CN116940675A - 唾液酸酶-her2-抗体融合蛋白及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及重组唾液酸酶和抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域融合蛋白。本发明还提供了包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其一部分的抗体缀合物。本发明还涉及使用唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物治疗癌症的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月6日提交的美国临时专利申请号63/134411和2021年7月2日提交的美国临时专利申请号63/217998的权益和优先权，这些临时专利申请的全部公开内容通过引用并入本文出于所有目的。
技术领域
本发明总体上涉及重组唾液酸酶融合蛋白和抗体缀合物，以及它们在治疗癌症中的用途。
背景技术
越来越多的证据支持聚糖以及特别是唾液酸聚糖在肿瘤进展的各个病理生理步骤中的作用。聚糖调控肿瘤增殖、侵袭、血源性转移和血管生成(Fuster等人，(2005)NAT.REV.CANCER 5(7):526-42)。在癌症中细胞表面糖缀合物的唾液酸化经常被改变，导致唾液酸化肿瘤相关糖类抗原的表达。肿瘤细胞对唾液酸化聚糖的表达通常与肿瘤的侵袭性和转移潜力提高相关(Julien S.,Delannoy P.(2015)Sialic Acid and Cancer.In:Taniguchi N.,Endo T.,Hart G.,Seeberger P.,Wong CH.(编)GLYCOSCIENCE:BIOLOGYAND MEDICINE,Springer,Tokyo.https://doi.org/10.1007/978-4-431-54841-6_193)。
最近变得越来越明显的是，Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素)，一个结合唾液酸的凝集素家族，通过与超唾液酸化的癌细胞结合并介导来自于活化的NK细胞受体的信号的抑制，从而抑制NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀，而在癌症免疫抑制中发挥作用(Jandus等人，(2014)J.CLIN.INVEST.124:1810-1820；等人，(2014)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 111:14211-14216；Hudak等人，(2014)NAT.CHEM.BIOL.10:69-75)。同样地，通过用唾液酸酶处理来酶促去除唾液酸可以增强NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀(Jandus，同上；Hudak，同上；Xiao等人，(2016)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 113(37):10304-9)。
编码HER2的基因位于17号染色体上，并且是EGF/erbB生长因子受体基因家族的成员，该家族还包括表皮生长因子受体(EGFR或HER1)、HER3/erbB3和HER4/erbB4。所有这些基因都编码跨膜生长因子受体，其是具有生长刺激潜力的酪氨酸激酶1型受体。HER家族成员的活化通常发生在配体和同一单体的二聚体或HER家族的其他成员结合在一起时。HER2没有已知的配体。一旦已活化发生，细胞质信号蛋白的酪氨酸自磷酸化将信号传递到细胞核，从而调节细胞生长、分裂、分化和迁移的各个方面。
HER2受体的过度表达导致受体将细胞增殖的过量信号传递到细胞核(Gutierrez等人(2011)ARCH.PATHOL.LAB.MED.135(1):55–62))。数据支持这样一种假设，即对于某些癌症，HER2的过表达直接导致肿瘤细胞的发病机制和临床侵袭性，并与包括无复发率和总生存率降低在内的不良预后相关(Iqbal等人(2014)MOL.BIOL.INT.2014:852748)。抗HER2抗体包括曲妥珠单抗(其已被美国准用于治疗例如乳腺癌症和胃或胃食管交界处腺癌)和佩图珠单抗(其已被美国批准用于治疗例如乳腺癌)。
癌症免疫疗法已改善了许多癌症患者的结果。然而，尽管到目前为止已取得进展，但许多患者对目前可用的疗法没有响应或仅有部分响应。因此，对用于治疗与超唾液酸化的癌细胞相关的癌症的有效干预手段，仍存在着需求。
发明内容
本发明部分是基于以下发现，即有可能产生融合蛋白，其含有唾液酸酶和抗HER2免疫球蛋白或其一部分，例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域；和/或抗体缀合物，其包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其一部分，例如抗原结合结构域和/或免疫球球蛋白Fc结构域。该融合蛋白和/或抗体缀合物的唾液酸酶部分可以包含相对于野生型唾液酸酶的至少一种突变。该突变或突变的组合可以提高唾液酸酶的表达、活性，或表达和活性两者，从而提高唾液酸酶在癌症诊断和/或治疗中的使用。
该融合蛋白和/或抗体缀合物具有合适的底物特异性和活性从而可用于从癌症细胞(例如，表达HER2的癌症细胞)表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子以及/或者从肿瘤微环境中除去唾液酸和/或含唾液酸分子，以及/或者降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
因此，在一方面，本发明提供了一种融合蛋白，其包含以下(或基本上由以下组成)：(a)唾液酸酶；和(b)抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶是人类唾液酸酶，例如重组突变人类唾液酸酶。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基(A42)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；(j)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；(k)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；(l)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；(m)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；(n)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；(o)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；(p)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(q)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；(r)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；(s)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；(t)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；(u)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；(v)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；(w)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(x)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；(y)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；(z)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；(oo)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或(pp)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；或任何上述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、A42、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被精氨酸(A42R)或天冬氨酸(A42D)取代；(d)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；(g)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q69H)；(i)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸取代(R78K)；(j)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸取代(D80P)；(k)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸取代(G107D)；(m)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q108H)；(n)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)取代；(o)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸取代(C125L)；(p)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；(q)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸取代(A150V)；(r)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸取代(C164G)；(s)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R170P)；(t)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸取代(A171G)；(u)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸取代(Q188P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R189P)；(w)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(x)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)取代；(y)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸取代(T249A)；(z)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸取代(D251G)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E225P)；(bb)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸取代(H239P)；(cc)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(dd)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(ee)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(ff)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；(gg)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E257P)；(hh)对应于第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S258C)；(ii)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(jj)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸取代(V265F)；(kk)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；(ll)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸取代(W292R)；(mm)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；(nn)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；(oo)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或(pp)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、A42R、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I的取代或任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含：(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的取代或缺失；(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的取代；(c)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的取代；或(d)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的取代；或任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，在所述唾液酸酶中：(a)所述对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸(M1A)取代或被天冬氨酸(M1D)取代；(b)所述对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸取代(V6Y)；(c)所述对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸取代(I187K)；或(d)所述对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸取代(C332A)；或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A取代；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I取代；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A取代；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A取代；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A取代；(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；或(l)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4，例如，所述唾液酸酶是Neu2。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方案中，所述唾液酸酶可以切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。在某些实施方案中，所述唾液酸酶可以切割α2,3和α2,8键联。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含SEQ ID NO:48-54、149、154、159、191或198中的任一者或与SEQ ID NO:48-54、149、154、159、191或198中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含下文表1-11中任一个表中所阐述的突变或突变的组合。
在某些实施方案中，所述融合蛋白进一步包含免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM Fc结构域，例如所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc结构域，例如所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
在某些实施方案中，所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域与第二抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域缔合(例如，共价或非共价缔合)以产生抗HER2抗原结合位点。
在某些实施方案中，所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、CT-P6、曲妥珠单抗dkst、MGAH22(马吉妥昔单抗(margetuximab))、PF-05280014、厄妥索单抗(ertumaxomab)、甘妥单抗(gancotamab)、timigutuzumab、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201的抗体，例如抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自曲妥珠单抗。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域和/或抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸接头连接。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:66-85、98-142、150-153、155-158、160-163、166-178、185、187、189、192-197、203-210、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244或249中的任一者。
在另一方面，本发明提供了一种抗体缀合物，其包含任何上述融合蛋白。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含单个唾液酸酶。在其他实施方案中，所述抗体缀合物包含两个可以相同或不同的唾液酸酶。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含两个相同的唾液酸酶。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含单个抗HER2抗原结合位点。在其他实施方案中，所述抗体缀合物包含两个可以相同或不同的抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含两个相同的抗HER2抗原结合位点。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa的分子量，或者所述抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。所述第三多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。第一多肽可以例如包含SEQ ID NO:66，第二多肽可以例如包含SEQ ID NO:67或189中的任一者，并且/或者第三多肽可以例如包含以下中的任一者：SEQ ID NO：68-74、98-112、150、151、155、156、160、161、185、187、192、195、203-208。在某些实施方案中，第一多肽包含SEQ ID NO:66，第二多肽包含SEQ ID NO:189，并且第三多肽包含SEQ ID NO:205。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，所述第三和第四多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗HER2抗原结合位点。所述第二和第三多肽可以例如分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一scFv限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第二scFv当存在时限定了第二抗HER2抗原结合位点。所述第一多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。所述第二多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和任选的第二scFv。第一多肽可以例如包含SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者，并且/或者第二多肽可以例如包含SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽，其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述scFv限定了第二抗HER2抗原结合位点。所述第二多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和scFv。所述第三多肽可以例如以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其包含编码任何上述融合蛋白或任何上述抗体缀合物的至少一部分的核苷酸序列。另一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含任何上述核酸。另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含任何上述表达载体。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任何上述融合蛋白或任何上述抗体缀合物。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体缀合物或任何上述药物组合物。
在某些实施方案中，所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如，子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管与食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、原发灶不明的癌症(CUP)、结直肠腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、头颈鳞状细胞癌、胸腺癌、非黑色素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮细胞卵巢癌(非EOC)、葡萄膜黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。例如，在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、结肠癌和黑色素瘤。
在另一方面，本发明提供了促进免疫细胞浸润到有需要的受试者的肿瘤中的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体缀合物或任何上述药物组合物。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在另一方面，本发明提供了增加有需要的受试者中循环自然杀伤(NK)细胞数目的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体缀合物，或任何上述药物组合物，以便相对于融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物的施用之前增加循环NK细胞的数目。
在另一方面，本发明提供了增加有需要的受试者的引流淋巴结中的T细胞数目的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体缀合物，或任何上述药物组合物，以便相对于融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物的施用之前增加引流淋巴结中T细胞的数目。在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如CD4+和/或CD8+T细胞。
在另一方面，本发明提供了增加细胞、组织或受试者中的Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcdl、Lag3、Il6、Illb、Il2、Ifng、Ifna1、Mxl、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。该方法包括使细胞、组织或受试者与有效量的任何上述融合蛋白、任何上述抗体缀合物或任何上述药物组合物接触，以便相对于与融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者增加Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
本发明的这些和其他方面和特点在下面的详细描述和如权利要求书中描述。
附图说明
参考下述附图，本发明可以被更完全地理解。
图1A-1I描绘了含有唾液酸酶例如人唾液酸酶和抗HER2抗原结合位点的某些抗体缀合物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)唾液酸酶的每种抗体缀合物构建物来说，每个唾液酸酶可以相同或不同。对于含有超过一个(例如两个)抗HER2抗原结合位点的每种抗体缀合物构建物来说，每个抗HER2抗原结合位点可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体缀合物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化以含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化以含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图2描绘了含有唾液酸酶例如人唾液酸酶和抗HER2抗原结合位点的某些抗体缀合物构建物的示意图。对于含有超过一个(例如两个)抗HER2抗原结合位点的每种抗体缀合物构建物来说，每个抗HER2抗原结合位点可以相同或不同。对于含有Fc结构域的每种抗体缀合物构建物来说，应该理解所述Fc结构域可以是野生型Fc结构域，或者可以是工程化的Fc结构域。例如，所述Fc结构域可以被工程化以含有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T或两者以促进异二聚化，或者所述Fc结构域可以被工程化以含有一个或多个修饰例如点突变，以提供任何其他改变的Fc结构域功能。
图3A-3E是被称为Raptor抗体-唾液酸酶缀合物(图3A)、Janus抗体-唾液酸酶缀合物(图3B)、Lobster抗体-唾液酸酶缀合物(图3C)、Bunk抗体-唾液酸酶缀合物(图3D)和Lobster-Fab抗体唾液酸酶缀合物(图3E)的示例性融合蛋白缀合物的示意图。
图4A描绘了示出在非还原和还原条件下的重组Neu2-M259-Fc的SDS-PAGE凝胶。图4B是Neu2-M259-Fc的SEC-HPLC迹线。
图5A是示出所指示的Neu2-Fc变体的酶活性作为底物(4-MU-Neu5Ac)浓度的函数的线形图。图5B是示出所指示的Neu2-Fc变体的酶活性作为酶浓度的函数的线形图。
图6是描绘所指示的Neu2-Fc变体的热稳定性的线图。
图7是描绘在37℃下温育所指示的时间长度后所指示的Neu2-Fc变体的酶促活性的条形图。
图8是Janus曲妥珠单抗2的SEC-HPLC迹线。
图9描绘了由ForteBio Octet确定的Janus曲妥珠单抗2与HER2抗原的结合。
图10描绘了在小鼠同基因肿瘤模型中使用经工程改造为表达人HER2的EMT6小鼠乳腺癌细胞对Janus曲妥珠单抗2进行的测试，其中在用同种型对照(图10A)、1mg/kg曲妥珠单抗(图10B)、10mg/kg曲妥珠单抗(图10C)、1mg/kg Janus曲妥珠单抗2(图10D)或10mg/kgJanus曲妥珠单抗2(图10E)处理后测量肿瘤体积，其中每条线代表个体小鼠，并且在图10F中，每条线代表所指示的治疗组的平均肿瘤体积。三角形表示施用频率。在图10A-图10E中，指示了完全响应(CR)和部分响应(PR)。
图11是示出Janus曲妥珠单抗2的酶活性作为底物(4-MU-Neu5Ac)浓度的函数的线图。指示出了酶动力学(Vmax、Km和Kcat)。
图12是描绘Janus曲妥珠单抗2的热酶稳定性的线图。
图13A-13B是描绘Janus曲妥珠单抗2(“Janus”)或Janus LOF(无酶活性的变体)对SKBR-3细胞(具有高水平HER2表达的人类细胞)的去唾液酸化的线图。图13A描绘了用指示浓度的Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理17小时后Hydra 9的染色，其中染色减少指示去唾液酸化。图13B描绘了用所指示浓度的Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理17小时后PNA的染色，其中染色增加指示去唾液酸化。
图14A-14B是描绘Janus曲妥珠单抗2(“Janus”)或Janus LOF(无酶活性的变体)对HT-29细胞(具有低但可检测水平的HER2表达的人类细胞)的去唾液酸化的线图。图14A描绘了用指示浓度的Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理17小时后Hydra 9的染色，其中染色减少指示去唾液酸化。图14B描绘了用指示浓度的Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理17小时后PNA的染色，其中染色增加指示去唾液酸化。
图15A-15C是描绘在指示的效应物与靶标(E:T)比率下Janus曲妥珠单抗2(“Janus”)、Janus LOF或曲妥珠单抗对BT-20细胞(图15A)、HT-29细胞(图15B)或SKBR3细胞(图15C)介导的ADCC活性的线图。
图16A-16C是描绘如由BT-20细胞的吞噬引起的杀伤百分比(图16A)、由HT-29细胞的吞噬引起的杀伤百分比(图16B)，或由SKBR3细胞的吞噬引起的杀伤百分比(图16C)所度量的10μg/mL或30μg/mL的Janus曲妥珠单抗2(“Janus”)、Janus LOF或曲妥珠单抗介导的ADCP活性的条形图。
图17描绘了利用被工程化成表达人HER2的EMT6小鼠乳腺癌细胞在小鼠同基因肿瘤模型中对Janus曲妥珠单抗2(“Janus”)进行的测试，其中肿瘤体积是在用10mg/kg同种型对照(图17A)、5mg/kg曲妥珠单抗(图17B)、10mg/kg Janus LOF(图17C)、1mg/kg Janus曲妥珠单抗2(图17D)、3mg/kg Janus曲妥珠单抗2(图17E)，或10mg/kg Janus曲妥珠单抗2(图17F)治疗后测量的。每条线代表一只单独的小鼠，三角形代表给药。
图18A描绘了Janus曲妥珠单抗2和Janus LOF治疗组(均以10mg/kg给药)的来自图17的肿瘤体积的平均值。三角形代表给药。**，p<0.05，由单向方差分析确定。图18B描绘了Janus曲妥珠单抗2、Janus LOF和曲妥珠单抗治疗组的存活曲线。ns，不显著。
下面更详细地讨论本发明的各种不同特点和方面。
详细描述
本发明部分是基于以下发现，即有可能产生融合蛋白，其含有唾液酸酶和抗HER2免疫球蛋白或其一部分，例如抗原结合结构域和/或免疫球蛋白Fc结构域；和/或抗体缀合物，其包含唾液酸酶和抗HER2抗体或其一部分，例如抗原结合结构域和/或免疫球球蛋白Fc结构域。该融合蛋白和/或抗体缀合物的唾液酸酶部分可以包含相对于野生型唾液酸酶的至少一种突变。该突变或突变的组合可以提高唾液酸酶的表达、活性，或表达和活性两者，从而提高唾液酸酶在癌症诊断和/或治疗中的使用。
该融合蛋白和/或抗体缀合物具有合适的底物特异性和活性从而可用于从癌症细胞(例如，表达HER2的癌症细胞)表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子以及/或者从肿瘤微环境中除去唾液酸和/或含唾液酸分子，以及/或者降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
本发明还涉及使用融合蛋白和/或抗体缀合物治疗癌症的药物组合物和方法。
I.唾液酸酶抗HER2融合蛋白
为了促进在高唾液酸化的癌细胞(例如表达HER2的癌细胞)中和/或在肿瘤微环境中的唾液酸的选择性去除，使如本文所述的唾液酸酶靶向此种细胞或此种肿瘤微环境可能是有帮助的。另外，为了促进受试者中唾液酸酶去除唾液酸，延长受试者中唾液酸酶的血浆半衰期可能是有帮助的。这些可以通过将唾液酸酶包含在融合蛋白和/或抗体缀合物(例如，化学缀合的缀合物)中来实现。
因此，本发明还提供了融合蛋白，该融合蛋白包含唾液酸酶或其功能片段，以及抗HER2抗体的一部分或片段，诸如免疫球蛋白抗原结合结构域(本文中也称为抗原结合结构域或免疫球蛋白Fc结构域(文中也称为Fc结构域)。在某些实施方案中，唾液酸酶和抗HER2抗体或其部分(例如抗原结合结构域或免疫球蛋白Fc结构域)通过肽键或氨基酸接头连接。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“融合蛋白”应理解为指包含基于两个或更多个单独的蛋白质或多肽链的氨基酸序列的单个多肽链，其中该两个氨基酸序列可以直接地融合或经由间插接头序列，例如，经由间插氨基酸接头融合。编码此种融合蛋白的核苷酸序列可以例如使用常规重组DNA技术产生。
在某些实施方案中，融合蛋白包含标签，诸如Strep标签(例如Strep II标签)、His标签(例如10x His标签)、myc标签或FLAG标签。该标签可以位于融合蛋白的C末端或N末端上。
a.唾液酸酶部分
当在本文中使用时，术语“唾液酸酶”是指从底物例如糖蛋白或糖脂切下末端唾液酸残基的任何酶或其功能性片段。术语唾液酸酶包括相对于野生型唾液酸酶序列具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的变体和/或包括唾液酸酶的融合蛋白或缀合物。唾液酸酶也被称为神经氨酸酶，并且除非另有指明，否则这两个术语在本文中可互换使用。当在本文中使用时，术语唾液酸酶的“功能性片段”是指全长唾液酸酶的片段，其保留了所述相应的全长、天然存在的唾液酸酶的例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的酶促活性。唾液酸酶的酶促活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放。在某些实施方案中，所述功能性片段包含在全长、天然存在的唾液酸酶中存在的至少100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360或370个连续氨基酸。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗HER2融合蛋白的唾液酸酶部分源自真核唾液酸酶，例如哺乳动物唾液酸酶，例如人或小鼠唾液酸酶。
人类基因组中编码四种唾液酸酶：Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。人类Neu1是一种溶酶体神经氨酸酶，其在与β-半乳糖苷酶和组织蛋白酶A的复合物中发挥作用。人类Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:7中，编码人类Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:23中。
人类Neu2是一种胞浆唾液酸酶。人类Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:1中，编码人类Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:24中。当在本文中使用时，除非另有陈述，否则野生型人类Neu2是指具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的人类Neu2。
人类Neu3是一种质膜唾液酸酶，具有特异性针对神经节苷脂的活性。人类Neu3具有两种同工型：同工型1和同工型2。人类Neu3同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:8中，编码人类Neu3同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:25中。人类Neu3同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:9中，编码人类Neu3同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:34中。
人类Neu4具有两种同工型：同工型1是一种外周膜蛋白，同工型2局限于溶酶体腔。人类Neu4同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:10中，编码人类Neu4同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:26中。人类Neu4同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:11中，编码人类Neu4同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:35中。
在小鼠基因组中也已发现四种唾液酸酶，它们被称为Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。小鼠Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:38中，编码小鼠Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ IDNO:42中。小鼠Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:39中，编码小鼠Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:43中。小鼠Neu3的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:40中，编码小鼠Neu3的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:44中。小鼠Neu4的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:41中，编码小鼠Neu4的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:45中。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗HER2融合蛋白的唾液酸酶部分衍生自原核唾液酸酶。示例性的原核唾液酸酶包括来自于鼠伤寒沙门氏菌和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的唾液酸酶。鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶(St-唾液酸酶)的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:30中，编码鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO:6中。霍乱弧菌唾液酸酶的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:36中，编码霍乱弧菌唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ IDNO:37中。
在某些实施方案中，唾液酸酶-抗HER2融合蛋白的唾液酸酶部分是突变型唾液酸酶，例如重组突变型人唾液酸酶。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应的(或模板)野生型人唾液酸酶的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、约100％或超过100％的酶促活性。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应(或模板)野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％，或超过100％的酶促活性。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶相同的底物特异性。在其他实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶可以切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。在某些实施方案中，所述唾液酸酶可以切割α2,3和α2,8键联。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞、CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞(例如NS0、Sp2/0)或人纤维肉瘤细胞(例如HT-1080)中的表达产量，高于所述相应的野生型人唾液酸酶的表达产量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应的野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶促活性，并且所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞中的表达产量高于相应的野生型唾液酸酶的表达产量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶的氨基酸序列与相应的野生型人唾液酸酶的氨基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
1.半胱氨酸残基的取代
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个半胱氨酸(cys，C)残基的取代。已发现，唾液酸酶中的某些半胱氨酸残基可能作为蛋白质聚集的结果而抑制有功能蛋白质的表达。因此，在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶含有至少一个突变以除去游离半胱氨酸(例如对于Neu1(SEQ ID NO:7)来说，例如C111、C117、C171、C183、C218、C240、C242和C252中的一者或多者的突变；对于Neu2(SEQ ID NO:1)来说，例如C125、C196、C219、C272、C332和C352中的一者或多者的突变；对于Neu3(SEQ ID NO:8)来说，例如C7、C90、C99、C106、C127、C136、C189、C194、C226、C242、C250、C273、C279、C295、C356、C365、C368、C384、C383、C394和C415中的一者或多者的突变；以及对于Neu4(SEQ ID NO:10)来说，C88、C125、C126、C186、C191、C211、C223、C239、C276、C437、C453、C480和C481中的一者或多者的突变)。游离半胱氨酸可以被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，所述游离半胱氨酸被丝氨酸(ser，S)、异亮氨酸(iso，I)、缬氨酸(val，V)、苯丙氨酸(phe，F)、亮氨酸(leu，L)或丙氨酸(ala，A)取代。Neu2中的示例性半胱氨酸取代包括C125A、C125I、C125S、C125V、C196A、C196L、C196V、C272S、C272V、C332A、C332S、C332V、C352L和C352V。在某些实施方案中，在对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处半胱氨酸被疏水性氨基酸，例如丙氨酸(C332A)、缬氨酸(C332V)、异亮氨酸(C332I)或亮氨酸(C332L)取代。在某些实施方案中，在对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处半胱氨酸被丙氨酸(C332A)取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个半胱氨酸取代。Neu2中的示例性双重或三重半胱氨酸取代包括：C125S和C332S；C272V和C332A；C272V和C332S；C332A和C352L；C125S和C196L；C196L和C352L；C196L和C332A；C332A和C352L；以及C196L、C332A和C352L。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶是Neu2唾液酸酶并包含取代C322A和C352L。
在某些实施方案中，所述唾液酸酶在人唾液酸酶例如Neu2或Neu3中通常存在的2、3、4、5或6个半胱氨酸处含有氨基酸取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表1中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表1
| 取代 |
| C125A |
| C125I |
| C125S |
| C125V |
| C196A |
| C196L |
| C196V |
| C272S |
| C272V |
| C332A |
| C332S |
| C332V |
| C352L |
| C352V |
| C125S+C332S |
| C272V+C332A |
| C272V+C332S |
| C332A+C352L |
| C125S+C196L |
| C196L+C352L |
| C196L+C332A |
| C196L+C332A+C352L |
2.提高pI和/或降低疏水性的残基取代
