CN114269937A - 重组唾液酸酶及其使用方法 - Google Patents

重组唾液酸酶及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114269937A
CN114269937A CN202080058195.9A CN202080058195A CN114269937A CN 114269937 A CN114269937 A CN 114269937A CN 202080058195 A CN202080058195 A CN 202080058195A CN 114269937 A CN114269937 A CN 114269937A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substitution
wild
type human
residue
position corresponding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080058195.9A
Other languages
English (en)
Inventor
彭力
曹立志
桑迪普·A·谢尔克
安德鲁·S·特纳
徐丽慧
韦恩·C·盖特林
詹姆斯·W·布罗德里克
卡尔·D·诺明顿
苏加塔·B·内尔
扎克尔·B·西迪基
阿布谢克·戴斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Palion Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Palion Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Palion Pharmaceutical Co ltd filed Critical Palion Pharmaceutical Co ltd
Publication of CN114269937A publication Critical patent/CN114269937A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明总体上涉及重组唾液酸酶、延长所述重组唾液酸酶的血清半衰期的方法和组合物及其在治疗唾液酸相关障碍中的用途。

Description

重组唾液酸酶及其使用方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月3日提交的美国临时专利申请系列号62/870,336和2020年1月3日提交的美国临时专利申请系列号62/957,027的利益和优先权，每个所述临时申请的全部内容整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及重组唾液酸酶、延长重组唾液酸酶的血清半衰期的方法和组合物及其在唾液酸相关障碍治疗中的用途。
背景技术
越来越多的证据支持聚糖、特别是唾液酸聚糖在肿瘤进展的各个不同病理生理步骤中的作用。聚糖调节肿瘤的增殖、侵袭、血源性转移和血管生成(Fuster等，(2005)NAT.REV.CANCER 5(7):526-42)。在癌症中细胞表面糖缀合物的唾液酸化经常被改变，导致唾液酸化肿瘤相关糖抗原的表达。肿瘤细胞中唾液酸化聚糖的表达通常伴有肿瘤的侵袭性和转移潜力的提高。
最近变得越来越明显的是，Siglecs(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素)这种结合唾液酸的凝集素家族，通过与超唾液酸化的癌细胞结合并介导来自于活化的NK细胞受体的信号的抑制，从而抑制NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀，而在癌症免疫抑制中发挥作用(Jandus等，(2014)J.CLIN.INVEST.124:1810-1820；
Figure BDA0003508968760000011
等，(2014)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 111:14211-14216；Hudak等，(2014)NAT.CHEM.BIOL.10:69-75)。同样地，通过用唾液酸酶酶法去除唾液酸可以增强NK细胞介导的肿瘤细胞灭杀(Jandus，同上；Hudak，同上；Xiao等，(2016)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 113(37):10304-9)。
使用包括阻断PD-1/PD-L1途径的抗体在内的免疫检查点抑制剂的癌症免疫疗法改善了许多癌症患者的结果。然而，尽管到目前为止已取得进展，但许多患者对目前可用的免疫检查点抑制剂没有响应。因此，对克服免疫抑制性肿瘤微环境并用于治疗与超唾液酸化的癌细胞相关的癌症的有效干预手段，仍存在着需求。
发明内容
本发明部分是基于下述发现，即有可能通过给药唾液酸酶或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶来治疗唾液酸介导的障碍。令人吃惊的是，已发现缺少靶向组成部分(例如针对肿瘤抗原的抗体结合结构域)的唾液酸酶或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶可以在体内有效地治疗唾液酸介导的障碍(例如癌症，例如实体肿瘤)。
本发明还涉及唾液酸酶的重组形式、与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶及其药物组合物，它们具有适合的底物特异性和活性，可用于从癌细胞表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子和/或从肿瘤微环境除去唾液酸和/或含唾液酸分子和/或降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
因此，在某些方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与在给药到受试者时提高唾液酸酶的血清半衰期的血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶，或基本上由其组成。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗唾液酸相关障碍的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的药物组合物，从而治疗所述障碍，所述药物组合物包含唾液酸酶和在给药到所述受试者时提高所述唾液酸酶的血清半衰期的血清半衰期增强剂。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶不与结合与癌细胞相关的癌抗原的癌抗原靶向剂偶联。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶是全长唾液酸酶的表现出所述全长唾液酸酶的至少50％的活性的功能性片段或变体。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂在融合蛋白中共价连接在一起，或被化学偶联在一起。
在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂选自Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、XTEN、氨基酸均聚物(homo-amino acid polymer)(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)、白蛋白结合结构域、CTP融合体、GLK融合体和聚乙二醇。
在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂是Fc结构域。
在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂不是Fc结构域或聚乙二醇。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶相对于模板野生型唾液酸酶包含一个或多个突变。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；或在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；或任何上述替换的组合。在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：(a)所述对应于野生型人Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸替换(M1A)或被天冬氨酸替换(M1D)；(b)所述对应于野生型人Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸替换(V6Y)；(c)所述对应于野生型人Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸替换(I187K)；或(d)所述对应于野生型人Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸替换(C332A)；或者所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含选自下述的替换组合：
(a)M1D,V6Y,P62G,A93E,I187K,C332A；
(b)M1D,V6Y,P62G,A93E,I187K,S301A,W302R,C332A；
(c)M1D,V6Y,P62G,A93E,Q126Y,I187K,A242F,Q270T,C332A；
(d)M1D,V6Y,P62G,A93E,Q126Y,I187K,C332A；和
(e)A93E,Q126Y,I187K,A242F,Q270T,C332A。
在某些实施方式中，所述与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶包含选自SEQ IDNO：115、152、180、184和188的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；在对应于野生型人Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；在对应于野生型人Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；在对应于野生型人Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；在对应于野生型人Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；在对应于野生型人Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；在对应于野生型人Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；在对应于野生型人Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；在对应于野生型人Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；在对应于野生型人Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；在对应于野生型人Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；在对应于野生型人Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；在对应于野生型人Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；在对应于野生型人Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；在对应于野生型人Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；在对应于野生型人Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；在对应于野生型人Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；在对应于野生型人Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；在对应于野生型人Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；在对应于野生型人Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；在对应于野生型人Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；在对应于野生型人Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；在对应于野生型人Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；在对应于野生型人Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；在对应于野生型人Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；在对应于野生型人Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；在对应于野生型人Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；在对应于野生型人Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；在对应于野生型人Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；在对应于野生型人Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；在对应于野生型人Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；在对应于野生型人Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；在对应于野生型人Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或在对应于野生型人Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶选自细菌唾液酸酶、病毒唾液酸酶和哺乳动物唾液酸酶。在某些实施方式中，所述唾液酸酶是人唾液酸酶。在某些实施方式中，所述人唾液酸酶选自neu1、neu2、neu3和neu4。在某些实施方式中，所述人唾液酸酶是neu2。
在某些实施方式中，所述药物组合物包含约0.01mg/kg至约100mg/kg的所述唾液酸酶。
在某些实施方式中，所述药物组合物包含第二治疗剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂选自抗炎药剂、抗血管生成药剂、抗纤维化药剂或抗增殖化合物(例如细胞毒性药剂或检查点抑制剂)。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含起稳定作用量的唾液酸酶稳定剂。在某些实施方式中，所述唾液酸酶稳定剂是阳离子。在某些实施方式中，所述阳离子选自钙和镁。
在某些实施方式中，所述药物组合物被安置在无菌容器(例如瓶或小管)中。在某些实施方式中，将所述药物组合物在所述无菌容器中冷冻干燥。在某些实施方式中，所述药物组合物作为溶液存在于所述无菌容器中。在某些实施方式中，所述无菌容器用隔膜密封。在某些实施方式中，所述无菌容器具有安置在其上的识别所述容器中包含的药物组合物的标签。
另一方面，本公开涉及一种在需要的受试者中治疗唾液酸相关障碍的方法，所述方法包括向所述受试者给药包含有效量的唾液酸酶和给药到受试者时增加所述唾液酸酶的血清半衰期的血清半衰期增强剂的药物组合物，从而治疗所述障碍。
在某些实施方式中，所述唾液酸相关障碍是癌症。在某些实施方式中，所述唾液酸酶不与结合与癌细胞相关的癌抗原的癌抗原靶向剂偶联。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶是全长唾液酸酶的功能性片段，其表现出所述全长唾液酸酶的至少50％的活性。在某些实施方式中，所述唾液酸酶是表现出野生型唾液酸酶的至少50％的活性的变体。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂在融合蛋白中共价连接在一起。在某些实施方式中，所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂被化学偶联在一起。
在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂选自Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、XTEN、氨基酸均聚物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)和聚乙二醇。在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂是Fc结构域。在某些实施方式中，所述血清半衰期增强剂不是Fc结构域或聚乙二醇。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶相对于模板野生型唾液酸酶包含一个或多个突变。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；或在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：所述对应于野生型人Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸替换(M1A)或被天冬氨酸替换(M1D)；所述对应于野生型人Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸替换(V6Y)；所述对应于野生型人Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸替换(I187K)；或所述对应于野生型人Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸替换(C332A)；或者所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含选自下述的替换组合：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、C332A；
(b)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R、C332A；
(c)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A；
(d)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、C332A；和
(e)A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A。
在某些实施方式中，所述与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶包含选自SEQ IDNO：115、152、180、184和188的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含：在对应于野生型人Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；在对应于野生型人Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；在对应于野生型人Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；在对应于野生型人Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；在对应于野生型人Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；在对应于野生型人Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；在对应于野生型人Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；在对应于野生型人Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；在对应于野生型人Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；在对应于野生型人Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；在对应于野生型人Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；在对应于野生型人Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；在对应于野生型人Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；在对应于野生型人Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；在对应于野生型人Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；在对应于野生型人Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；在对应于野生型人Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；在对应于野生型人Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；在对应于野生型人Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；在对应于野生型人Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；在对应于野生型人Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；在对应于野生型人Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；在对应于野生型人Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；在对应于野生型人Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；在对应于野生型人Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；在对应于野生型人Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；在对应于野生型人Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；在对应于野生型人Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；在对应于野生型人Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；在对应于野生型人Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；在对应于野生型人Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；在对应于野生型人Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；在对应于野生型人Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或在对应于野生型人Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶选自细菌唾液酸酶、病毒唾液酸酶和哺乳动物唾液酸酶。在某些实施方式中，所述哺乳动物唾液酸酶是人唾液酸酶。在某些实施方式中，所述人唾液酸酶选自neu1、neu2、neu3和neu4。在某些实施方式中，所述人唾液酸酶是neu2。
在某些实施方式中，将约0.01mg/kg至约100mg/kg的所述唾液酸酶给药到所述受试者。
在某些实施方式中，所述癌症是实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤或转移性病变。在某些实施方式中，所述实体肿瘤是肉瘤、腺癌或癌。在某些实施方式中，所述实体肿瘤是头颈部(例如咽)、甲状腺、肺(例如小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖或泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞，例如神经母细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑色素瘤)肿瘤。在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。
在某些实施方式中，所述造血系肿瘤是白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转移CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter’s综合征(Richter’s转化)。在某些实施方式中，所述癌症是淋巴瘤。
在某些实施方式中，所述药物组合物的给药提高所述受试者中颗粒酶B、IFNγ、IL-10、IL-6或IL-17A的表达。
在某些实施方式中，所述药物组合物与另一种治疗剂联合给药到所述受试者。在某些实施方式中，所述治疗剂选自抗炎药剂、抗血管生成药剂、抗纤维化药剂或抗增殖化合物(例如细胞毒性药剂或检查点抑制剂)。
