVQVWPGPSGYSSLTALENSTDGKKQPPQLFVLYEKGLNRYTESISMVKISVYGTL
SEQ ID NO：39：
MTVQPSPWFSDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO：40：
MEEVPPYSLSSTLFQQEEQSGVTYRIPALLYLPPTHTFLAFAEKRTSVRDEDAACLVLRRGLMKGRSVQWGPQRLLMEATLPGHRTMNPCPVWEKNTGRVYLFFICVRGHVTERCQIVWGKNAARLCFLCSEDAGCSWGEVKDLTEEVIGSEVKRWATFAVGPGHGIQLHSGRLIIPAYAYYVSRWFLCFACSVKPHSLMIYSDDFGVTWHHGKFIEPQVTGECQVAEVAGTAGNPVLYCSARTPSRFRAEAFSTDSGGCFQKPTLNPQLHEPRTGCQGSVVSFRPLKMPNTYQDSIGKGAPATQKCPLLDSPLEVEKGAETPSATWLLYSHPTSKRKRINLGIYYNRNPLEVNCWSRPWILNRGPSGYSDLAVVEEQDLVACLFECGEKNEYERIDFCLFSDHEVLSCEDCTSPSSD
SEQ ID NO：41：
METAGAPFCFHVDSLVPCSYWKVMGPTRVPRRTVLFQRERTGLTYRVPALLCVPPRPTLLAFAEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLTRGSVRWGTLSVLETAVLEEHRSMNPCPVLDEHSGTIFLFFIAVLGHTPEAVQIATGKNAARLCCVTSCDAGLTWGSVRDLTEEAIGAALQDWATFAVGPGHGVQLRSGRLLVPAYTYHVDRRECFGKICWTSPHSLAFYSDDHGISWHCGGLVPNLRSGECQLAAVDGDFLYCNARSPLGNRVQALSADEGTSFLPGELVPTLAETARGCQGSIVGFLAPPSIEPQDDRWTGSPRNTPHSPCFNLRVQESSGEGARGLLERWMPRLPLCYPQSRSPENHGLEPGSDGDKTSWTPECPMSSDSMLQSPTWLLYSHPAGRRARLHMGIYLSRSPLDPHSWTEPWVIYEGPSGYSDLAFLGPMPGASLVFACLFESGTRTSYEDISFCLFSLADVLENVPTGLEMLSLRDKAQGHCWPS
SEQ ID NO：42：
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SEQ ID NO：43：
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SEQ ID NO：44：
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SEQ ID NO：45：
GGACAGTGTGCATCACGGAGCTTGTGGCCCAGACTGTGCCTGGCAGACCCAGAGGACCTAAGGCTTGGCTCTAGTGGTGGTCAGCACAGCCCTCGGTGGTCTGCGGAGCCTGATATTGCTTTACGTAAGGGCTGTTCTGCTGTGCATCTCCTGTGTCTGAAGCTATTCGCCATGGAGACTGCTGGAGCTCCCTTCTGCTTCCATGTGGACTCCCTGGTACCTTGCTCCTACTGGAAGGTTATGGGGCCCACGCGTGTTCCCAGGAGAACGGTGCTCTTCCAGAGGGAAAGGACGGGCCTGACCTACCGTGTGCCTGCGTTACTCTGTGTGCCTCCCAGGCCTACTCTGCTGGCCTTCGCGGAACAGCGACTTAGCCCTGATGACTCCCATGCCCACCGCCTGGTGCTACGGAGGGGCACGCTGACCAGGGGCTCAGTGCGGTGGGGCACTCTGAGTGTACTGGAGACTGCAGTACTGGAGGAGCACAGGTCTATGAACCCTTGCCCGGTGCTGGATGAGCACTCTGGTACCATCTTCCTCTTCTTCATTGCCGTGCTGGGCCACACACCGGAGGCCGTGCAAATCGCCACTGGCAAGAACGCTGCTCGCCTCTGCTGTGTGACCAGCTGTGACGCTGGCCTCACCTGGGGCAGTGTTCGAGATCTCACTGAGGAAGCCATTGGTGCTGCATTGCAGGACTGGGCCACCTTTGCTGTGGGTCCGGGCCATGGAGTTCAGCTGCGCTCGGGTCGCCTGCTTGTTCCTGCTTACACCTATCATGTGGACCGACGGGAATGTTTTGGCAAGATCTGCTGGACCAGTCCCCACTCCTTGGCATTCTACAGTGATGATCATGGGATCTCCTGGCATTGTGGAGGCCTTGTGCCCAACCTACGCTCTGGAGAGTGCCAACTGGCTGCGGTAGATGGAGACTTTCTCTACTGTAATGCTCGAAGCCCTCTGGGTAACCGTGTGCAGGCACTGAGTGCTGATGAAGGCACGTCCTTCCTACCAGGGGAGCTGGTGCCTACATTGGCAGAGACGGCTCGTGGTTGCCAGGGTAGCATTGTGGGCTTCCTAGCTCCACCCTCAATCGAGCCTCAGGATGACCGGTGGACAGGGAGTCCTAGGAACACCCCACATTCCCCATGCTTCAATCTCAGAGTACAGGAGTCTTCGGGGGAAGGTGCCAGAGGTCTTCTTGAACGTTGGATGCCCAGGTTGCCTCTCTGCTACCCACAGTCCCGGAGCCCAGAGAATCATGGCCTAGAGCCTGGGTCAGATGGAGATAAGACATCCTGGACTCCGGAATGTCCTATGTCCTCTGATTCCATGCTTCAGAGCCCCACATGGCTACTATATTCCCACCCAGCAGGGCGTAGAGCTCGGCTCCACATGGGAATCTACCTGAGCCGATCCCCCTTGGATCCCCACAGCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTATGAGGGCCCCAGTGGCTACTCTGACCTTGCCTTTCTTGGGCCTATGCCTGGGGCATCCCTGGTTTTTGCCTGTCTGTTTGAGAGCGGGACCAGGACTTCCTATGAAGACATTTCTTTTTGCTTGTTCTCACTGGCGGATGTCCTGGAGAATGTGCCCACTGGCTTAGAGATGCTAAGTCTCAGGGATAAGGCTCAGGGGCATTGCTGGCCCTCTTGATGGCCTCACCCTCTCGTAGCCGCCTGGAGAGGAAGGGTAGACTATATAGAGGAGGTTAGGGGTAGGTCAGCATGATGCTAGGATGGAGAGAGCTCTGTCCCCTCGTGGATGGTGGTGGTGACTCACCCGGGGGGCCAGCTGCTTTCTGAGTGCAAATGAGAAAAATAAAGAGCTGCGCTGTGACTTTTCTTTCCACATCAAAGCTTGGGTGTCAGTGCTTTAGCTTGATGCTCTGATCACCATGCAAATCTTCCACCGGCGCCTTGCTCAGCTTTCATATCCCAAGGGTGCCTGGGAGGAAGGCAACAGGGACAGTGGACATCACTGCACCACTTTCCACGACCCTGTGTGCCAACCTCAGCCACTTTGAAACATGCTGATGACTGAGGTCTGTTCACTTTCTTAATTTCAAGCAGGAGAAGCAGGTTGGGGAGCCAGCCTCCCCAGCTAGAGGGGACAGAACTTGACTTGAGCAGGGGGGTACCTCCTAGGACCTGCTCCATGTGCCTACTTCTTTACCCTTCTCTAGAGAGGGCTCTTGTCCTGTCAGAGCTGTTTTCTCCCTTCTCTTGTTTTTTCTTTTTCAAGACTGTTTCTCTGTGTTAGCCCTGGCTGTCCTGGATCTCACTCTGTAGATCAGGCTGACCTTGAGTTCAAAGCTCCATCTGCCTCTACTTCTCACATTACTGTGATTAAAGGCATATACTACCACTGCCTGGTGCCCTTTTGTATTTCTTATTAAAGTCCTAATGTCTGATTATAAAAACAGTCTGTGTGGGCTGGAGTGATGGCTTACTCAGTAAAGCACTTGCCATGGAATCTGGGCAATCTGAGTTTCATTTTTAGCATCCTGTAAAAATCCCAATTTGATGGTGTACTTGTAATGTCAGCATGGAGAGGCAGAGATAGGTAAGTTCCCCAAGACTCTTTGAACCGACAGCTTGGCCTCACTGGCACATTCCAGGTCTCAGTGAGAGACCCTGCCTCAAAATACAAAGAAAGAGCTGCTGAAGAGTGGGTCAGAGTTGACCTCTGATCTCCGGAAGTATATGATACACACCCGTGCATGCACTCTTCCTTACAAAATAAAAAGCAAAACAAAACCCCAACAGGTATATGGCCATTTTAGAAAAATTAGAAGATTTAGAAAGCTATACATAAAAAAAAATGACCTAAAGAAAAATCTTTACTGTTCTGGGCACTATCCCTATCAAACCACTGTGTTCTTTGGCCAAGCCTTGGGGTGGACACTGTTTTGAGGTGGGTCCTGTTATCTCCACTAGGTAGTGGAGTTTTGTGTCAGACTAACTGGGTCTTAAAGCTGTCTTTAAGGCCATCAGGAGCTACTGACTTGCCTGCCTCAGCAGAGCATATCCTGAAGGTCGGGGTTAAGTCTCCTTCCCGAGCGAGTTGCCTTCCAGTGGGCCCCTGGACTCCTAGGTCCTCAGCGCTCATCAGCTGCCAAGGACTCTGAGGGAATGTCCTCTGACTGTGGCCCCGAAAGGTAGGGGAGGGGGATGTGCTTAGGCTTAGGACAGGGTCCTGTTTCAGTCTGCCTTCACTGTTAGTAGCACTGTGCCACATGGCACAGACTGGGCGAGCTTTAAAGGAAGGAGGTTGATATTGGTTCCCACTTCTGGGGATCATGGTTGAGCAGCCTTGTCTGATGATGGTTGTCTTGATGGTAGATCGTGAGGTAGTTGATGAAGGTATGACATGGTGAGAAACTCTGTGTGTGTGTGTTATTTTCTCTGTGTTCTACCTATACATCTATCTATGTATATATGTATCTATCTATCTACCTGGAGGCTGGAGAGATAGCTTAGTGGTTAAGAACATTTGTTGTTCTTGCATAGTCCTGGATTTAAATTTTCAGCACCCACATGGCAGCTCACAACAACCCATAAATCCAGTTTCAGAGGATCCAACCTCTGATATACCATGTCAGCCAGAGCAGACACGGCTGAAGGTGGTTTGATCCCCGTATGGAGAGGTGACAATTGGGAAGAGAGAAAGATCAACTTAACCATGCAAGGAACAGGAAGTTAAATACTGAACAGGGAAGGTAAAGGCAGGAAGTAGATGTAGAGGGCAAATCAATGAAACCCAAACATACCCAAATTACGCTAAACACACACTGACATGCCAATTAAAAGGACAAATTGGCTCCACTGGCAAAACCAAAACAGACACTGAAGATCCAAACAGTCACATGCCAACTACCGCGGAGGGAGACAGACACAGAGAAGACCGTGACAGACACTTGGACACTCTTGAGAGTGGATGTGCAGGAAGAGAGCTCTGCCAGTGGAGAAGAAAGCACTCAGAAGAAAGTGACAGCAGCTGTAAATTTGTATTCTGCTAATGTTATGTTCCAAAGTTGAAAGCAAAATTGTACCAATTCATAAGAACAAACAGGCTGACTCTCAGTTGTGACTGAACGTCTCTCAGTAACTGACGGGGCGAGCAGGCCAAAGGAGAGTCGGCTCAGAAGGGTGCATAGCCACGCCAAATCAAATAAGCAAGTACAACCGGCAGGCTCTATTTCTAGCACAAAGGGGTCTGTGCCTCATTCTGTGCTTGGGTCAGAGCTTGGGTCTCTCATTTGGATGTAAGTGGTGTAGTGGAGAAGCAGGAAATAATCCGGAGCGCATATTTTGATTTTAACATAAGTGCTGATTTGGGAGGGAGTTTTGTCAAATTGTGTTTTTACAATGTTTTTTTTTTTTTAAATGATGCTTTTTTGTAAAGTGTACAAATGTGATATAAGATTGGTTCTGCTACATTCAGTTTCTATAAAAGTGGTTCTAAAATATTGTACTGTCAATCATCTCATGATTATTCTACTGTACACATTACTGACTTTGTATGTAATAATTAATATTAGAAGAAAATATAATTTATTTGAATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：46：
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SEQ ID NO：47：
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SEQ ID NO：48：
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SEQ ID NO：49：
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SEQ ID NO：50：
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SEQ ID NO：53：
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SEQ ID NO：54：
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SEQ ID NO：55：
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SEQ ID NO：56：
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SEQ ID NO：57：
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SEQ ID NO：58：
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SEQ ID NO：59：
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SEQ ID NO：60：
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SEQ ID NO：61：
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SEQ ID NO：62：
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SEQ ID NO：63：
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SEQ ID NO：64：
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SEQ ID NO：65：
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SEQ ID NO：66：
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SEQ ID NO：67：
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SEQ ID NO：68：
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SEQ ID NO：69：
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SEQ ID NO：70：
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SEQ ID NO：71：
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SEQ ID NO：72：
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SEQ ID NO：73：
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SEQ ID NO：74：
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SEQ ID NO：75：
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SEQ ID NO：76：
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SEQ ID NO：77：
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SEQ ID NO：78：
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SEQ ID NO：81：
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SEQ ID NO：82：
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SEQ ID NO：83：
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDANTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：84：
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX1 1FX12MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：85：
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX1 0THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：86：
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACGTGAACACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACTCCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTAGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATAAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO：87：
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTCGCCAGAATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTTCTAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCtagcACCAAGGGCCCATCcGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCcTGGAACTCAGGCGCtCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：88：
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SEQ ID NO：89：
GATGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCGGCACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGAACAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCGCTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAA
SEQ ID NO：90：
TVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYNGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：91：
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAACggcggaggtggaagtggcggaggcggatccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcactagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO：92：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN
SEQ ID NO：93：