蛋白质的等电点(pI)是净电荷为零时的pH。pI通常也指示了蛋白质可溶性最低时的pH，其可能影响表达和纯化所述蛋白质的能力。通常，如果蛋白质的pI比溶液的pH高超过2个单位，则它具有良好的溶解性。人类Neu2具有7.5的预测pI。因此，人类Neu2在中性pH附近溶解性最低，这是不合乎需要的，因为表达和生理体系在中性pH处。相反，表现出良好的溶解性和重组表达的来自于鼠伤寒沙门氏菌的唾液酸酶(St-唾液酸酶)具有9.6的pI。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的pI。此外，减少唾液酸酶表面上疏水氨基酸的数目可能例如通过减少聚集而改进唾液酸酶的表达。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶降低所述唾液酸酶表面的疏水性。
因此，在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个氨基酸取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性。这可以通过将一个或多个带电荷的氨基酸例如带正或负电荷的氨基酸引入到所述重组唾液酸酶中来实现。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是取代成带电荷的氨基酸例如带正电荷的氨基酸如赖氨酸(lys，K)、组氨酸(his，H)或精氨酸(arg，R)或带负电荷的氨基酸如天冬氨酸(asp，D)或谷氨酸(glu，E)。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是取代成赖氨酸残基。在某些实施方案中，所述取代将所述唾液酸酶的pI提高到约7.75、约8、约8.25、约8.5、约8.75、约9、约9.25、约9.5或约9.75。
在某些实施方案中，所述氨基酸取代发生在表面暴露的D或E氨基酸处，在螺旋或环中，或在St-唾液酸酶的相应位置中具有K或R的位置中。在某些实施方案中，所述氨基酸取代发生在远离催化位点或不参与催化的氨基酸、不与其他人类Neu蛋白或与St-唾液酸酶或梭菌(Clostridium)NanH保守的氨基酸或不位于对功能重要的结构域(例如Asp-盒或β链)中的氨基酸处。
Neu2中相对于没有取代的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性的示例性氨基酸取代包括A2E、A2K、D215K、V325E、V325K、E257K和E319K。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个氨基酸取代，包括例如A2K和V325E、A2K和V325K、E257K和V325K、A2K和E257K以及E257K和A2K和V325K。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表2中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表2
| 取代 |
| A2K |
| E72K |
| D215K |
| E257K |
| V325K |
| A2K+E257K |
| A2K+V325E |
| A2K+V325K |
| E257K+V325K |
3.N-端肽的添加和N-或C-端取代
已发现，向人唾液酸酶的N-端添加两个或更多个氨基酸的肽序列可以提高所述唾液酸酶的表达和/或活性。在某些实施方案中，所述肽的长度为至少2个氨基酸，例如长度为2至20、2至10、2至5或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方案中，所述肽可以形成α-螺旋或具有形成α-螺旋的倾向性。
在小鼠中，在胸腺中发现的Neu2同工型(B型)含有在骨骼肌中发现的Neu2的经典(canonical)同工型中不存在的6个氨基酸。在本文的某些实施方案中，可以将所述小鼠胸腺Neu2同工型的N-端6个氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO:4)或其变体添加到人类Neu例如人类Neu2上。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的长度为至少2个氨基酸残基的肽。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的肽MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ IDNO:3)。在某些实施方案中，所述唾液酸酶还可以包含位于所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ ID NO:3)与所述唾液酸酶的其余部分之间的切割位点，例如蛋白水解切割位点。在某些实施方案中，所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO:4)或EDLRP(SEQ ID NO:3)可以在翻译后从所述唾液酸酶的其余部分上切掉。
可选地或与所述N-端添加相组合，可以移除所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸，例如可以移除N-端甲硫氨酸。在某些实施方案中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则可以移除N-端甲硫氨酸，可以移除前5个氨基酸(MASLP；SEQID NO:12)，或者可以移除第二至第四个氨基酸(ASLP；SEQ ID NO:13)。
在某些实施方案中，将所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)取代。例如在某些实施方案中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则将氨基酸MASLP(SEQ IDNO:12)、ASLP(SEQ ID NO:13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)取代。
人唾液酸酶具有β-螺旋桨结构，其特征是围绕中心轴呈环形排列的6个叶片形β-片层。通常，β-螺旋桨的叶片之间、包括N-和C-端叶片之间的疏水相互作用增强稳定性。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成包含提高所述唾液酸酶的N-和C-端β-螺旋桨叶片之间的疏水相互作用和/或氢键结合的氨基酸取代。
因此，在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的取代，其中所述取代相对于没有所述取代的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合。在某些实施方案中，将所述野生型氨基酸用天冬酰胺(asn，N)、赖氨酸(lys，K)、酪氨酸(tyr，Y)、苯丙氨酸(phe，F)或色氨酸(trp，W)取代。Neu2中提高N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合的示例性取代包括L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W。在某些实施方案中，在对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处缬氨酸被芳香族氨基酸，例如色氨酸(V6W)、酪氨酸(V6Y)或苯丙氨酸(V6F)取代。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含V6Y取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含上述取代的组合。例如，重组突变人类Neu2唾液酸酶可以在N-端处包含添加的氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)，并且相组合，可以包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W取代中的至少一者。在某些实施方案中，将重组突变人类Neu2唾液酸酶的氨基酸MASLP(SEQ ID NO:12)、ASLP(SEQ ID NO:13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO:4)、EDLRP(SEQ ID NO:3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO:14)代替，并且所述重组突变人类Neu2唾液酸酶还包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W取代中的至少一者。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表3中列出的突变或突变的组合的突变或突变的组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表3
此外，在某些实施方案中，所述唾液酸酶在所述唾液酸酶的N-端处包含N-端甲硫氨酸的取代或缺失。例如，在某些实施方案中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQID NO:1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的取代。在某些实施方案中，将所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸取代为丙氨酸(M1A)。在某些实施方案中，将所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸取代位带负电荷的氨基酸，例如谷氨酸(M1E)或天冬氨酸(M1D)。在某些实施方案中，将所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸取代为天冬氨酸(M1D)。在其他实施方案中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的缺失(ΔM1)。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表4中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表4
| 突变 |
| M1的缺失，V6Y，I187K |
| M1R，V6Y，I187K |
| M1H，V6Y，I187K |
| M1K，V6Y，I187K |
| M1D，V6Y，I187K |
| M1T，V6Y，I187K |
| M1N，V6Y，I187K |
| M1Q，V6Y，I187K |
| M1G，V6Y，I187K |
| M1A，V6Y，I187K |
| M1V，V6Y，I187K |
| M1L，V6Y，I187K |
| M1F，V6Y，I187K |
| M1Y，V6Y，I187K |
4.用于减少蛋白水解切割的残基取代
已发现，某些唾液酸酶(例如人类Neu2)易于被蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割。结果，所述唾液酸酶的蛋白水解切割可能在重组蛋白生产、收获、纯化或配制期间、向受试者施用期间或在施用到受试者之后发生。因此，在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶(例如人唾液酸酶)包含至少一个野生型氨基酸残基的取代，其中所述取代降低所述唾液酸酶相对于没有所述取代的唾液酸酶被蛋白酶(例如胰蛋白酶)的切割。
在某些实施方案中，蛋白酶是胰蛋白酶(例如，哺乳动物胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、人胰蛋白酶(如胰蛋白酶1、胰蛋白酶2或中胚层胰蛋白酶)、鳕鱼胰蛋白酶、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶、红糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraeus)胰蛋白酶、脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliatus)胰蛋白酶和微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)胰蛋白酶)、α-裂解蛋白酶或丝氨酸蛋白酶如激肽释放酶、弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。
在某些实施方案中，将所述重组突变唾液酸酶(例如人唾液酸酶)与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生约1％至约50％、约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％、约1％至约5％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约10％、约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约30％、约10％至约20％、约20％至约50％、约20％至约40％、约20％至约30％、约30％至约50％、约30％至约40％或约40％至约50％的相应的不含突变的唾液酸酶(例如野生型唾液酸酶)在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。在某些实施方案中，将所述重组突变唾液酸酶(例如人唾液酸酶)与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生低于50％、低于40％、低于30％、低于10％、低于5％、低于3％、低于1％或低于0.5％的相应的不含突变的唾液酸酶(例如野生型唾液酸酶)在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。蛋白水解切割可以通过本领域中已知的任何方法(包括例如通过SDS-PAGE)来测量。
提高对蛋白水解切割的抗性的示例性取代包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO:1)的第242位的位置处丙氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第243位的位置处精氨酸残基的取代，例如被谷氨酸(R243E)、组氨酸(R243H)、天冬酰胺(R243N)、谷氨酰胺(R243Q)或赖氨酸(R243K)取代；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第244位的位置处缬氨酸残基的取代，例如被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；或(iv)任何上述取代的组合。在某些实施方案中，在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸被芳香族氨基酸，例如，色氨酸(A242W)、酪氨酸(A242Y)或苯丙氨酸(A242F)取代。在某些实施方案中，在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸被半胱氨酸(A242C)取代。在某些实施方案中，重组突变人唾液酸酶或重组非人唾液酸酶包含对应于表5中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的氨基酸位置)。
表5
提高对蛋白水解切割的抗性(和/或提高表达产量和/或酶促活性)的另外的示例性取代包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第240位的位置处亮氨酸残基的取代，例如被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第213位的位置处丙氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第241位的位置处精氨酸残基的取代，例如被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(iv)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第258位的位置处丝氨酸残基的取代，例如被半胱氨酸取代(S258C)；(v)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第260位的位置处亮氨酸残基的取代，例如被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(vi)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的第265位的位置处缬氨酸残基的取代，例如被苯丙氨酸取代(V265F)；或(vii)任何上述取代的组合。设想了在某些实施方案中，在这些位置处的取代或取代组合可以改善所述唾液酸酶中二级结构元件之间(例如α-螺旋与最近的β-片层之间)的疏水和/或芳香性相互作用，从而使所述结构稳定并提高对蛋白水解切割的抗性。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶或重组非人唾液酸酶包含在L240位置处的突变。在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含在下述位置处的突变的组合：(i)A213和A242；(ii)A213、A242和S258；(iii)L240和L260；(iv)R241和A242；(v)A242和L260；(vi)A242和V265；或(vii)L240和A242。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含选自下述的取代组合：(i)A213C、A242F和S258C；(ii)A213C和A242F；(iii)A213T和A242F；(iv)R241Y和A242F；和(v)L240Y和A242F。在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶或重组非人唾液酸酶包含对应于在表6中列出的取代或取代组合的取代或取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表6
5.其他取代
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含以下取代中的至少一者：A328E、K370N或H210N。在某些实施方案中，将所述在对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处异亮氨酸取代为带正电荷的氨基酸，例如赖氨酸(I187K)或精氨酸(I187K)。在某些实施方案中，将所述在对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处异亮氨酸取代为赖氨酸(I187K)。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸GDYDAPTHQVQW(SEQ ID NO:15)被氨基酸SMDQGSTW(SEQ ID NO:16)或STDGGKTW(SEQ ID NO:17)的取代。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸PRPPAPEA(SEQ ID NO:18)被氨基酸QTPLEAAC(SEQ IDNO:19)的取代。在某些实施方案中，重组突变人类Neu2包含氨基酸NPRPPAPEA(SEQ ID NO:20)被氨基酸SQNDGES(SEQ ID NO:21)的取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于V212、A213、Q214、D215、T216、L217、E218、C219、Q220、V221、A222、E223、V224、E225或T225的位置处的至少一个取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶在表7中标识的位置处包含氨基酸取代(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含在表7中标识的氨基酸取代。在某些实施方案中，所述唾液酸酶包含在表7中标识的任何氨基酸取代的组合。
表7
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例如，在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基(A42)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；(j)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；(k)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；(l)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；(m)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；(n)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；(o)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；(p)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(q)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；(r)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；(s)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；(t)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；(u)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；(v)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；(w)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(x)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；(y)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；(z)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第290位的位置处丙氨酸残基(A290)的取代；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；(oo)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；(pp)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或(qq)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；或任何上述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、A42、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被带正电荷的氨基酸，例如精氨酸(A42R)或赖氨酸(A42K)取代，或者被天冬氨酸(A42D)取代；(d)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；(g)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q69H)；(i)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸取代(R78K)；(j)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸取代(D80P)；(k)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被带负电荷的氨基酸，例如天冬氨酸(A93D)或谷氨酸(A93E)取代，或者被赖氨酸(A93K)取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸取代(G107D)；(m)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q108H)；(n)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被谷氨酸(Q112E)、精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)取代；(o)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸取代(C125L)；(p)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被芳香族氨基酸，例如苯丙氨酸(Q126F)、酪氨酸(Q126Y)或色氨酸(Q126W)取代，或者被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、组氨酸(Q126H)或异亮氨酸(Q126I)取代；(q)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸取代(A150V)；(r)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸取代(C164G)；(s)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R170P)；(t)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸取代(A171G)；(u)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸取代(Q188P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R189P)；(w)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(x)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)取代；(y)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸取代(T249A)；(z)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸取代(D251G)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被半胱氨酸(E225C)或脯氨酸(E225P)取代；(bb)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸取代(H239P)；(cc)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(dd)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(ee)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(ff)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I),赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；(gg)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E257P)；(hh)对应于第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S258C)；(ii)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(jj)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸取代(V265F)；(kk)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基被极性不带电荷的氨基酸，例如丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代，或者被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)或脯氨酸(Q270P)取代；(ll)对应于野生型人类Neu2的第290位的位置处丙氨酸残基被半胱氨酸(A290C)取代；(mm)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸(W292R)取代。(nn)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；(oo)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；(pp)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或(qq)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、A42R、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I的取代或任何上述取代的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的亮氨酸残基的缺失(ΔL184)、对应于野生型人类Neu2的第185位的位置处的组氨酸残基的缺失(ΔH185)、对应于野生型人类Neu2的第186位的位置处的脯氨酸残基的缺失(ΔP186)、对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基的缺失(ΔI187)和对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的谷氨酰胺残基的缺失(ΔQ188)，或任何上述缺失的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第216位的位置处的苏氨酸残基与对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基之间的插入，例如选自S、T、Y、L、F、A、P、V、I、N、D和H的氨基酸的插入。
另外的示例性唾液酸酶突变和唾液酸酶突变的组合描述在国际(PCT)专利申请公布号WO 2019/136167中，包括在详细描述中题为“I.重组人唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例1、2、3、4、5和6中；并且描述在2020年7月3日提交的国际(PCT)专利申请公布号WO2021/003469中，包括在详细描述中题为“I.重组人唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例2、3、4和5中，并且描述在2021年7月2日提交的国际(PCT)专利申请号PCT/US2021/040240中，包括在详细描述中题为“I.重组人唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例2、3、4、5和11中。
6.取代的组合
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶包含本文中设想的任何突变的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个本文中设想的突变的组合。设想了所述重组突变唾液酸酶可以包含1-15、1-10、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-10、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-10、3-7、3-6、3-5或3-4个本文中设想的突变。
例如，重组突变唾液酸酶可包含M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、K9D取代、P62G取代、P62N取代、P62S取代、P62T取代、A93E取代、I187K取代、Q270A取代、S301R取代、W302K取代、C332A取代、V363R取代、L365I取代或任何上述缺失和取代的组合。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、I187K取代、C332A取代或任何上述缺失和取代的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含：(i)表7中标识的氨基酸取代或表7中标识的任何氨基酸取代的组合，和(ii)M1缺失(ΔM1)、M1A取代、M1D取代、V6Y取代、I187K取代、C332A取代或任何上述缺失和取代的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含：(i)表7中标识的氨基酸取代或表7中标识的任何氨基酸取代的组合，和(ii)选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方案中，所述重组突变唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A取代；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I取代；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A取代；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A取代；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A取代；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A取代；(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；(l)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代；(m)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q112E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A；或(n)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、E225C、Q270T、A290C、A242F、C332A取代。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶还包含在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代与在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代的组合。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含对应于表8的行中列出的取代组合的取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含：S301K和W302R取代；S301K和W302K取代；或S301A和W302S取代。
表8
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶还包含对应于表9的行中列出的取代组合的取代组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1))。
表9
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在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1、A42和Q270的取代，或任何上述取代的组合。发现这些取代例如提高了酶的活性(参见实施例1)。在某些实施方案中，唾液酸酶在M1、A42和Q270中的每一者处包含取代。在某些实施方案中，唾液酸酶包含选自M1D、A42R和Q270T的取代，或任何上述取代的组合。在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1D、A42R和Q270T取代中的每一者。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含V6、P62、A93、Q126和I187的取代，或任何上述取代的组合。发现这些取代例如提高酶的表达/产量(参见实施例1)。在某些实施方案中，唾液酸酶在V6、P62、A93、Q126和I187中的每一者处包含取代。在某些实施方案中，唾液酸酶包含选自V6Y、P62G、A93E、Q126Y和I187K的取代，或任何上述取代的组合。在某些实施方案中，唾液酸酶包含V6Y、P62G、A93E、Q126Y和I187K取代中的每一者。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1、A42、A242和Q270的取代，或任何上述取代的组合。发现这些取代例如提高了酶的稳定性(参见实施例1)。在某些实施方案中，唾液酸酶在M1、A42、A242和Q270中的每一者处包含取代。在某些实施方案中，唾液酸酶包含选自M1D、A42R、A242F和Q270T的取代，或任何上述取代的组合。在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1D、A42R、A242F和Q270T取代中的每一者。
在某些实施方案中，重组突变唾液酸酶包含：(a)V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(b)ΔM1缺失和V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(c)M1D、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(d)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(e)M1D、V6Y、A42R、A93E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(f)M1D、V6Y、A42R、P62G、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(g)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、I187K、Q270T、A242F和C332A取代；(h)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、Q270T、A242F和C332A取代；(i)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A取代；(j)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F和C332A取代；或(k)M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和A242F取代。
在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1、V6、A42、P62、A93、Q126、I187、A242、Q270或C332A的取代，或任何上述取代的组合。在某些实施方案中，唾液酸酶在M1、V6、A42、P62、A93、Q126、I187、A242、Q270和C332中的每一者处包含取代。在某些实施方案中，唾液酸酶包含选自M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A的取代，或任何上述取代的组合。在某些实施方案中，唾液酸酶包含M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代中的每一者。
在某些实施方案中，重组突变人唾液酸酶包含SEQ ID NO:48-54、149、154、159、191或198中的任一者的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:48-54、149、154、159、191或198中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX 14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRAN VTRLX19X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPG HX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHD HGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRP PAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEAN DYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO:199)，
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val，或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Ala或Arg，X8是Lys、Arg，或Glu，X9是Lys、Ala、Arg，或Glu，X10是Leu或Met，X11是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X12是Gln或His，X13是Arg或Lys，X14是Asp或Pro，X15是Ala、Glu或Lys，X16是Gly或Asp，X17是Gln或His，X18是Gln、Arg，或Lys，X19是Ala、Cys、Ile、Ser、Val，或Leu，X20是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X21是Ala或Val，X22是Cys或Gly，X23是Arg或Pro，X24是Ala或Gly，X25是Arg、Ile，或Lys，X26是Gln或Pro，X27是Arg或Pro，X28是Ala、Cys、Leu，或Val，X29是Ala、Cys、Asn、Ser，或Thr，X30是Leu、Ala，或Val，X31是Glu或Pro，X32是His或Pro，X33是Leu、Asp、Asn，或Tyr，X34是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln，或Tyr，X35是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X36是Val、Ile，或Lys，X37是Thr或Ala，X38是Asp或Gly，X39是Glu、Lys，或Pro，X40是Ser或Cys，X41是Leu、Asp、Phe、Gln，或Thr，X42是Val或Phe，X43是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X44是Cys或Val，X45是Trp或Arg，X46是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X47是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X48是Lys或Val，X49是Ala、Cys、Ser，或Val，X50是Cys、Leu，或Val，X51是Val或Arg，并且X52是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)包含至少一个突变。
在某些实施方案中，重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQR X4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHR SMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRAR SLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTL ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLV KKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QR ADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSP LFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO:200)，
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X6是Ala、Glu或Lys，X7是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X8是Arg、Ile或Lys，X9是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X10是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X11是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X12是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X13是Ala、Cys、Ser或Val，X14为Val或Arg，并且X15为Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ IDNO:1)包含至少一个突变。在某些实施方案中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X6是Ala或Glu，X7是Gln或Tyr，X8是Ile或Lys，X9是Ala或Thr，X10是Gln、Ala或Thr，X11是Ser、Arg或Ala，X12是Trp、Lys或Arg，X13是Ala或Cys，X14是Val或Arg，并且X15是Leu或Ile。
在某些实施方案中，所述重组突变人唾液酸酶相对于本文中公开的重组突变人唾液酸酶序列包含保守取代。当在本文中使用时，术语“保守取代”是指使用结构上相似的氨基酸的取代。例如，保守取代可以包括下述组内的取代：Ser和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；以及Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守取代也可以由BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法、BLOSUM取代矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM取代:p矩阵(例如PAM 250矩阵)定义。