在某些实施方式中，所述药物组合物还包含起稳定作用量的唾液酸酶稳定剂。在某些实施方式中，所述唾液酸酶稳定剂是阳离子。在某些实施方式中，所述阳离子选自钙和镁。
在某些实施方式中，所述药物组合物在给药之前被安置在无菌容器(例如瓶或小管)中。
在某些实施方式中，所述方法包括向所述受试者给药有效量的所述药物组合物。
在某些实施方式中，本公开涉及一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的所述药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。在某些实施方式中，所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子的表达提高。
在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中提高肿瘤细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括以有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者给药有效量的所述药物组合物，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬作用。
在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中活化树突状细胞(DC)的方法，所述方法包括以有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者给药所述药物组合物，从而在所述受试者中活化所述DC。
在某些实施方式中，本公开涉及一种降低Siglec-15结合活性，从而提高患者的肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的所述药物组合物，从而在所述受试者中提高抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
另一方面，本发明提供了一种表达重组唾液酸酶的方法。所述方法可以包括：(a)提供包含编码所述重组唾液酸酶的核酸的细胞；和(b)在稳定剂存在下表达所述重组唾液酸酶。在某些实施方式中，所述方法还包括纯化所述在步骤(b)中产生的重组唾液酸酶。所述纯化在稳定剂例如阳离子(例如钙或镁)存在下进行。
本发明的这些和其他方面和特点在下面的详细描述和权利要求书中描述。
附图说明
参考下述附图，本发明可以被更完全地理解。
图1描绘了唾液酸酶-Fc融合体构建物的不同配置。唾液酸酶-Fc融合体构建物可以包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域(“Fc结构域”)的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以例如通过二硫键共价连接在一起。图1A示出了具有两个Fc结构域和偶联到每个Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1B示出了具有两个Fc结构域和偶联到第一Fc结构域的C-端和第二Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1C示出了具有两个Fc结构域和偶联到第二Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1D示出了具有两个Fc结构域和偶联到第一Fc结构域的C-端的唾液酸酶的构建物。图1E示出了具有两个Fc结构域和偶联到每个Fc结构域的C-端的唾液酸酶的构建物。应该理解，所述Fc结构域可以是天然存在的Fc结构域或工程化改造的含有修饰的Fc结构域，所述修饰例如每条多肽链中有利于杵臼构型或提供改变的Fc结构域功能的点突变。
图2描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组人Neu1、Neu2、Neu3和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(St-唾液酸酶)。单体和二聚体物质被注明。
图3是示出了重组人Neu1、Neu2和Neu3的酶活性的条形图。
图4是示出了在所指示的pH下重组人Neu2和Neu3的酶活性随底物浓度而变的线图。
图5A描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组野生型人Neu2-Fc和Neu2-Fc变体M106(“M106”)。图5B和5C示出了野生型Neu2-Fc相比于M106的SEC-HPLC迹线，其中单体物质具有21分钟的保留时间。
图6是示出了M106的酶活性随底物浓度而变的线图。
图7是示出了Expi293细胞的上清液(“上清液”)或膜结合(“清洗过的细胞”)级分中Neu3-Fc的酶活性的条形图。
图8是Fc-ST唾液酸酶的SEC-HPLC迹线，其中单体物质具有21分钟的保留时间。
图9A-D是示出了小鼠A20(淋巴瘤)同基因肿瘤模型中的肿瘤体积的一系列线图。小鼠以10mg/kg的剂量每周两次给药阴性对照(“同种型对照”，图9A)、Fc-ST唾液酸酶(图9B)、阿维单抗(抗小鼠PD-L1抗体，图9C)或Fc-ST唾液酸酶与阿维单抗的组合(图9D)共15天，并随时间测量肿瘤体积。单独的或与阿维单抗组合的FC-ST唾液酸酶的给药减小肿瘤体积。
图10A-D是示出了利用被工程化改造以表达人类Her2的EMT6细胞的小鼠同基因肿瘤模型中的肿瘤体积的一系列线图。正如用三角形所指示的，小鼠以10mg/kg的剂量每周两次给药同种型对照(介质对照，图10A)、Fc-ST唾液酸酶(FC-ST，图10B)、曲妥珠单抗(抗人类Her2抗体，图10C)或Fc人唾液酸酶(M106，图10D)共15天，并随时间测量肿瘤体积。Fc人唾液酸酶或Fc-ST唾液酸酶减小肿瘤体积。
图11的条形图示出了通过添加CaCl2，使神经氨酸酶活性在37℃温育后稳定长达14天。
图12A的条形图示出了在存在或不存在4mM CaCl2的情况下，在转染后所指示的天，表达人类神经氨酸酶Fc构建物的细胞的调制培养基中的神经氨酸酶活性。正如所示，CaCl2的存在使活性稳定。图12B的条形图描绘了在存在或不存在4mM CaCl2的情况下，在转染后所指示的天的细胞存活率。
图13A的条形图示出了在表达人类神经氨酸酶Fc构建物的细胞的调制培养基中，不同浓度的CaCl2使神经氨酸酶活性稳定。示出了在存在0、0.05、0.5、1、2和4mM CaCl2的情况下，在转染后所指示的天的酶活性。图13B示出了在存在0、0.05、0.5、1、2和4mM CaCl2的情况下，在第6天的总蛋白产量。
图14提供的条形图描绘了从不同免疫亚群的Hydra-3(图14A)、Hydra-7(图14B)和Hydra-9(图14C)染色产生的几何平均荧光强度(gMFI)。
图15提供的条形图描绘了从不同免疫亚群的PNA(图15A)、MAL-II(图15B)和SNA(图15C)染色产生的几何平均荧光强度(gMFI)。
图16提供的线图描绘了通过提高M106浓度引起的树突状细胞(DC)的去唾液酸化程度。图16A描绘了平均荧光强度(MFI)，并且图16B提供的条形图描绘了与未处理的DC相比去唾液酸化的提高倍数。
图17提供的线图描绘了与LOF对照(正方形)相比，在用浓度逐渐提高的M106(三角形)处理后BT-20(乳腺癌)肿瘤细胞的去唾液酸化程度，其通过Hydra 9结合(图17A)或PNA结合(图17B)来确定，并通过gMFI来度量。
图18提供的线图描绘了与LOF对照(正方形)相比，在用浓度逐渐提高的M106(三角形)处理后HT-29肿瘤细胞的去唾液酸化程度，其通过Hydra 9结合(图18A)或PNA结合(图18B)来确定，并通过gMFI来度量。
图19提供的线图描绘了与LOF对照(正方形)相比，在用浓度逐渐提高的M106(三角形)处理后SK-BR-3肿瘤细胞的去唾液酸化程度，其通过Hydra 9结合(图19A)、MAL-II结合(图19B)或PNA结合(图19C)来确定，并通过gMFI来度量。
图20提供的条形图描绘了在存在或不存在脂多糖(LPS)处理的情况下(空心条相比于实心条)，在与用或未用M106处理的SKBR3肿瘤细胞温育后DC上的CD83hi表达(图20A)和CD86hi表达(图20B)的提高百分率。
图21描绘了M2样巨噬细胞对正如所指示的用M106或LOF去唾液酸化的HT-29肿瘤细胞的吞噬作用的剂量依赖性增强。肿瘤细胞源自于两个不同的健康供体(图21A和图21B)。M2样巨噬细胞对去唾液酸化BT20和SKBR-3肿瘤细胞的吞噬作用的类似的提高被分别描绘在图21C和图21D中。
图22提供的条形图描绘了在单核细胞被M106或LOF对照去唾液酸化后HLA-DR表达的剂量依赖性增强。单核细胞从两个不同的健康供体获得(图22A和图22B)。
图23提供的肿瘤生长曲线描绘了本公开的唾液酸酶在小鼠MC38同基因肿瘤模型中的体内活性。对于同种型对照治疗的小鼠(图23A)、M106治疗的小鼠(图23B)、抗PD-1抗体治疗的小鼠(图23C)或用M106和抗PD-1抗体的组合治疗的小鼠(图23D)来说，示出了单个小鼠的肿瘤生长曲线。三角形指示测试物的给药时间。
图24提供的肿瘤生长曲线描绘了本公开的唾液酸酶在小鼠B16F10同基因肿瘤模型中的体内活性。对于同种型对照治疗的小鼠(图24A)、M106治疗的小鼠(图24B)或抗PD-1抗体治疗的小鼠(图24C)来说，示出了单个小鼠的肿瘤生长曲线。图24D是同种型对照组和M106组的肿瘤生长曲线的叠加。三角形指示测试物的给药时间。
图25提供的肿瘤生长曲线描绘了本公开的唾液酸酶在小鼠EMT6同基因肿瘤模型中的体内活性。对于同种型对照治疗的小鼠(图25A)或M106治疗的小鼠(图25B)来说，示出了每只个体小鼠的肿瘤生长曲线。三角形指示测试物的给药时间。
图26描绘了在小鼠A20同基因皮下肿瘤模型中，单独的或与阿维单抗组合(“Ave”)的M106在所指示的剂量下的体内效能。描绘了每只小鼠的肿瘤生长曲线。也标注了观察到的部分响应(PR)和完全响应(CR)。
图27描绘了在小鼠A20同基因皮下肿瘤模型中，单独的或与阿维单抗组合的M106在所指示的剂量下的体内效能。描绘了每只小鼠的肿瘤生长曲线。三角形指示给药。
图28描绘了在同基因EL4-CD20淋巴瘤静脉内散布模型中，奥法木单抗、奥法木单抗与Neu2-M106-Fc的组合(“M106 FC”)和同种型对照在第28天(图28A)或第41天生命结束时(图28B)的体内活性。三角形指示各种不同测试物的给药。P-值通过对数秩(Mantle-Cox)检验来计算。
图29描绘了在未处理(“无”)、用失去功能的唾液酸酶处理(“LOF FC”)或用唾液酸酶(M106(“M106 FC”)或BiNaNH2(阳性对照))处理后，CD4+细胞(图29A)和CD8+细胞(图29B)的Siglec-15-Fc染色的结果。也示出了作为阴性对照的同种型IgG1染色。正如所示，与未处理或用失去功能的唾液酸酶处理相比，用M106或BiNaNH2处理活化的CD4和CD8细胞降低了Siglec-15-Fc染色。在每张图中提供了显示出荧光水平(gMFI)的条形图和基础的流式细胞术直方图数据。
图30描绘了使用与图30A-B中相同的方法获得的CD4+细胞(图30A)和CD8+细胞(图30B)的Siglec-15-Fc染色的结果，其中PBMC来自于第二位健康供体。
详细描述
本发明部分是基于下述发现，即有可能通过给药唾液酸酶或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶来治疗唾液酸介导的障碍。令人吃惊的是，已发现缺少靶向组成部分(例如针对肿瘤抗原的抗体结合结构域)的唾液酸酶或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶可以在体内有效地治疗唾液酸介导的障碍(例如癌症，例如实体肿瘤)。结果，本文中描述的构建物本身可用于治疗唾液酸介导的障碍例如癌症，或者它们可以与另一种药剂例如抗癌药剂相组合来治疗所述障碍例如癌症。例如，当与另一种抗癌药剂组合使用时，所述构建物可以例如通过使所述癌症对使用所述抗癌药剂的治疗更加敏感，来增强所述抗癌药剂的活性。
本发明还涉及唾液酸酶的重组形式、与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶及其药物组合物，它们具有适合的底物特异性和活性，可用于从癌细胞的表面除去唾液酸和/或含唾液酸分子和/或从肿瘤微环境除去唾液酸和/或含唾液酸分子和/或降低肿瘤微环境中唾液酸和/或含唾液酸分子的浓度。
本发明还涉及药物组合物和使用唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶治疗癌症例如实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤、转移性病变或上皮细胞癌的方法。
下面将更详细地讨论本发明的各种不同特点和方面。
I.重组唾液酸酶
当在本文中使用时，术语“唾液酸酶”是指从底物例如糖蛋白或糖脂切下末端唾液酸残基的任何酶或其功能性片段或变体。术语唾液酸酶包括相对于野生型唾液酸酶序列具有一个或多个氨基酸替换、缺失或插入的变体和/或包括唾液酸酶的融合蛋白或偶联物。唾液酸酶也被称为神经氨酸酶，并且除非另有指明，否则这两个术语在本文中可互换使用。当在本文中使用时，术语唾液酸酶的“功能性片段”是指全长唾液酸酶的片段，其保留了所述相应的全长、天然存在的唾液酸酶的例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％的酶活性。唾液酸酶的酶活性可以通过本领域中已知的任何方法来测定，包括例如通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放。在某些实施方式中，所述功能性片段包含在全长、天然存在的唾液酸酶中存在的至少100、150、200、250、300、310、320、330、340、350、360或370个连续氨基酸。
本文中描述的唾液酸酶可以是任何唾液酸酶，例如病毒、真菌、细菌、非人类哺乳动物或人类的唾液酸酶。在某些实施方式中，所述唾液酸酶是如上所述的重组人唾液酸酶，其相对于野生型人唾液酸酶包含至少一个突变，例如至少一个氨基酸的替换、缺失或添加。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶是本文中公开的任何重组突变人唾液酸酶或其功能性片段。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含C332A和C352L突变。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)的N-端添加。在某些实施方式中，所述唾液酸酶在N-端上包含LSHSLST(SEQ ID NO：22)肽。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含MEDLRP(SEQ ID NO：4)的N-端添加和A2K替换。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含MEDLRP(SEQ ID NO：4)的N-端添加和C332A替换。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含MEDLRP(SEQ ID NO：4)的N-端添加、C332A替换和C352L替换。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶部分包含M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、K9D替换、P62G替换、P62N替换、P62S替换、P62T替换、A93E替换、Q126Y替换、I187K替换、A242T替换、Q270A替换、Q270T替换、S301R替换、S301R替换、W302K替换、W302R替换、C332A替换、V363R替换、L365I替换或任何上述缺失和替换的组合。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-62、169-171或196中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48-62、169-171或196中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
a.病毒唾液酸酶
示例性的病毒唾液酸酶包括甲型流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶(例如NCBI登记号ACY01419.1，SEQ ID NO：63)、乙型流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶(例如NCBI登记号AIX94926.1，SEQ ID NO：64)或丙型流感病毒表面糖蛋白神经氨酸酶或其变体或功能性片段。其他示例性的病毒唾液酸酶包括副粘病毒科呼吸道病毒1型和3型副流感病毒(例如NCBI登记号BAD89145.1，SEQ ID NO：65)、3型牛副流感病毒(例如NCBI登记号ADQ43755，SEQID NO：66)、仙台病毒(例如UniProtKB登记号P04853.1，SEQ ID NO：67)、风疹病毒、腮腺炎病毒、猿猴病毒5和副流感病毒2和4a、4b型的唾液酸酶。
b.原核唾液酸酶
示例性的原核唾液酸酶包括来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)的唾液酸酶。鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)唾液酸酶(St-唾液酸酶)的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：30中，编码鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：6中。霍乱弧菌(Vibrio cholera)唾液酸酶的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：36中，编码霍乱弧菌(Vibriocholera)唾液酸酶的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：37中。
其他示例性的唾液酸酶包括：来自于黏液放线菌(Actinomyces viscosus)的唾液酸酶(Avis_NanH；Uniprot登记号AAA21932，SEQ ID NO：68)；烟草节杆菌(Arthrobacternicotianae)NA1和NA2；来自于嗜唾液酸节杆菌(Arthrobacter sialophilus)的唾液酸酶；产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)L、M1、M2和S(GenBank登记号BAD66680，SEQ IDNO：69)；来自于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的唾液酸酶；来自于沙氏梭菌(Clostridium chauvoei)的唾液酸酶；i A99 NanH(GenBank登记号CAA50436，SEQ ID NO：70)，NanI(GenBank登记号ABG83208，SEQ ID NO：71)，NanJ(GenBank登记号ABG84247，SEQID NO：72)；来自于败血梭菌(Clostridium septicum)的唾液酸酶(例如GenBank登记号CAA44916.1，SEQ ID NO：107)；来自于索氏梭菌(Clostridium sordellii)的唾液酸酶；来自于Clostridium tertium的唾液酸酶(例如GenBank登记号CAA69951，SEQ ID NO：73)；来自于白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的唾液酸酶(例如GenBank登记号ACS34893，SEQ ID NO：74)；来自于副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)的唾液酸酶；来自于绿色小单孢菌(Micromonospora viridifaciens)的唾液酸酶(例如GenBank登记号BAA00852，SEQ ID NO：75)；多杀巴氏杆菌(Pasteurella multocida)NanH(GenBank登记号AAG35310.1，SEQ ID NO：76)和NanB(AAG35309，SEQ ID NO：77)；来自于铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)的唾液酸酶(例如GenBank登记号AAG06182，SEQ ID NO：78)；来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)的唾液酸酶(例如GenBank登记号NP_459905，SEQ ID NO：79)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)NanA(GenBank登记号P62575，SEQ ID NO：108)、NanB(GenBank登记号AAC44396，SEQ ID NO：80)和NanC；来自于Tannerella forsythia的唾液酸酶(例如GenBank登记号TF0035，SEQ ID NO：81)；来自于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的唾液酸酶(例如GenBank登记号YP_001217324，SEQ ID NO：82)；来自于白喉棒杆菌(C.diphtheriae)的唾液酸酶(白喉棒杆菌KCTC3075NanH，被称为Cdip_NanH(GenBank登记号ACS34893，SEQ ID NO：83)及其同源物；谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)R假设蛋白(Cglu_hypP；YP_001138502，SEQ ID NO：84)；产气荚膜梭菌(C.perfringens)NCTC 8239唾液酸酶I(Cper_NanI；ZP_02643014，SEQ ID NO：85)；脆弱拟杆菌(B.fragilis)YCH46唾液酸酶(Bfra_NanH；Uniprot登记号BAA05853，SEQID NO：86)；绿色小单孢菌(M.viridifaciens)唾液酸酶(Mvir_NanH；Uniprot登记号BAA0085，SEQ ID NO：87)；肺炎链球菌(S.pneumoniae)NanA唾液酸酶(Spne_NanA；P62575，SEQ ID NO：88)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)唾液酸酶(Scoe_NanH；NP_630638，SEQ ID NO：89)；灰色链霉菌(Streptomyces griseus)NBRC 13350唾液酸酶(Sgri_NanH；YP_001827941，SEQ ID NO：90)；痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)SK137唾液酸酶(Pacn_NanH；ZP_03389398，SEQ ID NO：91)；Macrobdella decora唾液酸转移酶(Mdec_NanL；AAC47263，SEQ ID NO：92)；克氏锥虫(T.cruzi)唾液酸转移酶(Tcru_TS；GenBank登记号AAA99442，SEQ ID NO：93)；嗜黏液阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)(ATCC BAA-835/DSM 22959)Amuc_0625/Am0707(Uniprot登记号B2UPI5，SEQ ID NO：94)；脆弱拟杆菌(B.fragilis)TAL2480 YCH46唾液酸酶(GenBank登记号BF1729，SEQ ID NO：95)(P31206)；脆弱拟杆菌(B.fragilis)SBT3182；脆弱拟杆菌(B.fragilis)4852；脆弱拟杆菌(B.fragilis)YM4000；多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)VPI-5482唾液酸酶(BtsA；BTSA；BT0455)(GenBank登记号Q8AAK9，SEQ ID NO：96)；普通拟杆菌(B.vulgatus)ATCC8482/DSM1447/NCTC 11154BVU_4143(Uniprot登记号A6L7T1，SEQ ID NO：97)；两歧双岐杆菌(B.bifidum)JCM 1254外切-α-唾液酸酶(SiaBb2；BBP_0054)(GenBank登记号BAK26854.1，SEQ ID NO：98)；产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)A99“小”唾液酸酶1(P10481，SEQ ID NO：99)；产气荚膜梭菌(C.perfringens)ATCC 10543唾液酸酶2(NanH)(Uniprot登记号Q59311，SEQ ID NO：100)；产气荚膜梭菌(C.perfringens)ATCC 13124唾液酸酶(CPF_0721)(Uniprot登记号Q0TT67，SEQ ID NO：101)；产气荚膜梭菌(C.perfringens)str 13外切-α-唾液酸酶(NanI；CPSA；CPE0725)(Uniprot登记号Q8XMG4，SEQ ID NO：102)；产气荚膜梭菌(C.perfringens)str 13/ATCC 13124外切-α-唾液酸酶(NanJ；CPE0553(Uniprot登记号Q8XMY5，SEQ ID NO：103)；Clostridium tertium ATCC 14573唾液酸酶(NanH；SiaH)(Uniprot登记号P77848，SEQ ID NO：104)；R.gnavus ATCC 29149RgNanH(Uniprot登记号A7B557，SEQ ID NO：105)；鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)TA262/LT2唾液酸酶(NanH；STSA)(P29768，SEQ ID NO：106)。
其他示例性唾液酸酶包括来自于A.castellani、A.polyphaga、A.culbertsoni、A.astronyxis、A.hatchetti、A.palestinensis、A.rhysodes、E.tenella、E.maxima、E.necatrix、E.Spec、T.brucei和T.rangeli的唾液酸酶或神经氨酸酶。
c.小鼠唾液酸酶