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtccgacaggcccctggcaaaggacttgaatgggtcgccagaatctaccccaccaacggctacaccagatacgccgactctgtgaagggcagattcaccatcagcgccgacaccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccgtgtactactgttctagatggggaggcgacggcttctacgccatggattattggggccagggcaccctggtcaccgtttcttctgctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcctggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggtggcggaggatctggcggaggtggaagcggcggaggcggatctacagtggaaaagtccgtggtgttcaaggccgagggcgagcacttcaccgaccagaaaggcaataccatcgtcggctctggcagcggcggcaccaccaagtactttagaatccccgccatgtgcaccaccagcaagggcaccattgtggtgttcgccgacgccagacacaacaccgccagcgatcagagcttcatcgataccgctgccgccagaagtacagacggcggcaagacctggaacaagaagatcgccatctacaacgaccgcgtgaacagcaagctgagcagagtgatggaccctacctgcatcgtggccaacatccagggcagagaaaccatcctggtcatggtcggaaagtggaacaacaacgataagacctggggcgcctacagagacaaggcccctgataccgattgggacctcgtgctgtataagagcaccgacgacggcgtgaccttcagcaaggtggaaacaaacatccacgacatcgtgaccaagaacggcaccatctctgccatgctcggcggcgttggatctggcctgcaactgaatgatggcaagctggtgttccccgtgcagatggtccgaacaaagaacatcaccaccgtgctgaataccagcttcatctactccaccgacggcatcacatggtccctgcctagcggctactgtgaaggctttggcagcgagaacaacatcatcgagttcaacgccagcctggtcaacaacatccggaacagcggcctgcggagaagcttcgagacaaaggacttcggaaagacgtggaccgagtttcctccaatggacaagaaggtggacaaccggaaccacggcgtgcagggcagcacaatcacaatccctagcggcaacaaactggtggccgctcactctagcgcccagaacaagaacaacgattacaccagaagcgacatcagcctgtacgcccacaacctgtactccggcgaagtgaagctgatcgacgacttctaccccaaagtgggcaatgccagcggagccggctacagctgtctgagctaccggaaaaatgtggacaaagaaaccctgtacgtggtgtacgaggccaacggcagcatcgagtttcaggacctgagcagacatctgcccgtgatcaagagctacaat
SEQ ID NO：94：
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SEQ ID NO：95：
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SEQ ID NO：96：
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SEQ ID NO：97：
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SEQ ID NO：98：
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SEQ ID NO：99：
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SEQ ID NO：100：
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SEQ ID NO：101：
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SEQ ID NO：102：
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SEQ ID NO：103：
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SEQ ID NO：104：
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SEQ ID NO：105：
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SEQ ID NO：106：
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GGGGSGGGGS
SEQ ID NO：108：
EPKSS
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EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
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SEQ ID NO：113：
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SEQ ID NO：117：
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SEQ ID NO：118：
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SEQ ID NO：119：
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SEQ ID NO：137：
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SEQ ID NO：146：
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SEQ ID NO：153：
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：154：
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SEQ ID NO：155：
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
Claims (81)
1.一种融合蛋白，其包含：
(a)唾液酸酶；和
(b)抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是人唾液酸酶。
3.权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是重组突变人唾液酸酶。
4.权利要求3所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；
(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；
(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；
(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；
(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；
(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；
(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；
(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；
(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；
(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；
(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；
(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；
(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；
(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；
(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；
(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；
(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；
(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；
(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；
(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；
(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；
(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；
(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；
(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；
(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；
(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；
(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；
(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；