序列同一性可以以本领域技术人员的技术范围之内的各种不同方式确定，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析(Karlin等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268；Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402，其通过引用并入本文)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等人，(1994)NATURE GENETICS 6:119-129，其整体通过引用并入本文。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合的参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大对齐所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于报告与数据库序列匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919，其整体通过引用并入本文)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙延伸罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生单词命中)；和gapw＝16(设置在其中生成带间隙的对齐的窗口宽度)。等效的blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information))的BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，开放间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延伸间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[整数]：默认值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[整数]：默认值＝1；-e，预期值[实数]：默认值＝10；-W，词长[整数]：默认值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast延伸的衰减(X)：默认值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：默认值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和-Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。用于逐对蛋白质比对的ClustalW也可以使用(默认参数可以包括例如Blosum62矩阵和间隙开放罚分＝10和间隙延伸罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙延伸罚分)。Bestfit蛋白质比较中的等效设置是GAP＝8和LEN＝2。
b.抗体部分
当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“抗体”被理解为意味着完整抗体(例如完整单克隆抗体)或其片段，例如抗体的抗原结合片段(例如单克隆抗体的抗原结合片段)，或抗体的Fc片段(例如单克隆抗体的Fc片段)，包括已被修饰、工程化或化学缀合的完整抗体、抗原结合片段或Fc片段。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、单链抗体(例如scFv)、微型抗体和双体抗体。已被修饰或工程化的抗体的实例包括嵌合抗体、人源化抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)。化学缀合的抗体的实例是缀合到毒素组成部分的抗体。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白Fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的一个片段，其单独地或与第二免疫球蛋白Fc结构域相组合能够结合到Fc受体。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域和免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的，并且可以在例如PROSITE数据库(可以在万维网网址prosite.expasy.org处获得)中找到。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。可以引入单个氨基酸取代(根据Kabat编号系统S228P；被称为IgG4Pro)以废除在重组IgG4抗体中观察到的非均质性。参见Angal,S等人，(1993)MOL.IMMUNOL.30:105-108。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型或引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型(例如SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:5，或SEQ ID NO:211)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型或很少或不引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与第二多肽的异二聚化(残基号码根据EU编号系统，Kabat,E.A.等人，(1991)SEQUENCES OF PROTEINS OFIMMUNOLOGICAL INTEREST，第五版，U.S.Department of Health andHuman Services,NIH Publication No.91-3242)。例如，在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG1 Fc结构域并且包含Y407T突变(例如，融合蛋白包含SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:213，或SEQ ID NO:215)。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG1 Fc结构域并且包含T366Y突变(例如，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:214或SEQ ID NO:216)。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域被修饰成防止Fc结构域的糖基化。例如，在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自人IgG1 Fc结构域并且包含N297位的突变，例如N297A或N297G突变(根据EU编号的残基编号，Kabat，E.A.，等人，同上)。例如，在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:215或SEQ ID NO:216。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白抗原结合结构域。此种结构域的包含可以改进融合蛋白向唾液酸化癌细胞(例如，表达HER2的癌细胞)和/或肿瘤微环境的靶向。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白抗原结合结构域”是指单独地或与另一个免疫球蛋白抗原结合结构域相组合限定了抗原结合位点的多肽。示例性的免疫球蛋白抗原结合结构域包括例如免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区，其中所述可变区一起限定了抗原结合位点(例如，抗HER2抗原结合位点)。
在某些实施方案中，免疫球蛋白抗原结合结构域衍生自抗HER2抗体。示例性抗HER2抗体包括曲妥珠单抗帕妥珠单抗/>曲妥珠单抗dkst(OgivriTM)、MGAH22(马吉妥昔单抗)、PF-05280014、厄妥索单抗、甘妥单抗、timigutuzumab、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201。
在某些实施方案中，所述免疫球蛋白抗原结合结构域源自于曲妥珠单抗。曲妥珠单抗重链氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:63中，并且曲妥珠单抗轻链氨基酸序列描绘在SEQID NO:64中。源自于曲妥珠单抗的示例性scFv的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO:65中。
c.接头
在某些实施方案中，所述融合蛋白的唾液酸酶部分可以被直接连接或融合到所述融合蛋白的抗HER2抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)。在其他实施方案中，所述唾液酸酶部分可以通过接头共价结合到所述抗HER2抗体部分。
所述接头可以与一个或多个天然氨基酸、所述唾液酸酶或其功能性片段、所述抗体部分或片段缀合，其中所述氨基酸(例如半胱氨酸氨基酸)可以通过定点突变引入。所述接头可以包括一个或多个非天然氨基酸。设想了在某些情况下，含有例如一个或多个巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的接头可以共价连接所述唾液酸酶部分或抗体部分中的半胱氨酸，其是天然存在的半胱氨酸残基或者是位点特异性突变的产物。
所述接头可以是可切断的接头或不可切断的接头。任选地或此外，所述接头可以是柔性接头或非柔性接头。
所述接头应该具有足够长的长度，以允许所述唾液酸酶和抗体部分没有空间位阻地彼此连接，并且应该足够短，以保留所述融合蛋白的目标活性。所述接头优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不稳定性。所述接头优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不溶性。所述接头应该在体内足够稳定(例如它不被血清、酶等切断)，以允许在体内操作所述融合蛋白。
所述接头可以具有约1埃至约/>的长度或约/>至约120/>的长度或约/>至约/>的长度或约/>至约/>的长度。所述接头可以具有大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更大的长度和/或小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、/>或更小的长度。此外，所述接头可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和/>的长度。
在某些实施方案中，所述接头包含将所述融合蛋白的唾液酸酶部分连接或融合到所述融合蛋白的抗HER2抗体部分(例如免疫球蛋白Fc结构域和/或免疫球蛋白抗原结合结构域)的多肽接头。例如，设想了编码直接或间接(例如通过含有氨基酸的接头)连接到抗体部分的唾液酸酶部分的基因，可以使用常规重组DNA技术来产生和表达。例如，唾液酸酶部分的氨基端可以被连接到抗体部分的轻链或重链的羧基端。例如，对于Fab片段来说，可以将所述唾液酸酶的氨基端或羧基端连接到抗体重链的第一恒定结构域(CH1)。当使用接头时，所述接头可以包含亲水性氨基酸残基例如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。在某些实施方案中，所述接头是含有1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、2-15个氨基酸残基、3-10个氨基酸残基、3-7个氨基酸残基、4-25个氨基酸残基、4-20个氨基酸残基、4-15个氨基酸残基、4-10个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基或5-10个氨基酸残基的肽。示例性接头包括富含甘氨酸和丝氨酸的接头例如(GlyGlyPro)n或(GlyGlyGlyGlySer)n，其中n是1-5。在某些实施方案中，所述接头包含GGGGS(SEQ ID NO:184)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述接头包含GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:145)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方案中，所述接头包含EPKSS(SEQ IDNO:146)、由其组成或基本上由其组成。另外的示例性接头序列被公开在例如George等人，(2003)PROTEIN ENGINEERING 15:871-879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
在某些实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:66-85、98-142、150-153、155-158、160-163、166-178、185、187、189、192-197、203-210、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244或249中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:66-85、98-142、150-153、155-158、160-163、166-178、185、187、189、192-197、203-210、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244或249中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
d.抗体缀合物
本发明还提供了含有本文公开的融合蛋白中的一种或多种融合蛋白的抗体缀合物。当在本文中使用时，除非另有说明，否则术语“抗体缀合物”应理解为是指包含抗原结合活性(例如，抗HER2抗原结合活性)和/或Fc受体结合活性、缀合(例如，共价偶联)至另外的功能部分的抗体或其功能片段。在某些实施方案中，抗体或功能性抗体片段与唾液酸酶，例如本文公开的重组突变人唾液酸酶缀合。在某些实施方案中，抗体缀合物包含单个多肽链。在某些实施方案中，抗体缀合物包含共价或非共价缔合在一起从而产生多聚体复合物(例如二聚体、三聚体或四聚体复合物)的两条、三条、四条或更多条多肽链。例如，抗体缀合物可以包含含有重组突变人唾液酸酶和免疫球蛋白重链的第一多肽(融合蛋白)和含有免疫球蛋白轻链的第二多肽，其中例如所述免疫球蛋白重链和轻链一起限定了单个抗原结合位点(例如抗HER2抗原结合位点)。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物可以包括单个唾液酸酶。在其他实施方案中，所述抗体缀合物可以包括超过一个(例如两个)唾液酸酶。如果包括超过一个唾液酸酶，则所述唾液酸酶可以相同或不同。在某些实施方案中，所述抗体缀合物可以包括单个抗HER2抗原结合位点。在其他实施方案中，所述抗体缀合物可以包括超过一个(例如两个)抗HER2抗原结合位点。如果使用两个抗原结合位点，则它们可以相同或不同。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含免疫球蛋白Fc片段。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含一个或两个免疫球蛋白重链或其功能性片段。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含一个或两个免疫球蛋白轻链或其功能性片段。在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含融合到免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链的N-或C-端的唾液酸酶。
图1描绘了含有一个或多个唾液酸酶的示例性抗体缀合物构建物。例如，在图1A中，第一抗HER2抗原结合位点(例如，由VH和VL结构域限定)被描绘为10，第二抗HER2抗原结合位点被描绘为20，唾液酸酶被描绘为30，并且Fc被描绘为40。在图1A-1I中描绘的每个构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某些方式被修饰，例如使用杵臼(Knobs-into-Holes)类型的技术，例如由图1B中的50所示。在整个图1中，相似的结构用相似的示意图描绘。
图1A描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了被描绘为10的第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了被描绘为20的第二抗HER2抗原结合位点。被描绘为30的唾液酸酶可以缀合到所述第一和第二免疫球蛋白轻链或所述第一和第二免疫球蛋白重链的的N-或C-端。
图1B描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗HER2抗原结合位点。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图1C描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图1D描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图1E描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白轻链或第一免疫球蛋白重链的N-或C-端。
图1F描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。任选的第二唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。
图1G描绘的抗体缀合物构建物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；和包含免疫球蛋白重链可变区的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。所述唾液酸酶可以缀合到所述免疫球蛋白轻链或免疫球蛋白重链可变区的N-或C-端。
图1H描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别缀合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。单链可变区片段(scFv)可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二单链可变区片段(scFv)可以被分别缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。
图1I描绘了与图1H中描绘的相似的抗体缀合物构建物，区别在于每个scFv被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab代替。例如，图1I描绘的抗体缀合物构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。唾液酸酶可以缀合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的N-端。任选的第二唾液酸酶可以被分别缀合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的N-端。抗体片段(Fab)可以被缀合或融合到所述第一免疫球蛋白Fc结构域或第二免疫球蛋白Fc结构域的C-端。任选的第二抗体片段(Fab)可以被分别缀合或融合到所述第二免疫球蛋白Fc结构域或第一免疫球蛋白Fc结构域的C-端。在融合的情况下，所述Fc结构域的C端被连接(通过键或氨基酸接头)到限定抗HER2免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链。在具有由单个可变区限定的抗原结合位点的抗体的情况下，这可能足以提供对靶抗原(例如HER2)的结合亲和性。在其他情况下，例如在人类抗体的情况下，所述限定了免疫球蛋白抗原结合片段的第一多肽链可以被缀合(例如共价缀合，例如通过二硫键)到限定了免疫球蛋白抗原结合片段的第二多肽链，所述两个抗原结合片段一起限定了用于结合所述靶抗原(例如HER2)的抗原结合位点。
图2描绘了另外的抗体缀合物构建物。例如图2描绘了能够抗体缀合物构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和scFv的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述重链和scFv。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗原结合位点。在某些实施方案中，所述scFv限定了第二抗原结合位点。图2描绘了一种另外的抗体构建物，其包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶的第三多肽，其中Fab片段被缀合到所述免疫球蛋白重链的N-端。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗原结合位点。在某些实施方案中，所述Fab片段限定了第二抗原结合位点。在图2中描绘的每种构建物中，应该理解scFv在存在时可以被Fab片段代替，或者Fab片段在存在时可以被scFv代替。在图2中描绘的每种构建物中，应该理解所述Fc可以任选地以某种方式被修饰。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。这个实施方案的实例示出在图3A中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，所述第三和第四多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第三多肽和第四多肽一起限定了第二抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二唾液酸酶和所述第一和第二免疫球蛋白重链。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。这个实施方案的实例示出在图3B中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶。
在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与SEQ IDNO:66具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67或189中的任一者的氨基酸序列或与SEQ IDNO:67或189中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第三多肽包含SEQ ID NO:68-74、98-112、150、151、155、156、160、161、185、187、192、195、203-208中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:68-74、98-112、150、151、155、156、160、161、185、187、192、195、203-208中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第三多肽包含氨基酸序列
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAE QRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQA X13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQ TRANVTRLX19X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTF AVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X2 6X27PIPSAF X28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTL NARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLF GX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQX53DKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:201),
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Ala或Arg，X8是Lys、Arg，或Glu，X9是Lys、Ala、Arg，或Glu，X10是Leu或Met，X11是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X12是Gln或His，X13是Arg或Lys，X14是Asp或Pro，X15是Ala、Glu或Lys，X16是Gly或Asp，X17是Gln或His，X18是Gln、Arg，或Lys，X19是Ala、Cys、Ile、Ser、Val，或Leu，X20是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X21是Ala或Val，X22是Cys或Gly，X23是Arg或Pro，X24是Ala或Gly，X25是Arg、Ile，或Lys，X26是Gln或Pro，X27是Arg或Pro，X28是Ala、Cys、Leu，或Val，X29是Ala、Cys、Asn、Ser，或Thr，X30是Leu、Ala，或Val，X31是Glu或Pro，X32是His或Pro，X33是Leu、Asp、Asn，或Tyr，X34是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln，或Tyr，X35是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X36是Val、Ile，或Lys，X37是Thr或Ala，X38是Asp或Gly，X39是Glu、Lys，或Pro，X40是Ser或Cys，X41是Leu、Asp、Phe、Gln，或Thr，X42是Val或Phe，X43是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X44是Cys或Val，X45是Trp或Arg，X46是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X47是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X48是Lys或Val，X49是Ala、Cys、Ser，或Val，X50是Cys、Leu，或Val，X51是Val或Arg，X52是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser并且X53是GGGGS(SEQ ID NO:184)、GGGGSGGGGS(SEQID NO:145)，或EPKSS(SEQ ID NO:146)，并且所述唾液酸酶包含至少一个相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的突变。
在某些实施方案中，所述第三多肽包含氨基酸序列
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQX16DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:202)，
其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X6是Ala、Glu，或Lys，X7是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X8是Arg、Ile，或Lys，X9是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X10是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X11是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X12是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X13是Ala、Cys、Ser，或Val，X14是Val或Arg，X15是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser，并且X16是GGGGS(SEQ ID NO:184)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:145)，或EPKSS(SEQ ID NO:146)，并且所述唾液酸酶包含至少一个相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的突变。在某些实施方案中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X6是Ala或Glu，X7是Gln或Tyr，X8是Ile或Lys，X9是Ala或Thr，X10是Gln、Ala，或Thr，X11是Ser、Arg，或Ala，X12是Trp、Lys，或Arg，X13是Ala或Cys，X14是Val或Arg，并且X15是Leu或Ile。
在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ IDNO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:68。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:69。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:70。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:71。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQID NO:72。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ IDNO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:73。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:74。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:98。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:99。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQID NO:100。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:101。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:102。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:103。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:104。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:105。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:106。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQID NO:107。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:108。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:109。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:110。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:111。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:112。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:150。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQID NO:151。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:155。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:156。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:160。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:161。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:192。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:67，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:195。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:189，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:185。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:189，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:187。在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:189，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:205。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)的第一多肽；和包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变区片段(scFv)(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第二多肽链代替)的第二多肽。这个实施方案的实例示出在图3C中(在图3C所描绘的构建物中，应当理解scFv在存在时可以被Fab片段取代，或者Fab片段在存在时可以被scFv取代)。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一scFv限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第二scFv限定了第二抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一scFv。在某些实施方案中，所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一scFv、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一唾液酸酶。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二scFv。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二scFv、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二唾液酸酶。
在某些实施方案中，所述第一多肽包含SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述第二多肽包含SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO:77-83、166-178、194、197、244或249中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAE QRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQA X13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQ TRANVTRLX19X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTF AVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X2 6X27PIPSAF X28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTL NARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLF GX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQX53DKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:248)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val，或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Ala或Arg，X8是Lys、Arg，或Glu，X9是Lys、Ala、Arg，或Glu，X10是Leu或Met，X11是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X12是Gln或His，X13是Arg或Lys，X14是Asp或Pro，X15是Ala、Glu或Lys，X16是Gly或Asp，X17是Gln或His，X18是Gln、Arg，或Lys，X19是Ala、Cys、Ile、Ser、Val，或Leu，X20是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X21是Ala或Val，X22是Cys或Gly，X23是Arg或Pro，X24是Ala或Gly，X25是Arg、Ile，或Lys，X26是Gln或Pro，X27是Arg或Pro，X28是Ala、Cys、Leu，或Val，X29是Ala、Cys、Asn、Ser，或Thr，X30是Leu、Ala，或Val，X31是Glu或Pro，X32是His或Pro，X33是Leu、Asp、Asn，或Tyr，X34是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln，或Tyr，X35是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X36是Val、Ile，或Lys，X37是Thr或Ala，X38是Asp或Gly，X39是Glu、Lys，或Pro，X40是Ser或Cys，X41是Leu、Asp、Phe、Gln，或Thr，X42是Val或Phe，X43是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X44是Cys或Val，X45是Trp或Arg，X46是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X47是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X48是Lys或Val，X49是Ala、Cys、Ser，或Val，X50是Cys、Leu，或Val，X51是Val或Arg，X52是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser，并且X53是GGGGS(SEQID NO:184)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:145)，或EPKSS(SEQ ID NO:146)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)包含至少一个突变。
在某些实施方案中，所述第一和/或第二多肽包含氨基酸序列
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQR X4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHR SMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRA RSLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQD TLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQES QLVKKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGP DGSPLFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQX16DKTHT CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
(SEQ ID NO:247)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val，或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X6是Ala、Glu，或Lys，X7是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu，或Tyr，X8是Arg、Ile，或Lys，X9是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp，或Tyr，X10是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser，或Thr，X11是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp，或Tyr，X12是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val，或Tyr，X13是Ala、Cys、Ser，或Val，X14是Val或Arg，X15是Leu、Gln、His、Ile、Lys，或Ser，并且X16是GGGGS(SEQ ID NO:184)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:145)，或EPKSS(SEQ ID NO:146)，并且所述唾液酸酶包含至少一个相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO:1)的突变。在某些实施方案中，X1是Ala、Asp、Met，或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Arg或Ala，X5是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X6是Ala或Glu，X7是Gln或Tyr，X8是Ile或Lys，X9是Ala或Thr，X10是Gln、Ala，或Thr，X11是Ser、Arg，或Ala，X12是Trp、Lys，或Arg，X13是Ala或Cys，X14是Val或Arg，并且X15是Leu或Ile。