在小鼠基因组中也已发现四种唾液酸酶，并被称为Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。小鼠Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：38中，编码小鼠Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：42中。小鼠Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：39中，编码小鼠Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：43中。小鼠Neu3的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：40中，编码小鼠Neu3的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：44中。小鼠Neu4的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：41中，编码小鼠Neu4的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：45中。
d.人唾液酸酶
在人类基因组中已发现四种唾液酸酶，它们被称为Neu1、Neu2、Neu3和Neu4。
人类Neu1是一种溶酶体神经氨酸酶，其在与β-半乳糖苷酶和组织蛋白酶A的复合物中发挥作用。人类Neu1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：7中，编码人类Neu1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：23中。
人类Neu2是一种胞浆唾液酸酶。人类Neu2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：1中，编码人类Neu2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：24中。
人类Neu3是一种质膜唾液酸酶，具有特异性针对神经节苷脂的活性。人类Neu3具有两种同工型：同工型1和同工型2。人类Neu3同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：8中，编码人类Neu3同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：25中。人类Neu3同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：9中，编码人类Neu3同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：34中。
人类Neu4具有两种同工型：同工型1是一种外周膜蛋白，同工型2局限于溶酶体腔。人类Neu4同工型1的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：10中，编码人类Neu4同工型1的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：26中。人类Neu4同工型2的氨基酸序列描绘在SEQ ID NO：11中，编码人类Neu4同工型2的核苷酸序列描绘在SEQ ID NO：35中。
在某些实施方式中，重组突变人唾液酸酶具有相应的(或模板)野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶活性。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶相同的底物特异性。在其他实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有与所述相应的野生型人唾液酸酶不同的底物特异性。例如在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶可以切开α2,3、α2,6和/或α2,8连键。在某些实施方式中，所述唾液酸酶可以切开α2,3和α2,8连键。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞、CHO细胞、鼠骨髓瘤细胞(NS0、Sp2/0)或人纤维肉瘤细胞(HT-1080)例如HEK293细胞中的表达量，高于所述相应的野生型人唾液酸酶的表达量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶具有相应的野生型人唾液酸酶的约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％或超过100％的酶活性，并且所述重组突变人唾液酸酶在哺乳动物细胞例如HEK293细胞中的表达量高于所述相应的野生型人唾液酸酶的表达量的约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、约150％、约200％、约250％、约300％、约400％、约500％、约600％、约700％、约800％、约900％或约1,000％。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶的氨基酸序列与相应的野生型人唾液酸酶得氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
应该理解，本文中描述的唾液酸酶例如人唾液酸酶可以被修饰以增强所述酶的一种或多种性质，例如提高表达、活性、稳定性(例如提高对蛋白酶降解的抗性)。这些性质中的某些性质适用于本文中描述的各种不同唾液酸酶，例如对蛋白酶降解的提高的抗性。
i.半胱氨酸残基的替换
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个半胱氨酸(cys，C)残基的替换。已发现，唾液酸酶中的某些半胱氨酸残基可能作为蛋白质聚集的结果而抑制有功能蛋白质的表达。因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶含有至少一个突变以除去游离半胱氨酸(例如对于Neu1(SEQ ID NO：7)来说，C111、C117、C171、C183、C218、C240、C242和C252中的一者或多者的突变；对于Neu2(SEQ ID NO：1)来说，C125、C196、C219、C272、C332和C352中的一者或多者的突变；对于Neu3(SEQ ID NO：8)来说，C7、C90、C99、C106、C127、C136、C189、C194、C226、C242、C250、C273、C279、C295、C356、C365、C368、C384、C383、C394和C415中的一者或多者的突变；以及对于Neu4(SEQ ID NO：10)来说，C88、C125、C126、C186、C191、C211、C223、C239、C276、C437、C453、C480和C481中的一者或多者的突变)。游离半胱氨酸可以被任何氨基酸替换。在某些实施方式中，所述游离半胱氨酸被丝氨酸(ser，S)、异亮氨酸(iso，I)、缬氨酸(val，V)、苯丙氨酸(phe，F)、亮氨酸(leu，L)或丙氨酸(ala，A)替换。Neu2中的示例性半胱氨酸替换包括C125A、C125I、C125S、C125V、C196A、C196L、C196V、C272S、C272V、C332A、C332S、C332V、C352L和C352V。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个半胱氨酸替换。Neu2中的示例性双重或三重替换包括：C125S和C332S；C272V和C332A；C272V和C332S；C332A和C352L；C125S和C196L；C196L和C352L；C196L和C332A；C332A和C352L；以及C196L、C332A和C352L。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶是Neu2唾液酸酶并包含替换C322A和C352L(SEQ ID NO：5)。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶在人唾液酸酶例如Neu2或Neu3中通常存在的2、3、4、5或6个半胱氨酸处含有氨基酸替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表1中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表1
替换
C125A
C125I
C125S
C125V
C196A
C196L
C196V
C272S
C272V
C332A
C332S
C332V
C352L
C352V
C125S+C332S
C272V+C332A
C272V+C332S
C332A+C352L
C125S+C196L
C196L+C352L
C196L+C332A
C196L+C332A+C352L
ii.提高pI和/或降低疏水性的残基替换
蛋白质的等电点(pI)是净电荷为零时的pH。pI也指示了蛋白质可溶性最低时的pH，其影响表达和纯化所述蛋白质的能力。通常，如果蛋白质的pI比溶液的pH高超过2个单位，则它具有良好的溶解性。人类Neu2具有7.5的预测pI。因此，人类Neu2在中性pH附近溶解性最低，这是不合乎需要的，因为表达和生理体系在中性pH处。相反，表现出良好的溶解性和重组表达的来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的唾液酸酶(St-唾液酸酶)具有9.6的pI。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的pI。此外，减少唾液酸酶表面上疏水氨基酸的数目可能例如通过减少聚集而改进唾液酸酶的表达。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成含有一个或多个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶降低所述唾液酸酶表面的疏水性。
因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个氨基酸替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性。这可以通过将一个或多个带电荷的氨基酸例如带正或负电荷的氨基酸引入到所述重组唾液酸酶中来实现。在某些实施方式中，所述氨基酸替换是替换成带电荷的氨基酸例如带正电荷的氨基酸如赖氨酸(lys，K)、组氨酸(his，H)或精氨酸(arg，R)或带负电荷的氨基酸如天冬氨酸(asp，D)或谷氨酸(glu，E)。在某些实施方式中，所述氨基酸替换是替换成赖氨酸残基。在某些实施方式中，所述替换将所述唾液酸酶的pI提高到约7.75、约8、约8.25、约8.5、约8.75、约9、约9.25、约9.5或约9.75。
在某些实施方式中，所述氨基酸替换发生在表面暴露的D或E氨基酸处，在螺旋或环中，或在St-唾液酸酶的相应位置中具有K或R的位置中。在某些实施方式中，所述氨基酸替换发生在远离催化位点或不参与催化的氨基酸、不与其他人类Neu蛋白或与St-唾液酸酶或梭菌(Clostridium)NanH保守的氨基酸或不位于对功能重要的结构域(例如Asp-盒或β链)中的氨基酸处。
Neu2中相对于没有替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的等电点(pI)和/或降低所述唾液酸酶的疏水性的示例性氨基酸替换包括A2E、A2K、D215K、V325E、V325K、E257K和E319K。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含两个或更多个氨基酸替换，包括例如A2K和V325E、A2K和V325K、E257K和V325K、A2K和E257K以及E257K和A2K和V325K。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表2中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表2
替换
A2K
E72K
D215K
E257K
V325K
A2K+E257K
A2K+V325E
A2K+V325K
E257K+V325K
iii.N-端肽的添加和N-或C-端替换
已发现，向人唾液酸酶的N-端添加两个或更多个氨基酸的肽序列可以提高所述唾液酸酶的表达和/或活性。在某些实施方式中，所述肽的长度为至少2个氨基酸，例如长度为2至20、2至10、2至5或2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽可以形成α-螺旋或具有形成α-螺旋的倾向性。
在小鼠中，在胸腺中发现的Neu2同工型(B型)含有在骨骼肌中发现的Neu2的经典同工型中不存在的6个氨基酸。在本文的某些实施方式中，可以将所述小鼠胸腺Neu2同工型的N-端6个氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO：4)或其变化形式添加到人类Neu例如人类Neu2上。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的长度为至少2个氨基酸残基的肽。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含与所述唾液酸酶的N-端氨基酸共价结合的肽MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)。在某些实施方式中，所述唾液酸酶还可以包含位于所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)与所述唾液酸酶的其余部分之间的切割位点，例如蛋白水解切割位点。在某些实施方式中，所述肽例如MEDLRP(SEQ ID NO：4)或EDLRP(SEQ ID NO：3)可以在翻译后从所述唾液酸酶的其余部分上切掉。
可选地或与所述N-端添加相组合，可以移除所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸，例如可以移除N-端甲硫氨酸。在某些实施方式中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则可以移除N-端甲硫氨酸，可以移除前5个氨基酸(MASLP；SEQID NO：12)，或者可以移除第二至第四个氨基酸(ASLP；SEQ ID NO：13)。
在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶的12个氨基酸的N-端区域的1-5个氨基酸用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)替换。例如在某些实施方式中，如果所述重组突变人唾液酸酶是Neu2，则将氨基酸MASLP(SEQ IDNO：12)、ASLP(SEQ ID NO：13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)替换。
人唾液酸酶具有β-螺旋桨结构，其特征是围绕中心轴呈环形排列的6个叶片形β-片层。通常，β-螺旋桨的叶片之间、包括N-和C-端叶片之间的疏水相互作用增强稳定性。因此，为了提高人类Neu2或其他人唾液酸酶的表达，可以将重组突变人唾液酸酶设计成包含提高所述唾液酸酶的N-和C-端β-螺旋桨叶片之间的疏水相互作用和/或氢键结合的氨基酸替换。
因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的替换，其中所述替换相对于没有所述替换的唾液酸酶提高所述唾液酸酶的N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合。在某些实施方式中，将所述野生型氨基酸用天冬酰胺(asn，N)、赖氨酸(lys，K)、酪氨酸(tyr，Y)、苯丙氨酸(phe，F)或色氨酸(trp，W)替换。Neu2中提高N-和C-端之间的疏水相互作用和/或氢键结合的示例性替换包括L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含V6Y替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含上述替换的组合。例如，重组突变人类Neu2唾液酸酶可以在N-端处包含添加的氨基酸MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)，并且相组合，可以包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W替换中的至少一者。在某些实施方式中，将重组突变人类Neu2唾液酸酶的氨基酸MASLP(SEQ ID NO：12)、ASLP(SEQ ID NO：13)或M用MEDLRP(SEQ ID NO：4)、EDLRP(SEQ ID NO：3)或TVEKSVVF(SEQ ID NO：14)代替，并且所述重组突变人类Neu2唾液酸酶还包含L4N、L4K、V6Y、L7N、L4N和L7N、L4N和V6Y和L7N、V12N、V12Y、V12L、V6Y、V6F或V6W替换中的至少一者。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表3中列出的突变或突变组合的突变或突变组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表3
Figure BDA0003508968760000291
此外，在某些实施方式中，所述唾液酸酶在所述唾液酸酶的N-端处包含N-端甲硫氨酸的替换或缺失。例如，在某些实施方式中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的替换，例如将所述在对应于野生型人类Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸替换为丙氨酸(M1A)或天冬氨酸(M1D)。在其他实施方式中，所述唾液酸酶在对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第1位的位置处包含甲硫氨酸残基的缺失(ΔM1)。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表4中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表4
突变
M1的缺失，V6Y，I187K
M1R，V6Y，I187K
M1H，V6Y，I187K
M1K，V6Y，I187K
M1D，V6Y，I187K
M1T，V6Y，I187K
M1N，V6Y，I187K
M1Q，V6Y，I187K
M1G，V6Y，I187K
M1A，V6Y，I187K
M1V，V6Y，I187K
M1L，V6Y，I187K
M1F，V6Y，I187K
M1Y，V6Y，I187K
d.降低蛋白水解切割的残基的替换
已发现，某些唾液酸酶(例如人类Neu2)易于被蛋白酶(例如胰蛋白酶)切割。结果，所述唾液酸酶的蛋白水解切割可能在重组蛋白生产、收获、纯化、配制期间、向受试者给药期间或在给药到受试者之后或上述事件的任何组合时发生。因此，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含至少一个野生型氨基酸残基的替换，其中所述替换降低所述唾液酸酶相对于没有所述替换的唾液酸酶被蛋白酶(例如胰蛋白酶)的切割。
在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生约1％至约50％、约1％至约40％、约1％至约30％、约1％至约20％、约1％至约10％、约1％至约5％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约5％至约20％、约5％至约10％、约10％至约50％、约10％至约40％、约10％至约30％、约10％至约20％、约20％至约50％、约20％至约40％、约20％至约30％、约30％至约50％、约30％至约40％或约40％至约50％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。在某些实施方式中，将所述重组突变人唾液酸酶与蛋白酶(例如胰蛋白酶)温育，产生低于50％、低于40％、低于30％、低于10％、低于5％、低于3％、低于1％或低于0.5％的相应的野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下温育时的蛋白水解切割。蛋白水解切割可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括例如通过在本文实施例5中所描述的SDS-PAGE。
提高对蛋白水解切割的抗性的示例性替换包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第242位的位置处丙氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第243位的位置处精氨酸残基的替换，例如被谷氨酸(R243E)、组氨酸(R243H)、天冬酰胺(R243N)、谷氨酰胺(R243Q)或赖氨酸(R243K)替换；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第244位的位置处缬氨酸残基的替换，例如被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)替换；或(iv)任何上述替换的组合。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含选自A242C、A242F、A242Y和A242W的替换。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于在表5中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表5
Figure BDA0003508968760000311
Figure BDA0003508968760000321
提高对蛋白水解切割的抗性(和/或提高表达量和/或酶活性)的另外的示例性替换包括：(i)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第240位的位置处亮氨酸残基的替换，例如被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第213位的位置处丙氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；(iii)对应于野生型人类Neu2(SEQ IDNO：1)的第241位的位置处精氨酸残基的替换，例如被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；(iv)对应于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)的第258位的位置处丝氨酸残基的替换，例如被半胱氨酸(S258C)替换；(v)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第260位的位置处亮氨酸残基的替换，例如被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；(vi)对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)的第265位的位置处缬氨酸残基的替换，例如被苯丙氨酸替换(V265F)；或(vii)任何上述替换的组合。设想了在某些实施方式中，在这些位置处的替换或替换组合可以改善所述唾液酸酶中二级结构元件之间(例如α-螺旋与最近的β-片层之间)的疏水和/或芳香性相互作用，从而使所述结构稳定并提高对蛋白水解切割的抗性。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含在L240位置处的突变。在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含在下述位置处的突变的组合：(i)A213和A242；(ii)A213、A242和S258；(iii)L240和L260；(iv)R241和A242；(v)A242和L260；(vi)A242和V265；或(vii)L240和A242。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含选自下述的替换组合：(i)A213C、A242F和S258C；(ii)A213C和A242F；(iii)A213T和A242F；(iv)R241Y和A242F；或(v)L240Y和A242F。在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于在表6中列出的替换或替换组合的替换或替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表6
替换
A242C，V244P
A242R，V244R
A242R，V244H
A242Y，V244P
A242T，V244P
A242N，V244P
A213C，A242F
A213S，A242F
A213T，A242F
A213N，A242F
A213C，A242F，S258C
A242F，L260F
A242F，V265F
L240Y
L240Y，L260F
L240D，L260T
L240N，L260T
L240N，L260D
L240N，L260Q
L240Y，A242F
R241A，A242F
R241Y，A242F
iv.其他替换
本发明还提供了一种重组突变人唾液酸酶，其包含下述替换中的至少一者：I187K，A328E，K370N或H210N。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸GDYDAPTHQVQW(SEQ ID NO：15)被氨基酸SMDQGSTW(SEQ ID NO：16)或STDGGKTW(SEQ ID NO：17)的替换。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸PRPPAPEA(SEQ ID NO：18)被氨基酸QTPLEAAC(SEQ ID NO：19)的替换。在某些实施方式中，重组突变人类Neu2包含氨基酸NPRPPAPEA(SEQ ID NO：20)被氨基酸SQNDGES(SEQ ID NO：21)的替换。
本发明还提供了一种重组突变人唾液酸酶，其包含在对应于V212、A213、Q214、D215、T216、L217、E218、C219、Q220、V221、A222、E223、V224、E225或T225的位置处的至少一个替换。