(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；
(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；
(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；
(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；
(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；
(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或
(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；
或任何上述替换的组合。
5.权利要求3或4所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；
(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；
(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；
(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；
(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；
(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；
(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；
(i)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(j)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；
(k)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；
(l)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；
(m)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；
(n)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(o)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；
(p)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；
(q)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；
(r)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；
(s)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；
(t)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；
(u)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(v)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；
(w)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(x)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(y)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或
(z)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；
或任何上述替换的组合。
6.权利要求4或5所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含K9、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的替换或任何上述替换的组合。
7.权利要求4-6任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含K9、P62、A93、Q270、S301、W302、V363或L365的替换或任何上述替换的组合。
8.权利要求4-7中的任一项所述的融合蛋白，其中在所述唾液酸酶中：
(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸替换(P5H)；
(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸替换(K9D)；
(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)替换；
(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)替换；
(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸替换(L54M)；
(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)替换；
(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q69H)；
(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸替换(R78K)；
(i)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸替换(D80P)；
(j)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)替换；
(k)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸替换(G107D)；
(l)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q108H)；
(m)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)替换；
(n)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸替换(C125L)；
(o)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)替换；
(p)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸替换(A150V)；
(q)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸替换(C164G)；
(r)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R170P)；
(s)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸替换(A171G)；
(t)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸替换(Q188P)；
(u)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R189P)；
(v)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；
(w)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)替换；
(x)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸替换(T249A)；
(y)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸替换(D251G)；
(z)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E225P)；
(aa)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸替换(H239P)；
(bb)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；
(cc)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；
(dd)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；
(ee)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I)或脯氨酸(V244P)替换；
(ff)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E257P)；
(gg)对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸替换(S258C)；
(hh)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；
(ii)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸替换(V265F)；
(jj)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)替换；
(kk)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸替换(W292R)；
(ll)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)替换；
(mm)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)替换；
(nn)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸替换(V363R)；或
(oo)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)替换；
或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
9.权利要求4-8中的任一项所述的融合蛋白，其中在所述唾液酸酶中：
(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸替换(P5H)；
(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸替换(K9D)；