在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:77。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:78。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQID NO:79。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:80。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:81。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:82。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:83。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:166。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:167。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:168。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:169。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:170。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:171。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:172。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:173。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ IDNO:174。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:175。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:176。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:177。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:178。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:194。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:197。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:244。在某些实施方案中，所述第一和第二多肽包含SEQ ID NO:249。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含：包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽(也应该理解所述scFv可以被免疫球蛋白抗原结合片段例如Fab片段的第一多肽链代替)；和包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽。这个实施方案的实例示出在图3D中。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽一起限定了第一抗HER2抗原结合位点(即所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗HER2抗原结合位点)。在某些实施方案中，所述scFv限定了第二抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和scFv，或者以N-至C-端的方向包含所述scFv和免疫球蛋白重链。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域，或者以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和免疫球蛋白Fc结构域。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含有包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一免疫球蛋白重链可变区的第二多肽；包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二免疫球蛋白重链可变区的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽。还应当理解，免疫球蛋白轻链可以被免疫球蛋白重链可变区取代，并且免疫球蛋白重链可变区可以被免疫球蛋白轻链取代(例如，所述抗体缀合物可以包含有包含第一免疫球蛋白重链链可变区的第一多肽；包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一免疫球蛋白轻链的第二多肽；包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二免疫球蛋白轻链的第三多肽；和包含第二免疫球蛋白重链可变区的第四多肽)。该实施方案的实例示出在图3E中。所述第二多肽和第三多肽可以被共价连接在一起。所述共价键联可以是二硫键。在某些实施方案中，所述第一多肽和第二多肽限定了第一抗HER2抗原结合位点，而所述第三多肽和第四多肽限定了第二抗HER2抗原结合位点。在某些实施方案中，所述第二多肽以N-端至C-端方向包含所述第一唾液酸酶、所述第一免疫球蛋白Fc结构域和所述第一免疫球蛋白重链可变区。在某些实施方案中，所述第三多肽以N-至C-端方向包含所述第二唾液酸酶、所述第二免疫球蛋白Fc结构域和所述第二免疫球蛋白重链可变区。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa例如约140kDa的分子量。在其他实施方案中，所述抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa例如约230kDa的分子量。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物包含各自包含免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽具有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与所述第二多肽异二聚化，并且所述第二多肽具有“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与所述第一多肽异二聚化(残基编号根据EU编号系统，Kabat,E.A.等人，(1991)同上)。例如，在某些实施方案中，所述抗体包含各自包含源自于人IgG1 Fc结构域的免疫球蛋白Fc结构域的两个多肽，并且所述第一多肽包含Y407T突变(例如所述第一多肽包含SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:213或SEQ ID NO:215)，并且所述第二多肽包含T366Y突变(例如所述第二多肽包含SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:214或SEQ ID NO:216)。
当在本文中使用时，术语“多特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到至少两种不同抗原的抗体，即包含至少两个抗原结合位点、结合到至少两种不同抗原的抗体。当在本文中使用时，术语“双特异性抗体”被理解为意味着特异性结合到两种不同抗原的抗体，即包含两个抗原结合位点的抗体，每个所述抗原结合位点结合到分开且不同的抗原。换句话说，第一结合位点结合第一抗原，并且第二结合位点结合第二种不同抗原。多特异性或双特异性抗体可以是例如人类或人源化抗体，和/或可以是全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
本发明涵盖了包含抗体片段的抗体缀合物，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，(2003)，同上。
在某些实施方案中，所述抗体缀合物或融合蛋白可以与生物修饰剂共价或非共价结合，所述生物修饰剂可用于增强所述抗体的溶解性，提高结合特异性，降低免疫原性或毒性，或改变所述抗体的药物动力学特性。例如，所述生物修饰剂可用于提高所述抗体的分子量以增加其循环半衰期。
设想了所述抗体缀合物或融合蛋白可以被共价键合到一个或多个(例如2、3、4、5、6、8、9、10个或更多个)生物修饰剂，所述生物修饰剂可以包含直链或支链聚合物。示例性的生物修饰剂可以包括例如各种不同的聚合物，例如在美国专利号7,842,789中所描述的。特别有用的是聚亚烷基醚例如聚乙二醇(PEG)及其衍生物(例如烷氧基聚乙二醇，例如甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二醇等)，聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)，聚甲基丙烯酸酯，卡波姆，以及包含糖单体例如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡糖醛酸的支链或直链多糖。
在其他实施方案中，所述生物修饰剂可以是亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)类型的聚合物。所述生物修饰剂可以是官能化的聚乙烯吡咯烷酮，例如在所述聚合物的一个(或两个)末端上羧基或胺官能化(正如可以从PolymerSource获得的)。或者，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。或者，所述生物修饰剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或官能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或官能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。所述修饰剂在缀合之前不必须但优选是水溶性的，但所述最终缀合物应该是水溶性的。
通常，所述生物修饰剂可以具有约2kDa至约5kDa、约2kDa至约10kDa、约2kDa至约20kDa、约2kDa至约30kDa、约2kDa至约40kDa、约2kDa至约50kDa、约2kDa至约60kDa、约2kDa至约70kDa、约2kDa至约80kDa、约2kDa至约90kDa、约2kDa至约100kDa、约2kDa至约150kDa、约5kDa至约10kDa、约5kDa至约20kDa、约5kDa至约30kDa、约5kDa至约40kDa、约5kDa至约50kDa、约5kDa至约60kDa、约5kDa至约70kDa、约5kDa至约80kDa、约5kDa至约90kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约150kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约40kDa、约10kDa至约50kDa、约10kDa至约60kDa、约10kDa至约70kDa、约10kDa至约80kDa、约10kDa至约90kDa、约10kDa至约100kDa、约10kDa至约150kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约40kDa、约20kDa至约50kDa、约20kDa至约60kDa、约20kDa至约70kDa、约20kDa至约80kDa、约20kDa至约90kDa、约20kDa至约100kDa、约20kDa至约150kDa、约30kDa至约40kDa、约30kDa至约50kDa、约30kDa至约60kDa、约30kDa至约70kDa、约30kDa至约80kDa、约30kDa至约90kDa、约30kDa至约100kDa、约30kDa至约150kDa、约40kDa至约50kDa、约40kDa至约60kDa、约40kDa至约70kDa、约40kDa至约80kDa、约40kDa至约90kDa、约40kDa至约100kDa、约40kDa至约150kDa、约50kDa至约60kDa、约50kDa至约70kDa、约50kDa至约80kDa、约50kDa至约90kDa、约50kDa至约100kDa、约50kDa至约150kDa、约60kDa至约70kDa、约60kDa至约80kDa、约60kDa至约90kDa、约60kDa至约100kDa、约60kDa至约150kDa、约70kDa至约80kDa、约70kDa至约90kDa、约70kDa至约100kDa、约70kDa至约150kDa、约80kDa至约90kDa、约80kDa至约100kDa、约80kDa至约150kDa、约90kDa至约100kDa、约90kDa至约150kDa或约100kDa至约150kDa的分子量。
设想了将所述抗体缀合物或融合蛋白附连到约10个或更少的聚合物分子(例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个)，每个聚合物分子具有至少约20,000D或至少约30,000D或至少约40,000D的分子量。
尽管各种不同的聚合物可用作生物修饰剂，但设想了可以将本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白附连到聚乙二醇(PEG)聚合物。在一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约20,000D的PEG。在另一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约30,000D的PEG。在另一个实施方案中，本文中描述的抗体缀合物或融合蛋白被共价附连到至少一个真实MW为至少约40,000D的PEG。在某些实施方案中，所述PEG是甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)。这些PEGS可以从Nektar Therapeutics或SunBiowest商购获得。
抗体缀合物或融合蛋白上用于生物修饰剂的附连位点包括N-端氨基和赖氨酸残基上存在的ε氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。利用或不利用本领域中已知并使用的利用化学原理的多功能(通常为双功能)交联剂，可以将所述聚合物直接共价键合到所述抗体缀合物或融合蛋白。例如，巯基可以通过缀合到马来酰亚胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯或可以从Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville,Ala.商购获得的PEG-马来酰亚胺)进行衍生。
II.制造融合蛋白或抗体缀合物的方法
用于生产融合蛋白例如本文中公开的融合蛋白、抗体或抗体缀合物例如本文共公开的抗体缀合物的方法，在本领域中是已知的。例如，编码轻链可变区和/或重链可变区的DNA分子可以通过化学法或通过重组DNA方法合成。例如，通过常规的杂交技术或聚合酶链反应(PCR)技术，使用适合的合成核酸引物，可以从杂交瘤克隆所述抗体的序列。得到的编码感兴趣的可变区的DNA分子可以被连接到其他适合的核苷酸序列包括例如恒定区编码序列和表达控制序列，以产生编码所需抗体的常规基因表达构建物(即表达载体)。确定基因构建物的产生在本领域的常规技术之内。
编码所需融合蛋白和/或抗体缀合物的核酸可以被并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是原本不产生IgG蛋白的大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以将转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达编码所述免疫球蛋白轻链和/或重链可变区的基因的条件下生长。
具体表达和纯化条件将随着使用的表达系统而变。例如，如果将要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将所述工程化的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游，将它克隆到表达载体中。所述表达的蛋白可能被分泌。所述表达的蛋白可能积累在折光体或包含体中，其可以在通过弗氏压碎器或超声破碎细胞后收获。然后将所述折光体溶解，并且可以通过本领域中已知的方法将所述蛋白质重新折叠和/或切断。
如果将要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达所述工程化的基因，则首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、poly A序列和终止密码子的表达载体中。任选地，所述载体或基因构建物可能含有增强子和内含子。在涉及包含抗体或其部分的融合蛋白的实施方案中，所述表达载体任选地含有编码全部或一部分恒定区的序列，使得能够表达整个或一部分重链或轻链。可以使用常规技术将所述基因构建物引入到真核宿主细胞中。
所述宿主细胞表达包含唾液酸酶和VL或VH片段、VL-VH异二聚体、VH-VL或VL-VH单链多肽、完整的免疫球蛋白重链或轻链或其部分(其各自可以被附连到具有另一种功能(例如细胞毒性)的组成部分)的融合蛋白和/或抗体缀合物。在涉及融合蛋白和/或抗体缀合物的某些实施方案中，将宿主细胞用表达编码唾液酸酶和整个或一部分重链(例如重链可变区)或唾液酸酶和轻链(例如轻链可变区)的多肽或编码完整或一部分重链(例如重链可变区)或轻链(例如轻链可变区)的多肽的单一载体转染。在某些实施方案中，将宿主细胞用单一载体转染，所述载体编码(a)包含重链可变区的多肽和包含轻链可变区的多肽，或(b)完整免疫球蛋白重链和完整免疫球蛋白轻链，其中在(a)中或(b)中，所述多肽还可以包含唾液酸酶。在某些实施方案中，将宿主细胞用超过一个表达载体共转染(例如一个表达载体表达包含完整或一部分重链或重链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶，并且另一个表达载体表达包含完整或一部分轻链或轻链可变区的多肽，任选地包含融合到它的唾液酸酶)。
包含融合蛋白(例如包含免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区的融合蛋白)的多肽，可以通过将用编码这种可变区的表达载体转染的宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后，所述多肽可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。
在生产融合蛋白和/或抗体缀合物的实施方案中，融合到单克隆抗体、抗体的Fc结构域或抗原结合结构域的唾液酸酶，可以通过将宿主细胞在允许两条链表达的条件下生长(培养)来生产，所述宿主细胞用下述表达载体转染：(a)编码完整或部分免疫球蛋白重链的表达载体，和编码完整或部分免疫球蛋白轻链的分开的表达载体；或(b)编码两条链(例如完整或部分重链和轻链)的单一表达载体。所述唾液酸酶将被融合到所述链中的一者或多者。所述完整的融合蛋白和/或抗体缀合物可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如蛋白A、蛋白G、亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。从单一表达载体或两个分开的表达载体表达重链和轻链，在本领域的常规技术之内。
在某些实施方案中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，将所述蛋白质的本源N-端信号序列用例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:28)代替。在某些实施方案中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，添加N-端信号序列例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO:28)。另外的示例性的N-端信号序列包括来自于白介素-2、CD-5、IgGκ轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素的信号序列。在某些实施方案中，为了将蛋白质例如融合蛋白作为分泌蛋白表达，将C端溶酶体信号基序例如YGTL(SEQ IDNO:29)移除。
用于降低或消除抗体和抗体片段的抗原性的方法在本领域中是已知的。当所述抗体将要施用到人类时，优选地将所述抗体“人源化”以降低或消除在人类中的抗原性。优选地，每个人源化抗体与它所源自的非人源化小鼠抗体对所述抗原具有相同或基本上相同的亲和性。
在一种人源化方法中，产生了其中将小鼠免疫球蛋白恒定区用人类免疫球蛋白恒定区代替的嵌合蛋白。参见例如Morrison等人，1984,PROC.NAT.ACAD.SCI.81:6851-6855；Neuberger等人，1984,NATURE 312:604-608；美国专利号6,893,625(Robinson)；5,500,362(Robinson)；和4,816,567(Cabilly)。
在被称为CDR嫁接的方法中，将轻链和重链可变区的CDR嫁接刀来自于另一个物种的构架中。例如，可以将鼠类CDR嫁接到人类FR中。在某些实施方案中，将抗体的轻链和重链可变区的CDR嫁接到人类FR或共有人类FR中。为了产生共有人类FR，将来自于几个人类重链或轻链氨基酸序列的FR比对以鉴定共有氨基酸序列。CDR嫁接被描述在美国专利号7,022,500(Queen)；6,982,321(Winter)；6,180,370(Queen)；6,054,297(Carter)；5,693,762(Queen)；5,859,205(Adair)；5,693,761(Queen)；5,565,332(Hoogenboom)；5,585,089(Queen)；5,530,101(Queen)；Jones等人，(1986)NATURE 321:522-525；Riechmann等人，(1988)NATURE 332:323-327；Verhoeyen等人，(1988)SCIENCE 239:1534-1536；和Winter(1998)FEBS LETT 430:92-94中。
在被称为“SUPERHUMANIZATIONTM”的方法中，在人类CDR与待人源化的小鼠抗体的CDR的结构相似性的基础上，从人类胚系基因选择人类CDR序列。参见例如美国专利号6,881,557(Foote)；和Tan等人，2002,J.IMMUNOL.169:1119-1125。
降低免疫原性的其他方法包括“重塑”、“过度嵌合”和“镶饰/表面重修”。参见例如Vaswami等人，1998,ANNALS OF ALLERGY,ASTHMA,&IMMUNOL.81:105；Roguska等人，1996,PROT.ENGINEER9:895-904；和美国专利号6,072,035(Hardman)。在镶饰/表面重修方法中，将鼠类抗体中表面可接近的氨基酸残基用在人类抗体中在相同位置处更频繁存在的氨基酸残基代替。这种类型的抗体表面重修被描述在例如美国专利号5,639,641(Pedersen)中。
用于将小鼠抗体转变成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法被称为ACTIVMABTM技术(Vaccinex,Inc.,Rochester,NY)，其涉及基于痘苗病毒的载体以在哺乳动物细胞中表达抗体。可以产生高水平的IgG重链和轻链的组合多样性。参见例如美国专利号6,706,477(Zauderer)；6,800,442(Zauderer)；和6,872,518(Zauderer)。用于将小鼠抗体转变成适合于人类使用的形式的另一种方法是一种在由KaloBios Pharmaceuticals,Inc.(Palo Alto,CA)商业实践的技术。这种技术涉及使用专有的人类“受体”文库来生产“聚焦于表位的”文库用于抗体选择。用于将小鼠抗体修改成适合于人类中的医学用途的形式的另一种方法是“人类工程”(HUMAN ENGINEERINGTM)技术，其由XOMA(US)LLC商业实践。参见例如国际(PCT)公布号WO 93/11794和美国专利号5,766,886(Studnicka)；5,770,196(Studnicka)；5,821,123(Studnicka)；和5,869,619(Studnicka)。
任何适合的方法，包括任何上述方法，可用于降低或消除抗体的人类免疫原性。
此外，可以在小鼠中产生全人抗体。缺少任何非人类序列的全人mAb可以从人免疫球蛋白转基因小鼠，通过在例如Lonberg等人，NATURE 368:856-859,1994；Fishwild等人，NATURE BIOTECHNOLOGY 14:845-851,1996；和Mendez等人，NATURE GENETICS 15:146-156,1997中参考的技术来制备。全人单克隆抗体也可以从噬菌体展示文库，通过在例如Knappik等人，J.MOL.BIOL.296:57-86,2000；和Krebs等人，J.IMMUNOL.METH.254:67-84 2001中参考的技术来制备和优化。
本发明涵盖了包含抗体片段的融合蛋白，所述抗体片段可以通过传统手段例如酶消化或通过重组技术来产生。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，(2003)NAT.MED.9:129-134。
已开发了各种不同的技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化来衍生(参见例如Morimoto等人，(1992)JOURNAL OFBIOCHEMICAL ANDBIOPHYSICALMETHODS24:107-117；和Brennan等人，(1985)SCIENCE229:81)。然而，这些片段现在可以通过重组宿主细胞直接生产。Fab、Fv和ScFv抗体片段都可以在大肠杆菌中表达并从其分泌，从而允许容易地生产大量这些片段。抗体片段可以从抗体噬菌体文库分离。或者，可以将Fab’-SH片段从大肠杆菌直接回收并化学偶联，以形成F(ab’)2片段(Carter等人，(1992)BIO/TECHNOLOGY10:163-167)。根据另一种方法，可以从重组宿主细胞培养物直接分离F(ab’)2片段。包含援救受体结合表位残基的具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段，被描述在美国专利号5,869,046中。用于生产抗体片段的其他技术对于专业技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见美国专利号5,571,894和5,587,458。
用于制造双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。参见Milstein和Cuello(1983)NATURE 305:537，国际(PCT)公布号WO93/08829，和Traunecker等人，(1991)EMBO J.,10:3655。对于产生双特异性抗体的进一步细节，参见例如Suresh等人，(1986)METHODSENZYMOL.121:210。双特异性抗体包括交联的或“异体缀合的”或“异二聚体”抗体。例如，所述异二聚体中的抗体之一可以被偶联到亲和素，另一者被偶联到生物素。异二聚体抗体可以使用任何方便的交联方法来制造。适合的交联剂在本领域中是公知的，并与大量交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。
异二聚体或不对称IgG样分子的实例包括但不限于使用下述技术获得会使用下述格式的分子：Triomab/Quadroma，杵臼(Knobs-into-Holes)，CrossMabs，静电匹配的抗体，LUZ-Y，链交换工程化结构域体，Biclonic和DuoBody。
使用抗体片段(例如F(ab)和F(ab’)2片段)的优点包括消除抗体的Fc部分与细胞(例如巨噬细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞和B细胞)上的Fc受体之间的非特异性结合。此外，由于它们更小的尺寸，它们可能能够更高效地穿透组织。
异二聚体抗体或不对称抗体允许更大的灵活性和新的格式，用于将各种不同药物附连到抗体臂。用于产生异二聚体抗体的通用格式之一是“杵臼”(knobs-into-holes)格式。这种格式特异性针对抗体中恒定区的重链部分。所述“杵”部分通过将小的氨基酸用更大的氨基酸代替来构造，其适合被纳入“臼”中，所述臼通过将大的氨基酸用更小的氨基酸代替来构造。将所述“杵”连接到“臼”的是每条链之间的二硫键。所述“杵臼”形状促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。将单链可变区片段(scFv)通过短的接头肽连接到所述重链和轻链的可变结构域。所述接头富含提供更大柔性的甘氨酸和提供特异性的丝氨酸/苏氨酸。两个不同的scFv片段可以通过铰链区一起连接到重链的恒定结构域或轻链的恒定结构域。这为所述抗体提供了双特异性，允许两种不同抗原的结合特异性。所述“杵臼”格式加强异二聚体形成但不抑制同二聚体形成。
几种支持异二聚化的方法已被描述在例如国际(PCT)公布号WO96/27011、WO98/050431、WO2007/110205、WO2007/147901、WO2009/089004、WO2010/129304、WO2011/90754、WO2011/143545、WO2012/058768、WO2013/157954和WO2013/096291以及欧洲专利公布号EP1870459中。通常，在本领域中已知的方法中，将第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域两者以互补的方式工程化，使得包含一个工程化的CH3结构域的重链不再能够与另一个具有相同结构的重链同二聚化(例如CH3工程化的第一重链不再能够与另一个CH3工程化的第一重链同二聚化；并且CH3工程化的第二重链不再能够与另一个CH3工程化的第二重链同二聚化)。由此迫使包含一个工程化的CH3结构域的重链与包含以互补方式工程化的CH3结构域的另一个重链异二聚化。作为结果，所述第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域通过氨基酸取代以互补的方式工程化，使得所述第一重链和第二重链被迫异二聚化，而所述第一重链和第二重链不再能够同二聚化(例如由于空间位阻的原因)。
III.药物组合物
对于治疗使用来说，优选地将融合蛋白和/或抗体缀合物与可药用载体组合。当在本文中使用时，术语“可药用”是指那些在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏响应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏响应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药载体例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin,Remington’s PharmaceuticalSciences，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在这些实施方案中，适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色、调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醇)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)，递送媒介物，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂(参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company,1990)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有纳米粒子例如聚合物纳米粒子、脂质体或胶束(参见Anselmo等人，(2016)BIOENG.TRANSL.MED.1:10-29)。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有持续或受控递送配方。用于配制持续或受控递送手段例如脂质体载体、可生物侵蚀的微粒或多孔珠和储库注射剂的技术，对于本领域技术人员来说也是已知的。持续释放制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或采取塑形制品例如薄膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一种来制备。
含有本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜、鞘内和直肠施用。在某些实施方案中，本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过IV输注施用。在某些实施方案中，本文中公开的唾液酸酶融合蛋白或抗体缀合物通过肿瘤内注射施用。有用的剂型可以通过制药领域中已知的方法来制备。例如参见Remington’sPharmaceutical Sciences，第18版，(Mack Publishing Company,1990)。适合于肠胃外施用的剂型组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内施用来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存的条件下应该稳定，并且应该针对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。
在某些实施方案中，药物组合物可以含有稳定剂。在某些实施方案中，所述稳定剂是阳离子，例如二价阳离子。在某些实施方案中，所述阳离子是钙或镁。所述阳离子可以采取盐的形式，例如氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)。
在某些实施方案中，所述稳定剂以约0.05mM至约5mM的量存在。例如，所述稳定剂可以以约0.05mM至约4mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、约0.05mM至约1mM、约0.05mM至约0.5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM或约1mM至约2mM的量存在。
药物制剂优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法来实现，例如通过无菌滤膜过滤。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，可以在冷冻干燥和复溶之前或之后进行过滤除菌。
本文描述的组合物可以局部或系统性施用。施用通常是肠胃外施用。在优选实施方案中，所述药物组合物被皮下施用，并且在甚至更优选实施方案中被静脉内施用。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。
通常，活性组分例如融合蛋白和/或抗体缀合物的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。所述施用的量将取决于变量例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、所述抗体的体内效能、药物配方和施用途径。可以将初始剂量提高到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最佳剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计在0.5mg/kg至20mg/kg运行的常规I期剂量递增研究中优化。施用频率可以随着多种因素而变，例如施用途径、剂量、所述融合蛋白和/或抗体缀合物的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的施用频率是每日一次、每周一次和每两周一次。优选的施用途径是肠胃外，例如静脉内输注。在某些实施方案中，将融合蛋白和/或抗体缀合物冷冻干燥，然后在施用时在缓冲盐水中复溶。
IV.治疗用途
本文中公开的组合物和方法可用于在受试者中治疗各种不同形式的癌症或在受试者中抑制癌生长。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括单独地或与另一种治疗剂相组合向所述受试者施用有效量的唾液酸酶抗HER2融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文中公开的融合蛋白或抗体缀合物，以在所述受试者中治疗所述癌症。当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性剂(例如根据本发明的融合蛋白)的量。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用，并且不预期限于特定制剂或施用途径。
当在本文中使用时，“治疗”意味着在受试者例如人类中治疗疾病。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的减退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿类、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，并且更优选地包括人类。
癌症的实例包括实体瘤、软组织肿瘤、血液肿瘤和转移性病变。血液肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或里克特氏综合征(里克特氏转化)。实体瘤的例子包括各种不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和恶性上皮肿瘤，例如那些影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、泌尿上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞，例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑色素瘤)的恶性肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是上皮癌，例如上调唾液酸化聚糖的表达的上皮癌。上皮癌的实例包括但不限于子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌或输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。上皮癌还包括恶性上皮肿瘤，例如腺泡癌、腺癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌、基底类癌、基底、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、癌样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维状癌，胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛发基质癌、多血癌、、肝细胞癌、嗜酸细胞癌、玻璃样癌、肾上腺样癌、婴儿期胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、类骨癌、乳头状癌、门周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯性癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、纺锤细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、串状癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性皮癌、结节性癌、疣状癌和绒毛状癌。
在某些实施方案中，所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如，子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管与食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、原发灶不明的癌症(CUP)、结直肠腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、头颈鳞状细胞癌、胸腺癌、非黑色素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮细胞卵巢癌(非EOC)、葡萄膜黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。
在某些实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌或肾癌。
在某些实施方案中，所述癌症是腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。在某些实施方案中，所述癌症是难治性癌症。
在某些实施方案中，所述癌症对使用抗体例如具有ADCC活性的抗体例如曲妥珠单抗的治疗具有抗性或无响应。
本文描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或方式相组合使用。当在本文中使用时，术语“相组合”施用被理解为意味着在所述受试者患有障碍的过程中向所述受试者递送两种(或更多种)不同治疗，使得对所述患者的治疗效果在时间点上交叠。在某些实施方案中，在一种治疗的递送仍在进行时开始第二种治疗的递送，使得在施用方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方案中，由于组合施用，所述治疗更加有效。例如，所述第二种治疗更加有效，例如使用更少的第二种治疗看到等同的效果，或者所述第二种治疗以比在不存在第一种治疗的情况下施用所述第二种治疗时观察到的更大的程度减轻症状，或者在使用第一种治疗时观察到类似的情况。在某些实施方案中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的降低大于在不存在一种治疗的情况下递送另一种治疗时观察到的降低。所述两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得在递送第二种治疗时递送的第一种治疗的效果仍然可检测。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法例如手术、放疗或另一种化学制剂的施用相组合施用。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括化疗例如细胞毒性药剂。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括靶向疗法，例如酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增殖化合物，例如甾类、生物免疫调节剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀类、抗炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在某些实施方案中，所述另外的疗法可以包括不同类别治疗剂的组合。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与检查点抑制剂相组合施用。所述检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂和TIGIT拮抗剂。
在某些实施方案中，所述检查点抑制剂是PD-1或PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T-细胞表面上的一种充当免疫系统检查点的受体，其在适合的时间抑制或以其他方式调节T-细胞活性以防止免疫系统过度活化。然而，癌细胞可以通过表达配体例如与T-细胞表面上的PD-1相互作用的PD-L1来利用这个检查点，以关闭或调节T-细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。利用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性的治疗方法被描述在美国专利号8,728,474和9,073,994以及欧洲专利号1537878B1中，并且包括例如使用抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体被描述在例如美国专利号8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(/>MerckSharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，CureTech)。示例性的抗PD-L1抗体被描述在例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(Genentech)、德瓦鲁单抗(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗和BMS 936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂相组合施用。在CTLA-4途径中，T-细胞上的CTLA-4与其在抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面上的配体(例如也被称为B7-1的CD80和CD86)的相互作用导致T-细胞抑制。示例性的基于CTLA-4的免疫检查点抑制方法被描述在美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性的抗CTLA-4抗体被描述在美国专利号6,984,720、6,682,736、7,311,910、7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984、国际(PCT)公开号WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424以及欧洲专利号EP 1212422 B1中。示例性的CTLA-4抗体包括伊匹单抗或曲美单抗。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与(i)PD-1或PD-L1抑制剂例如本文中公开的PD-1或PD-L1抑制剂和(ii)CTLA-4抑制剂例如本文中公开的CTLA-4抑制剂相组合施用。
在某些实施方案中，本文中描述的方法或组合物与IDO抑制剂相组合施用。示例性的IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(被称为indoximod)、epacadostat(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)和BMS-986205。
可以与本文中描述的方法或组合物相组合施用的示例性细胞毒性药剂包括例如抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、含铂药剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC抑制剂例如伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古柳菌素A(TSA)、mocetinostat(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228、缩酚酸肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类、埃博霉素、插层剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进凋亡的药剂和辐射或结合表面蛋白以递送有毒药剂的抗体分子缀合物。在一个实施方案中，可以与本文中描述的方法或组合物一起施用的细胞毒性药剂是基于铂的药剂(例如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、拓扑替康、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙素、蒽环类抗生素(例如多柔比星或表柔比星)、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒素或美登素类化合物。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文中公开的融合蛋白或抗体缀合物相接触。在某些实施方案中，所述细胞选自树突状细胞和外周血单核细胞(PBMC)。
在某些实施方案中，相对于尚未与所述融合蛋白或抗体缀合物相接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞、组织或受试者中HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ、IL-1b、IL-6、TNFα、IL-17A、IL-2或IL-6的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA或通过Luminex多重测定法。
本发明还提供了一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白和/或抗体缀合物，例如本文中公开的融合蛋白或抗体缀合物。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T-细胞例如CD4+和/或CD8+T-细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T-细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方案中，相对于尚未施用所述融合蛋白或抗体缀合物的相似或在其他方面相同的肿瘤和/或受试者，在所述受试者中免疫细胞在所述肿瘤中的浸润被提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。免疫细胞在肿瘤中的浸润可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白和/或抗体缀合物，例如本文中公开的融合蛋白或抗体缀合物，以便相对于所述融合蛋白、抗体缀合物，或药物组合物的施用之前增加循环NK细胞的数目。