本发明还提供了一种重组突变人唾液酸酶，其在表7中列出的位置处包含氨基酸替换(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表7中鉴定的氨基酸替换。在某些实施方式中，所述唾液酸酶包含在表7中鉴定的任何氨基酸替换的组合。
表7
Figure BDA0003508968760000341
Figure BDA0003508968760000351
Figure BDA0003508968760000361
例如，在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；或任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含K9、P62、A93、Q216、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸替换(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸替换(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)替换；(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)替换；(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸替换(L54M)；(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)替换；(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q69H)；(h)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸替换(R78K)；(i)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸替换(D80P)；(j)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)替换；(k)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸替换(G107D)；(l)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸替换(Q108H)；(m)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)替换；(n)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸替换(C125L)；(o)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)替换；(p)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸替换(A150V)；(q)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸替换(C164G)；(r)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R170P)；(s)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸替换(A171G)；(t)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸替换(Q188P)；(u)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸替换(R189P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)替换；(w)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)替换；(x)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸替换(T249A)；(y)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸替换(D251G)；(z)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E225P)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸替换(H239P)；(bb)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)替换；(cc)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)替换；(dd)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)替换；(ee)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I),赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)替换；(ff)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸替换(E257P)；(gg)对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸替换(S258C)；(hh)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)替换；(ii)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸替换(V265F)；(jj)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)替换；(kk)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸替换(W292R)；(ll)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、甘氨酸(S301G)、组氨酸(S301H)、异亮氨酸(S301I)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)替换；(mm)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、谷氨酸(W302E)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)替换；(nn)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸替换(V363R)；或(oo)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)替换；或所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。例如，所述唾液酸酶可以包含选自K9D、P62G、P62N、P62S、P62T、D80P、A93E、Q126H、Q126Y、R189P、H239P、A242T、Q270A、Q270S、Q270T、S301A、S301R、W302K、W302R、V363R和L365I的替换或任何上述替换的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的亮氨酸残基的缺失(ΔL184)、对应于野生型人类Neu2的第185位的位置处的组氨酸残基的缺失(ΔH185)、对应于野生型人类Neu2的第186位的位置处的脯氨酸残基的缺失(ΔP186)、对应于野生型人类Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基的缺失(ΔI187)和对应于野生型人类Neu2的第184位的位置处的谷氨酰胺残基的缺失(ΔQ188)，或任何上述缺失的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第216位的位置处的苏氨酸残基与对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基之间的插入，例如选自S、T、Y、L、F、A、P、V、I、N、D、和H的氨基酸的插入。
其他的示例性唾液酸酶突变和唾液酸酶突变的组合描述在2019年1月3日提交的国际(PCT)专利申请号PCT/US2019/012207中，包括在详细描述中题为“I.重组人唾液酸酶”的章节中和实施例中的实施例1、2、3、4、5和6中。
v.替换的组合
本发明还提供了一种重组突变人唾液酸酶，其包含本文中设想的任何突变的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个本文中设想的突变的组合。设想了所述重组突变唾液酸酶可以包含1-15、1-10、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-15、2-10、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-15、3-10、3-7、3-6、3-5或3-4个本文中设想的突变。
例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、K9D替换、P62G替换、P62N替换、P62S替换、P62T替换、A93E替换、I187K替换、Q270A替换、S301R替换、W302K替换、C332A替换、V363R替换、L365I替换或任何上述缺失和替换的组合。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、I187K替换、C332A替换或任何上述缺失和替换的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含：(i)表8中鉴定的氨基酸替换或表8中鉴定的任何氨基酸替换的组合，和(ii)M1缺失(ΔM1)、M1A替换、M1D替换、V6Y替换、I187K替换、C332A替换或任何上述缺失和替换的组合。例如，所述重组突变唾液酸酶可以包含：(i)表8中鉴定的氨基酸替换或表8中鉴定的任何氨基酸替换的组合，和(ii)选自下述的突变的组合：M1A和V6Y；M1A和I187K；M1A和C332A；M1D和V6Y；M1D和I187K；M1D和C332A；ΔM1和V6Y；ΔM1和I187K；ΔM1和C332A；V6Y和I187K；V6Y和C332A；I187K和C332A；M1A、V6Y和I187K；M1A、V6Y和C332A；M1A、I187K和C332A；M1D、V6Y和I187K；M1D、V6Y和C332A；M1D、I187K和C332A；ΔM1、V6Y和I187K；ΔM1、V6Y和C332A；ΔM1、I187K和C332A；V6Y、I187K和C332A；M1A、V6Y、I187K和C332A；M1D、V6Y、I187K和C332A；以及ΔM1、V6Y、I187K和C332A。
在某些实施方式中，所述重组突变唾液酸酶包含：(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K和C332A替换；(b)M1D、V6Y、K9D、A93E、I187K、C332A、V363R和L365I替换；(c)M1D、V6Y、P62N、I187K和C332A替换；(d)M1D、V6Y、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(e)M1D、V6Y、P62S、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(f)M1D、V6Y、P62T、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(g)M1D、V6Y、P62N、I187K、Q270A、S301R、W302K和C332A替换；(h)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R和C332A替换；(i)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、Q270T和C332A替换；或(j)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K和C332A替换；或(k)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T和C332A替换。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换与在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换的组合。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含对应于表8的行中列出的替换组合的替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。例如，所述重组突变人唾液酸酶可以包含：S301K和W302R替换；S301K和W302K替换；或S301A和W302S替换。
表8
Figure BDA0003508968760000431
Figure BDA0003508968760000441
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含对应于表9的行中列出的替换组合的替换组合(氨基酸位置对应于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1))。
表9
Figure BDA0003508968760000442
Figure BDA0003508968760000451
Figure BDA0003508968760000461
Figure BDA0003508968760000471
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含SEQ ID NO：48-62、169-171或196中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：48-62、169-171或196中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX2 4ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQ(SEQ ID NO：47)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，并且X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQ
(SEQ ID NO：46)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，并且X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LX13GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRLX18X19VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQLHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTWARGHFVX2 8QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPSPRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX47LLAKGSX48AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQ
(SEQ ID NO：172)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Asp或Pro，X14是Ala、Glu或Lys，X15是Gly或Asp，X16是Gln或His，X17是Gln、Arg或Lys，X18是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X19是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X20是Ala或Val，X21是Cys或Gly，X22是Arg或Pro，X23是Ala或Gly，X24是Arg、Ile或Lys，X25是Gln或Pro，X26是Arg或Pro，X27是Ala、Cys、Leu或Val，X28是Ala、Cys、Asn、Ser或Thr，X29是Leu、Ala或Val，X30是Glu或Pro，X31是His或Pro，X32是Leu、Asp、Asn或Tyr，X33是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln或Tyr，X34是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X35是Val、Ile或Lys，X36是Thr或Ala，X37是Asp或Gly，X38是Glu、Lys或Pro，X39是Ser或Cys，X40是Leu、Asp、Phe、Gln或Thr，X41是Val或Phe，X42是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X43是Cys或Val，X44是Trp或Arg，X45是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X46是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X47是Lys或Val，X48是Ala、Cys、Ser或Val，X49是Cys、Leu或Val，X50是Val或Arg，并且X51是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQ IDNO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX13FX14MFTLKQAFPAEYLPQ
(SEQ ID NO：173)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X7是Arg、Ile或Lys，X8是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X9是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X10是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X11是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X12是Ala、Cys、Ser或Val，X13是Val或Arg，并且X14是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人类Neu2(SEQID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Gln或Tyr，X7是Ile或Lys，X8是Ala或Thr，X9是Gln、Ala或Thr，X10是Ser、Arg或Ala，X11是Trp、Lys或Arg，X12是Ala或Cys，X13是Val或Arg，并且X14是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述重组突变人唾液酸酶相对于本文中公开的重组突变人唾液酸酶序列包含保守替换。当在本文中使用时，术语“保守替换”是指使用结构上相似的氨基酸的替换。例如，保守替换可以包括下述组内的替换：Ser和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；以及Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守替换也可以由BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))算法、BLOSUM替换矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM替换:p矩阵(例如PAM 250矩阵)定义。
序列同一性可以以本领域技术人员的技术范围之内的各种不同方式确定，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))分析(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL.36:290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402，其通过引用并入本文)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATURE GENETICS6:119-129，其整体通过引用并入本文。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合的参数，包括在被比较的序列的全长内实现最大对齐所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于报告与数据库序列匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA89:10915-10919，其整体通过引用并入本文)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙延伸罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生单词命中)；和gapw＝16(设置在其中生成带间隙的对齐的窗口宽度)。等效的blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information))的BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，开放间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延伸间隙成本[整数]：默认值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配罚分[整数]：默认值＝-3；-r，核苷酸匹配奖励[整数]：默认值＝1；-e，预期值[实数]：默认值＝10；-W，词长[整数]：默认值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以字节为单位的blast延伸的衰减(X)：默认值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带间隙的比对的X衰减值(以字节为单位)：默认值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和–Z，带间隙的比对的最终X衰减值(以字节为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。用于逐对蛋白质比对的ClustalW也可以使用(默认参数可以包括例如Blosum62矩阵和间隙开放罚分＝10和间隙延伸罚分＝0.1)。在GCG软件包10.0版中可用的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙延伸罚分)。Bestfit蛋白质比较中的等效设置是GAP＝8和LEN＝2。
II.血清半衰期延长剂
当在本文中使用时，“血清半衰期延长剂”是指可以与唾液酸酶结合以延长它在受试者血清中的循环半衰期的组成部分。在某些实施方式中，血清半衰期延长剂可以选自Fc结构域(参见例如Beck等，(2011)MABS 4:1015-28)、白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)，参见Weimer等，(2013)“重组白蛋白融合蛋白”(Recombinant albumin fusion proteins)，在Schmidt S主编的《用于生物制药的融合蛋白技术：应用和挑战》(Fusion proteintechnologies for biopharmaceuticals:applications and challenges)，Hoboken:Wiley；2013,p.297-323中)、白蛋白结合结构域(例如HSA结合剂，参见Walker等，(2013)“新的长效治疗剂的开发中的结合白蛋白的融合蛋白”(Albumin-binding fusion proteinsin the development of novel long-acting therapeutics)，在Schmidt S主编的《用于生物制药的融合蛋白技术：应用和挑战》(Fusion protein technologies forbiopharmaceuticals:applications and challenges)，Hoboken:Wiley；2013,p.325-43中)、转铁蛋白(参见Kim等，(2010)J PHARMACOL EXP THER 334:682-92)、XTEN(也被称为重组PEG或“rPEG”，参见Schellenberger等，(2009)NAT.BIOTECHNOL.27:1186-90)、氨基酸均聚物(HAP，参见Schlapschy等，(2007)PROTEIN ENG DES SEL.20:273-84)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS，参见Schlapschy等，(2013)PROTEIN ENG DES SEL.26:489-501)、弹性蛋白样肽(ELP，参见Floss等，(2013)《用于生物制药的融合蛋白技术：应用和挑战》(Fusionprotein technologies for biopharmaceuticals:applications and challenges)，p.372-98)、羧基端肽(CTP，Duijkers等，(2002)HUM REPROD.17:1987-93)、明胶样蛋白(GLK，Huang等，(2010)EUR J PHARM BIOPHARM 72:435-41)和聚乙二醇(PEG)。