(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)替换；
(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)替换；
(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸替换(L54M)；
(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)替换；
(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q69H)；
(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸替换(R78K)；
(i)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)替换；
(j)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸替换(G107D)；
(k)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q108H)；
(l)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)替换；
(m)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸替换(C125L)；
(n)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸替换(Q126L)；
(o)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸替换(A150V)；
(p)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸替换(C164G)；
(q)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸替换(A171G)；
(r)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)替换；
(s)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸替换(T249A)；
(t)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸替换(D251G)；
(u)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)或脯氨酸(Q270P)替换；
(v)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸替换(W292R)；
(w)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被精氨酸替换(S301R)；
(x)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被赖氨酸替换(W302K)；
(y)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸替换(V363R)；或
(z)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)替换；
或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
10.权利要求8或9所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I的替换或任何上述替换的组合。
11.权利要求8-10中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q270A、S301R、W302K、V363R和L365I替换的替换或任何上述替换的组合。
12.权利要求1-11中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；
(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的替换；
(c)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的替换；或
(d)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的替换；
或任何上述替换的组合。
13.权利要求12所述的融合蛋白，其中在所述唾液酸酶中：
(a)所述对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸替换(M1A)或被天冬氨酸替换(M1D)；
(b)所述对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸替换(V6Y)；
(c)所述对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸替换(I187K)；或
(d)所述对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸替换(C332A)；
或者所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
14.权利要求13所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换；
(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I替换；
(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A替换；
(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A替换；
(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A替换；
(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A替换；或
(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A替换。
15.权利要求13或14所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换；
(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I替换；
(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A替换；
(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；
(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；或
(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换。
16.权利要求1-15中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。
17.权利要求16所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是Neu2。
18.权利要求1-17中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。
19.权利要求18所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶可以切开α2,3、α2,6和/或α2,8连键。
20.权利要求19所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶可以切开α2,3和α2,8连键。
21.权利要求1-20中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-62、111、114、117或151中的任一者。
22.权利要求1-21中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-54中的任一者。
23.权利要求1-22中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含在表5-12或14-27中的任一者中阐述的突变。
24.权利要求1-23中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含在表1-4中的任一者中阐述的突变。
25.权利要求1-24中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。
26.权利要求25所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM Fc结构域。
27.权利要求26所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
28.权利要求27所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
29.权利要求1-28中的任一项所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域与第二抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域结合，以产生抗HER2抗原结合部位。
30.权利要求1-29中的任一项所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、CT-P6、曲妥珠单抗-dkst、MGAH22(margetuximab)、PF-05280014、厄妥索单抗、甘妥单抗、替米妥珠单抗、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201的抗体。
31.权利要求30所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于曲妥珠单抗。
32.权利要求1-31中的任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域和/或抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸连接物相连。
33.权利要求1-32中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：66-85、98-106、112、113、115、116、118、119、122-134、141、143、145、147或152-155中的任一者。