在某些实施方案中，相对于尚未施用所述融合蛋白或抗体缀合物的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中循环NK细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中的循环NK细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中提高引流淋巴结中T-细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的融合蛋白、抗体缀合物和/或药物组合物，例如本文中公开的融合蛋白、抗体缀合物和/或药物组合物，以便相对于所述融合蛋白、抗体缀合物，或药物组合物的施用之前增加引流淋巴结中T-细胞的数目。在某些实施方案中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+T-细胞。
在某些实施方案中，相对于尚未施用所述融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中所述引流淋巴结中T-细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中引流淋巴结中的T-细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的融合蛋白、抗体缀合物和/或药物组合物例如本文公开的融合蛋白、抗体缀合物和/或药物组合物相接触，以便相对于与所述融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者提高所述Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
在某些实施方案中，相对于尚未与所述融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物接触的相似或在其他方面相同的细胞、组织或受试者，在所述细胞、组织或受试者中Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或Nanostring技术。
本发明还提供了一种从细胞或组织除去唾液酸的方法。所述方法包括将所述细胞或组织与有效量的融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物相接触。本发明还提供了一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物的药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
在某些实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。在某些实施方案中，所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子(例如HLA-DR)的表达提高。在某些实施方案中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体缀合物接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞或组织中MHC-II分子的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或流式细胞术。
本发明还提供了一种增强肿瘤细胞的吞噬的方法。所述方法包括将所述肿瘤细胞与有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物相接触，从而增强所述肿瘤细胞的吞噬。在某些实施方案中，本公开涉及一种在受试者中提高肿瘤细胞的吞噬的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物组合物，所述药物组合物以有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量包含融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬。
在某些实施方案中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体缀合物接触的相似或在其他方面相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞群体，吞噬提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。吞噬可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种活化树突状细胞(DC)的方法。所述方法包括将所述DC与已用融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物处理的肿瘤细胞相接触。在某些实施方案中，本公开涉及一种在受试者中活化树突状细胞(DC)或DC群体的方法，所述方法包括以有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者施用包含融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物的药物组合物，由此在所述受试者中活化所述DC或DC群体。
在某些实施方案中，相对于尚未与已用所述融合蛋白和/或抗体缀合物处理的肿瘤细胞接触的相似或在其他方面相同的DC或DC群体，所述DC或DC群体的活化提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。活化可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
本发明还提供了一种降低Siglec-15结合活性，从而提高肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括将T细胞与融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物相接触。在某些实施方案中，本公开涉及一种降低患者的Siglec-15结合活性，从而提高肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的包含融合蛋白和/或抗体缀合物例如本文公开的融合蛋白或抗体缀合物的药物组合物，从而在所述受试者中提高抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
在某些实施方案中，相对于尚未与所述融合蛋白和/或抗体缀合物接触的Siglec-15，Siglec-15结合活性降低至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％或约100％。结合可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量。
在整个本说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为是包括在所叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所述叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自所述叙述的要素或组分中的两者或更多者。
此外应该理解，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以在不背离本发明的精神和范围的情况下以各种不同方式组合，不论在本文中是明示还是暗示。例如，在提及特定化合物的情况下，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方案中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，实施方案以能够书写和绘制清楚简明的申请的方式进行描述和描绘，但预期并且应该认识到实施方案可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本文的教授和发明。例如应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点均可适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”包括在所述表述后的单独的每个叙述的受试者以及所述叙述的受试者中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和使用中另有理解。与三个或更多个叙述的受试者相关联的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”、“含义”、包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除另外的未叙述的要素或步骤，除非从上下文另有具体陈述或理解。
在将术语“约”用于定量值之前的情况下，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从标称值偏差±10％，除非另有指示或推测。
应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中任何和所有实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用，仅预期更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外提出权利要求。本说明书中的任何语言均不应被解释为表明任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不意在以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1
本实施例描述了带有提高唾液酸酶的表达和/或活性的突变的重组人唾液酸酶的构建。
构建了在A42位置处包含合理设计的取代的突变Neu2唾液酸酶。同源唾液酸酶的结构分析表明，将G147R神经氨酸酶(唾液酸酶)突变从甲型流感(H1N1)pdm09转移到人类Neu2上可能具有稳定作用。
使用pCEP4哺乳动物表达载体使Neu2-M259-Fc(具有氨基酸序列SEQ ID NO:210，由核苷酸序列SEQ ID NO:217编码，并且包括突变M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A)在Expi293人细胞的1L转染中表达。使用蛋白A、随后进行阳离子交换和陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析来纯化Neu2-M259-Fc，使用UV-Vis光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。
在本实施例中制备和测试的另外的突变Neu2唾液酸酶包含Neu2-M260-Fc(具有氨基酸序列SEQ ID NO:220，由核苷酸序列SEQ ID NO:221编码，并且包括突变M1D、V6Y、P62G、A93E、Q112E、Q126Y、I187K、Q270T、A242F和C332A)、Neu2-M261-Fc(具有氨基酸序列SEQ IDNO:222，由核苷酸序列SEQ ID NO:223编码，并且包括突变M1D、V6Y、P62G，A93E、Q126Y、I187K、E225C、Q270T、A290C、A242F和C332A)、Neu2-M106-Fc(具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，由核苷酸序列SEQ ID NO:89编码，并且包括突变M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A)，和Neu2-173-Fc(具有氨基酸序列SEQ ID NO:159，由核苷酸顺序SEQ ID NO:181编码，并且包括突变M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A)。
图4A是示出在非还原和还原条件下的Neu2-M259-Fc的SDS-PAGE凝胶图像。图4B是Neu2-M259-Fc的SEC-HPLC迹线，其中单体物质的滞留时间为21.7分钟，并且单体含量为96％。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定Neu2-M259-Fc、Neu2-M260-Fc、Neu2-M261-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的酶动力学。Neu2-M259-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的Michaelis-Menton动力学表征(在可变底物浓度下测量)描绘在图5A中。估计的KM值为0.27mM(Neu2-M106-Fc)、0.46mM(Neu2-M173-Fc)和0.20mM(Neu2-M259-Fc)。Neu2-M259-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的酶效力(在可变酶浓度下测量)描绘在图5B中。EC50近似值为20.7μg/mL(Neu2-M106-Fc)、38.3μg/mL(Neu2-M173-Fc)和15.18μg/mL(Neu2-M259-Fc)。
测定了Neu2-M259-Fc、Neu2-M260-Fc、Neu2-M261-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的热稳定性。将样品制备为0.2mg/mL，并在37℃至80℃的温度梯度内温育15分钟。然后通过将2μg酶与0.5mM 4-MU-Neu5Ac底物一起温育来测量酶活性。通过拟合酶活性曲线对比温度曲线来确定Tm。图6描绘了Neu2-M259-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的热稳定性表征。
Neu2-Fc变体M106-Fc、M173-Fc、M259-Fc、Neu2-M260-Fc和Neu2-M261-Fc的某些生化属性的总结描绘在表10中。在表10中，酶促活性表示为“+++”，其表示活性比野生型Neu2高>2倍；或“++”，其表示活性与野生型Neu2相当。总之，这些结果表明Neu2-Fc变体M259-Fc和M260-Fc相对于M106-Fc和M173-Fc构建物具有改进的表达产量和热稳定性，并且M261-Fc相对于M106-Fc和M173-Fc构建物具有改进的表达产量。
表10
通过将样品以1mg/mL在37℃下温育4小时、24小时或5天来进一步测定Neu2-M259-Fc、Neu2-M106-Fc和Neu2-173-Fc的热稳定性。然后使用4-MU-Neu5Ac测定法测量酶活性。结果描绘在图7中并且显示Neu2-M259-Fc的热稳定性增加。
对Neu2变体M-259-Fc中的十个突变进行了系统分析，以确定每个取代的贡献。Neu2变体M-259-Fc中的十个突变中的每一个突变均回复突变为野生型Neu2中的相应残基，从而产生十个变体(M262-Fc到M271-Fc)，每个变体具有九个突变。表11中描述了所得变体。
表11
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使用pCEP4哺乳动物表达载体使M259-Fc、M262-Fc至M270-Fc和M173-Fc在Expi293人细胞中表达，使用一步蛋白-A纯化进行纯化，用UV-Vis光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SEC-HPLC进行检查。通过测量唾液酸从荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定酶动力学。通过如上所述在37℃至80℃的温度梯度下温育样品、随后测量酶活性来测定热稳定性。通过拟合酶活性曲线对比温度曲线来确定Tm。结果描述于表12中。在表12中，酶促活性表示为“+++”，其表示活性比野生型Neu2高>2倍；“++”，其表示活性与野生型Neu2相当；或“+”，其表示活性低于野生型Neu2。
表12
总之，结果表明去除M259-Fc中的单个突变中的每一个对单体百分比、产量、热稳定性或酶活性中的至少一者产生负面影响。换言之，发现突变中的每个均对M259-Fc构建物的单体百分比、产量、稳定性和活性中的至少一者有贡献。
实施例2
本实施例描述了使用突变的人唾液酸酶构建和表达抗HER2抗体-唾液酸酶基因融合蛋白和含有该融合蛋白的抗HER2抗体唾液酸酶缀合物(ASC)。
五种类型的示例性ASC的结构体系描绘在图3中。第一种类型的ASC被称为“Raptor”，包括抗体(具有两条重链和两条轻链)，该抗体具有融合在所述抗体的每条重链的C-端处的唾液酸酶(图3A)。第二种类型的ASC被称为“Janus”，含有一条抗体臂(具有一条重链和一条轻链)和一个唾液酸酶-Fc融合体，所述融合体具有融合在Fc的一条臂的N-端处的唾液酸酶。所述Janus ASC中的每个Fc结构域多肽含有用于异二聚化的“杵”(T366Y)或“臼”(Y407T)突变(残基编号按照EU编号系统，Kabat,E.A.等人，(1991)，同上)(图3B)。第三种类型的ASC被称为“Lobster”，含有两个Fc结构域多肽，每个Fc结构域多肽具有融合在Fc的N-端处的唾液酸酶和融合在Fc的C-端处的scFv(图3C)。第四种类型的ASC被称为“Bunk”，含有具有融合在Fc的一条臂的C-端处的scFv的一条抗体臂(具有一条重链和一条轻链)，和一个唾液酸酶-Fc融合体，该融合体具有融合在Fc的另一条臂的N-端处的唾液酸酶。BunkASC中的每个Fc结构域多肽含有用于异二聚化的“杵”(T366Y)或“臼”(Y407T)突变(残基编号按照EU编号系统，Kabat,E.A.等人，(1991)，同上)(图3D)。第五种类型的ASC被称为“Lobster-Fab”，含有两个Fc结构域多肽，每个Fc结构域多肽具有融合在Fc的N-端处的唾液酸酶和融合在Fc的C-端处的Fab(图3E)。
使用带有M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代的Neu2和曲妥珠单抗制备Janus抗体唾液酸酶缀合物(ASC)。该ASC被称为“Janus曲妥珠单抗2”，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189、由核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的第二多肽链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:205、由核苷酸序列SEQ ID NO:246编码的第三多肽链。
使用pCEP4哺乳动物表达载体使Janus曲妥珠单抗2在Expi293人类细胞的1,000mL转染中表达。使用蛋白A、阳离子交换和陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析纯化ASC，使用UV-Vis光度计(NanoDrop)进行定量，并通过SDS-PAGE进行检查。Janus曲妥珠单抗2表达良好，具有如通过SEC-HPLC确定的95％单体纯度(图8)。
通过如上所述测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定重组表达的Janus曲妥珠单抗2的酶促活性。Janus曲妥珠单抗2具有酶促活性，且Vmax为2.2x108。
通过使用ForteBio Octet将ASC捕获在抗Fc传感器上并浸泡在HER2的连续稀释液(从100nM开始，在2x系列稀释中滴定)，来测试Janus曲妥珠单抗2的抗原(HER2)结合。从信号中减去缓冲液参考并将其与基线比对。使用1:1拟合模型生成KD、Kon和Koff值。如图9所示，Janus曲妥珠单抗2以5.5E-10的KD、1.24E06(1/Ms)的Kon和6.91E-04(1/s)的Koff与HER2结合。
使用具有M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、E218A、A242F、Q270T和C332A取代的Neu2和曲妥珠单抗制备额外的Janus抗体唾液酸酶缀合物(ASC)。该ASC包括导致唾液酸酶活性丧失的E218A突变，被称为“Janus Trastuzumab LOF”或“Janus LOF”，并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链；具有氨基酸序列SEQ ID NO：189、由核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的第二多肽链；和具有氨基酸序列SEQ ID NO：250、由核苷酸序列SEQ ID NO:251编码的第三多肽链。
Janus LOF通常如上所述表达和纯化，在100mg/mL下产生89％单体纯度的蛋白质，并且没有可测量的酶活性。
实施例3
本实施例描述了含有人唾液酸酶的抗HER2抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的体内施用。
本实施例中制备和测试了Janus曲妥珠单抗2，其是如上文实施例2中所描述并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66的由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189的由核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的第二多肽链以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:205的由核苷酸序列SEQ ID NO:246编码的第三多肽链。
在注射了稳定表达人HER2(EMT6-HER2)的小鼠乳腺癌细胞系的小鼠同基因肿瘤模型中，将Janus曲妥珠单抗2与同种型对照抗体和曲妥珠单抗进行比较。在6-8周龄的小鼠右下腹区域皮下接种表达HER2的细胞以促进肿瘤发育。当肿瘤达到平均约75-100mm 3时，将小鼠随机分配到5组(每组8只动物)，并如表13所示进行治疗。
表13
通过每隔一天腹膜内注射10mg/kg的曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗2或同种型对照对小鼠进行治疗，并记录肿瘤体积(mm3)。完全响应(CR)被定义为在研究期间的任何时间点低于触及极限的消退，而部分响应(PR)被定义为可触及肿瘤，而实际上没有肿瘤。
单个小鼠的肿瘤体积示出在图10A-10E中。如所描绘，与同等剂量的曲妥珠单抗相比，Janus曲妥珠单抗2表现出基于CR和PR的抗肿瘤活性增加。平均肿瘤体积在图10F中示出。总的来说，这些结果表明Janus曲妥珠单抗2构建物表现出与曲妥珠单抗相当或更高的活性。
实施例4
本实施例描述了抗HER2抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的表征。
本实施例中制备并且测试了以下：Janus曲妥珠单抗2，其如上文实施例2中所描述并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189、由核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的第二多肽链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:205、由核苷酸序列SEQ ID NO:246编码的第三条多肽链；和JanusLOF，其如上文实施例2中所描述，并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189、由核苷酸序列SEQ IDNO:245编码的第二多肽链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:250、由核苷酸序列SEQ ID NO:251编码的第三多肽链。
通过如上所述测量唾液酸从荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定Janus曲妥珠单抗2的酶活性。结果如图11所示。Janus曲妥珠单抗2的Vmax为0.002354mM/min，Km为1.464mM，并且Kcat为每秒8260。
通过将包含2μg Janus曲妥珠单抗2和0.5mM底物的样品在37℃至80℃的温度梯度下温育15分钟来测定Janus曲妥珠单抗2的热稳定性。然后测量酶活性，并且通过拟合酶活性曲线与温度曲线来确定Tm。结果在图12中示出。Janus曲妥珠单抗2的热稳定性(Tm)为58.7±0.2℃。
还评估了Janus曲妥珠单抗2使具有低水平或高水平HER2表达的人肿瘤细胞去唾液酸化的能力。将细胞与不同浓度的Janus曲妥珠单抗2或无酶活性的Janus LOF在37℃下温育17小时。洗涤细胞，然后用Hydra9染色细胞，Hydra9是人Siglec 9胞外结构域的六聚体型式(如国际(PCT)申请公布号WO2019/237070中所述)。Hydra9与细胞表面上基于唾液酸的糖结构结合，因此Hydra9染色的减少指示脱唾液酸化。还用生物素化花生凝集素(PNA，Vector Laboratories，B-1075-5)染色细胞。PNA与因唾液酸的去除而暴露的半乳糖基结构结合，因此PNA染色的增加指示脱唾液酸化。
使用SKBR-3细胞(一种具有高水平HER2表达的人细胞系)的结果在图13中示出。图13A描绘了用Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理后的Hydra9染色。Janus曲妥珠单抗2展现出.0002992μg/mL的IC50，而Janus LOF没有展现出明显的活性。图13B描绘了用Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理后的PNA染色。Janus曲妥珠单抗2展现出0.1298μg/mL的EC50，而Janus LOF没有展现出明显的活性。
使用HT-29细胞(一种具有低但可检测的水平的HER2表达的人细胞系)的结果在图14中示出。图14A描绘了用Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理后的Hydra9染色。Janus曲妥珠单抗2展现出0.1129μg/mL的IC50，而Janus LOF没有展现出明显的活性。图14B描绘了用Janus曲妥珠单抗2或Janus LOF处理后的PNA染色。Janus曲妥珠单抗2展现出14.48μg/ml的EC50，而Janus LOF没有展现出明显的活性。
Janus曲妥珠单抗2对表达较高HER2的SKBR-3细胞的IC50值和EC50值均低于对表达较低HER2的HT-29细胞的相应IC50和EC50值，这表明HER2抗体介导的细胞结合增加细胞表面脱唾液酸化效率。
实施例5
本实施例描述了使用抗HER2抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬测定(ADCP)测定。
对于ADCC测定，将自然杀伤细胞(1024-5133JN21，Cellero/Hemacare)在含有10％热灭活胎牛血清、抗生素和浓度为10ng/mL的重组人白细胞介素-2的RPMI-1640培养基中培养过夜。在ADCC测定当天，收获、洗涤并计数NK细胞。
将靶肿瘤细胞系在补充有10％热灭活胎牛血清、抗生素、非必需氨基酸、丙酮酸的适当培养基中培养，并且通过传代2-3次生长至对数生长期。通过用PBS洗涤来制备靶肿瘤细胞，将该细胞通过用细胞消化液(Accutase)处理从培养皿中取出，用PBS洗涤，离心，并以25个细胞/mL的浓度重悬于适当的培养基中。
用浓度为10μg/mL的曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗2、Janus LOF或同种型对照(IgG)处理靶肿瘤细胞过夜(约15小时)。对于直接杀伤对照，用PBS处理靶肿瘤细胞。
ADCC测定以多个效应物:靶标(E:T)比率进行，并且每个比率设置一式三份。将50μL NK细胞等分到96孔V底测定板的孔中，并添加50μL先前处理的靶细胞(BT-20、HT-29或SK-BR-3)。对照孔包括仅靶细胞(10,000)、仅NK细胞(20,000、40,000或60,000)、靶细胞和裂解缓冲液、仅培养基，以及培养基和裂解缓冲液。将测定板在37℃下温育4小时，然后将测定板在250g下离心5分钟，并将50μL测定上清液转移至具有深色壁和透明底部的96孔平底板中。加入50μLLDH反应混合物，并且在室温下温育30分钟后，加入50μL终止溶液。使用SpectraMax i3x(Molecular Devices)分光光度计在490和680nm波长下测量分光光度法吸光度。
通过从实验、效应细胞自发、LDH释放对照和靶细胞自发LDH释放对照的平均值减去培养基背景对照的平均值来生成校正值。然后从靶细胞裂解LDH释放对照的平均值中减去体积校正对照的平均值。使用以下公式计算细胞毒性百分比：％细胞毒性＝(实验值-效应细胞自发对照-靶细胞自发对照)*100/(靶细胞最大对照-靶细胞自发对照)。
结果在图15中示出。图15A描绘了BT-20细胞的靶向性杀伤，图15B描绘了HT-29细胞的靶向性杀伤，并且图15C描绘了SKBR3细胞的靶向性杀伤。如图所描绘，ASC的ADCC得以维持，并且与曲妥珠单抗的ADCC相当。
对于ADCP测定，效应细胞的来源是由CD14+单核细胞产生的经细胞因子诱导且经培养的M2样巨噬细胞。按照制造商的方案通过Ficoll密度梯度(GE HealthcareBiosciences)从Leukopaks(ZenBio)中分离出PBMC。使用磁珠从PBMC中分离出CD14+单核细胞，并且将该细胞在含有20％热灭活胎牛血清、抗生素和50ng/mL重组人M-CSF的RPMI-1640培养基中培养5天。在第7天，通过细胞消化液处理和轻轻刮擦将M0/M2样巨噬细胞从培养皿中取出，并且使用补充有IL-10(20ng/mL)、TGF-β(50ng/mL)和M-CSF(20ng/mL)的相同培养基重新接种在24孔组织培养皿(每孔50,000个细胞)上，并且在37℃下温育48小时以极化为M2表型。在吞噬测定当天，通过用细胞消化液处理和温和的刮擦将极化的M2样巨噬细胞取出，洗涤该细胞并且对该细胞进行计数。
BT-20(乳腺)、HT-29(结肠直肠)和SK-BR-3(乳腺)肿瘤细胞系用作靶细胞。将靶肿瘤细胞系在补充有10％热灭活胎牛血清、抗生素、非必需氨基酸、丙酮酸的适当培养基中培养，并且通过传代2-3次生长至对数生长期。吞噬测定前一天，通过用细胞消化液处理收获靶细胞(BT-20、HT-29和SK-BR-3)，将该细胞洗涤、计数并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记。然后用浓度为10μg/mL和30μg/mL的曲妥珠单抗、Janus曲妥珠单抗2、Janus-LOF或同型对照(IgG)对靶肿瘤细胞进行过夜治疗。用PBS进行的处理被用作对照。
吞噬细胞(M2样巨噬细胞)对靶细胞的内化/吞噬导致CFSE阳性吞噬细胞。通过用流式细胞术测量CFSE+M2样巨噬细胞来计算吞噬％或杀伤％。所有吞噬测定均一式三份进行。在平底48孔板中以1:5(50,000个效应细胞和250,000个靶细胞)的效应子:靶标(E:T)比率一式三份设置吞噬测定。将测定板在37℃下温育2小时，然后将细胞从测定板上刮下，洗涤并且进行染色以分析活/死、CD45和CD14，并且使用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟。将细胞在PBS中洗涤两次并重悬于FACS染色缓冲液中。单染色的M2细胞和仅CFSE标记的靶细胞被用作对照。使用BD FACS Celesta(Becton Dickinson)FACS分析仪对细胞进行流式细胞术分析。使用FloJo(Tree Star/Becton Dickinson)软件程序分析结果并计算杀伤百分比。结果在图16中示出。
图16A描绘了由BT-20细胞的吞噬引起的杀伤百分比，图16B描绘了由HT-29细胞的吞噬引起的杀伤百分比，并且图16C描绘了由SKBR-3的吞噬引起的杀伤百分比。如图所示，ASC的ADCP得以维持并且与曲妥珠单抗的ADCP相当。
实施例6
本实施例描述了抗HER2抗体唾液酸酶缀合物(ASC)的体内施用。
本实施例中制备并且测试了以下：Janus曲妥珠单抗2，其如上文实施例2中所描述并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189、由核苷酸序列SEQ ID NO:245编码的第二多肽链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:205、由核苷酸序列SEQ ID NO:246编码的第三条多肽链；和JanusLOF，其如上文实施例2中所描述，并且包括具有氨基酸序列SEQ ID NO:66、由核苷酸序列SEQ ID NO:86编码的第一多肽链，具有氨基酸序列SEQ ID NO:189、由核苷酸序列SEQ IDNO:245编码的第二多肽链，以及具有氨基酸序列SEQ ID NO:250、由核苷酸序列SEQ ID NO:251编码的第三多肽链。
在注射了稳定表达人HER2(EMT6-HER2)的鼠乳腺癌细胞系的小鼠同基因肿瘤模型中，将Janus曲妥珠单抗2与同种型对照抗体、曲妥珠单抗和Janus LOF进行比较。在6-8周龄的小鼠右下腹区域皮下接种表达HER2的细胞以促进肿瘤发育。当肿瘤达到平均约75-100mm3时，将小鼠随机分配至6组(每组8只动物)，并且如表14中所示进行治疗。
表14
通过腹膜内注射指示的测试物品并每周给药两次来治疗小鼠，并记录肿瘤体积(mm 3)。
图17A-17F中示出了个体小鼠的肿瘤体积。图18A示出了用Janus曲妥珠单抗2(10mg/kg)或Janus LOF(10mg/kg)治疗的小鼠的平均肿瘤体积。用Janus曲妥珠单抗2、Janus LOF或曲妥珠单抗治疗的小鼠的存活曲线在图18B中示出。如图所示，相对于JanusLOF治疗，Janus曲妥珠单抗2治疗导致肿瘤生长减少。此外，相对于Janus LOF或曲妥珠单抗治疗，Janus曲妥珠单抗2治疗导致存活期延长。
通过引用并入
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等效方案
本发明可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方案在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的如权利要求书而不是由上述描述指明，并预期将在如权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。
序列表
SEQ ID NO:1:
MASLPVLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPIQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:2:
MEDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO:3:
EDLRP
SEQ ID NO:4:
MEDLRP
SEQ ID NO:5:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:6:
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAAC
SEQ ID NO:7:
ENDFGLVQPLVTMEQLLWVSGRQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKMSSSDEGAKFIALRRSMDQGSTWSPTAFIVNDGDVPDGLNLGAVVSDVETGVVFLFYSLCAHKAGCQVASTMLVWSKDDGVSWSTPRNLSLDIGTEVFAPGPGSGIQKQREPRKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWRYGSGVSGIPYGQPKQENDFNPDECQPYELPDGSVVINARNQNNYHCHCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGAVVTSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWRKETVQLWPGPSGYSSLATLEGSMDGEEQAPQLYVLYEKGRNHYTESISVAKISV
SEQ ID NO:8:
MEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO:9:
MRPADLPPRPMEESPASSSAPTETEEPGSSAEVMEEVTTCSFNSPLFRQEDDRGITYRIPALLYIPPTHTFLAFAEKRSTRRDEDALHLVLRRGLRIGQLVQWGPLKPLMEATLPGHRTMNPCPVWEQKSGCVFLFFICVRGHVTERQQIVSGRNAARLCFIYSQDAGCSWSEVRDLTEEVIGSELKHWATFAVGPGHGIQLQSGRLVIPAYTYYIPSWFFCFQLPCKTRPHSLMIYSDDLGVTWHHGRLIRPMVTVECEVAEVTGRAGHPVLYCSARTPNRCRAEALSTDHGEGFQRLALSRQLCEPPHGCQGSVVSFRPLEIPHRCQDSSSKDAPTIQQSSPGSSLRLEEEAGTPSESWLLYSHPTSRKQRVDLGIYLNQTPLEAACWSRPWILHCGPCGYSDLAALEEEGLFGCLFECGTKQECEQIAFRLFTHREILSHLQGDCTSPGRNPSQFKSN
SEQ ID NO:10:
MGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO:11:
MMSSAAFPRWLSMGVPRTPSRTVLFERERTGLTYRVPSLLPVPPGPTLLAFVEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLAGGSVRWGALHVLGTAALAEHRSMNPCPVHDAGTGTVFLFFIAVLGHTPEAVQIATGRNAARLCCVASRDAGLSWGSARDLTEEAIGGAVQDWATFAVGPGHGVQLPSGRLLVPAYTYRVDRRECFGKICRTSPHSFAFYSDDHGRTWRCGGLVPNLRSGECQLAAVDGGQAGSFLYCNARSPLGSRVQALSTDEGTSFLPAERVASLPETAWGCQGSIVGFPAPAPNRPRDDSWSVGPGSPLQPPLLGPGVHEPPEEAAVDPRGGQVPGGPFSRLQPRGDGPRQPGPRPGVSGDVGSWTLALPMPFAAPPQSPTWLLYSHPVGRRARLHMGIRLSQSPLDPRSWTEPWVIYEGPSGYSDLASIGPAPEGGLVFACLYESGARTSYDEISFCTFSLREVLENVPASPKPPNLGDKPRGCCWPS
SEQ ID NO:12:
MASLP
SEQ ID NO:13:
ASLP
SEQ ID NO:14:
TVEKSVVF
SEQ ID NO:15:
GDYDAPTHQVQW
SEQ ID NO:16:
SMDQGSTW
SEQ ID NO:17:
STDGGKTW
SEQ ID NO:18:
PRPPAPEA
SEQ ID NO:19:
QTPLEAAC
SEQ ID NO:20:
NPRPPAPEA
SEQ ID NO:21:
SQNDGES
SEQ ID NO:22:
LSHSLST
SEQ ID NO:23:
GAGAACGACTTTGGACTGGTGCAGCCTCTGGTCACCATGGAACAGCTGCTGTGGGTTTCCGGCAGACAGATCGGCAGCGTGGACACCTTCAGAATCCCTCTGATCACCGCCACACCTAGAGGCACCCTGCTGGCCTTTGCCGAGGCCAGAAAGATGAGCAGCTCTGACGAGGGCGCCAAGTTTATTGCCCTGAGGCGGTCTATGGACCAGGGCTCTACATGGTCCCCTACCGCCTTCATCGTGAACGATGGCGACGTGCCCGATGGCCTGAATCTGGGAGCTGTGGTGTCCGATGTGGAAACCGGCGTGGTGTTCCTGTTCTACAGCCTGTGTGCCCACAAGGCCGGTTGTCAGGTGGCCAGCACAATGCTCGTGTGGTCCAAGGACGACGGCGTGTCCTGGTCTACCCCTAGAAACCTGAGCCTGGACATCGGCACCGAAGTGTTTGCTCCAGGACCTGGCTCTGGCATCCAGAAGCAGAGAGAGCCCAGAAAGGGCAGACTGATCGTGTGTGGCCACGGCACCCTTGAGAGAGATGGCGTTTTCTGCCTGCTGAGCGACGATCATGGCGCCTCTTGGAGATACGGCAGCGGAGTGTCTGGAATCCCTTACGGCCAGCCTAAGCAAGAGAACGATTTCAACCCCGACGAGTGCCAGCCTTACGAGCTGCCTGATGGCAGCGTCGTGATCAACGCCCGGAACCAGAACAACTACCACTGCCACTGCCGGATCGTGCTGAGAAGCTACGACGCCTGCGATACCCTGCGGCCTAGAGATGTGACCTTCGATCCTGAGCTGGTGGACCCTGTTGTTGCCGCTGGTGCCGTCGTGACATCTAGCGGCATCGTGTTCTTCAGCAACCCTGCTCACCCCGAGTTCAGAGTGAATCTGACCCTGCGGTGGTCCTTCAGCAATGGCACAAGCTGGCGGAAAGAAACCGTGCAGCTTTGGCCTGGACCTAGCGGCTACTCTTCTCTGGCTACACTGGAAGGCAGCATGGACGGCGAAGAACAGGCCCCTCAGCTGTACGTGCTGTACGAGAAGGGCAGAAACCACTACACCGAGAGCATCAGCGTGGCCAAGATCAGCGTT
SEQ ID NO:24:
ATGGCCAGCCTGCCTGTGCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCCCTACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGCCCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCATCCAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCTGTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAA
SEQ ID NO:25:
ATGGAGGAAGTGACCACCTGTAGCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAAGAGGACGACCGGGGCATCACCTACAGAATCCCTGCTCTGCTGTACATCCCTCCTACACACACCTTTCTGGCCTTCGCCGAGAAGCGGAGCACCAGACGAGATGAAGATGCCCTGCACCTGGTGCTGAGAAGAGGCCTGAGAATCGGACAGCTGGTGCAGTGGGGACCTCTGAAGCCTCTGATGGAAGCCACACTGCCCGGCCACAGAACCATGAATCCTTGTCCTGTGTGGGAGCAGAAAAGCGGCTGCGTGTTCCTGTTCTTCATCTGCGTGCGGGGCCACGTGACCGAGAGACAGCAAATCGTGTCCGGCAGAAACGCCGCCAGACTGTGCTTCATCTACAGCCAGGATGCCGGCTGCTCTTGGAGCGAAGTTCGGGATCTGACCGAAGAAGTGATCGGCAGCGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTTGGCCCTGGCCACGGAATCCAGCTGCAATCTGGCAGACTGGTCATCCCCGCCTACACCTACTATATCCCCAGCTGGTTCTTCTGCTTCCAACTGCCTTGCAAGACCCGGCCTCACAGCCTGATGATCTACAGCGACGATCTGGGCGTGACATGGCACCACGGCAGACTGATCAGACCCATGGTCACCGTGGAATGCGAGGTGGCCGAAGTGACAGGCAGAGCTGGACACCCTGTGCTGTACTGCTCTGCCAGAACACCCAACCGGTGTAGAGCCGAGGCTCTGTCTACAGATCACGGCGAGGGCTTTCAGAGACTGGCCCTCTCTAGACAGCTGTGCGAACCTCCTCATGGCTGTCAGGGCAGCGTGGTGTCCTTCAGACCTCTGGAAATCCCTCACCGGTGCCAGGACAGCAGCTCTAAGGATGCCCCTACCATCCAGCAGTCTAGCCCTGGCAGCAGCCTGAGACTGGAAGAGGAAGCCGGAACACCTAGCGAGAGCTGGCTGCTGTACTCTCACCCCACCAGCAGAAAGCAGAGAGTGGACCTGGGCATCTACCTGAATCAGACCCCTCTGGAAGCCGCCTGTTGGAGCAGACCTTGGATTCTGCACTGTGGCCCTTGCGGCTACTCTGATCTGGCCGCTCTGGAAGAAGAGGGCCTGTTCGGCTGCCTGTTTGAGTGCGGCACAAAGCAAGAGTGCGAGCAGATCGCCTTCCGGCTGTTCACCCACAGAGAGATCCTGAGCCATCTGCAGGGCGACTGCACAAGCCCAGGCAGAAATCCCAGCCAGTTCAAGAGCAACSEQ ID NO:26:
ATGGGCGTGCCCAGAACACCCAGCAGAACCGTGCTGTTCGAGAGAGAGAGGACCGGCCTGACCTACAGAGTGCCTTCTCTGCT
GCCTGTGCCTCCTGGACCTACACTGCTGGCCTTCGTGGAACAG
AGACTGAGCCCCGATGATTCTCACGCCCACAGACTGGTGCTGA
GAAGAGGAACACTGGCTGGCGGCTCTGTTAGATGGGGAGCAC
TGCATGTGCTGGGCACAGCTGCTCTTGCCGAGCACAGATCCAT
GAATCCCTGTCCTGTGCACGACGCCGGAACCGGCACAGTGTTT
CTGTTCTTTATCGCCGTGCTGGGCCACACACCTGAGGCCGTTCA
AATTGCCACCGGCAGAAATGCCGCCAGACTGTGTTGTGTGGCC
TCCAGAGATGCCGGCCTGTCTTGGGGATCTGCCAGAGATCTGA
CCGAGGAAGCCATTGGCGGAGCCGTTCAGGATTGGGCCACATT
TGCTGTTGGACCTGGACACGGCGTGCAGCTGCCAAGTGGTAGA
CTGCTGGTGCCTGCCTACACATACAGAGTGGATCGGAGAGAGT
GCTTCGGAAAGATCTGCCGGACAAGCCCTCACAGCTTCGCCTT
CTACTCCGACGATCACGGCCGGACTTGGAGATGTGGTGGCCTG
GTGCCTAATCTGAGAAGCGGCGAATGTCAACTGGCCGCCGTTG