适合的血清半衰期延长剂还包括各种不同的聚合物，例如在美国专利号7,842,789中所描述的。例如，可以使用聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段聚合物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯；卡波姆；以及包含糖单体例如D-甘露糖、D-和L-半乳糖、岩藻糖、果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖和D-葡萄糖醛酸的支链或非支链多糖。在其他实施方式中，所述血清半衰期延长剂可以是亲水性聚乙烯基聚合物例如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)类型的聚合物。所述血清半衰期延长剂可以是功能化的、例如在聚合物的一个(或两个)末端上用羧基或胺功能化的聚乙烯吡咯烷酮(可以从PolymerSource获得)。或者，所述血清半衰期延长剂可以包括聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)或功能化的HPMA(胺、羧基等)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)或功能化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)。
在一个实施方式中，通过基因融合(即重组融合蛋白的产生)或通过化学偶联，将唾液酸酶共价附连到天然长半衰期的多肽或蛋白质例如Fc结构域(Beck等，同上)、转铁蛋白(Kim等，同上)或白蛋白(Weimer等，同上)，以形成融合蛋白。
在另一个实施方式中，通过基因融合(即重组融合蛋白的产生)或通过化学偶联，将唾液酸酶共价附连到惰性多肽例如XTEN(也被称为重组PEG或“rPEG”，参见Schellenberger，同上)、氨基酸均聚物(HAP，参见Schlapschy等，(2007)，同上)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS，参见Schlapschy等，(2013)，同上)、弹性蛋白样肽(ELP，参见Floss等，同上)或明胶样蛋白(GLK，Huang等，同上)，以形成融合蛋白。除了其他功能之外，惰性多肽起到增加唾液酸酶的尺寸和流体动力学半径，从而延长半衰期的作用。在某些实施方式中，XTEN多肽具有约25个氨基酸至约1500个氨基酸，例如约25个氨基酸至约100个氨基酸、约25个氨基酸至约250个氨基酸、约25个氨基酸至约500个氨基酸、约25个氨基酸至约750个氨基酸、约25个氨基酸至约1000个氨基酸、约25个氨基酸至约1250个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约250个氨基酸、约100个氨基酸至约500个氨基酸、约100个氨基酸至约750个氨基酸、约100个氨基酸至约1000个氨基酸、约100个氨基酸至约1250个氨基酸、约100个氨基酸至约1500个氨基酸、约250个氨基酸至约1250个氨基酸、约250个氨基酸至约1000个氨基酸、约250个氨基酸至约750个氨基酸、约250个氨基酸至约500个氨基酸、约500个氨基酸至约750个氨基酸、约500个氨基酸至约1000个氨基酸、约500个氨基酸至约1250个氨基酸、约500个氨基酸至约1500个氨基酸、约750个氨基酸至约1000个氨基酸、约750个氨基酸至约1250个氨基酸、约750个氨基酸至约1500个氨基酸、约1000个氨基酸至约1250个氨基酸、约1000个氨基酸至约1500个氨基酸或约1250个氨基酸至约1500个氨基酸的长度。
在某些实施方式中，唾液酸酶被化学偶联到重复的化学组成部分例如PEG或透明质酸(参见Mero等，(2013)，CARB POLYMERS 92:2163-70)，其增加唾液酸酶的流体动力学半径，从而延长半衰期。
在另一个实施方式中，唾液酸酶自身被聚唾液酸化或共价附连到带负电荷的高唾液酸化的蛋白质(例如绒毛膜促性腺激素(CG)β-链的羧基端肽(CTP)，参见Duijkers等，(2002)HUM REPROD 17:1987-93)。
制造和使用上述血清半衰期延长剂的方法在本领域中是已知的。也参见例如Strohl(2015)BIODRUGS 29:215-239。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶被偶联到不是Fc结构域和/或不是PEG的血清半衰期延长剂。
设想了可以将一个或多个唾液酸酶共价结合到一个或多个(例如2、3、4、5、6、8、9、10个或更多个)血清半衰期延长剂。
在某些实施方式中，所述与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶的血清半衰期为至少24、36、48或60小时。
通常，所述血清半衰期延长剂可以具有约2kDa至约5kDa、约2kDa至约10kDa、约2kDa至约20kDa、约2kDa至约30kDa、约2kDa至约40kDa、约2kDa至约50kDa、约2kDa至约60kDa、约2kDa至约70kDa、约2kDa至约80kDa、约2kDa至约90kDa、约2kDa至约100kDa、约2kDa至约150kDa、约5kDa至约10kDa、约5kDa至约20kDa、约5kDa至约30kDa、约5kDa至约40kDa、约5kDa至约50kDa、约5kDa至约60kDa、约5kDa至约70kDa、约5kDa至约80kDa、约5kDa至约90kDa、约5kDa至约100kDa、约5kDa至约150kDa、约10kDa至约20kDa、约10kDa至约30kDa、约10kDa至约40kDa、约10kDa至约50kDa、约10kDa至约60kDa、约10kDa至约70kDa、约10kDa至约80kDa、约10kDa至约90kDa、约10kDa至约100kDa、约10kDa至约150kDa、约20kDa至约30kDa、约20kDa至约40kDa、约20kDa至约50kDa、约20kDa至约60kDa、约20kDa至约70kDa、约20kDa至约80kDa、约20kDa至约90kDa、约20kDa至约100kDa、约20kDa至约150kDa、约30kDa至约40kDa、约30kDa至约50kDa、约30kDa至约60kDa、约30kDa至约70kDa、约30kDa至约80kDa、约30kDa至约90kDa、约30kDa至约100kDa、约30kDa至约150kDa、约40kDa至约50kDa、约40kDa至约60kDa、约40kDa至约70kDa、约40kDa至约80kDa、约40kDa至约90kDa、约40kDa至约100kDa、约40kDa至约150kDa、约50kDa至约60kDa、约50kDa至约70kDa、约50kDa至约80kDa、约50kDa至约90kDa、约50kDa至约100kDa、约50kDa至约150kDa、约60kDa至约70kDa、约60kDa至约80kDa、约60kDa至约90kDa、约60kDa至约100kDa、约60kDa至约150kDa、约70kDa至约80kDa、约70kDa至约90kDa、约70kDa至约100kDa、约70kDa至约150kDa、约80kDa至约90kDa、约80kDa至约100kDa、约80kDa至约150kDa、约90kDa至约100kDa、约90kDa至约150kDa或约100kDa至约150kDa的分子量。
a.Fc结构域
在某些实施方式中，所述融合蛋白包含免疫球蛋白Fc结构域。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白Fc结构域”或“Fc结构域”或“Fc”是指免疫球蛋白重链恒定区的一个片段，其单独地或与第二免疫球蛋白Fc结构域相组合或未偶联或偶联到唾液酸酶，能够结合到Fc受体。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域和免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的，并且可以在例如PROSITE数据库(可以在万维网网址prosite.expasy.org处获得)中找到。
图1A-E描绘了唾液酸酶-Fc融合体构建物的某些实施方式，所述构建物包含：包含第一免疫球蛋白Fc结构域的第一多肽，和包含第二免疫球蛋白Fc结构域的第二多肽。所述第一和第二多肽可以被共价连接在一起。所述共价连键可以是二硫键。唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。任选的第二唾液酸酶可以被偶联到所述第一免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端或所述第二免疫球蛋白Fc结构域的N-或C-端。
图1A示出了具有两个Fc结构域和偶联到每个Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1B示出了具有两个Fc结构域和偶联到第一Fc结构域的C-端和第二Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1C示出了具有两个Fc结构域和偶联到第二Fc结构域的N-端的唾液酸酶的构建物。图1D示出了具有两个Fc结构域和偶联到第一Fc结构域的C-端的唾液酸酶的构建物。图1E示出了具有两个Fc结构域和偶联到每个Fc结构域的C-端的唾液酸酶的构建物。应该理解，所述Fc结构域可以是天然存在的Fc结构域或工程化改造的含有修饰的Fc结构域，所述修饰是例如在每条多肽链中利于杵臼构型或提供改变的Fc结构域功能的点突变。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE和IgM Fc结构域。可以引入单个氨基酸替换(根据Kabat编号系统S228P；被称为IgG4Pro)以废除在重组IgG4抗体中观察到的非均质性。参见Angal,S等，(1993)MOL.IMMUNOL.30:105-108。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型或引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG1同种型(例如SEQ ID NO：31或SEQ IDNO：69)。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型或很少或不引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体介导的细胞毒性(CDC)的另一种同种型。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域源自于人IgG4同种型。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含“杵”突变例如T366Y或“臼”突变例如Y407T，用于与第二多肽的异二聚化(残基号码根据EU编号系统，Kabat,E.A.等，(1991)《免疫学重要的蛋白质的序列》(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICALINTEREST)第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242)。在包含具有两个Fc结构域的唾液酸酶-Fc融合体的某些实施方式中，所述第一Fc结构域可以包含“杵”突变(例如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：148)，并且所述第二Fc结构域可以包含“臼”突变(例如SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：147)。
在某些实施方式中，唾液酸酶-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO：129-158、177-192和197-200中的任一者的氨基酸序列或与SEQ ID NO：129-158、177-192和197-200中的任一者具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX2 4ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：159)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，并且X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：160)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg、and X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LDGHRSMNPCPLYDX13QTGTLFLFFIAIPX14X15VTEX16QQLQTRANVTRLX17X18VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX19YREWSTFAVGPGHX20LQLHDRX21RSLVVPAYAYRKLHPX22QRPIPSAFX23FLSHDHGRTWARGHFVAQDTX2 4ECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSX25NX26GLDFQX27SQLVKKLVEPPPX28GX29QGSVISFPSPRSGPGSPAQX30LLYTHPTHX31X32QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX33LLAKGSX34AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX35LYEANDYEEIX36FX37MFTLKQAFPAEYLPQX38DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：161)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp.X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Ala、Glu或Lys，X14是Gly或Asp，X15是Gln或His，X16是Gln、Arg或Lys，X17是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X18是Gln或Leu，X19是Ala或Val，X20是Cys或Gly，X21是Ala或Gly，X22是Arg、Ile或Lys，X23是Ala、Cys、Leu或Val，X24是Leu、Ala或Val，X25是Thr或Ala，X26是Asp或Gly，X27是Glu或Lys，X28是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X29是Cys或Val，X30是Trp或Arg，X31是Ser或Arg，X32是Trp或Lys，X33是Lys或Val，X34是Ala、Cys、Ser或Val，X35是Cys、Leu或Val，X36是Val或Arg，X37是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X38是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：162)或EPKSS(SEQ ID NO：163)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCQVTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX6QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRARVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX7GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX8X9QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX10AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX11FX12MFTLKQAFPAEYLPQX13DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：164)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Arg、Ile或Lys，X7是Gln、Ala、His、Phe或Pro，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala、Cys、Ser或Val，X11是Val或Arg，X12是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，并且X13是GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：162)或EPKSS(SEQ ID NO：163)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Ile或Lys，X7是Gln或Ala，X8是Ser或Arg，X9是Trp或Lys，X10是Ala或Cys，X11是Val或Arg，并且X12是Leu或Ile。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1X2SX3X4X5LQX6ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASX7X8DEHAELIVX9RRGDYDAX10THQVQWX11AQEVVAQAX12LX1 3GHRSMNPCPLYDX14QTGTLFLFFIAIPX15X16VTEX17QQLQTRANVTRLX18X19VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPX20YREWSTFAVGPGHX21LQLHDX22X23RSLVVPAYAYRKLHPX24X25X26PIPSAFX27FLSHDHGRTWARGHFVX28QDTX29ECQVAEVX30TGEQRVVTLNARSX31X32X33X34RX35QAQSX36NX37GLDFQX38X39QX40VKKLX41EPPPX42GX43QGSVISFPSPRSGPGSPAQX44LLYTHPTHX45X46QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPX47LLAKGSX48AYSDLQSMGTGPDGSPLFGX49LYEANDYEEIX50FX51MFTLKQAFPAEYLPQX52DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：165)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Ala或Lys，X3是Asn或Leu，X4是Pro或His，X5是Phe、Trp、Tyr或Val，X6是Lys或Asp，X7是Lys、Arg或Glu，X8是Lys、Ala、Arg或Glu，X9是Leu或Met，X10是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X11是Gln或His，X12是Arg或Lys，X13是Asp或Pro，X14是Ala、Glu或Lys，X15是Gly或Asp，X16是Gln或His，X17是Gln、Arg或Lys，X18是Ala、Cys、Ile、Ser、Val或Leu，X19是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X20是Ala或Val，X21是Cys或Gly，X22是Arg或Pro，X23是Ala或Gly，X24是Arg、Ile或Lys，X25是Gln或Pro，X26是Arg或Pro，X27是Ala、Cys、Leu或Val，X28是Ala、Cys、Asn、Ser或Thr，X29是Leu、Ala或Val，X30是Glu或Pro，X31是His或Pro，X32是Leu、Asp、Asn或Tyr，X33是Arg、Ala、Asp、Leu、Gln或Tyr，X34是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X35是Val、Ile或Lys，X36是Thr或Ala，X37是Asp或Gly，X38是Glu、Lys或Pro，X39是Ser或Cys，X40是Leu、Asp、Phe、Gln或Thr，X41是Val或Phe，X42是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X43是Cys或Val，X44是Trp或Arg，X45是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X46是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X47是Lys或Val，X48是Ala、Cys、Ser或Val，X49是Cys、Leu或Val，X50是Val或Arg，X51是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X52是GGGGS(SEQ ID NO：174)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：162)或EPKSS(SEQ ID NO：163)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。
在某些实施方式中，所述唾液酸酶-Fc融合蛋白包含氨基酸序列X1ASLPX2LQX3ESVFQSGAHAYRIPALLYLPGQQSLLAFAEQRASKKDEHAELIVLRRGDYDAX4THQVQWQAQEVVAQARLDGHRSMNPCPLYDX5QTGTLFLFFIAIPGQVTEQQQLQTRANVTRLCX6VTSTDHGRTWSSPRDLTDAAIGPAYREWSTFAVGPGHCLQLHDRARSLVVPAYAYRKLHPX7QRPIPSAFCFLSHDHGRTWARGHFVAQDTLECQVAEVETGEQRVVTLNARSHLRX8RVQAQSTNDGLDFQESQLVKKLVEPPPX9GCQGSVISFPSPRSGPGSPAQWLLYTHPTHX10X11QRADLGAYLNPRPPAPEAWSEPVLLAKGSX12AYSDLQSMGTGPDGSPLFGCLYEANDYEEIX13FX14MFTLKQAFPAEYLPQX1 5DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLTSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(SEQ ID NO：166)，其中X1是Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Val或不存在，X2是Phe、Trp、Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Asp、His、Glu、Gly、Ser或Thr，X5是Ala、Glu或Lys，X6是Gln、Leu、Glu、Phe、His、Ile、Leu或Tyr，X7是Arg、Ile或Lys，X8是Ala、Cys、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Val、Trp或Tyr，X9是Gln、Ala、His、Phe、Pro、Ser或Thr，X10是Ser、Arg、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Thr、Val、Trp或Tyr，X11是Trp、Lys、Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val或Tyr，X12是Ala、Cys、Ser或Val，X13是Val或Arg，X14是Leu、Gln、His、Ile、Lys或Ser，X15是GGGGS(SEQ ID NO：184)、GGGGSGGGGS(SEQ IDNO：162)或EPKSS(SEQ ID NO：163)，并且所述唾液酸酶相对于野生型人Neu2(SEQ ID NO：1)包含至少一个突变。在某些实施方式中，X1是Ala、Asp、Met或不存在，X2是Tyr或Val，X3是Lys或Asp，X4是Pro、Asn、Gly、Ser或Thr，X5是Ala或Glu，X6是Gln或Tyr，X7是Ile或Lys，X8是Ala或Thr，X9是Gln、Ala或Thr，X10是Ser、Arg或Ala，X11是Trp、Lys或Arg，X12是Ala或Cys，X13是Val或Arg，并且X14是Leu或Ile。
b.聚乙二醇(PEG)
在一个实施方式中，所述血清半衰期延长剂是聚乙二醇(PEG)及其衍生物(例如烷氧基聚乙二醇，例如甲氧基聚乙二醇、乙氧基聚乙二醇等)。在一个实施方式中，本文中描述的唾液酸酶被共价附连到至少一个真实MW为至少约20,000D的PEG。在另一个实施方式中，所述唾液酸酶被共价附连到至少一个真实MW为至少约30,000D的PEG。在另一个实施方式中，所述唾液酸酶被共价附连到至少一个真实MW为至少约40,000D的PEG。在某些实施方式中，所述PEG是甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、甲氧基PEG(5000)-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)。此类PEG可以从Nektar Therapeutics或SunBiowest或LaysanBio或NOF商购。在一个实施方式中，所述PEG可以是分支或Y形的，正如可以从JenKemUSA或NOF获得的，或梳状的，或者通过将两个或更多个PEG偶联到小分子例如谷氨酸来合成。
所述PEG的ω位可以包括羟基或甲氧基，并且所述PEG也可以在ω位中含有氨基。这个氨基进而可以被偶联到各种不同的试剂。在本发明的另一个实施方式中，所述生物改性剂可以是聚乙二醇化的聚L-赖氨酸或聚乙二醇化的聚D-赖氨酸。