34.权利要求1-33中的任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：66-85或98-106中的任一者。
35.一种抗体偶联物，其包含权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白。
36.权利要求35所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含单个唾液酸酶。
37.权利要求35所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含两个唾液酸酶。
38.权利要求37所述的抗体偶联物，其中所述两个唾液酸酶是相同的。
39.权利要求35-38中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含单个抗HER2抗原结合部位。
40.权利要求35-38中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含两个抗HER2抗原结合部位。
41.权利要求40所述的抗体偶联物，其中所述两个抗HER2抗原结合部位是相同的。
42.权利要求35-41中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物具有约135kDa至约165kDa的分子量。
43.权利要求35-41中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
44.权利要求35-43中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起定义抗HER2抗原结合部位。
45.权利要求44所述的抗体偶联物，其中所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
46.权利要求44或45所述的抗体偶联物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：66。
47.权利要求44-46中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：67或149中的任一者。
48.权利要求44-47中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：67。
49.权利要求44-48中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第三多肽包含SEQ ID NO：68-74、98-104、112、113、115、116、118、119、141、143、145、147、152或154中的任一者。
50.权利要求44-49中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第三多肽包含SEQ ID NO：68-74或98-104中的任一者。
51.权利要求35-43中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；
(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和
(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，所述第三和第四多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起定义第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第三多肽和第四多肽一起定义第二抗HER2抗原结合部位。
52.权利要求51所述的抗体偶联物，其中所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。
53.权利要求35-43中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和
(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一scFv定义第一抗HER2抗原结合部位，并且所述第二scFv定义第二抗HER2抗原结合部位。
54.权利要求53所述的抗体偶联物，其中所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv，并且所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二scFv。
55.权利要求53或54所述的抗体偶联物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者。
56.权利要求53-55中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：77-83、122-134、153或155中的任一者。
57.权利要求53-56中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：77-83中的任一者。
58.权利要求53-57中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO：77-83中的任一者。
59.权利要求35-43中的任一项所述的抗体偶联物，其中所述抗体偶联物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起定义第一抗HER2抗原结合部位，并且所述scFv定义第二抗HER2抗原结合部位。
60.权利要求59所述的抗体偶联物，其中所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和scFv，并且所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
61.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白或权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物的至少一部分的核苷酸序列。
62.一种表达载体，其包含权利要求61所述的核酸。
63.一种宿主细胞，其包含权利要求62所述的表达载体。
64.一种药物组合物，其包含权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白或权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物。
65.一种在需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白、权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物或权利要求64所述的药物组合物。
66.权利要求65所述的方法，其中所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管和食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、不明原发癌(CUP)、结肠直肠腺癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、头颈部鳞癌、胸腺癌、非黑素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮性卵巢癌(non-EOC)、葡萄膜黑素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌症、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。
67.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
68.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
69.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是膀胱癌。
70.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是肾癌。
71.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
72.权利要求65或66所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
73.一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白、权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物或权利要求64所述的药物组合物。
74.权利要求73所述的方法，其中所述免疫细胞是T-细胞。
75.权利要求74所述的方法，其中所述T-细胞是CD4+T-细胞和/或CD8+T-细胞。
76.权利要求75所述的方法，其中所述CD8+T-细胞是CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T-细胞。
77.权利要求73所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
78.一种在需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白、权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物或权利要求64所述的药物组合物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加循环NK细胞的数目。
79.一种在需要的受试者中增加引流淋巴结中的T-细胞数目的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白、权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物或权利要求64所述的药物组合物，以便相对于给药所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物之前增加引流淋巴结中的T-细胞数目。
80.权利要求79所述的方法，其中所述T-细胞是CD4+T-细胞和/或CD8+T-细胞。
81.一种在细胞、组织或受试者中提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法，所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的权利要求1-34中的任一项所述的融合蛋白、权利要求35-59中的任一项所述的抗体偶联物或权利要求64所述的药物组合物相接触，以便相对于与所述融合蛋白、抗体偶联物或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
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