ATGGTGGACAGGCTGGCAGCTTCCTGTACTGCAACGCCAGATC
TCCTCTGGGCTCTAGAGTGCAGGCCCTGTCTACCGATGAGGGC
ACCAGTTTTCTGCCCGCCGAAAGAGTTGCCTCTCTGCCTGAAA
CAGCCTGGGGCTGTCAGGGCTCTATCGTGGGATTTCCTGCTCCT
GCTCCAAACAGACCCCGGGACGATTCTTGGAGTGTCGGCCCTG
GATCTCCACTGCAGCCTCCATTGCTTGGACCAGGCGTTCACGA
GCCACCTGAAGAGGCTGCCGTTGATCCTAGAGGCGGACAAGTT
CCTGGCGGCCCTTTTAGCAGACTGCAGCCAAGAGGCGACGGCC
CTAGACAACCTGGACCAAGACCTGGCGTCAGCGGAGATGTTGG
CTCTTGGACACTGGCCCTGCCTATGCCTTTTGCCGCTCCTCCTC
AGTCTCCTACCTGGCTGCTGTACTCTCACCCTGTTGGCAGACGG
GCCAGACTGCACATGGGCATCAGACTGTCTCAGAGCCCTCTGG
ACCCCAGAAGCTGGACAGAGCCTTGGGTCATCTATGAGGGCCC
TAGCGGCTACAGCGATCTGGCCTCTATTGGCCCAGCTCCTGAA
GGCGGACTGGTGTTCGCTTGTCTGTATGAGAGCGGCGCCAGAA
CCAGCTACGACGAGATCAGCTTCTGCACCTTCAGCCTGCGCGA
GGTGCTGGAAAATGTGCCCGCCTCTCCTAAGCCTCCTAACCTG
GGCGATAAGCCTAGAGGCTGTTGCTGGCCATCT
SEQ ID NO:27:
MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFAAIFLLLSLAASWSKA
SEQ ID NO:28:
MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC
SEQ ID NO:29:
YGTL
SEQ ID NO:30:
MTVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN
SEQ ID NO:31:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:32:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:33:
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:34:
ATGAGACCTGCGGACCTGCCCCCGCGCCCCATGGAAGAATCCCCGGCGTCCAGCTCTGCCCCGACAGAGACGGAGGAGCCGGGGTCCAGTGCAGAGGTCATGGAAGAAGTGACAACATGCTCCTTCAACAGCCCTCTGTTCCGGCAGGAAGATGACAGAGGGATTACCTACCGGATCCCAGCCCTGCTCTACATACCCCCCACCCACACCTTCCTGGCCTTTGCAGAGAAGCGTTCTACGAGGAGAGATGAGGATGCTCTCCACCTGGTGCTGAGGCGAGGGTTGAGGATTGGGCAGTTGGTACAGTGGGGGCCCCTGAAGCCACTGATGGAAGCCACACTACCGGGGCATCGGACCATGAACCCCTGTCCTGTATGGGAGCAGAAGAGTGGTTGTGTGTTCCTGTTCTTCATCTGTGTGCGGGGCCATGTCACAGAGCGTCAACAGATTGTGTCAGGCAGGAATGCTGCCCGCCTTTGCTTCATCTACAGTCAGGATGCTGGATGTTCATGGAGTGAGGTGAGGGACTTGACTGAGGAGGTCATTGGCTCAGAGCTGAAGCACTGGGCCACATTTGCTGTGGGCCCAGGTCATGGCATCCAGCTGCAGTCAGGGAGACTGGTCATCCCTGCGTATACCTACTACATCCCTTCCTGGTTCTTTTGCTTCCAGCTACCATGTAAAACCAGGCCTCATTCTCTGATGATCTACAGTGATGACCTAGGGGTCACATGGCACCATGGTAGACTCATTAGGCCCATGGTTACAGTAGAATGTGAAGTGGCAGAGGTGACTGGGAGGGCTGGCCACCCTGTGCTATATTGCAGTGCCCGGACACCAAACAGGTGCCGGGCAGAGGCGCTCAGCACTGACCATGGTGAAGGCTTTCAGAGACTGGCCCTGAGTCGACAGCTCTGTGAGCCCCCACATGGTTGCCAAGGGAGTGTGGTAAGTTTCCGGCCCCTGGAGATCCCACATAGGTGCCAGGACTCTAGCAGCAAAGATGCACCCACCATTCAGCAGAGCTCTCCAGGCAGTTCACTGAGGCTGGAGGAGGAAGCTGGAACACCGTCAGAATCATGGCTCTTGTACTCACACCCAACCAGTAGGAAACAGAGGGTTGACCTAGGTATCTATCTCAACCAGACCCCCTTGGAGGCTGCCTGCTGGTCCCGCCCCTGGATCTTGCACTGTGGGCCCTGTGGCTACTCTGATCTGGCTGCTCTGGAGGAGGAGGGCTTGTTTGGGTGTTTGTTTGAATGTGGGACCAAGCAAGAGTGTGAGCAGATTGCCTTCCGCCTGTTTACACACCGGGAGATCCTGAGTCACCTGCAGGGGGACTGCACCAGCCCTGGTAGGAACCCAAGCCAATTCAAAAGCAAT
SEQ ID NO:35:
ATGATGAGCTCTGCAGCCTTCCCAAGGTGGCTGAGCATGGGGGTCCCTCGTACCCCTTCACGGACAGTGCTCTTCGAGCGGGAGAGGACGGGCCTGACCTACCGCGTGCCCTCGCTGCTCCCCGTGCCCCCCGGGCCCACCCTGCTGGCCTTTGTGGAGCAGCGGCTCA
GCCCTGACGACTCCCACGCCCACCGCCTGGTGCTGAGGAGGGG
CACGCTGGCCGGGGGCTCCGTGCGGTGGGGTGCCCTGCACGTG
CTGGGGACAGCAGCCCTGGCGGAGCACCGGTCCATGAACCCCT
GCCCTGTGCACGATGCTGGCACGGGCACCGTCTTCCTCTTCTTC
ATCGCGGTGCTGGGCCACACGCCTGAGGCCGTGCAGATCGCCA
CGGGAAGGAACGCCGCGCGCCTCTGCTGTGTGGCCAGCCGTGA
CGCCGGCCTCTCGTGGGGCAGCGCCCGGGACCTCACCGAGGAG
GCCATCGGTGGTGCCGTGCAGGACTGGGCCACATTCGCTGTGG
GTCCCGGCCACGGTGTGCAGCTGCCCTCAGGCCGCCTGCTGGT
ACCCGCCTACACCTACCGCGTGGACCGCCGAGAGTGTTTTGGC
AAGATCTGCCGGACCAGCCCTCACTCCTTCGCCTTCTACAGCG
ATGACCACGGCCGCACCTGGCGCTGTGGAGGCCTCGTGCCCAA
CCTGCGCTCAGGCGAGTGCCAGCTGGCAGCGGTGGACGGTGG
GCAGGCCGGCAGCTTCCTCTACTGCAATGCCCGGAGCCCACTG
GGCAGCCGTGTGCAGGCGCTCAGCACTGACGAGGGCACCTCCT
TCCTGCCCGCAGAGCGCGTGGCTTCCCTGCCCGAGACTGCCTG
GGGCTGCCAGGGCAGCATCGTGGGCTTCCCAGCCCCCGCCCCC
AACAGGCCACGGGATGACAGTTGGTCAGTGGGCCCCGGGAGT
CCCCTCCAGCCTCCACTCCTCGGTCCTGGAGTCCACGAACCCCC
AGAGGAGGCTGCTGTAGACCCCCGTGGAGGCCAGGTGCCTGGT
GGGCCCTTCAGCCGTCTGCAGCCTCGGGGGGATGGCCCCAGGC
AGCCTGGCCCCAGGCCTGGGGTCAGTGGGGATGTGGGGTCCTG
GACCCTGGCACTCCCCATGCCCTTTGCTGCCCCGCCCCAGAGC
CCCACGTGGCTGCTGTACTCCCACCCAGTGGGGCGCAGGGCTC
GGCTACACATGGGTATCCGCCTGAGCCAGTCCCCGCTGGACCC
GCGCAGCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTACGAGGGCCCCAG
CGGCTACTCCGACCTGGCGTCCATCGGGCCGGCCCCTGAGGGG
GGCCTGGTTTTTGCCTGCCTGTACGAGAGCGGGGCCAGGACCT
CCTATGATGAGATTTCCTTTTGTACATTCTCCCTGCGTGAGGTC
CTGGAGAACGTGCCCGCCAGCCCCAAACCGCCCAACCTTGGGG
ACAAGCCTCGGGGGTGCTGCTGGCCCTCC
SEQ ID NO:36:
MRFKNVKKTALMLAMFGMATSSNAALFDYNATGDTEFDSPAKQGWMQDNTNNGSGVLTNADGMPAWLVQGIGGRAQWTYSLSTNQHAQASSFGWRMTTEMKVLSGGMITNYYANGTQRVLPIISLDSSGNLVVEFEGQTGRTVLATGTAATEYHKFELVFLPGSNPSASFYFDGKLIRDNIQPTASKQNMIVWGNGSSNTDGVAAYRDIKFEIQGDVIFRGPDRIPSIVASSVTPGVVTAFAEKRVGGGDPGALSNTNDIITRTSRDGGITWDTELNLTEQINVSDEFDFSDPRPIYDPSSNTVLVSYARWPTDAAQNGDRIKPWMPNGIFYSVYDVASGNWQAPIDVTDQVKERSFQIAGWGGSELYRRNTSLNSQQDWQSNAKIRIVDGAANQIQVADGSRKYVVTLSIDESGGLVANLNGVSAPIILQSEHAKVHSFHDYELQYSALNHTTTLFVDGQQITTWAGEVSQENNIQFGNADAQIDGRLHVQKIVLTQQGHNLVEFDAFYLAQQTPEVEKDLEKLGWTKIKTGNTMSLYGNASVNPGPGHGITLTRQQNISGSQNGRLIYPAIVLDRFFLNVMSIYSDDGGSNWQTGSTLPIPFRWKSSSILETLEPSEADMVELQNGDLLLTARLDFNQIVNGVNYSPRQQFLSKDGGITWSLLEANNANVFSNISTGTVDASITRFEQSDGSHFLLFTNPQGNPAGTNGRQNLGLWFSFDEGVTWKGPIQLVNGASAYSDIYQLDSENAIVIVETDNSNMRILRMPITLLKQKLTLSQN
SEQ ID NO:37:
TTGTCAATCAAGATGACTTCACAACGAAGAAGAGCATCGATTCACAAGGAAACAGATTCTAATATAAAGGGAGTAGATATGCGTTTCAAAAACGTAAAGAAAACCGCTTTAATGCTTGCAATGTTCGGTATGGCGACAAGCTCAAACGCCGCACTTTTTGACTATAACGCAACGGGTGACACTGAGTTTGACAGTCCAGCCAAACAGGGATGGATGCAAGACAACACGAATAATGGCAGCGGCGTTTTAACCA
ATGCAGATGGAATGCCCGCTTGGTTGGTGCAAGGTATTGGAGG
GAGAGCTCAATGGACATATTCTCTCTCTACTAATCAACATGCC
CAAGCATCAAGTTTCGGTTGGCGAATGACGACAGAAATGAAA
GTGCTCAGTGGTGGAATGATCACAAACTACTACGCCAACGGCA
CTCAGCGTGTCTTACCCATCATTTCATTAGATAGCAGTGGTAAC
TTAGTTGTTGAGTTTGAAGGGCAAACTGGACGCACCGTTTTGG
CAACCGGCACAGCAGCAACGGAATATCATAAATTTGAATTGGT
ATTCCTTCCTGGAAGTAACCCATCCGCTAGCTTTTACTTCGATG
GCAAACTCATTCGTGACAACATCCAGCCGACTGCATCAAAACA
AAATATGATCGTATGGGGGAATGGCTCATCAAATACGGATGGT
GTCGCCGCTTATCGTGATATTAAGTTTGAAATTCAAGGCGACG
TCATCTTCAGAGGCCCAGACCGTATACCGTCCATTGTAGCAAG
TAGCGTAACACCAGGGGTGGTAACCGCATTTGCAGAGAAACGT
GTGGGGGGAGGAGATCCCGGTGCTCTGAGTAATACCAATGAC
ATAATCACTCGTACCTCACGAGATGGCGGTATAACTTGGGATA
CCGAGCTCAACCTCACTGAGCAAATCAATGTCAGTGATGAGTT
TGATTTCTCCGATCCTCGGCCTATCTATGATCCTTCCTCCAATA
CGGTTCTTGTCTCTTATGCTCGATGGCCGACCGATGCCGCTCAA
AACGGAGATCGAATAAAACCATGGATGCCAAACGGTATTTTTT
ACAGCGTCTATGATGTTGCATCAGGGAACTGGCAAGCGCCTAT
CGATGTTACCGATCAGGTGAAAGAACGCAGTTTCCAAATCGCT
GGTTGGGGTGGTTCAGAGCTGTATCGCCGAAATACCAGCCTAA
ATAGCCAGCAAGACTGGCAATCAAACGCTAAGATCCGAATTGT
TGATGGTGCAGCGAACCAGATACAAGTTGCCGATGGTAGCCGA
AAATATGTTGTCACACTGAGTATTGATGAATCAGGTGGTCTAG
TCGCTAATCTAAACGGTGTTAGTGCTCCGATTATCCTGCAATCT
GAACACGCAAAGGTACACTCTTTCCATGACTACGAACTTCAAT
ATTCGGCGTTAAACCACACCACAACGTTATTCGTGGATGGTCA
GCAAATCACAACTTGGGCTGGCGAAGTATCGCAGGAGAACAA
CATTCAGTTTGGTAATGCGGATGCCCAAATTGACGGCAGACTG
CATGTGCAAAAAATTGTTCTCACACAGCAAGGCCATAACCTCG
TGGAGTTTGATGCTTTCTATTTAGCACAGCAAACCCCTGAAGT
AGAGAAAGACCTTGAAAAGCTTGGTTGGACAAAAATTAAAAC
GGGCAACACCATGAGTTTGTATGGAAATGCCAGTGTCAACCCA
GGACCGGGTCATGGCATCACCCTTACTCGACAACAAAATATCA
GTGGCAGCCAAAACGGCCGCTTGATCTACCCAGCGATTGTGCT
TGATCGTTTCTTCTTGAACGTCATGTCTATTTACAGTGATGATG
GCGGTTCAAACTGGCAAACCGGTTCAACACTCCCTATCCCCTTT
CGCTGGAAGAGTTCGAGTATCCTAGAAACTCTCGAACCTAGTG
AAGCTGATATGGTTGAACTCCAAAACGGTGATCTACTCCTTAC
TGCACGCCTTGATTTTAACCAAATCGTTAATGGTGTGAACTATA
GCCCACGCCAGCAATTTTTGAGTAAAGATGGTGGAATCACGTG
GAGCCTACTTGAGGCTAACAACGCTAACGTCTTTAGCAATATC
AGTACTGGTACCGTTGATGCTTCTATTACTCGGTTCGAGCAAA
GTGACGGTAGCCATTTCTTACTCTTTACTAACCCACAAGGAAA
CCCTGCGGGGACAAATGGCAGGCAAAATCTAGGCTTATGGTTT
AGCTTCGATGAAGGGGTGACATGGAAAGGACCAATTCAACTTG
TTAATGGTGCATCGGCATATTCTGATATTTATCAATTGGATTCG
GAAAATGCGATTGTCATTGTTGAAACGGATAATTCAAATATGC
GAATTCTTCGTATGCCTATCACATTGCTAAAACAGAAGCTGAC
CTTATCGCAAAACTAA
SEQ ID NO:38:
MVGADPTRPRGPLSYWAGRRGQGLAAIFLLLVSAAESEARAEDDFSLVQPLVTMEQLLWVSGKQIGSVDTFRIPLITATPRGTLLAFAEARKKSASDEGAKFIAMRRSTDQGSTWSSTAFIVDDGEASDGLNLGAVVNDVDTGIVFLIYTLCAHKVNCQVASTMLVWSKDDGISWSPPRNLSVDIGTEMFAPGPGSGIQKQREPGKGRLIVCGHGTLERDGVFCLLSDDHGASWHYGTGVSGIPFGQPKHDHDFNPDECQPYELPDGSVIINARNQNNYHCRCRIVLRSYDACDTLRPRDVTFDPELVDPVVAAGALATSSGIVFFSNPAHPEFRVNLTLRWSFSNGTSWLKERVQVWPGPSGYSSLTALENSTDGKKQPPQLFVLYEKGLNRYTESISMVKISVYGTL
SEQ ID NO:39:
MTVQPSPWFSDLRPMATCPVLQKETLFRTGVHAYRIPALLYLKKQKTLLAFAEKRASKTDEHAELIVLRRGSYNEATNRVKWQPEEVVTQAQLEGHRSMNPCPLYDKQTKTLFLFFIAVPGRVSEHHQLHTKVNVTRLCCVSSTDHGRTWSPIQDLTETTIGSTHQEWATFAVGPGHCLQLRNPAGSLLVPAYAYRKLHPAQKPTPFAFCFISLDHGHTWKLGNFVAENSLECQVAEVGTGAQRMVYLNARSFLGARVQAQSPNDGLDFQDNRVVSKLVEPPHGCHGSVVAFHNPISKPHALDTWLLYTHPTDSRNRTNLGVYLNQMPLDPTAWSEPTLLAMGICAYSDLQNMGQGPDGSPQFGCLYESGNYEEIIFLIFTLKQAFPTVFDAQ
SEQ ID NO:40:
MEEVPPYSLSSTLFQQEEQSGVTYRIPALLYLPPTHTFLAFAEKRTSVRDEDAACLVLRRGLMKGRSVQWGPQRLLMEATLPGHRTMNPCPVWEKNTGRVYLFFICVRGHVTERCQIVWGKNAARLCFLCSEDAGCSWGEVKDLTEEVIGSEVKRWATFAVGPGHGIQLHSGRLIIPAYAYYVSRWFLCFACSVKPHSLMIYSDDFGVTWHHGKFIEPQVTGECQVAEVAGTAGNPVLYCSARTPSRFRAEAFSTDSGGCFQKPTLNPQLHEPRTGCQGSVVSFRPLKMPNTYQDSIGKGAPATQKCPLLDSPLEVEKGAETPSATWLLYSHPTSKRKRINLGIYYNRNPLEVNCWSRPWILNRGPSGYSDLAVVEEQDLVACLFECGEKNEYERIDFCLFSDHEVLSCEDCTSPSSD
SEQ ID NO:41:
METAGAPFCFHVDSLVPCSYWKVMGPTRVPRRTVLFQRERTGLTYRVPALLCVPPRPTLLAFAEQRLSPDDSHAHRLVLRRGTLTRGSVRWGTLSVLETAVLEEHRSMNPCPVLDEHSGTIFLFFIAVLGHTPEAVQIATGKNAARLCCVTSCDAGLTWGSVRDLTEEAIGAALQDWATFAVGPGHGVQLRSGRLLVPAYTYHVDRRECFGKICWTSPHSLAFYSDDHGISWHCGGLVPNLRSGECQLAAVDGDFLYCNARSPLGNRVQALSADEGTSFLPGELVPTLAETARGCQGSIVGFLAPPSIEPQDDRWTGSPRNTPHSPCFNLRVQESSGEGARGLLERWMPRLPLCYPQSRSPENHGLEPGSDGDKTSWTPECPMSSDSMLQSPTWLLYSHPAGRRARLHMGIYLSRSPLDPHSWTEPWVIYEGPSGYSDLAFLGPMPGASLVFACLFESGTRTSYEDISFCLFSLADVLENVPTGLEMLSLRDKAQGHCWPS
SEQ ID NO:42:
GGGTCACATGCTGATGGACTAATTGGAGTCGCGGCAGCGCGGGCTGCGGCCCCCAAGGGGAGGGGTCGGAGTGACGTGCGCGCTTTTAAAGGGCCGAGGTCAGCTGACGGCTTGCCACCGGTGACCAGTTCCTGGACAGGGATCGCCGGGAGCTATGGTGGGGGCAGACCCGACCAGACCCCGGGGACCGCTGAGCTATTGGGCGGGCCGTCGGGGTCAGGGGCTCGCAGCGATCTTCCTGCTCCTGGTGTCCGCGGCGGAATCCGAGGCCAGGGCAGAGGATGACTTCAGCCTGGTGCAGCCGCTGGTGACCATGGAGCAGCTGCTGTGGGTGAGCGGGAAGCAGATCGGCTCTGTAGACACTTTCCGCATCCCGCTCATCACAGCCACCCCTCGGGGCACGCTCCTGGCCTTCGCTGAGGCCAGGAAAAAATCTGCATCCGATGAGGGGGCCAAGTTCATCGCCATGAGGAGGTCCACGGACCAGGGTAGCACGTGGTCCTCTACAGCCTTCATCGTAGACGATGGGGAGGCCTCCGATGGCCTGAACCTGGGCGCTGTGGTGAACGATGTAGACACAGGGATAGTGTTCCTTATCTATACCCTCTGTGCTCACAAGGTCAACTGCCAGGTGGCCTCTACCATGTTGGTTTGGAGTAAGGACGACGGCATTTCCTGGAGCCCACCCCGGAATCTCTCTGTGGATATTGGCACAGAGATGTTT
GCCCCTGGACCTGGCTCAGGCATTCAGAAACAGCGGGAGCCTG
GGAAGGGCCGGCTCATTGTGTGTGGACACGGGACGCTGGAGC
GAGATGGGGTCTTCTGTCTCCTCAGTGATGACCACGGTGCCTC
CTGGCACTACGGCACTGGAGTGAGCGGCATTCCCTTTGGCCAG
CCCAAACACGATCACGATTTCAACCCCGACGAGTGCCAGCCCT
ACGAGCTTCCAGATGGCTCGGTCATCATCAACGCCCGGAACCA
GAATAACTACCATTGCCGCTGCAGGATCGTCCTCCGCAGCTAT
GACGCCTGTGACACCCTCAGGCCCCGGGATGTGACCTTCGACC
CTGAGCTCGTGGACCCTGTGGTAGCTGCAGGAGCACTAGCCAC
CAGCTCCGGCATTGTCTTCTTCTCCAATCCAGCCCACCCTGAGT
TCCGAGTGAACCTGACCCTGCGCTGGAGTTTCAGCAATGGTAC
ATCCTGGCAGAAGGAGAGGGTCCAGGTGTGGCCGGGACCCAG
CGGCTACTCGTCCCTGACAGCCCTGGAAAACAGCACGGATGGA
AAGAAGCAGCCCCCGCAGCTGTTCGTTCTGTACGAGAAAGGCC
TGAACCGGTACACCGAGAGCATCTCCATGGTCAAAATCAGCGT
CTACGGCACGCTCTGAGCCCCGTGCCCAAAGGACACCAAGTCC
TGGTCGCTGACTTCACAGCTCTCTGGACCATCTGCAGAGGGTG
CCTGAAACACAGCTCTTCCTCTGAACTCTGACCTTTTGCAACTT
CTCATCAACAGGGAAGTCTCTTCGTTATGACTTAACACCCAGC
TTCCTCTCGGGGCAGGAAGTCCCTCCGTCACCAAGAGCACTTT
TTTCCAGTATGCTGGGGATGGCCCCTGTCCATTCTCTTCCAGGA
CAACGGAGCTGTGCCTTTCTGGGACAGGATGGGGGAGGGGCTC
CCCCTGGAGAGATGAACAGATACGAACTCAGGGAACTGAGAA
GGCCCGGTGTCCTAGGGTACAAAGGCAGGTACTAGATGTGATT
GCTGAAAGTCCCCAGGGCAGAGTGTCCTTTCAGAGCAAGGATA
AGCACACCTACGTGTGCACCTTTGATTATTTATGAATCGAAAT
ATTTGTAACTTAAAATTTTTGATGCAGAAAAAGCGTTTGTGGA
GTCTGTGGTTCTGTCTGCTCACGCCTTCCCAATTGCCTCCTGGA
GAGACAGGAAGGCAGCTGGAAGAGGAGCCGATGTACTTACTG
GGAAGCAGAAACCCCTAGATTCCATCCTGGCTGCTGCTGTTTG
CAAGTGTCAAAGATGGGGGGGCGTGTTTATATTTTATATTTCTA
AGATGGGGTGGCATAGGAAATAGGGAACAGATGTGTAAAACC
AGATGGGAAGGACAGTCTGTGAGAAAGGAGCAAGCAGTTGCT
GCAGGTGTGGGAGAGCAAAGCCCTTCTCCACGTGGAAAGAGC
CCAGATGGACGCTAAGCATGTTGGGCACCTGTAACCCCGCACT
CGCTGGACTGACGGTGTAGCTCAGTGGTGGAGCTAGTACTTGG
AACGCCTAAGACTCTGGGTTCAGTCCTTGGGGGGGGGGGTATG
TGTTTATTGAGAGGAAGGTGTACGTACTGTAGGTCAGAGGACA
GCTTACTGGAGTTGTCTCTCTCCTTCACGCTGTGAGTCCTGTGG
AATGACCTCAGGTGTCAGAGTTGGGGGCAGGTGCCTTTGCCAG
CTGAGCCATCTTGCTGTCTCTGCTTTAATTTAAAAAAAAAAAA
AAAAAAGAATATTAAGGTCTGAGGGATTCGGGCTGCGTTCATT
TCAATTAGAGGGTCATATTTCTTTTGACATTTCTTCTCTAAGAA
ATGTTAAGATCATTTGTTCTGTGTGATAGAGGTATAGCTCCATT
GTATGTCAGCAGTGAGGGATCCTGTGCATTTTATCCAGAGTTT
GTACGGTGTTCTAGGGGCTGCTAGTGCAGCCCAGTGCTAAACA
CTTCAGCATGCACAAGGCCTCAATCAGTGCATGCATGTGCACA
CACACACAGACACACACGTACACACTGACACAGGTACACAAA
TACACACTGGCCCACATGTACACATCGACTCACAGGTACACAG
ACCCACTTTGACACACATATACACAGACACAAACGCACTGGCA
CACACATATACACAGGCACACATGGATAGATGGACACACGTGT
ACACATACACACACACACAGAAATACAAATGTTCAGGTTTTCT
AAAAAAAAAAAAATTAGAGACGTGTTGACTTCATTTTTAGCAA
AAATCCTGTCATGTATCTTAAAGTGGATTGAACCCACTATGTA
GCCCAGGCTGGCCTCCAAATGGGCATCCTTCTGCCTCAGTCTCC
CGAGGGCTAGGATAACAGGAGTATGCCATCACACCTGGCTAAT
AGAAATTTTCAAAATTGTTTGTTTGAAGGTGACTCTTACTATAT
TGCCTAACTGATCTCCAGTTCGTGAAATCCTCCTGCCTCAGAAC
CAGGACTGTCAATATAACCCACCAAGACAGGCCAACATTCACA
ATTGATTGTTAGTTTGTGGTCTGAATCAAGGTCTTATACTGTAG
CCCAGGCTAGCCCGGAATACACGATATCTCCAGTGCTTCAGAT
CCTCAGTTCTAACTAAGCATGGCCACATCCATGTTTAACTGCA
AATTTGATGTTACCATGGTTTGGTTTGGTTTGGTTTGGTTTGGT
TTGGTTTGGTTTGGTTTTTTGGCCATTTTTTTTTTCTCATGCTGA
GGCCTTGTGCTCTCAAGTTGGGGAGACAGCATGGAGGGTAGCT
GCAACTGTAACCCCAGTTCCAGGGGACCTGACACCCTCTGGCC
TCCACAAGTATTAGGCACATCTGTGGTGCACAGACATACAATC
AGGCAAAATATTCATACACATAAAATAAAATAATTTAAAACAA
AAGCAAAAATCAGGACCTAAGAAAAAAATCTATTCCTGATTCT
TTTATGTTTTGTTTGTATTTTATCAAGACAGGGTTGTTTCTCTGT
ATAGCCCTGGCTGTCTTGGAATTCACTCTGTAGACCAGGCTGG
CCTCAAACTCAGAAATCCTCCTGCCTTTGCCTTCCAAGTGCTGG
AATTAAAGGCATGCGCCACC
SEQ ID NO:43:
GACATGACCCAAACGGCCCCTGGCTGCAAGGTAATATCGGAAGTTGACTAAGAATGGACGCCCCACCACTGACTGACCCGCCCCCTGAGTCTGAGATTGGACTTGTCTCTGGATACAGTCATACTTTGAGGTACTACAAGTTAGAAACTGTTAGGTTACTCAGTTCAGTCCATGACAGTCCAACCTTCTCCATGGTTTTCCGATCTCAGGCCCATGGCGACCTGCCCTGTCCTGCAGAAGGAGACACTGTTCCGCACAGGCGTCCATGCTTACAGAATCCCTGCTCTGCTCTACCTGAAGAAGCAGAAGACCCTGCTGGCCTTTGCGGAAAAGCGAGCCAGCAAGACGGATGAGCACGCAGAGTTGATTGTCCTGAGAAGAGGAAGCTACAACGAAGCCACCAACCGTGTCAAGTGGCAGCCTGAGGAAGTGGTGACCCAAGCCCAGCTGGAAGGCCACCGCTCCATGAATCCATGTCCCTTGTATGACAAGCAAACAAAGACCCTCTTCCTTTTCTTCATCGCTGTCCCTGGGCGTGTATCAGAACATCATCAGCTCCACACTAAGGTTAATGTCACACGGCTGTGCTGTGTCAGCAGCACTGACCATGGGAGGACCTGGAGCCCCATCCAGGACCTCACAGAGACCACCATTGGCAGCACTCATCAGGAATGGGCCACATTTGCTGTGGGTCCTGGGCATTGTCTGCAGCTGCGGAACCCAGCTGGGAGCCTGCTGGTACCTGCTTATGCCTACCGGAAACTGCACCCTGCTCAGAAGCCTACCCCCTTTGCCTTCTGCTTCATCAGCCTTGACCATGGGCACACATGGAAACTAGGCAACTTTGTGGCTGAAAACTCACTGGAGTGCCAGGTGGCTGAGGTTGGCACTGGAGCTCAGAGGATGGTATATCTCAATGCTAGGAGCTTCCTGGGAGCCAGGGTCCAGGCACAAAGTCCTAATGATGGTCTGGATTTCCAGGACAACCGGGTAGTGAGTAAGCTTGTAGAGCCCCCCCACGGGTGTCATGGAAGTGTGGTTGCCTTCCACAACCCCATCTCTAAGCCACATGCCTTAGACACATGGCTTCTTTATACACACCCTACAGACTCCAGGAATAGAACCAACCTGGGTGTGTACCTAAACCAGATGCCACTAGATCCCACAGCCTGGTCAGAGCCCACCCTGCTGGCCATGGGCATCTGTGCCTACTCAGACTTACAGAACATGGGGCAAGGCCCTGATGGCTCCCCACAGTTTGGGTGTCTGTATGAATCAGGTAACTATGAAGAGATCATTTTCCTCATATTCACCCTGAAGCAAGCTTTCCCCACTGTATTTGATGCCCAGTGATCTCAGTGCACGTGGCCCAAAGGGCTTCCTTGTGCTTCAAAACACCCATCTCTCTTTGCTTCCAGCATCCTCTGGACTCTTGAGTCCAGCTCTTGGGTAACTTCCTCAGGAGGATGCAGAGAATTTGGTCTCTTGACTCTCTGCAGGCCTTATTGTTTCAGCCTCTGGTTCTCTTTTCAGCCCAGAAATCAAAGGAGCCTGGCTTTCCTCAGCCTGTTGGCAGGGCAGGTGGGGACAGTATATATAGAGGCTGCCATTCTGCATGTCGGTTGTCACTATGCTAGTTTAACCTGCCTGTTTCCCCATGCCTAGTGTTTGAATGAGTATTAATAAAATATCCAACCCAGCCCATTTCTTCCTGGAAAAAAA
SEQ ID NO:44:
ACTGCGCGGTGAAGGGGCGTGGCCTGGCCGGGGAGGTTGACACCCAGACGCTGCTCTCAGTCCTCTGGCGCCTGCTCCCCAGCGCATTCCTTCTGCTCCTGGGATATTTGTCTCATTACTGCCAGT
TCTTGCGCAGCGGTCACTGGGTTCGTTTCAGCGTCTGTGGTTTC
TGTCGCTGTTATCCAGTCTCCATCGCCCCAGCTCAGCTTCAGGC
CTTCTTCCGAGACTCCACGGGAGAGCCCAGAGAGCCTCCGGAG
CCGAAGCCATGGAGGAAGTCCCACCCTACTCCCTCAGCAGCAC
CCTGTTCCAGCAGGAAGAACAGAGTGGGGTGACCTACCGGATC
CCAGCCCTGCTGTACCTTCCTCCCACCCACACCTTCCTGGCCTT
TGCAGAGAAGCGGACCTCAGTCAGAGATGAGGATGCTGCCTG
CCTGGTGCTCAGACGAGGGCTGATGAAGGGGCGCTCTGTACAG
TGGGGCCCCCAACGGCTACTGATGGAGGCCACATTACCTGGGC
ATCGCACCATGAACCCCTGCCCTGTGTGGGAGAAAAATACTGG
CCGTGTGTACCTGTTTTTCATCTGTGTGCGGGGCCATGTTACTG
AGAGGTGCCAGATTGTGTGGGGCAAAAATGCCGCCCGTCTCTG
CTTCCTTTGCAGTGAAGATGCCGGCTGCTCTTGGGGTGAAGTG
AAAGACTTGACCGAGGAGGTCATTGGCTCAGAGGTGAAGCGC
TGGGCCACATTTGCTGTGGGCCCAGGTCATGGCATCCAGCTAC
ACTCGGGAAGGCTGATCATCCCCGCCTATGCCTACTATGTCTC
ACGTTGGTTTCTCTGCTTTGCGTGTTCAGTCAAGCCCCATTCCC
TGATGATCTACAGTGATGACTTTGGAGTCACATGGCACCATGG
CAAGTTCATTGAGCCCCAGGTGACAGGGGAGTGCCAAGTGGCC
GAAGTGGCTGGGACGGCTGGTAACCCTGTGCTCACTGCAGTGC
CCGAACACCAAGCCGATTTCGAGCAGAGGCTTTTAGTACTGAT
AGTGGTGGCTGCTTTCAGAAGCCAACCCTGAACCCACAACTCC
ATGAGCCTCGAACCGGCTGCCAAGGTAGTGTAGTGAGCTTCCG
GCCTTTGAAGATGCCAAATACCTATCAAGACTCAATTGGCAAA
GGTGCTCCCGCTACTCAGAAGTGCCCTCTGCTGGACAGTCCTCT
GGAGGTGGAGAAAGGAGCTGAAACACCATCAGCAACATGGCT
CTTGTACTCACATCCAACTAGCAAGAGGAAGAGGATTAACCTA
GGCATCTACTACAACCGGAACCCCTTGGAGGTGAACTGCTGGT
CCCGCCCGTGGATCTTGAACCGTGGGCCCAGTGGCTACTCTGA
TCTGGCTGTTGTGGAAGAACAGGACTTGGTGGCGTGTTTGTTT
GAGTGTGGGGAGAAGAATGAGTATGAGCGGATTGACTTCTGTC
TGTTTTCAGACCATGAGGTCCTGAGCTGTGAAGACTGTACCAG
CCCTAGTAGCGACTAAAGCCAAATCAAGACGGATGAGTGAGG
CCCAGCTTCCCACAGAAAGGAATGGCAGCTACAGCCAGGGTA
ACAGAGGTCTCTGATGTCTAGAGAAAACTCTAAAAACTAATAA
TCTGCTCCTTGAATTTTTTCACTTTTCCCTTCAATGAGCATGGTG
AAAATTGTGCCATATCTTACATAACGAGGCTCTTGAACTGGGA
GTTTGAATCTCTTCTCTTCCCATTAAAAGGAGAGGCCATGTGCT
CGCTTCGCGTTCGACAAAGCCTGGATTCTGATCTTGAGTGGAA
GCCACAGGCTTGTCTTTTCCAATGGTTCACTGCTCACCTGAGTA
TTAGGTGATGTGTAGGTGCCTTGGCCAGAAGAAAGATCTGTGT
TGTTGTATTTTTTTAAATTTATTTATTTACTATATGTAAGTACAC
TGCAGCTGTCTTCAGACACACCAGAAGAGGGCGTCAGATCTCA
TTAGAGATGGTTGTGAGCCACCATGTGGTTGCTGGGATTTGAA
CTCAGGACCTTCAGAAGAGCAGTCAGTGCTCTTAACTACTGAG
CCATCTCTCAAGCCCCGCATTGCTGTATTTTTAATAAGAAAAAT
GCCCTTATCCTTCCAATAATGCCTGGAGCTGTACAAATTCTCTG
TCTTAGAAGACTTGAGAAAGCAGAACTGTAAGGTCAGATGCTT
TCTCCAGCCTTGATGCTGTGTTCCACCTTCCCTTCCTCATCCAG
AAAACAGTTACTAGGGAGAAAATGAGAAACCCATGCCAGCTG
CCCTTGATGATGGTTGATAACGGTGCTTATTGCTTTTGATGTCA
TTACCTCTGTTAGAGATGAATCAGAGTCAGAGGTCCTTAGCTG
CATCCACCCATTTCCAGGGGGACATTCTAACACTGCTGAACAG
TCAGCTAAAATGAGAGCTGTGTGTCCTAGCCTGATTCCAGGTT
AGTCATGATGCTTCCTGGAGCTGGGCTTTTATCTAATCCCAGGA
GCCATCTAGGGGAGGCTCAGAGCTAGCAGGTGATCTTCCTGAG
ATGGTTTCACCGTGACAGGTGAACCATGAGCCCTTCCAAGCAA
GGCCAAAGGACAACATTATAGGAAAGATTTCTAGTATTAATAT
GCCTTTTCTCTGTGTGTGTACTGTCTTGTAGTGATGCTATATAG
ACAAATAGATGATTTCTTATTTTTTGTTTGTTTGTTTGTTTTTTT
GTTTTTCTGTAGCCCTAGCTGTCCTGGAACTCACTTTGTAAACC
AGGCTGGCCTCGATCTCAGAAATCCGCCTGCCTCTGCCTCCCG
AGTGCTGGGATTAAAGGTGTGCACCACCACACCTTAATGATGA
TCCTATAAGTATTCCTAAAATTATACTAGTAATTATTAACTCCT
TTATAATAGGACTGCTATTAAAGCCCTCGCTGATATGAAAACT
ACAGTGAGAACTCTGCCAGTCTTCACATGTCATAATTACTTCTG
AGATAGAAAGCAGGCATTTACAACTTAGAACACATTTCTTAGA
GCTGTAAAACAATTAACTAGAGGTCATAAAAGGGAATGAAAG
ATTTATTGTAGGTGCTAGGACAGAACATAAAATATTGACTGGG
CTTATCTATATGAAACTTCATTGTTAACTTTTACACAAGAATTA
TGGTTTTTAACTTTCAGTGAACCTGCGGAGCTAGTGACAGAAG
AGAAATGTCTAGTTAGATAACTACTCTTAATGGAAATTCACAT
AAACATCTGTTGCCATCTTCTTTTTGAATTTATGTTTAAACTTGT
GAATGTTTGAATTAGACACTACGCGAGCACATAGAAAATAAA
GAACTAAGCGTGAA
SEQ ID NO:45:
GGACAGTGTGCATCACGGAGCTTGTGGCCCAGACTGTGCCTGGCAGACCCAGAGGACCTAAGGCTTGGCTCTAGTGGTGGTCAGCACAGCCCTCGGTGGTCTGCGGAGCCTGATATTGCTTTACGTAAGGGCTGTTCTGCTGTGCATCTCCTGTGTCTGAAGCTATTCGCCATGGAGACTGCTGGAGCTCCCTTCTGCTTCCATGTGGACTCCCTGGTACCTTGCTCCTACTGGAAGGTTATGGGGCCCACGCGTGTTCCCAGGAGAACGGTGCTCTTCCAGAGGGAAAGGACGGGCCTGACCTACCGTGTGCCTGCGTTACTCTGTGTGCCTCCCAGGCCTACTCTGCTGGCCTTCGCGGAACAGCGACTTAGCCCTGATGACTCCCATGCCCACCGCCTGGTGCTACGGAGGGGCACGCTGACCAGGGGCTCAGTGCGGTGGGGCACTCTGAGTGTACTGGAGACTGCAGTACTGGAGGAGCACAGGTCTATGAACCCTTGCCCGGTGCTGGATGAGCACTCTGGTACCATCTTCCTCTTCTTCATTGCCGTGCTGG
GCCACACACCGGAGGCCGTGCAAATCGCCACTGGCAAGAACG
CTGCTCGCCTCTGCTGTGTGACCAGCTGTGACGCTGGCCTCACC
TGGGGCAGTGTTCGAGATCTCACTGAGGAAGCCATTGGTGCTG
CATTGCAGGACTGGGCCACCTTTGCTGTGGGTCCGGGCCATGG
AGTTCAGCTGCGCTCGGGTCGCCTGCTTGTTCCTGCTTACACCT
ATCATGTGGACCGACGGGAATGTTTTGGCAAGATCTGCTGGAC
CAGTCCCCACTCCTTGGCATTCTACAGTGATGATCATGGGATCT
CCTGGCATTGTGGAGGCCTTGTGCCCAACCTACGCTCTGGAGA
GTGCCAACTGGCTGCGGTAGATGGAGACTTTCTCTACTGTAAT
GCTCGAAGCCCTCTGGGTAACCGTGTGCAGGCACTGAGTGCTG
ATGAAGGCACGTCCTTCCTACCAGGGGAGCTGGTGCCTACATT
GGCAGAGACGGCTCGTGGTTGCCAGGGTAGCATTGTGGGCTTC
CTAGCTCCACCCTCAATCGAGCCTCAGGATGACCGGTGGACAG
GGAGTCCTAGGAACACCCCACATTCCCCATGCTTCAATCTCAG
AGTACAGGAGTCTTCGGGGGAAGGTGCCAGAGGTCTTCTTGAA
CGTTGGATGCCCAGGTTGCCTCTCTGCTACCCACAGTCCCGGA
GCCCAGAGAATCATGGCCTAGAGCCTGGGTCAGATGGAGATA
AGACATCCTGGACTCCGGAATGTCCTATGTCCTCTGATTCCATG
CTTCAGAGCCCCACATGGCTACTATATTCCCACCCAGCAGGGC
GTAGAGCTCGGCTCCACATGGGAATCTACCTGAGCCGATCCCC
CTTGGATCCCCACAGCTGGACAGAGCCCTGGGTGATCTATGAG
GGCCCCAGTGGCTACTCTGACCTTGCCTTTCTTGGGCCTATGCC
TGGGGCATCCCTGGTTTTTGCCTGTCTGTTTGAGAGCGGGACCA
GGACTTCCTATGAAGACATTTCTTTTTGCTTGTTCTCACTGGCG
GATGTCCTGGAGAATGTGCCCACTGGCTTAGAGATGCTAAGTC
TCAGGGATAAGGCTCAGGGGCATTGCTGGCCCTCTTGATGGCC
TCACCCTCTCGTAGCCGCCTGGAGAGGAAGGGTAGACTATATA
GAGGAGGTTAGGGGTAGGTCAGCATGATGCTAGGATGGAGAG
AGCTCTGTCCCCTCGTGGATGGTGGTGGTGACTCACCCGGGGG
GCCAGCTGCTTTCTGAGTGCAAATGAGAAAAATAAAGAGCTGC
GCTGTGACTTTTCTTTCCACATCAAAGCTTGGGTGTCAGTGCTT
TAGCTTGATGCTCTGATCACCATGCAAATCTTCCACCGGCGCCT
TGCTCAGCTTTCATATCCCAAGGGTGCCTGGGAGGAAGGCAAC
AGGGACAGTGGACATCACTGCACCACTTTCCACGACCCTGTGT
GCCAACCTCAGCCACTTTGAAACATGCTGATGACTGAGGTCTG
TTCACTTTCTTAATTTCAAGCAGGAGAAGCAGGTTGGGGAGCC
AGCCTCCCCAGCTAGAGGGGACAGAACTTGACTTGAGCAGGG
GGGTACCTCCTAGGACCTGCTCCATGTGCCTACTTCTTTACCCT
TCTCTAGAGAGGGCTCTTGTCCTGTCAGAGCTGTTTTCTCCCTT
CTCTTGTTTTTTCTTTTTCAAGACTGTTTCTCTGTGTTAGCCCTG
GCTGTCCTGGATCTCACTCTGTAGATCAGGCTGACCTTGAGTTC
AAAGCTCCATCTGCCTCTACTTCTCACATTACTGTGATTAAAGG
CATATACTACCACTGCCTGGTGCCCTTTTGTATTTCTTATTAAA
GTCCTAATGTCTGATTATAAAAACAGTCTGTGTGGGCTGGAGT
GATGGCTTACTCAGTAAAGCACTTGCCATGGAATCTGGGCAAT
CTGAGTTTCATTTTTAGCATCCTGTAAAAATCCCAATTTGATGG
TGTACTTGTAATGTCAGCATGGAGAGGCAGAGATAGGTAAGTT
CCCCAAGACTCTTTGAACCGACAGCTTGGCCTCACTGGCACAT
TCCAGGTCTCAGTGAGAGACCCTGCCTCAAAATACAAAGAAAG
AGCTGCTGAAGAGTGGGTCAGAGTTGACCTCTGATCTCCGGAA
GTATATGATACACACCCGTGCATGCACTCTTCCTTACAAAATA
AAAAGCAAAACAAAACCCCAACAGGTATATGGCCATTTTAGA
AAAATTAGAAGATTTAGAAAGCTATACATAAAAAAAAATGAC
CTAAAGAAAAATCTTTACTGTTCTGGGCACTATCCCTATCAAA
CCACTGTGTTCTTTGGCCAAGCCTTGGGGTGGACACTGTTTTGA