唾液酸酶上用于PEG或其衍生物的附连位点包括存在于赖氨酸残基上的N-端氨基和ε氨基，以及其他的氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。PEG可以使用或不使用利用化学的和本领域中使用的已知多功能(通常为双功能)交联剂，直接共价键合到唾液酸酶。例如，所述PEG改性剂可以通过使用硫醇反应性交联剂，然后与PEG上的硫醇基团反应，偶联到所述唾液酸酶。在某些实施方式中，巯基可以通过与马来酰亚胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)或可以从Shearwater polymers,Inc.(Huntsville,Ala)商购的PEG-马来酰亚胺偶联来衍生。
c.人血清白蛋白(HSA)和HSA结合剂
人血清白蛋白(HSA)(分子质量～67kDa)是血浆中最丰富的蛋白质，以约50mg/mL(600μM)存在，并在人类中具有20天左右的半衰期。HSA用于维持血浆pH，对胶体血压有贡献，起到许多代谢物和脂肪酸的载体的作用，并充当血浆中的主要药物转运蛋白。
在某些实施方式中，所述血清半衰期延长剂是人血清白蛋白(HSA)或HSA结合肽(参见例如PCT公布号WO2013128027A1和WO2014140358A1)。新生儿Fc受体(FcRn)似乎参与延长白蛋白在循环中的寿命(参见Chaudhury等，(2003)J.EXP.MED.,3:315-22)。白蛋白和IgG非协同地结合FcRn的不同位点并形成三分子(参见同上)。人类FcRn与HSA和人类IgG的结合是pH依赖性的，在酸性pH下较强，在中性或生理pH下较弱(参见同上)。这一观察表明蛋白质和含有白蛋白的蛋白复合体类似于含有IgG(特别是Fc)的蛋白复合体，通过与FcRn的pH敏感性相互作用的保护而免于降解(参见同上)。使用表面等离子体共振(SPR)测量单个HSA结构域结合固定化的可溶性人类FcRn的能力，显示出FcRn与白蛋白通过白蛋白的D-III结构域，以pH依赖性方式在不同于IgG结合位点的位点上相互作用(参见Chaudhury等，(2006)BIOCHEM.45:4983-90和PCT公布号WO2008068280A1)。
示例性的HSA结合蛋白在本领域中是已知的。例如，美国专利申请公布号US20130316952A1公开了一种结合血清白蛋白的多肽，其具有LKEAKEKAIEELKKAGITSDYYFDLINKAKTVEGVNALKDEILKA(SEQ ID NO：109)的氨基酸序列。结合HSA的其他示例性多肽描述在下述文献中：Dennis等，(2002)J.BIOL.CHEM.,277:35035-43；Jacobs等，(2015)PROTEINENG.DES.SEL.,28:385-93；和Zorzi等，(2017)NAT.COMMUN.,8:16092。
III.连接物
在某些实施方式中，所述唾液酸酶可以被直接连接或融合到所述血清半衰期延长剂。在其他实施方式中，所述唾液酸酶可以通过连接物共价结合到所述血清半衰期延长剂。
所述连接物可以与一个或多个天然氨基酸、所述唾液酸酶或其功能性片段和所述血清半衰期延长剂偶联，其中所述一个或多个天然氨基酸(例如半胱氨酸氨基酸)可以通过定点突变引入。所述连接物可以包括一个或多个非天然氨基酸。设想了在某些情况下，含有例如一个或多个巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的连接物可以共价连接所述唾液酸酶部分或血清半衰期延长剂中的半胱氨酸，其是天然存在的半胱氨酸残基或者是位点特异性突变的产物。
所述连接物可以是可切断的连接物或不可切断的连接物。任选地或此外，所述连接物可以是柔性连接物或非柔性连接物。
所述连接物应该具有足够长的长度，以允许所述唾液酸酶和血清半衰期延长剂没有空间位阻地彼此连接，并且应该足够短，以保留所述融合蛋白的目标活性。所述连接物优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不稳定性。所述连接物优选地足够亲水，以避免或最小化所述融合蛋白的不溶性。所述连接物应该在体内足够稳定(例如它不被血清、酶等切断)，以允许在体内操作所述融合蛋白。
所述连接物可以具有约1埃(
Figure BDA0003508968760000671
)至约
Figure BDA0003508968760000672
的长度或约
Figure BDA0003508968760000676
至约
Figure BDA0003508968760000674
的长度或约
Figure BDA0003508968760000673
至约
Figure BDA0003508968760000675
的长度或约
Figure BDA0003508968760000677
至约
Figure BDA0003508968760000678
的长度。所述连接物可以具有大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更大的长度和/或小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、
Figure BDA0003508968760000679
或更小的长度。此外，所述连接物可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和
Figure BDA00035089687600006710
的长度。
在某些实施方式中，所述连接物包含将所述融合蛋白的唾液酸酶连接或融合到血清半衰期延长剂(例如Fc结构域)的多肽连接物。例如，设想了编码直接或间接(例如通过含有氨基酸的连接物)连接到血清半衰期延长剂的唾液酸酶的基因，可以使用常规重组DNA技术来产生和表达。例如，可以将唾液酸酶的氨基端连接到血清半衰期延长剂的羧基端。当使用连接物时，所述连接物可以包含亲水性氨基酸残基例如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。在某些实施方式中，所述连接物是含有1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、2-15个氨基酸残基、3-10个氨基酸残基、3-7个氨基酸残基、4-25个氨基酸残基、4-20个氨基酸残基、4-15个氨基酸残基、4-10个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基或5-10个氨基酸残基的肽。示例性连接物包括富含甘氨酸和丝氨酸的连接物例如(GlyGlyPro)n(SEQ ID NO：110)或(GlyGlyGlyGlySer)n(SEQ ID NO：111)，其中n是1-5。在某些实施方式中，所述连接物包含GGGGS(SEQ ID NO：174)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方式中，所述连接物包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：162)、由其组成或基本上由其组成。在某些实施方式中，所述连接物包含EPKSS(SEQ ID NO：163)、由其组成或基本上由其组成。其他示例性连接物序列被公开在例如George等，(2003)PROTEIN ENGINEERING 15:871–879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
IV.制造唾液酸酶和/或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶的方法
用于生产例如本文中公开的唾液酸酶或与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，编码血清半衰期增强剂(例如Fc结构域)的DNA分子可以通过化学法或通过重组DNA方法合成。例如，所述血清半衰期增强剂的序列可以通过常规的杂交技术或聚合酶链反应(PCR)技术，使用适合的合成核酸引物来克隆。得到的编码感兴趣的蛋白质的DNA分子可以被连接到其他适合的核苷酸序列包括例如表达控制序列，以产生编码所需血清半衰期增强剂的常规基因表达构建物(即表达载体)。确定基因构建物的产生在本领域的常规技术之内。
编码所需唾液酸酶的核酸可以被并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是原本不产生IgG蛋白的大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚胎肾293(HEK 293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以将转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达所述唾液酸酶的条件下生长。
具体表达和纯化条件将随着使用的表达系统而变。例如，如果将要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将所述工程化改造的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游，将它克隆到表达载体中。所述表达的蛋白可能被分泌。所述表达的蛋白可能积累在折光体或包含体中，其可以在通过弗氏压碎器或超声破碎细胞后收获。然后将所述折光体溶解，并且可以通过本领域中已知的方法将所述蛋白质重新折叠和/或切断。
如果将要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达所述工程化改造的基因，则首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、poly A序列和终止密码子的表达载体中。任选地，所述载体或基因构建物可能含有增强子和内含子。可以使用常规技术将所述基因构建物引入到真核宿主细胞中。
包含唾液酸酶或融合蛋白例如包含免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区的融合蛋白的多肽，可以通过将用编码这种可变区的表达载体转染的宿主细胞在允许所述多肽表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后，所述多肽可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。
在实施方式中，唾液酸酶或与Fc区偶联的唾液酸酶，可以通过将宿主细胞在允许两个多肽表达的条件下生长(培养)来生产，所述宿主细胞用下述表达载体转染：(a)编码一个Fc多肽的表达载体和编码另一个Fc多肽的分开的表达载体；或(b)编码两个Fc多肽的单一表达载体。所述唾液酸酶将被融合到所述链中的一者或多者。所述完整的唾液酸酶-Fc结构域融合蛋白可以被收获，并使用本领域中已知的技术例如蛋白A、蛋白G、亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签来纯化或分离。
在某些实施方式中，唾液酸酶或与血清半衰期延长剂偶联的唾液酸酶在稳定剂存在下表达和/或纯化。所述稳定剂阻止所述唾液酸酶或与血清半衰期延长剂偶联的唾液酸酶在表达、纯化和/或储存期间的蛋白质解折叠、蛋白质错折叠、蛋白质聚集、蛋白质抑制、酶学损失和/或蛋白质降解中的一者或多者。在某些实施方式中，所述稳定剂是阳离子例如二价阳离子。在某些实施方式中，所述阳离子是钙或镁。所述阳离子可以采取盐的形式，例如氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)。
在某些实施方式中，在表达和/或纯化期间所述稳定剂以约0.05mM至约5mM的量存在。例如，所述稳定剂可以以约0.05mM至约4mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、约0.05mM至约1mM、约0.05mM至约0.5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM或约1mM至约2mM的量存在。
在某些实施方式中，为了将蛋白质例如唾液酸酶作为分泌蛋白表达，将所述蛋白质的本源N-端信号序列用例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)代替。在某些实施方式中，为了将蛋白质例如重组人唾液酸酶作为分泌蛋白表达，添加N-端信号序列例如MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)。其他示例性的N-端信号序列包括来自于白介素-2、CD-5、IgGκ轻链、胰蛋白酶原、血清白蛋白和催乳素的信号序列。在某些实施方式中，为了将蛋白质例如重组人唾液酸酶作为分泌蛋白表达，将C端溶酶体信号基序例如YGTL(SEQ ID NO：29)移除。
在某些实施方式中，当唾液酸酶被化学偶联到血清半衰期延长剂时，所述化学偶联可以使用本领域中已知的方法来进行。唾液酸酶和/或血清半衰期延长剂上的附连位点包括赖氨酸残基上存在的N-端氨基和ε氨基，以及其他氨基、亚氨基、羧基、巯基、羟基或其他亲水性基团。血清半衰期延长剂可以使用或不使用利用化学的和本领域中使用的已知多功能(通常为双功能)交联剂，直接共价键合到唾液酸酶。例如，在PEG的情况下，巯基可以通过与马来酰亚胺基取代的PEG(例如烷氧基-PEG胺加上4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺基酯)或可以从Shearwater polymers,Inc.(Huntsville,Ala)商购的PEG-马来酰亚胺偶联来衍生。
V.药物组合物
对于治疗使用来说，优选地将唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶与可药用载体组合。当在本文中使用时，术语“可药用”是指那些在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药载体例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保持例如所述组合物的pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透的制剂材料。在这些实施方式中，适合的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色、调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如普朗尼克、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、四丁酚醇)，稳定性增强剂/稳定剂(例如蔗糖、山梨糖醇或阳离子)，渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)，递送介质，稀释剂，赋形剂和/或药物佐剂(参见《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第18版，MackPublishing Company,1990)。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有稳定剂。在某些实施方式中，所述稳定剂是阳离子例如二价阳离子。在某些实施方式中，所述阳离子是钙或镁。所述阳离子可以采取盐的形式，例如氯化钙(CaCl2)或氯化镁(MgCl2)。
在某些实施方式中，所述稳定剂以约0.05mM至约5mM的量存在。例如，所述稳定剂可以以约0.05mM至约4mM、约0.05mM至约3mM、约0.05mM至约2mM、约0.05mM至约1mM、约0.05mM至约0.5mM、约0.5mM至约4mM、约0.5mM至约3mM、约0.5mM至约2mM、约0.5mM至约1mM、约1mM至约4mM、约1mM至约3mM或约1mM至约2mM的量存在。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有纳米粒子例如聚合物纳米粒子、脂质体或胶束(参见Anselmo等，(2016)BIOENG.TRANSL.MED.1:10-29)。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有持续或受控递送配方。用于配制持续或受控递送手段例如脂质体载体、可生物侵蚀的微粒或多孔珠和储库注射剂的技术，对于本领域技术人员来说也是已知的。持续释放制剂可以包括例如多孔聚合物微粒或采取塑形制品例如薄膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一种来制备。
含有唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的药物组合物可以以剂量单位形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其打算的给药途径相容。给药途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜、鞘内和直肠给药。在某些实施方式中，唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶通过IV输注给药。在某些实施方式中，唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶通过肿瘤内注射给药。有用的剂型可以通过制药领域中已知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington’sPharmaceutical Sciences)，第18版，(Mack Publishing Company,1990)。适合于肠胃外给药的剂型组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内给药来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体在制造和储存的条件下应该稳定，并且应该针对微生物进行防腐。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适合的混合物的溶剂或分散介质。
药物制剂优选为无菌的。除菌可以通过任何适合的方法来实现，例如通过无菌滤膜过滤。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行过滤除菌。
在某些实施方式中，所述药物组合物被安置在无菌容器(例如瓶或小管)中。所述药物组合物可以例如在所述无菌容器中冷冻干燥或作为溶液存在。所述无菌容器可以用隔膜密封，并且可以具有安置在其上的识别所述容器中包含的药物组合物的标签。
本文描述的组合物可以局部或系统性给药。给药通常是肠胃外给药。在优选实施方式中，所述药物组合物被皮下给药，并且在甚至更优选实施方式中被静脉内给药。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。
通常，活性组分例如唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。所述给药的量将取决于变量例如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、所述活性组分的体内效能、药物配方和给药途径。可以将初始剂量提高到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最佳剂量，并且可以在治疗过程中逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计在0.5mg/kg至20mg/kg运行的常规I期剂量递增研究中优化。给药频率可以随着多种因素而变，例如给药途径、剂量、所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的血清半衰期和待治疗的疾病。示例性的给药频率是每日一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是肠胃外，例如静脉内输注。在某些实施方式中，将唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶冷冻干燥，然后在给药时在缓冲盐水中重构。
V.治疗用途
本文中公开的组合物和方法可用于在受试者中治疗各种不同形式的癌症或在受试者中抑制癌生长。本发明提供了一种在受试者中治疗癌症的方法。所述方法包括单独地或与另一种治疗剂相组合向所述受试者给药有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，以在所述受试者中治疗所述癌症。当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性药剂(例如根据本发明的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶)的量。有效量可以在一次或多次给药、施用或剂量中给药，并且不打算限于特定制剂或给药途径。
当在本文中使用时，“治疗”意味着在受试者例如人类中治疗疾病。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的减退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿类、马科、牛科、猪科、犬科、猫科动物等)，并且更优选地包括人类。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、血液肿瘤和转移性病变。血液肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥散性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合症(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter's综合征(Richter's转化)。实体肿瘤的例子包括各种不同器官系统的恶性肿瘤，例如肉瘤、腺癌和恶性上皮肿瘤，例如那些影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和泌尿生殖道(例如肾、泌尿上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞，例如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑色素瘤)的恶性肿瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，例如上调唾液酸化聚糖的表达的上皮癌。上皮癌的实例包括但不限于子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌或输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。上皮癌还包括恶性上皮肿瘤，例如腺泡癌、腺癌、腺囊性癌、腺样囊性癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底细胞癌、基底类癌、基底、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺状癌、子宫体癌、筛状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎癌、脑样癌、表皮样癌、癌样上皮癌、外植癌、溃疡性癌、纤维状癌，胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛发基质癌、多血癌、、肝细胞癌、嗜酸细胞癌、玻璃样癌、肾上腺样癌、婴儿期胚胎癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化癌、类骨癌、乳头状癌、门周癌、浸润前癌、棘细胞癌、脑样癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯性癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、纺锤细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、串状癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性癌、结节性癌、疣状癌和绒毛状癌。
在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是转移性癌症。在某些实施方式中，所述癌症是难治性癌症。
在某些实施方式中，所述癌症对使用抗体例如具有ADCC活性的抗体例如曲妥珠单抗的治疗具有抗性或无反应。
本文描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或方式相组合使用。当在本文中使用时，术语“联合”给药被理解为意味着在所述受试者患有障碍的过程中向所述受试者递送两种(或更多种)不同治疗，使得对所述患者的治疗效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，在一种治疗的递送仍在进行时开始第二种治疗的递送，使得在给药方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，由于联合给药，所述治疗更加有效。例如，所述第二种治疗更加有效，例如使用更少的第二种治疗看到等同的效果，或者所述第二种治疗以比在不存在第一种治疗的情况下给药所述第二种治疗时观察到的更大的程度减轻症状，或者在使用第一种治疗时观察到类似的情况。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的降低大于在不存在一种治疗的情况下递送另一种治疗时观察到的降低。所述两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或大于累加。所述递送可以使得在递送第二种治疗时递送的第一种治疗的效果仍然可检测。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法例如手术、放疗或另一种化学制剂的给药相组合给药。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括化疗例如细胞毒性药剂。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括靶向疗法，例如酪氨酸激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂或蛋白酶抑制剂。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增殖化合物，例如甾类、生物免疫调节剂、单克隆抗体、抗体片段、适体、siRNA、反义分子、融合蛋白、细胞因子、细胞因子受体、支气管扩张剂、他汀类、抗炎剂(例如甲氨蝶呤)或NSAID。在某些实施方式中，所述另外的疗法可以包括不同类别治疗剂的组合。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与检查点抑制剂相组合给药。所述检查点抑制剂可以例如选自PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、腺苷A2A受体拮抗剂、B7-H3拮抗剂、B7-H4拮抗剂、BTLA拮抗剂、KIR拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、VISTA拮抗剂或TIGIT拮抗剂。
在某些实施方式中，所述检查点抑制剂是PD-1或PD-L1抑制剂。PD-1是存在于T-细胞表面上的一种充当免疫系统检查点的受体，其在适合的时间抑制或以其他方式调节T-细胞活性以防止免疫系统过度活化。然而，癌细胞可以通过表达配体例如与T-细胞表面上的PD-1相互作用的PD-L1来利用这个检查点，以关闭或调节T-细胞活性。示例性的基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂包括基于抗体的治疗剂。利用基于PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制的示例性的治疗方法被描述在美国专利号8,728,474和9,073,994以及欧洲专利号1537878B1中，并且包括例如使用抗PD-1抗体。示例性的抗PD-1抗体被描述在例如美国专利号8,952,136、8,779,105、8,008,449、8,741,295、9,205,148、9,181,342、9,102,728、9,102,727、8,952,136、8,927,697、8,900,587、8,735,553和7,488,802中。示例性的抗PD-1抗体包括例如纳武单抗(
Figure BDA0003508968760000771
Bristol-Myers Squibb Co.)、派姆单抗(
Figure BDA0003508968760000772
Merck Sharp&Dohme Corp.)、PDR001(Novartis Pharmaceuticals)和pidilizumab(CT-011，Cure Tech)。示例性的抗PD-L1抗体被描述在例如美国专利号9,273,135、7,943,743、9,175,082、8,741,295、8,552,154和8,217,149中。示例性的抗PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(
Figure BDA0003508968760000773
Genentech)、德瓦鲁单抗(AstraZeneca)、MEDI4736、阿维单抗和BMS936559(Bristol Myers Squibb Co.)。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与CTLA-4抑制剂相组合给药。在CTLA-4途径中，T-细胞上的CTLA-4与其在抗原呈递细胞(而不是癌细胞)表面上的配体(例如也被称为B7-1的CD80和CD86)的相互作用导致T-细胞抑制。示例性的基于CTLA-4的免疫检查点抑制方法被描述在美国专利号5,811,097、5,855,887、6,051,227中。示例性的抗CTLA-4抗体被描述在美国专利号6,984,720、6,682,736、7,311,910、7,307,064、7,109,003、7,132,281、6,207,156、7,807,797、7,824,679、8,143,379、8,263,073、8,318,916、8,017,114、8,784,815和8,883,984、国际(PCT)公开号WO98/42752、WO00/37504和WO01/14424以及欧洲专利号EP 1212422 B1中。示例性的CTLA-4抗体包括伊匹单抗或曲美单抗。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与(i)PD-1或PD-L1抑制剂例如本文中公开的PD-1或PD-L1抑制剂和(ii)CTLA-4抑制剂例如本文中公开的CTLA-4抑制剂联合给药。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与CD20抑制剂联合给药。在某些实施方式中，所述CD20抑制剂是抗CD20抗体。在某些实施方式中，所述抗CD20抗体选自奥法木单抗、利妥昔单抗、奥瑞珠单抗、碘I 131托西莫单抗、奥滨尤妥珠单抗、替伊莫单抗和透明质酸酶利妥昔单抗。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与IDO抑制剂相组合给药。示例性的IDO抑制剂包括1-甲基-D-色氨酸(被称为indoximod)、epacadostat(INCB24360)、navoximod(GDC-0919)和BMS-986205。
可以与本文中描述的方法或组合物相组合给药的示例性细胞毒性药剂包括例如抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢物、蛋白质合成和降解抑制剂、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、含铂药剂、核酸合成抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(HDAC抑制剂例如伏立诺他(SAHA、MK0683)、恩替诺特(MS-275)、帕比司他(LBH589)、曲古柳菌素A(TSA)、mocetinostat(MGCD0103)、贝利司他(PXD101)、罗米地辛(FK228、缩酚酸肽))、DNA甲基转移酶抑制剂、氮芥、亚硝基脲、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、三氮烯、叶酸类似物、核苷类似物、核糖核苷酸还原酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷类、埃博霉素、插层剂、能够干扰信号转导途径的药剂、促进凋亡的药剂和辐射或结合表面蛋白以递送有毒药剂的抗体分子偶联物。在一个实施方式中，可以与本文中描述的方法或组合物一起给药的细胞毒性药剂是基于铂的药剂(例如顺铂)、环磷酰胺、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、拓扑替康、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙素、蒽环类抗生素(例如多柔比星或表柔比星)、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒素或美登素类化合物。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高颗粒酶B、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ或TNFα的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触，以便相对于在与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶接触之前的相应表达水平，提高细胞、组织或受试者中颗粒酶B、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ或TNFα的表达。在某些实施方式中，所述细胞选自树突状细胞和外周血单核细胞(PBMC，例如单核细胞)。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞、组织或受试者中颗粒酶B、IL-1b、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17A、HLA-DR、CD86、CD83、IFNγ或TNFα的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、通过Luminex多重测定法或通过在本文实施例中描述的流式细胞术。
本发明还提供了个从细胞或组织除去唾液酸的方法。所述方法包括将所述细胞或组织与有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触。本发明还提供了一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
在某些实施方式中，所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。在某些实施方式中，所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子(例如HLA-DR)的表达提高。在某些实施方式中，相对于尚未与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触的相似或在其他方面相同的细胞或组织，所述细胞或组织中MHC-II分子的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、通过Luminex多重测定法或通过在本文实施例中描述的流式细胞术。
本发明还提供了一种提高肿瘤细胞的吞噬作用的方法。所述方法包括将所述肿瘤细胞与有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬作用。在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中提高肿瘤细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的药物组合物，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬作用。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触的相似或在其他方面相同的肿瘤细胞或肿瘤细胞群体，吞噬作用提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。吞噬作用可以如本文实施例9中所述来测量。
本发明还提供了一种活化树突状细胞(DC)或DC群体的方法。所述方法包括将所述DC或DC群体与已用唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶处理的肿瘤细胞相接触。在某些实施方式中，本公开涉及一种在受试者中活化树突状细胞(DC)或DC群体的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量的包含唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的药物组合物，从而在所述受试者中活化DC或DC群体。
在某些实施方式中，相对于尚未与用所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶处理的肿瘤细胞相接触的相似或在其他方面相同的DC或DC群体，所述DC或DC群体的活化提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。活化可以如本文实施例8中所述来测量。
本发明还提供了一种降低Siglec-15结合活性，从而提高肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括将T细胞与唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触。在某些实施方式中，本公开涉及一种在患者的肿瘤微环境中降低Siglec-15结合活性，从而提高抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的药物组合物，从而在所述受试者中提高抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触的Siglec-15，Siglec-15结合活性降低至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％或约100％。结合可以如本文实施例16中所述来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中促进免疫细胞在肿瘤中的浸润的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，例如本文中公开的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞例如CD4+和/或CD8+T-细胞，例如CD69+CD8+和/或GzmB+CD8+T-细胞。在某些实施方式中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的相似或在其他方面相同的肿瘤和/或受试者，在所述受试者中免疫细胞在所述肿瘤中的浸润被提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。免疫细胞在肿瘤中的浸润可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中增加循环自然杀伤(NK)细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，例如本文中公开的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，以便相对于给药所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶或药物组合物之前增加循环NK细胞的数目。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中循环NK细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中的循环NK细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体染色来测量。
本发明还提供了一种在需要的受试者中提高引流淋巴结中T-细胞的数目的方法。所述方法包括向所述受试者给药有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，例如本文中公开的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶，以便相对于给药所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶或药物组合物之前增加引流淋巴结中T-细胞的数目。在某些实施方式中，所述免疫细胞是T-细胞，例如CD4+和/或CD8+T-细胞。
在某些实施方式中，相对于尚未给药所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶的相似或在其他方面相同的受试者，在所述受试者中所述引流淋巴结中T-细胞的数目增加至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。受试者中引流淋巴结中的T-细胞可以通过本领域中已知的任何适合的方法例如抗体来测量。
本发明还提供了一种在细胞、组织或受试者中提高Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达的方法。所述方法包括将所述细胞、组织或受试者与有效量的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶例如本文公开的唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶相接触，以便相对于与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶或药物组合物接触之前的细胞、组织或受试者提高所述Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达。
在某些实施方式中，相对于尚未与所述唾液酸酶或与半衰期延长剂偶联的唾液酸酶接触的相似或在其他方面相同的细胞、组织或受试者，在所述细胞、组织或受试者中Cd3、Cd4、Cd8、Cd274、Ctla4、Icos、Pdcd1、Lag3、Il6、Il1b、Il2、Ifng、Ifna1、Mx1、Gzmb、Cxcl9、Cxcl12和/或Ccl5的表达提高至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约75％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约400％、至少约500％、至少约600％、至少约700％、至少约800％、至少约900％或至少约1,000％。基因表达可以通过本领域中已知的任何适合的方法来测量，例如通过ELISA、Luminex多重测定法或Nanostring技术。
在整个本说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在基本上由所叙述的组分构成或由所叙述的组分构成的本发明的组合物，并且存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由所叙述的过程步骤构成的符合本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为是包括在所叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单时，应该理解所述要素或组分可以是所述叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自所述叙述的要素或组分中的两者或更多者。
此外应该理解，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以在不背离本发明的精神和范围的情况下以各种不同方式组合，不论在本文中是明示还是暗示。例如，在提及特定化合物的情况下，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，实施方式以能够书写和绘制清楚简明的申请的方式进行描述和描绘，但打算并且应该认识到实施方式可以进行各种不同的组合或分离，而不背离本文的教授和发明。例如应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点均可适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”包括在所述表述后的单独的每个叙述的受试者以及所述叙述的受试者中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和使用中另有理解。与三个或更多个叙述的受试者相关联的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”、“含义”、包括其语法等同语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除另外的未叙述的要素或步骤，除非从上下文另有具体陈述或理解。
在将术语“约”用于定量值之前的情况下，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指从标称值偏差±10％，除非另有指示或推测。
应该理解，步骤的顺序或用于执行某些行动的顺序并不重要，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中任何和所有实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用，仅打算更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制，除非另外提出权利要求。本说明书中的任何语言均不应被解释为表明任何未提出权利要求的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1：重组唾液酸酶的构建和表达
本实施例描述了重组人唾液酸酶(Neu1、Neu2、Neu3和Neu4)的构建。将人唾液酸酶Neu1、Neu2、Neu3(同工型1和Neu4(同工型1)表达成带有10хHis标签的分泌蛋白。
为了将Neu1表达为分泌蛋白，将本源N端信号肽(MTGERPSTALPDRRWGPRILGFWGGCRVWVFA AIFLLLSLAASW SKA；SEQ ID NO：27)用MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)代替，并移除C端溶酶体信号基序(YGTL；SEQ ID NO：29)。为了将Neu2、Neu3和Neu4表达为分泌蛋白，向每一者添加N端信号肽MDMRVPAQLLGLLLLWLPGARC(SEQ ID NO：28)。
唾液酸酶在24孔板中，在200mL使用pCEP4哺乳动物表达载体转染的HEK293F人类细胞中表达。唾液酸酶使用Ni-NTA柱纯化，用UV-Vis分光光度计(NanoDrop)定量，并如图2中所示通过SDS-PAGE检查。Neu1表达良好，具有～3μg/ml的产量，并且主要以单体形式存在。Neu2和Neu3表达各自给出～0.15μg/mL的产量，并且各自主要以二聚体形式存在。当通过NanoDrop测量时，Neu4没有可检测的表达量。来自于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的细菌唾液酸酶(细菌-唾液酸酶；SEQ ID NO：30)以与Neu1-4(上文)相同的方式表达，并给出与Neu1可比的产量，并主要以单体形式存在。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定所述重组表达的唾液酸酶的活性。如图3中所示，Neu1不具有高于无酶对照的可检测的活性，这与以前的报道相一致，所述报道表明除非与β-半乳糖苷酶和保护性蛋白质/组织蛋白酶A(PPCA)复合，否则Neu1是无活性的。Neu2和Neu3有活性，细菌唾液酸酶也是如此。使用Neu2和Neu3进行了酶动力学测定。将1nM的固定浓度的酶与浓度在4000μM至7.8μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。测定在酸性(pH 5.6)和中性(pH 7)两种条件下进行。如图4中所示，Neu2和Neu3两者在酸性和中性条件下均有活性，并显示出与以前报道的可比的酶动力学。
实施例2：重组唾液酸酶-Fc融合蛋白的构建和表达
本实施例描述了重组Fc唾液酸酶遗传融合体的构建。具体来说是Neu2-Fc、Neu3-Fc和ST唾液酸酶-Fc。
对利用野生型Neu2的Fc-唾液酸酶(Neu2-Fc；SEQ ID NO：113，由SEQ ID NO：114编码)和被命名为M106的变体Fc-唾液酸酶(SEQ ID NO：115，由SEQ ID NO：116编码)(M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、C332A和具有臼(Y407T)突变的人类IgG1)进行了表达、纯化和表征。使用pCEP4哺乳动物表达载体，将Neu2-Fc分子在1L转染的Expi293人类细胞中表达。Neu2-Fc使用蛋白A，然后是阳离子交换层析(Hitrap SP-HP，GE Lifesciences)进行纯化。Neu2-Fc具有0.3mg/升的得率，M106具有20mg/升的得率。
图5A描绘的SDS-PAGE凝胶示出了在非还原和还原条件下的重组野生型人Neu2-Fc和M106。图5B-C示出的SEC-HPLC迹线将野生型Neu2-Fc相对于M106进行比较。单体物质具有21mins的保留时间。Neu2-Fc(图5B)具有7％的SEC单体纯度，M106(图5C)具有85％的SEC单体纯度。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放测定了M106的活性。酶动力学测定使用2μg/孔的固定浓度的酶来进行，并与浓度在4mM至0.03μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。图6描绘了M106的酶活性。
使用pCEP4哺乳动物表达载体，将利用野生型Neu3的FC唾液酸酶(Neu3-Fc；SEQ IDNO：117，由SEQ ID NO：118编码)在100ml转染的Expi293人类细胞中表达。使用表达Neu3-Fc的细胞(N3-正常)、用衣霉素处理的表达Neu3-Fc的细胞(N3-Tunic)和模拟转染的细胞，在细胞调制培养基(上清液)和清洗过的细胞沉积物两者中确定了活性。图7显示在细胞沉积物中检测到Neu3-Fc活性，代表了表面结合的活性，并且在上清液中检测到低水平的活性，代表了分泌的Neu3-Fc。用S-酰化和N-糖基化的抑制剂衣霉素处理不改变表面结合的活性或上清液中的活性。
使用基于杵臼的Fc设计构建了使用鼠伤寒沙门氏菌的Fc细菌唾液酸酶(Fc-ST唾液酸酶)。所述Fc-ST唾液酸酶包含两条多肽的二聚体：SEQ ID NO：119(pCEP-StSia-G4S2-hIgG1Fc-臼，由SEQ ID NO：121编码)和SEQ ID NO：120(pCEP-StSia-G4S2-hIgG1Fc-杵，由SEQ ID NO：122编码)。使用pCEP4哺乳动物表达载体，将Fc-ST唾液酸酶在1L转染的Expi293人类细胞中表达。Fc-ST唾液酸酶使用蛋白A，然后是阳离子交换层析(Hitrap SP-HP，GELifesciences)进行纯化。图8描绘的SEC-HPLC迹线显示表达的Fc-ST唾液酸酶是单体物质，具有21分钟的保留时间和75％的SEC单体纯度。
通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放测定了Fc-ST唾液酸酶的活性。酶动力学测定使用2μg/孔的固定浓度的酶来进行，并与浓度在4mM至0.03μM范围内的产荧光底物4MU-NeuAc温育。FCST具有接近3x108荧光AU的活性。
实施例3：Fc唾液酸酶的体内给药减小肿瘤体积
本实施例显示了本发明的Fc唾液酸酶在同基因小鼠肿瘤模型中的体内给药减小肿瘤体积。
在用鼠类淋巴瘤癌细胞系A20注射的小鼠同基因肿瘤模型中，将实施例2中描述的Fc-鼠伤寒沙门氏菌唾液酸酶构建物(Fc-ST唾液酸酶)与阿维单抗(抗PD-L1抗体)进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用0.1ml PBS中的A20肿瘤细胞(5x105)皮下接种，用于肿瘤发展。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到4个组中，每组8只动物。