GGTGGGTCCTGTTATCTCCACTAGGTAGTGGAGTTTTGTGTCAG
ACTAACTGGGTCTTAAAGCTGTCTTTAAGGCCATCAGGAGCTA
CTGACTTGCCTGCCTCAGCAGAGCATATCCTGAAGGTCGGGGT
TAAGTCTCCTTCCCGAGCGAGTTGCCTTCCAGTGGGCCCCTGG
ACTCCTAGGTCCTCAGCGCTCATCAGCTGCCAAGGACTCTGAG
GGAATGTCCTCTGACTGTGGCCCCGAAAGGTAGGGGAGGGGG
ATGTGCTTAGGCTTAGGACAGGGTCCTGTTTCAGTCTGCCTTCA
CTGTTAGTAGCACTGTGCCACATGGCACAGACTGGGCGAGCTT
TAAAGGAAGGAGGTTGATATTGGTTCCCACTTCTGGGGATCAT
GGTTGAGCAGCCTTGTCTGATGATGGTTGTCTTGATGGTAGATC
GTGAGGTAGTTGATGAAGGTATGACATGGTGAGAAACTCTGTG
TGTGTGTGTTATTTTCTCTGTGTTCTACCTATACATCTATCTATG
TATATATGTATCTATCTATCTACCTGGAGGCTGGAGAGATAGC
TTAGTGGTTAAGAACATTTGTTGTTCTTGCATAGTCCTGGATTT
AAATTTTCAGCACCCACATGGCAGCTCACAACAACCCATAAAT
CCAGTTTCAGAGGATCCAACCTCTGATATACCATGTCAGCCAG
AGCAGACACGGCTGAAGGTGGTTTGATCCCCGTATGGAGAGGT
GACAATTGGGAAGAGAGAAAGATCAACTTAACCATGCAAGGA
ACAGGAAGTTAAATACTGAACAGGGAAGGTAAAGGCAGGAAG
TAGATGTAGAGGGCAAATCAATGAAACCCAAACATACCCAAA
TTACGCTAAACACACACTGACATGCCAATTAAAAGGACAAATT
GGCTCCACTGGCAAAACCAAAACAGACACTGAAGATCCAAAC
AGTCACATGCCAACTACCGCGGAGGGAGACAGACACAGAGAA
GACCGTGACAGACACTTGGACACTCTTGAGAGTGGATGTGCAG
GAAGAGAGCTCTGCCAGTGGAGAAGAAAGCACTCAGAAGAAA
GTGACAGCAGCTGTAAATTTGTATTCTGCTAATGTTATGTTCCA
AAGTTGAAAGCAAAATTGTACCAATTCATAAGAACAAACAGG
CTGACTCTCAGTTGTGACTGAACGTCTCTCAGTAACTGACGGG
GCGAGCAGGCCAAAGGAGAGTCGGCTCAGAAGGGTGCATAGC
CACGCCAAATCAAATAAGCAAGTACAACCGGCAGGCTCTATTT
CTAGCACAAAGGGGTCTGTGCCTCATTCTGTGCTTGGGTCAGA
GCTTGGGTCTCTCATTTGGATGTAAGTGGTGTAGTGGAGAAGC
AGGAAATAATCCGGAGCGCATATTTTGATTTTAACATAAGTGC
TGATTTGGGAGGGAGTTTTGTCAAATTGTGTTTTTACAATGTTT
TTTTTTTTTTAAATGATGCTTTTTTGTAAAGTGTACAAATGTGA
TATAAGATTGGTTCTGCTACATTCAGTTTCTATAAAAGTGGTTC
TAAAATATTGTACTGTCAATCATCTCATGATTATTCTACTGTAC
ACATTACTGACTTTGTATGTAATAATTAATATTAGAAGAAAAT
ATAATTTATTTGAATATAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO:46:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX1 1FX12MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:47:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX1 0THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX 33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:48:
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SEQ ID NO:49:
DASLPYLQDESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIRFIMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:50:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDANTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:51:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:52:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDASTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:53:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDATTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:54:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDANTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPAGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHRKQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:55:
ASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:56:
MASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:57:
ASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:58:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:59:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSCAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:60:
AASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAPTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDAQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPQGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQ
SEQ ID NO:61:
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SEQ ID NO:62:
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SEQ ID NO:85:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX1 0THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX24ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX 33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:86:
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACGTGAACACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACTCCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTAGAAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATAAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO:87:
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTCGCCAGAATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTTCTAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCtagcACCAAGGGCCCATCcGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCcTGGAACTCAGGCGCtCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtacTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:88:
GATGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCGGCACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGAACAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCA
GCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGAC
CTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTG
ACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCT
TCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGC
TAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCAC
CCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCA
CGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCA
GGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGA
GCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCC
AGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAA
GAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAG
GGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCG
GCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACA
CACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTA
GACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGC
CAAGGGCAGCGCTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACA
GGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCA
ACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCA
GGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAAGGCGGAGGTGGAAGT
GGCGGAGGCGGATCCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC
CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC
CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG
GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG
CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC
GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAA
TGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA
GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCC
CGAGAACCACAGGTCTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGA
TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT
CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA
GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCC
GACGGCTCCTTCTTCCTCACTAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA
GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA
TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTG
TCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:89:
GATGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGGCCAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCGGCACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATGAACAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTCAAGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGAGCCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCACAGGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCGCTGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAA
SEQ ID NO:90:
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SEQ ID NO:91:
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCA
TCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGG
ACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCAT
CCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTG
GGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTC
GTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGG
TGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCA
TCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAA
TGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAG
AATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCG
ACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTT
TGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTC
AACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACA
AAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACA
AGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAA
TCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAG
CGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAG
CCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATC
GACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCT
ACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCC
TGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGA
CCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAACggcggaggt
ggaagtggcggaggcggatccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgg
ggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgagg
tcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggc
gtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtca
gcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaa
gccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtct
acaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaagg
cttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagacc
acgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctcactagcaagctcaccgtggacaagagcagg
tggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaag
agcctctccctgtctccgggtaaa
SEQ ID NO:92:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSTVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYN
SEQ ID NO:93:
gaggtgcagctggttgaatctggcggaggactggttcagcctggcggatctctgagactgtcttgtgccgccagcggcttcaacatcaaggacacctacatccactgggtccgacaggcccctggcaaaggacttgaatgggtcgccagaatctaccccaccaacggctacaccagatacgccgactctgtgaagggcagat
tcaccatcagcgccgacaccagcaagaacaccgcctacctgcagatgaacagcctgagagccgagga
caccgccgtgtactactgttctagatggggaggcgacggcttctacgccatggattattggggccaggg
caccctggtcaccgtttcttctgctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaaga
gcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggt
gtcctggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggact
ctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgt
gaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcaca
catgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaaccca
aggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagac
cctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggg
aggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaat
ggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaa
agccaaagggcagccccgagaaccacaggtctacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaa
gaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggaga
gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc
ctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatg
catgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaggtggcggagg
atctggcggaggtggaagcggcggaggcggatctacagtggaaaagtccgtggtgttcaaggccgag
ggcgagcacttcaccgaccagaaaggcaataccatcgtcggctctggcagcggcggcaccaccaagt
actttagaatccccgccatgtgcaccaccagcaagggcaccattgtggtgttcgccgacgccagacaca
acaccgccagcgatcagagcttcatcgataccgctgccgccagaagtacagacggcggcaagacctg
gaacaagaagatcgccatctacaacgaccgcgtgaacagcaagctgagcagagtgatggaccctacct
gcatcgtggccaacatccagggcagagaaaccatcctggtcatggtcggaaagtggaacaacaacgat
aagacctggggcgcctacagagacaaggcccctgataccgattgggacctcgtgctgtataagagcac
cgacgacggcgtgaccttcagcaaggtggaaacaaacatccacgacatcgtgaccaagaacggcacc
atctctgccatgctcggcggcgttggatctggcctgcaactgaatgatggcaagctggtgttccccgtgc
agatggtccgaacaaagaacatcaccaccgtgctgaataccagcttcatctactccaccgacggcatca
catggtccctgcctagcggctactgtgaaggctttggcagcgagaacaacatcatcgagttcaacgcca
gcctggtcaacaacatccggaacagcggcctgcggagaagcttcgagacaaaggacttcggaaagac
gtggaccgagtttcctccaatggacaagaaggtggacaaccggaaccacggcgtgcagggcagcaca
atcacaatccctagcggcaacaaactggtggccgctcactctagcgcccagaacaagaacaacgatta
caccagaagcgacatcagcctgtacgcccacaacctgtactccggcgaagtgaagctgatcgacgact
tctaccccaaagtgggcaatgccagcggagccggctacagctgtctgagctaccggaaaaatgtggac
aaagaaaccctgtacgtggtgtacgaggccaacggcagcatcgagtttcaggacctgagcagacatct
gcccgtgatcaagagctacaat
SEQ ID NO:94:
TVEKSVVFKAEGEHFTDQKGNTIVGSGSGGTTKYFRIPAMCTTSKGTIVVFADARHNTASDQSFIDTAAARSTDGGKTWNKKIAIYNDRVNSKLSRVMDPTCIVANIQGRETILVMVGKWNNNDKTWGAYRDKAPDTDWDLVLYKSTDDGVTFSKVETNIHDIVTKNGTISAMLGGVGSGLQLNDGKLVFPVQMVRTKNITTVLNTSFIYSTDGITWSLPSGYCEGFGSENNIIEFNASLVNNIRNSGLRRSFETKDFGKTWTEFPPMDKKVDNRNHGVQGSTITIPSGNKLVAAHSSAQNKNNDYTRSDISLYAHNLYSGEVKLIDDFYPKVGNASGAGYSCLSYRKNVDKETLYVVYEANGSIEFQDLSRHLPVIKSYNGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:95:
ACAGTGGAAAAGTCCGTGGTGTTCAAGGCCGAGGGCGAGCACTTCACCGACCAGAAAGGCAATACCATCGTCGGCTCTGGCAGCGGCGGCACCACCAAGTACTTTAGAATCCCCGCCATGTGCACCACCAGCAAGGGCACCATTGTGGTGTTCGCCGACGCCAGACACAACACCGCCAGCGATCAGAGCTTCATCGATACCGCTGCCGCCAGATCTACCGATGGCGGCAAGACCTGGAACAAGAAGATCGCCATCTACAACGACCGCGTGAACAGCAAGCTGAGCAGAGTGATGGACCCTACCTGCATCGTGGCCAACATCCAGGGCAGAGAAACCATCCTGGTCATGGTCGGAAAGTGGAACAACAACGATAAGACCTGGGGCGCCTACAGAGACAAGGCCCCTGATACCGATTGGGACCTCGTGCTGTACAAGAGCACCGATGACGGCGTGACCTTCAGCAAGGTGGAAACAAACATCCACGACATCGTGACCAAGAACGGCACCATCTCTGCCATGCTCGGCGGCGTTGGATCTGGCCTGCAACTGAATGATGGCAAGCTGGTGTTCCCCGTGCAGATGGTCCGAACAAAGAATATCACCACCGTGCTGAATACCAGCTTCATCTACAGCACCGACGGCATCACATGGTCCCTGCCTAGCGGCTACTGTGAAGGCTTTGGCAGCGAGAACAACATCATCGAGTTCAACGCCAGCCTGGTCAACAACATCCGGAACAGCGGCCTGCGGAGAAGCTTCGAGACAAAGGACTTCGGAAAGACGTGGACCGAGTTTCCTCCAATGGACAAGAAGGTGGACAACCGGAACCACGGCGTGCAGGGCAGCACAATCACAATCCCTAGCGGCAACAAACTGGTGGCCGCTCACTCTAGCGCCCAGAACAAGAACAACGACTACACCAGAAGCGACATCAGCCTGTACGCCCACAACCTGTACAGCGGCGAAGTGAAGCTGATCGACGACTTCTACCCCAAAGTGGGCAATGCCAGCGGAGCCGGCTACAGCTGTCTGAGCTACCGGAAAAATGTGGACAAAGAAACCCTGTACGTGGTGTACGAGGCCAACGGCAGCATCGAGTTTCAGGACCTGAGCAGACATCTGCCCGTGATCAAGAGCTACAACGGCGGAGGTGGAAGTGGCGGAGGCGGATCcGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG
ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG
ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT
GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAG
CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAC
TGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAA
GCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCG
GGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT
CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG
CTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGT
GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC
GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC
TCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGG
TGGAAGTGGCGGAGGCGGATCTGAGGTGCAGCTGGTTGAATCT
GGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTT
GTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTG
GGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTCGCCAG
AATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTG
AAGGGCAGATTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACC
GCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCC
GTGTACTACTGTTCTAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCA
TGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGGC
GGAGGAGGATCTGGCGGAGGCGGAAGTGGCGGAGGCGGATCT
GACATCCAGATGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCAGCG
TGGGAGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGACG
TGAACACAGCCGTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGC
CCCTAAGCTGCTGATCTACAGCGCCAGCTTTCTGTACTCCGGCG
TGCCCAGCAGATTCAGCGGCTCTAGAAGCGGCACCGACTTCAC
CCTGACCATAAGCAGTCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTAC
TACTGTCAGCAGCACTACACCACACCTCCAACCTTTGGCCAGG
GCACCAAGGTGGAAATCAAG
SEQ ID NO:96:
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SEQ ID NO:97:
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SEQ ID NO:171:
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SEQ ID NO:172:
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SEQ ID NO:173:
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SEQ ID NO:174:
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SEQ ID NO:175:
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SEQ ID NO:176:
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SEQ ID NO:177:
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SEQ ID NO:178:
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SEQ ID NO:179:
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SEQ ID NO:180:
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SEQ ID NO:181:
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SEQ ID NO:184:
GGGGS
SEQ ID NO:185:
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SEQ ID NO:186:
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SEQ ID NO:187:
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SEQ ID NO:188:
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SEQ ID NO:189:
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SEQ ID NO:190:
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SEQ ID NO:191:
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SEQ ID NO:193:
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SEQ ID NO:194:
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SEQ ID NO:195:
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SEQ ID NO:196:
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SEQ ID NO:198:
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SEQ ID NO:199:
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SEQ ID NO:201:
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SEQ ID NO:202:
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SEQ ID NO:203:
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SEQ ID NO:230:
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SEQ ID NO:231:
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GGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACA
CTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGA
GTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTGC
AGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCC
AGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCAG
GGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCT
CTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTG
GCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCT
GCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCA
GCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGAT
GGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACG
AAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCC
AGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACT
CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC
CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG
ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA
GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG
CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA
GTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG
CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAAG
CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:232:
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SEQ ID NO:233:
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TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
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CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT
GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT
CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG
CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:234:
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SEQ ID NO:235:
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GCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCG
TTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
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CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT
GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT
CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG
CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:236:
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SEQ ID NO:237:
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CAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCAC
CGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGAC
GCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCG
TTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCatcCA
GCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACG
GCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACAC
TGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAG
TCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTGCA
GGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCA
GCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCAGG
GAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTC
TCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGG
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CTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAG
CgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATG
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AGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCA
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ACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC
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CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCA
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CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTC
TCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCC
CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG
CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAAG
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CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:238:
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SEQ ID NO:239:
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SEQ ID NO:240:
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SEQ ID NO:241:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGcggAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGC
GATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAG
AGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAA
CCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTT
CTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTG
CAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCAC
CGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGAC
GCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCG
TTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
CAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCA
CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAcagGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT
GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT
CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG
CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:242:
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SEQ ID NO:243:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGC
CAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGcggAGC
AAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGC
GATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAG
AGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAA
CCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTT
CTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTG
CAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCAC
CGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGAC
GCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCG
TTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
CAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCA
CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCtgtGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT
GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
GCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC
AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT
GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT
CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGA
CCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA
GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC
GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAA
GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT
CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG
CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:244:
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SEQ ID NO:245:
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGAGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATCCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAATGGGTCGCCAGAATCTACCCCACCAACGGCTACACCAGATACGCCGACTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCGCCGACACCAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTTCTAGATGGGGAGGCGACGGCTTCTACGCCATGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTTTCTTCTGCtagcACCAAGGGCCCATCcGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCcTGGAACTCAGGCGCtCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCaccAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:246:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGcggAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATCTCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAACAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCACGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACACACTGGAATGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAGAGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTGCAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGCCAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCAGGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGCTCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCTGGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCCTGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGCAGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGATGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTACGAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTCCAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGtaCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:247:
X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX4SKKDEHAELIVLRRGDYDAX5THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX6QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX7VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX8QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX9RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX10GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX11X12QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX13AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX14FX15MFTLKQAFPAEYLPQX16DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:248:
X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRX7SX8X9DEHAELIVX10RRGDYDAX11THQVQWX12AQEVVAQAX13LX14GHRSMNPCPLYDX15QTGTLFLFFIAIPX16X17VTEX18QQLQTRANVTRLX1 9X20VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX21YREWSTFAVGPGHX22LQLHDX23X24RSLVVPAYAYRKLHPX25X26X27PIPSAFX28FLSHDHGRTWARGHFVX29QDTX30ECQVAEVX31TGEQRVVTLNARSX32X33X34X35RX36QAQSX37NX38GLDFQX39X40QX41VKKLX42EPPPX43GX44QGSVISFPSPRSGPGSPAQX45LLYTHPTHX46X47QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX48LLAKGSX49AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX50LYEANDYEEIX51FX52MFTLKQAFPAEYLPQX53DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:249:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRRSKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRFRVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPTGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO:250:
DASLPYLQKESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRRSKKDEHAELIVLRRGDYDAGTHQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDEQTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCYVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPKQRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLACQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRFRVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPTGCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHSWQRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSAAYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIVFLMFTLKQAFPAEYLPQEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLYCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:251:
gatGCATCTCTGCCTTACCTGCAGAAAGAAAGCGTGTTCCAGTCTGGCGCCCACGCCTACAGAATTCCCGCTCTGCTGTATCTGCCAGGCCAGCAGTCTCTGCTGGCTTTCGCTGAACAGCGGcggAGCAAGAAGGATGAGCACGCCGAACTGATCGTGCTGCGGAGAGGCGATTACGACGCCggcACACATCAGGTGCAGTGGCAGGCTCAAGAGGTGGTGGCTCAGGCTAGACTGGACGGCCACAGATCTATGAACCCCTGTCCTCTGTACGATgaaCAGACCGGCACACTGTTTCTGTTCTTTATCGCTATCCCCGGCCAAGTGACCGAGCAGCAGCAGCTGCAGACAAGAGCCAACGTGACCAGACTGTGTtacGTGACCTCCACCGACCACGGCAGAACCTGGTCTAGCCCTAGAGATCTGACCGACGCCGCCATCGGACCTGCCTATAGAGAGTGGTCCACCTTCGCCGTTGGACCTGGACACTGTCTCCAGCTGCACGACAGGGCTAGATC
TCTGGTGGTGCCTGCCTACGCCTATAGAAAGCTGCACCCCAAA
CAGCGGCCTATTCCTAGCGCCTTCTGCTTTCTGAGCCACGATCA
CGGCAGGACATGGGCCAGAGGACATTTCGTGGCCCAGGACAC
ACTGGCCTGCCAGGTGGCCGAAGTGGAAACCGGCGAGCAGAG
AGTCGTGACCCTGAACGCCAGATCTCACCTGAGATTCAGAGTG
CAGGCCCAGAGCACAAACGACGGCCTGGATTTCCAAGAGAGC
CAGCTGGTCAAGAAACTGGTGGAACCTCCTCCAaccGGCTGTCA
GGGAAGCGTGATCAGCTTTCCATCTCCTAGAAGCGGCCCTGGC
TCTCCTGCTCAGTGGCTGCTGTATACACACCCCACACACAGCT
GGCAGAGAGCCGATCTGGGCGCCTACCTGAATCCTAGACCTCC
TGCTCCTGAGGCTTGGAGCGAACCTGTTCTGCTGGCCAAGGGC
AGCgctGCCTACAGCGATCTGCAGTCTATGGGCACAGGCCCTGA
TGGCAGCCCTCTGTTTGGCTGTCTGTACGAGGCCAACGACTAC
GAAGAGATCGTGTTCCTGATGTTCACCCTGAAGCAGGCCTTTC
CAGCCGAGTACCTGCCTCAAGAGCCCAAATCTTCTGACAAAAC
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GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG
AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACG
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AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT
GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGT
CTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC
AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTcTACACCCTGC
CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGta
CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG
TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACG
CCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCtatAGCAAG
CTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
Claims (68)
1.一种融合蛋白，其包含：
(a)重组突变人唾液酸酶，其中所述唾液酸酶包含在与野生型人Neu2(A42)的位置42对应的位置处的丙氨酸残基的取代；和
(b)抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中在对应于野生型人Neu2的位置42的位置处的丙氨酸残基被精氨酸(A42R)取代。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；
(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；
(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；
(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；
(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；
(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；
(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；
(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；
(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；
(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；
(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；
(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；
(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；
(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；
(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；
(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；
(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；
(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；
(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；
(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；
(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；
(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；
(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；
(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；
(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；
(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；
(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；
(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；
(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；
(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；
(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；
(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；
(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；
(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；
(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；
(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；
(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；
(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；
(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；
(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或
(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；
或任何上述取代的组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含K9、P62、A93、Q126、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何上述取代的组合。
5.如权利要求3或4所述的融合蛋白，其中，在所述唾液酸酶中：
(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；
(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；
(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；
(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；
(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；
(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；
(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q69H)；
(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸取代(R78K)；
(i)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸取代(D80P)；
(j)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；
(k)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸取代(G107D)；
(l)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q108H)；
(m)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)取代；
(n)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸取代(C125L)；
(o)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；
(p)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸取代(A150V)；
(q)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸取代(C164G)；
(r)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R170P)；
(s)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸取代(A171G)；
(t)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸取代(Q188P)；
(u)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R189P)；
(v)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；
(w)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)取代；
(x)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E225P)；
(y)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸取代(H239P)；
(z)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；
(aa)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；
(bb)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；
(cc)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I)或脯氨酸(V244P)取代；
(dd)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸取代(T249A)；
(ee)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸取代(D251G)；
(ff)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E257P)；
(gg)对应于第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S258C)；
(hh)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；
(ii)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸取代(V265F)；
(jj)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；
(kk)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸取代(W292R)；
(ll)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；
(mm)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；
(nn)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或
(oo)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；
或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。
6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、A93E、Q126Y、A242F、A242W、A242Y、Q270A、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I取代的取代或任何上述取代的组合。
7.如权利要求1-6中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含：
(a)对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基(M1)的取代或缺失；
(b)对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基(V6)的取代；
(c)对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基(I187)的取代；或
(d)对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基(C332)的取代；
或任何上述取代的组合。
8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中，在所述唾液酸酶中：
(a)所述对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸取代(M1A)或被天冬氨酸取代(M1D)；
(b)所述对应于野生型人类Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸取代(V6Y)；
(c)所述对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸取代(I187K)；或
(d)所述对应于野生型人类Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸取代(C332A)；
或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含M1D、V6Y、A42R、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A取代。
10.如权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶选自Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶是Neu2。
12.如权利要求1-11中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶具有与相应的野生型唾液酸酶不同的底物特异性。
13.如权利要求12所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶可以切割α2,3、α2,6和/或α2,8键联。
14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶可以切割α2,3和α2,8键联。
15.如权利要求1-14中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO:198。
16.如权利要求1-15中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶包含表1-11中的任一者中所示的突变或突变的组合。
17.如权利要求1-16中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白还包含免疫球蛋白Fc结构域。
18.如权利要求17所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM Fc结构域。
19.如权利要求18所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc结构域。
20.如权利要求19所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人类IgG1 Fc结构域。
21.如权利要求1-20中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域与第二抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域缔合，以产生抗HER2抗原结合位点。
22.如权利要求1-21中任一项所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于选自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、CT-P6、曲妥珠单抗dkst、MGAH22(马吉妥昔单抗)、PF-05280014、厄妥索单抗、甘妥单抗、timiguzumab、Ontruzant、ABP-980、SB3、DS-8201、MYL-1410、BCD-022和HD201的抗体。
23.如权利要求22所述的融合蛋白，其中所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域源自于曲妥珠单抗。
24.如权利要求1-23中任一项所述的融合蛋白，其中所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域和/或所述抗HER2免疫球蛋白抗原结合结构域通过肽键或氨基酸接头连接。
25.如权利要求1-24中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:203-208中的任一者。
26.一种抗体缀合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白。
27.如权利要求26所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含单个唾液酸酶。
28.如权利要求26所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含两个唾液酸酶。
29.如权利要求28所述的抗体缀合物，其中所述两个唾液酸酶是相同的。
30.如权利要求26-29中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含单个抗HER2抗原结合位点。
31.如权利要求26-29中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含两个抗HER2抗原结合位点。
32.如权利要求31所述的抗体缀合物，其中所述两个抗HER2抗原结合位点是相同的。
33.如权利要求26-32中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约135kDa至约165kDa的分子量。
34.如权利要求26-32中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物具有约215kDa至约245kDa的分子量。
35.如权利要求26-34中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被连接在一起，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽一起限定了抗HER2抗原结合位点。
36.如权利要求35所述的抗体缀合物，其中所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域。
37.如权利要求35或36所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:66。
38.如权利要求35-37中任一项所述的抗体缀合物，其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:67或189中的任一者。
39.如权利要求35-38中任一项所述的抗体缀合物，其中所述第三多肽包含SEQ IDNOs:203-208中的任一者。
40.如权利要求35-39中任一项所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:66，所述第二多肽包含SEQ ID NO:189，并且所述第三多肽包含SEQ ID NO:205。
41.如权利要求26-34中任一项所述的抗体缀合物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含第一免疫球蛋白重链和第一唾液酸酶的第二多肽；
(c)包含第二免疫球蛋白重链和第二唾液酸酶的第三多肽；和
(d)包含第二免疫球蛋白轻链的第四多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，所述第三和第四多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一多肽和所述第二多肽一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第三多肽和所述第四多肽一起限定了第二抗HER2抗原结合位点。
42.如权利要求41所述的抗体缀合物，其中所述第二和第三多肽分别以N-至C-端的方向包含所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述第一和第二唾液酸酶。
43.如权利要求26-34中任一项所述的抗体缀合物，其中所述融合蛋白包含：
(a)包含第一唾液酸酶、第一免疫球蛋白Fc结构域和第一单链可变片段(scFv)的第一多肽；和
(b)包含第二唾液酸酶、第二免疫球蛋白Fc结构域和第二单链可变片段(scFv)的第二多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且其中所述第一scFv限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述第二scFv限定了第二抗HER2抗原结合位点。
44.如权利要求43所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽以N-至C-端的方向包含所述第一唾液酸酶、所述第一免疫球蛋白Fc结构域和所述第一scFv，并且所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述第二唾液酸酶、所述第二免疫球蛋白Fc结构域和所述第二scFv。
45.如权利要求43或44所述的抗体缀合物，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO:244或SEQ ID NO:249并且/或者其中所述第二多肽包含SEQ ID NO:244或SEQ ID NO:249。
46.如权利要求26-34中任一项所述的抗体缀合物，其中所述抗体缀合物包含：
(a)包含免疫球蛋白轻链的第一多肽；
(b)包含免疫球蛋白重链和单链可变片段(scFv)的第二多肽；和
(c)包含免疫球蛋白Fc结构域和唾液酸酶的第三多肽；
其中所述第一和第二多肽被共价连接在一起，并且所述第二和第三多肽被共价连接在一起，并且其中所述免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链一起限定了第一抗HER2抗原结合位点，并且所述scFv限定了第二抗HER2抗原结合位点。
47.如权利要求46所述的抗体缀合物，其中所述第二多肽以N-至C-端的方向包含所述免疫球蛋白重链和所述scFv，并且所述第三多肽以N-至C-端的方向包含所述唾液酸酶和所述免疫球蛋白Fc结构域。
48.一种分离的核酸，其包含编码权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白，或权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物的至少一部分的核苷酸序列。
49.一种表达载体，其包含权利要求48所述的核酸。
50.一种宿主细胞，其包含权利要求49所述的表达载体。
51.一种药物组合物，其包含权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白，或权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物。
52.一种治疗有需要的受试者中的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白、权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求51的药物组合物。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述癌症选自肺细支气管肺泡癌(BAC)、膀胱癌、女性生殖道恶性肿瘤(例如，子宫浆液性癌、子宫内膜癌、外阴鳞状细胞癌和子宫肉瘤)、卵巢表面上皮癌(例如卵巢透明细胞癌、上皮性卵巢癌、输卵管癌和原发性腹膜癌)、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、男性生殖道恶性肿瘤(例如睾丸癌)、腹膜后或腹膜癌、胃食管腺癌、食管胃结合部癌、肝细胞癌、食管与食管胃结合部癌、宫颈癌、胆管癌、胰腺腺癌、肝外胆管腺癌、小肠恶性肿瘤、胃腺癌、原发灶不明的癌症(CUP)、结直肠腺癌、食道癌、前列腺癌、肾癌、头颈鳞状细胞癌、胸腺癌、非黑色素瘤皮肤癌、甲状腺癌(例如乳头状癌)、头颈癌、肛门癌、非上皮细胞卵巢癌(非EOC)、葡萄膜黑色素瘤、恶性胸膜间皮瘤、小细胞肺癌(SCLC)、中枢神经系统癌、神经内分泌肿瘤和软组织肿瘤。
54.如权利要求52或53的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
55.如权利要求52或53所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌。
56.如权利要求52或53的方法，其中所述癌症是膀胱癌。
57.如权利要求52或53的方法，其中所述癌症是肾癌。
58.如权利要求52或53的方法，其中所述癌症是结肠癌。
59.如权利要求52或53的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。
60.一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白、利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求51所述的药物组合物。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述CD8+T细胞是CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T细胞。
64.如权利要求60所述的方法，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
65.一种在有需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白、权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求51所述的药物组合物，以便相对于所述融合蛋白、抗体缀合物，或药物组合物的施用之前增加循环NK细胞的数目。
66.一种增加有需要的受试者的引流淋巴结中的T细胞数目的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白、权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求51所述的药物组合物，以便相对于所述融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物的施用之前增加所述引流淋巴结中T细胞的数目。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
68.一种增加细胞、组织或受试者中的Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcdl、Lag3、Il6、Illb、Il2、Ifng、Ifna1、Mxl、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法，所述方法包括使所述细胞、组织或受试者与有效量的权利要求1-25中任一项所述的融合蛋白、权利要求26-47中任一项所述的抗体缀合物，或权利要求51所述的药物组合物接触，以便相对于与所述融合蛋白、抗体缀合物或药物组合物接触之前的所述细胞、组织或受试者增加Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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