小鼠每周两次通过10mg/kg的阴性对照(“同种型对照”，图9A)、Fc-ST唾液酸酶(图9B)、阿维单抗(抗小鼠PD-L1抗体，图9C)或Fc-ST唾液酸酶与阿维单抗的组合(图9D)的腹膜内注射给药共15天，并随时间测量肿瘤体积(mm3)。本实施例证实了本发明的Fc唾液酸酶可以在体内减小肿瘤体积。
将所述Fc-ST唾液酸酶在使用被工程化改造以表达人类Her2的小鼠肿瘤细胞系(EMT6-Her2细胞)的第二个模型中进行评估。在用EMT6-Her2细胞注射的小鼠同基因肿瘤模型中，将Fc-ST唾液酸酶和人Neu2-Fc构建物M106(在实施例2中描述)与曲妥珠单抗(抗HER2抗体)进行比较。将6-8周龄的雌性BALB/c小鼠在右下胁区域中用0.1ml PBS中的EMT6-Her2肿瘤细胞(5x105)皮下接种，用于肿瘤发展。当肿瘤达到50-100mm3，平均值为～75-100mm3时，将小鼠随机分派到4个组中，每组8只动物。
正如由三角形所指示的，小鼠每周两次通过10mg/kg的同种型对照(介质对照，图10A)、Fc-ST唾液酸酶(FC-ST，图10B)、曲妥珠单抗(抗人类Her2抗体，图10C)或Fc人唾液酸酶(M106，图10D)的腹膜内注射给药共15天，并随时间测量肿瘤体积(mm3)。本实施例证实了本发明的Fc唾液酸酶可以在体内减小肿瘤体积。
实施例4：二价阳离子可以使唾液酸酶的活性稳定
本实施例描述了二价阳离子特别是钙使本发明的唾液酸酶的活性稳定的能力。具体来说，将Fc-Neu2唾液酸酶(SEQ ID NO：123)(M1D、V6Y、I187K、C332A)与曲妥珠单抗的重链和轻链一起表达(包括具有由核苷酸序列SEQ ID NO：125编码的氨基酸序列SEQ ID NO：124的第一多肽链，具有由核苷酸序列SEQ ID NO：127编码的氨基酸序列SEQ ID NO：126的第二多肽链，和具有由核苷酸序列SEQ ID NO：128编码的氨基酸序列SEQ ID NO：123的第三多肽链)。
将纯化的蛋白质在PBS或含有4mM CaCl2的PBS中在37℃温育长达2周。通过测量唾液酸从产荧光底物4-甲基伞形酮基-N-乙酰神经氨酸(4MU-NeuAc)的释放来测定含有约2μg蛋白质的样品。测定在37℃下4小时后和第1、3、7和14天进行。结果示出在图11中。正如可以看到的，向酶制备物添加CaCl2使酶活性极大地稳定。
为了观察在哺乳动物细胞中CaCl2是否可以在表达期间使酶活性稳定，从转染后24小时开始向瞬时转染的Expi293细胞的表达培养基添加4mM CaCl2。如图12A中所示，直至第7天，CaCl2的添加极大地增加分泌的酶活性的量。然而，如图12B中所示，4mM CaCl2导致细胞存活率降低。
为了优化可以使酶活性稳定但维持细胞存活率的CaCl2浓度，在转染后第1天添加范围为0.05mM、0.5mM、1mM、2mM和4mM的5种浓度的CaCl2。如图13A中所示，在第4-6天的三天时间过程中收集调制培养基并确定酶活性(以及因此存活率)。也测量了蛋白质得率(图13B)。发现4mM CaCl2使活性稳定并给出适度的得率，但存活率不佳。发现了在所测试的条件下使用0.5mM CaCl2维持唾液酸酶的活性提供了较高的蛋白质得率，并且对细胞的毒性较低。
实施例5：人类PMBC的亚群的唾液酸聚糖分布情况
本实施例描述了使用流式细胞术获得的人类外周血单核细胞(PBMC)的不同亚群的唾液酸聚糖分布情况。存在于免疫细胞表面上的唾液酸聚糖在维持稳态中发挥重要作用。在自身免疫、肿瘤细胞的免疫监督逃逸机制等中报告了免疫细胞上唾液酸聚糖分布的失衡。
在使用Ficoll方法分离PBMC后，使用台式离心机以350x g离心5分钟将细胞用冰冷的PBS清洗两次，使用CountessTM II自动细胞计数仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)对细胞计数，并将250K个细胞的等分试样添加到96孔板的每个孔中。制备在PBS中含有Human Trustain FcX(1/20稀释)和LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染料(1/2000稀释)的Fc阻断溶液，并将细胞在冰上温育10分钟。将细胞用冰冷的PBS(1％BSA)清洗，以350x g离心5min。使用如表10中所示的Hydra和凝集素试剂进行细胞表面唾液酸聚糖染色。Hydra-3、Hydra-7和Hydra-9分别是人类Siglec 3、Siglec 7和Siglec 9的细胞外结构域的六聚体形式(如国际(PCT)申请公布号WO2019/237070中所述)。使用的凝集素包括生物素化的西洋接骨木(Sambucus Nigra)(SNA，Vector Laboratories,B-1305-2)、生物素化的Machia Amurensis(MAL-II，Vector Laboratories，B-1265-1)和生物素化的花生凝集素(PNA，Vector Laboratories，B-1075-5)。SNA是偏好性地结合到以α-2,6连键并在较低程度上以α-2,3连键附连到末端半乳糖的唾液酸的凝集素。MAL-II是结合到采取α-2,3连键的唾液酸的凝集素。PNA是结合到末端半乳糖残基的凝集素。PNA染色的增加可以指示末端唾液酸被唾液酸酶的去除和下方半乳糖的暴露。
表10
试剂 储用液 工作浓度 缓冲液
Hydra-3 可变 250nM FACS染色缓冲液
Hydra-7 可变 25nM FACS染色缓冲液
Hydra-9 可变 75nM FACS染色缓冲液
MAL-II 1mg/mL 2μg/mL PBS
PNA 5mg/mL 1μg/mL FACS染色缓冲液
SNA 2mg/mL 0.5μg/mL FACS染色缓冲液
将PBMC与各种不同的Hydra和凝集素试剂在冰上温育30分钟。将细胞在每个孔中用150μL PBS(1％BSA)清洗，并以350x g离心5分钟。快速倾倒出板中的溶液。将在PBS中1/2000稀释的AF-647山羊抗小鼠IgG抗体用作Hydra试剂(Hydra-7和Hydra-9)的第二染色剂。将在PBS中1/2000稀释的链亲合素偶联的Alexa Fluor 647用作凝集素试剂(PNA、MAL-II和SNA)的第二染色剂。将细胞在冰上温育15分钟。如表11中所示使用指定抗体进行细胞谱系特异性染色。除了Live Dead染色剂购自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)之外，所有其他抗体均购自
Figure BDA0003508968760000901
(San Diego,CA)。
表11
Figure BDA0003508968760000902
Figure BDA0003508968760000911
使用表11中的试剂在FACS染色缓冲液中制备主混合物(“染色剂混合物”)，并将30μl的染色剂混合物的等分试样添加到每个孔/管中，使最终活性抗体浓度为～1μg/ml。将细胞在冰上温育15分钟。另外，制备各个细胞补偿对照。将细胞用PBS(1％BSA)清洗，并在室温下在4％聚甲醛中重悬浮10min。将细胞用PBS清洗两次，并将沉积物重悬浮在150μl PBS中。使用流式细胞仪(BD FACSCelestaTM(BD Biosciences))运行样品。
将来自于两位不同健康供体的人类PBMC用Hydra-3、Hydra-7和Hydra-9染色，如图14中所描绘(黑色和灰色条代表两位供体)。正如所示，与其他细胞群体相比，单核细胞和DC细胞群体表现出增加的Hydra-9染色(图14A)。与其他细胞群体相比，单核细胞和DC细胞群体表现出增加的Hydra-7染色(图14B)。一位供体表现出CD4+T细胞上的Hydra-7染色增加。与其他细胞群体相比，单核细胞和DC细胞群体表现出增加的Hydra-3染色(图14C)。一位供体表现出CD4+T细胞上的Hydra-3染色增加。
来自于健康供体的人类PBMC的凝集素染色(MAL-II、PNA和SNA)描绘在图15中(黑色和灰色条代表两位独立的供)。正如所示，与Hydra-9染色相比PNA染色相对低(参见Y-轴的刻度与图14的比较)，但特异性针对单核细胞和DC(图15A)。MAL-II染色大多数免疫细胞群体(图15B)。与其他细胞群体相比，T细胞(CD4+和CD8+)表现出增加的MAL-II染色。SNA染色大多数免疫细胞群体(图15C)，其中与其他细胞群体相比NK细胞表现出更少的SNA染色。
实施例6：唾液酸酶有效地将树突状细胞(DC)去唾液酸化
本实施例演示了本发明的唾液酸酶分子对人类单核细胞来源的树突状细胞(DC)的去唾液酸化效率。
已知DC表达高水平的Siglec(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素，例如Siglec-3、-7和-9)，它们抑制肿瘤细胞的NK细胞介导的灭杀。此外，DC表达大量唾液酸聚糖，正如在前一个实施例中证实的，它们是Siglec分子的配体。DC上的Siglecs与同一细胞或另一个相互作用的细胞(例如癌细胞)上的唾液酸聚糖的相互作用调控DC活化。
使用标准的Ficoll密度梯度方法，从白细胞单采样品(富含PBMC的血样)分离PBMC。在PBMC分离后，通过以350x g离心5分钟，将细胞用冷
Figure BDA0003508968760000921
漂洗缓冲液(含有5％BSA；Miltenyi Biotec)清洗两次。使用CD14微珠(Miltenyi Biotec)对CD14+单核细胞进行磁性纯化，并将其分化成树突状细胞。具体来说，将CD14+细胞以0.8x106个细胞/mL的浓度重悬浮在含有50ng/ml重组人GM-CSF和50ng/mL重组人IL-4的完全培养基(含有10％FBS的RPMI培养基)中。在第0天，将细胞在6孔板中铺板，每孔3ml细胞悬液(2.4x106个细胞/孔)。在第3天和第6天，从每个孔除去一半的培养基，小心地不扰动松散附着的细胞。向每个孔补充1.5mL含有各100ng/mL的rhGM-CSF和rhIL-4的新鲜培养基。在第7天，通过用培养基轻轻冲刷来收获分化的DC，将其用完全培养基清洗一次，并以2x106/mL重悬浮。
对于去唾液酸化测定来说，使用M106(M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、C332A和带有臼(Y407T)突变的人类IgG1 Fc和EPKSS(SEQ ID NO：163)连接物)(SEQ ID NO：152，由SEQ IDNO：193编码)。该构建物如实施例2中所述，但使用EPKSS(SEQ ID NO：163)连接物代替GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：162)连接物。此后在实施例中使用的术语“M106”是指这种构建物。此外，使用被称为LOF的Neu2-FC变体(M1D、V6Y、K9D、I187K、C332A、A93E、V363R、L365R、E218A、C219N和带有臼(Y407T)突变的人类IgG1 Fc(SEQ ID NO：175，由SEQ ID NO：176编码))作为阴性对照。将每孔100,000个DC铺于96孔U形底格式板中，每孔分发200μl。LPS以指定的0.3ng/mL使用，并且M106和LOF构建物以下述浓度(单位为μg/mL)使用：0，6.25，12.5，25，50和100。将DC温育过夜(16小时)，然后对CD83、CD86和MHCII(HLA-DR)进行流式分析。去唾液酸化如实施例5中所述通过PNA染色来测量。
在温育后，将板以350x g离心4分钟并除去培养基。将细胞用FACS染色缓冲液清洗一次。通过添加100μl含有人类Trustain FcX(1/20稀释)和LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂(1/2000稀释)的PBS溶液并在冰上温育10分钟，将细胞阻断并同时对死细胞染色。将细胞离心并用FACS缓冲液清洗一次。向每个孔添加50μL PNA-生物素(1μg/mL，在FACS染色缓冲液中)，并在冰上温育10分钟。将细胞离心并用FACS缓冲液清洗两次。向每个孔添加50μL包括链亲合素Alexa FluorTM647在内的抗体混合物(描述在下面的表12中)，并在冰上温育30分钟。温育后，将细胞用150μL FACS缓冲液清洗两次，并重悬浮在125μL FACS缓冲液中用于流式细胞术采集。流式细胞术数据在流式细胞仪(BD FACSCelestaTM(BDBiosciences))上使用HTS(高通量采样器)选项采集。在数据采集后，使用FlowJo流式分析软件(BD Biosciences)分析信号。
表12
Figure BDA0003508968760000931
Figure BDA0003508968760000941
图16描绘了基于PNA染色的M106对DC的去唾液酸化程度。PNA染色的增加表明末端唾液酸的去除，暴露出被PNA凝集素识别的下方半乳糖残基。图16A显示出随着M106浓度提高，指示PNA染色的荧光(MFI)增加。图16B示出了与未处理的DC相比PNA信号的增加倍数。观察到PNA信号的明显的剂量依赖性增加，表明DC的稳健的去唾液酸化。
合在一起，本实施例显示了M106以剂量依赖性方式引起DC的稳健的去唾液酸化。
实施例7：唾液酸酶对肿瘤细胞系的去唾液酸化
唾液酸聚糖在人类生理条件下发挥维持耐受性和稳态的作用。在肿瘤细胞系中观察到唾液酸聚糖的过表达。本实施例证实了M106使肿瘤细胞系BT-20、SKBR-3、HT-29去唾液酸化的能力，正如通过Hydra-9和凝集素染色所确定的。
使用适合的培养基将BT-20和HT-29细胞在板上生长至70-80％合生。使用
Figure BDA0003508968760000942
(Innovative Cell Technologies,Inc.)这种含有蛋白水解和胶原水解酶活性的酶混合物，通过将板在37℃温育15分钟将细胞解离。在细胞被解离时，添加等体积的完全培养基以中和
Figure BDA0003508968760000943
。将细胞悬液转移并以300x g离心5min。舍弃上清液并将细胞用冷PBS清洗两次。将细胞计数并以1x106个细胞/ml重悬浮在培养基中。以不同的稀释度向细胞添加M106和LOF。将细胞在37℃温育10小时。温育后，将细胞用PBS清洗并转移到96孔圆底板进行染色。染色如实施例5中所述使用Hydra-9和PNA来进行。
图17描绘了在用M106(三角形)或LOF对照(正方形)处理后，通过用荧光(gMFI)度量的Hydra 9结合的丧失(图17A)或PNA染色的增加(图17B)所确定的BT-20细胞的去唾液酸化程度。被M106去唾液酸化的IC50对于Hydra 9来说是3.088μg/mL，对于SNA来说是58.75μg/mL。图18描绘了在用M106(三角形)或LOF对照(正方形)处理后，通过用荧光(gMFI)度量的Hydra 9结合的丧失(图18A)或PNA染色的增加(图18B)所确定的BT-20细胞的去唾液酸化程度。被Neu2-Fc变体M106去唾液酸化的IC50对于Hydra 9来说是2.95μg/mL，对于SNA来说是131.5μg/mL。
使用SKBR-3细胞进行了类似的实验，其中除了Hydra 9和PNA之外，还将细胞用MAL-II凝集素染色。对于MAL-II染色来说，使用在PBS中2μg/mL的终浓度，并将细胞在室温染色10分钟。图19描绘了在用M106(三角形)或LOF对照(圆圈)处理后，通过用荧光度量的Hydra 9结合的丧失(图19A)、MAL-II染色的丧失(图19B)或PNA染色的增加(图19C)所确定的SKBR-3细胞的去唾液酸化程度。被M106去唾液酸化的IC50对于Hydra 9来说是4.4μg/ml，对于MAL-II来说是大约120μg/mL，并且对于SNA来说是22μg/ml。
合在一起，本实施例表明M106表现出剂量依赖性地从肿瘤细胞除去细胞表面唾液酸。与MAL II染色的丧失或PNA染色的增加相比，Hydra 9染色的丧失是更灵敏的指示物，EC50在3至4ug/mL的M106左右。
实施例8：唾液酸酶对肿瘤细胞系的去唾液酸化增强人类树突状细胞活化
唾液酸聚糖在人类生理条件下发挥维持耐受性和稳态的作用。尽管在肿瘤细胞系中观察到唾液酸聚糖的过表达，但正如在前面的实施例中所示，得到的唾液酸聚糖可以用本发明的唾液酸酶除去。本实施例演示了肿瘤细胞系的去唾液酸化对树突状细胞活性的影响。
简单来说，树突状细胞(DC)从来自于健康供体的PBMC分离的CD14+单核细胞产生。使用制造商的方案(Miltenyi Cat#130-050-201)将CD14+细胞磁性纯化。然后将纯化的细胞在GM-CSF(R&D Systems Cat#7954-GM/CF)和IL-4(R&D Systems Cat#6507-IL/CF)存在下培养7天，以产生不成熟的DC。
在实验当天，使用
Figure BDA0003508968760000961
从T-75培养瓶收获SKBR-3肿瘤细胞，并用10％FBSMcCoy’s 5A培养基清洗两次。然后将细胞以5x106/mL重悬浮在10％FBS McCoy’s 5A培养基中。向样品添加100μg/mL M106，并在37℃温育4小时。除了向管添加M106之外，未处理组进行同样的处理。4小时后，将细胞用10％FBS McCoy’s 5A培养基清洗两次，并以2x106/mL重悬浮在完全培养基(10％FBS RPMI)中。向指定的孔添加50μl悬液(100,000DC)。
将DC收获，在完全培养基(10％FBS RPMI)中清洗并以2x106/ml重悬浮。向指定的孔添加50μL悬液(100,000DC)。
添加LPS(InvivoGen Cat#tlrl-pb5lps)至终浓度为0.3ng/mL。添加完全培养基(10％FBS RPMI)，其需要达到每孔200μL的终体积。将测定板在37℃温育过夜。第二天，将细胞用染色缓冲液清洗并对DC标志物(CD11c、CD209、CD1c、CD83、CD86和HLA-DR)进行染色。肿瘤细胞的去唾液酸化如实施例6中所述通过用Hydra-9染色来证实。
图20描绘了通过CD83hi表达(图20A)或CD86hi表达(图20B)确定的在各种不同条件下对树突状细胞活化的影响。未处理的DC(“No Tx”)具有低百分率的CD83hi和CD86hi。向DC添加LPS强烈诱导活化，正如通过CD83h和CD86hi的百分率提高所显示的(“LPS”)。当将DC与未处理的SKBR-3肿瘤细胞共温育时，CD83和CD86两者的LPS诱导的表达被抑制(参见图20A和20B中的水平线)。在与DC和LPS共温育之前，在SKBR-3肿瘤细胞被M106去唾液酸化后，SKBR-3肿瘤细胞对DC的抑制被逆转(“LPS+M106 FC”)。此外，在不存在LPS的情况下唾液酸酶处理略微增强DC的活化(将无处理和未处理的SKBR-3肿瘤细胞与M106处理的SKBR-3肿瘤细胞(“M106FC”)进行比较)。
本实施例证实了肿瘤细胞的去唾液酸化可以逆转唾液酸聚糖诱导的DC的免疫抑制，这表明肿瘤细胞的去唾液酸化可以引起更强的抗肿瘤应答。
实施例9：唾液酸酶对巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的影响
存在于免疫细胞表面上的唾液酸聚糖在维持稳态中发挥重要作用。本实施例证实本发明的唾液酸酶对M2样人类巨噬细胞对HT-29肿瘤细胞的吞噬作用的影响。
通过Ficoll方法从人类志愿者的全血分离PBMC。使用CD14微珠对CD14+单核细胞进行磁性纯化。通过将CD14+细胞以1x106/mL的浓度重悬浮在含有50ng/mL重组人M-CSF的RPMI培养基中(10％FBS)，将单核细胞分化成M2样巨噬细胞。在第0天，将细胞以20mL的体积铺板于150mm组织培养板中(每块板接种～20x106个细胞)。在第3天和第6天，从每个孔除去一半的培养基，小心地不扰动附着的细胞。补充M-CSF至终浓度为50ng/mL。在第7天，将培养基上清液收集在50mL管中，并将板用20mL PBS轻柔清洗。添加20mL
Figure BDA0003508968760000971
并将板温育20分钟，以从板上解离细胞。将细胞重悬浮在增补有10％FBS和非必需氨基酸(NEAA)、丙酮酸钠和含有10ng/ml M-CSF的HEPES的完全RPMI培养基中，并以50K细胞/孔/100μL接种在平底96孔板中。
使用
Figure BDA0003508968760000972
从培养瓶收获HT-29细胞。将细胞用PBS清洗。将细胞用以1:1000的体积比稀释的Cell TraceTM CFSE标记染料(FITC)偶联物(Thermo Fisher)标记(终浓度为10μM)。将细胞在室温温育10分钟，并通过添加等体积的冷藏FBS淬灭所述标记反应。将细胞清洗两次，并以1.2x106个细胞/ml重悬浮在培养基(增补有10％FBS的McCoy’s培养基)中。以100μg/ml的最高浓度，然后是2倍的稀释添加M106和LOF。保留了使用未处理的HT-29细胞的无处理对照组。将细胞在37℃温育～20小时。
在温育后，将细胞离心下来，用PBS清洗，并以2.5x106个细胞/mL的最终细胞密度重悬浮在完全RPMI(10％FBS)培养基中。在适合的孔中以1:5的巨噬细胞:肿瘤细胞比例(E:T)向M2样巨噬细胞添加100μL HT-29细胞悬液。将含有巨噬细胞和肿瘤细胞的板温育2小时，以允许吞噬作用。2小时后，使用多通道移液器轻柔地除去培养基，并向板添加200μL
Figure BDA0003508968760000981
在冰上温育45分钟，以从板上拆解HT-29和巨噬细胞两者。将细胞重悬浮并收集在新的96孔板中。将板离心，舍弃上清液，并将细胞沉积物在200μL PBS中清洗。
将细胞沉积物重悬浮，并使用人类Trustain Fc阻断剂在冰上阻断5-7分钟。温育后，将细胞用PBS清洗。如下面的表13所述对细胞进行CD45和CD14荧光染料标志物染色。抗体购自
Figure BDA0003508968760000982
。
表13
标志物 荧光染料 克隆 目录号 标志物用于
CD14 BV421 MSE2 301830 巨噬细胞
CD45 APC 2D1 368512 巨噬细胞
在FACS染色缓冲液中制备主混合物，其中以1:30的稀释比添加染色抗体。每孔添加30μl主混合物。平行地对适合的补偿对照(例如根据用于多色流式细胞术的标准流式细胞术做法，用于补偿的单色染色对照)进行染色。将细胞在冰上温育15分钟，然后用PBS清洗，350g离心8分钟。然后将细胞用4％甲醛在室温固定10分钟，然后用PBS清洗两次。将细胞重悬浮在150μL PBS中，并在流式细胞仪(BD FACSCelestaTM(BD Biosciences))上运行。
确定了CFSE阳性、CD14+CD45+巨噬细胞的百分率。CFSE阳性、CD14+CD45+巨噬细胞指示了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬百分率，因为被CD14+CD45+巨噬细胞吞噬的CFSE阳性肿瘤细胞是CFSE阳性的。
图21描绘了源自于两个不同健康供体的M2样巨噬细胞对去唾液酸化的HT-29肿瘤细胞的吞噬作用的剂量依赖性增强(图21A和图21B)。用浓度高于25μg/mL的唾液酸酶预处理的HT-29表现出可重复的被巨噬细胞吞噬的提高。观察到M2样巨噬细胞对去唾液酸化的BT20和SKBR-3肿瘤细胞的吞噬作用的类似的提高(分别为图21C和图21D)。
因此，用本文中所描述的唾液酸酶处理肿瘤细胞导致巨噬细胞对所述肿瘤细胞的吞噬作用的提高。
实施例10：唾液酸酶处理增强单核细胞上的II类MHC表达
本实施例证实了本发明的唾液酸酶对单核细胞上的II类MHC(HLA-DR)表达的影响。MHC-II表达代表了单核细胞上的抗原呈递能力。增强的II类表达指示了抗原向T细胞呈递以产生有效免疫应答的增强。
使用Ficoll方法从健康志愿者分离PBMC，并使用台式离心机以350x g离心10分钟，将细胞用冰冷的PBS清洗两次。将细胞重悬浮在培养基中，并使用CountessTM II自动细胞计数仪计数。将最终的悬液调整到2.5x106个细胞/L。将约250,000个细胞(100μL)接种在96孔圆底板中。将细胞与最高浓度为50μg/mL，然后进行2倍稀释的M106或LOF温育。包含了无处理组。将细胞在37℃温育18小时。将板以350x g离心10分钟。将细胞沉积物用冷PBS清洗，使用表14中描述的FACS染色组进行阻断和染色步骤。除了购自Thermo Fisher的LiveDead染色剂之外，所有其他抗体均购自
Figure BDA0003508968760000992
。唾液酸聚糖染色使用PNA凝集素，通过使用实施例7中描述的方法确认去唾液酸化来进行。
表14
Figure BDA0003508968760000991
Figure BDA0003508968760001001
图22描绘了在来自于两位不同健康供体的单核细胞中，在LOF相比，在M106去唾液酸化后HLA-DR表达的剂量依赖性增强(图22A和图22B)。
因此，本实施例显示，本文描述的唾液酸酶对单核细胞的去唾液酸化导致单核细胞上II类MHC(HLA-DR)的表达提高。MHC-II表达代表了单核细胞上的抗原呈递能力，因此，增强的II类表达指示了抗原向T细胞呈递的增强，这可以增强T细胞产生有效免疫应答的能力。
实施例11：唾液酸酶处理不引起不利的细胞因子释放
测定来自于与M106或LOF温育的PBMC的调制培养基对细胞因子释放的刺激。LPS(1ng/mL)被用作阳性对照。当通过LEGENDplexTM人类M1/M2巨噬细胞组(10-plex；
Figure BDA0003508968760001002
)测量时，在两个独立的供体中，在所有处理剂量下PBMC的M106(以及LOF)处理没有表现出TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-1RA或IL-10的增加。相反，LPS表现出明显的细胞因子诱导。这些结果证实，PBMC的唾液酸酶处理不引起不利的细胞因子释放。
实施例12：单独的和与抗PD-1抗体组合的唾液酸酶处理导致肿瘤生长的完全和部 分缓解
本实施例显示了在各种不同的小鼠同基因肿瘤模型中本发明的唾液酸酶的体内给药可以引起肿瘤生长的完全和部分缓解。
使用MC38结肠癌细胞模型试验了单独的和与其他癌症治疗相组合的唾液酸酶治疗。将每只小鼠在右下胁区域中用0.1mL PBS中的5x105个肿瘤细胞皮下接种，以诱导肿瘤发生。当平均肿瘤尺寸达到大约50mm3时，将小鼠随机分组。将32只小鼠随机分派到4个研究组。将小鼠每周两次用M106、抗小鼠PD-1抗体、Neu2-Fc变体M106与抗PD-1抗体的组合或同种型对照以每种药剂10mg/kg的量给药共5剂。图23描绘了在同种型对照组(图23A)、M106组(图23B)、抗PD-1抗体组(图23C)或M106与抗PD-1抗体的组合组(图23D)中每只小鼠的肿瘤生长。M106治疗的小鼠在一只动物中表现出肿瘤生长的完全缓解(CR)，与此相比在同种型治疗组中没有小鼠响应。M106与抗PD-1抗体的组合表现出1CR和1例部分响应(PR)，并且与同种型对照相比在所有小鼠中表现出肿瘤生长的全面减少。
接下来，使用B16F10黑素瘤癌细胞模型试验了单独的和与其他癌症治疗相组合的唾液酸酶治疗。将每只小鼠在右下胁区域中用0.1mL PBS中的5x105个肿瘤细胞皮下接种，以诱导肿瘤发生。当平均肿瘤尺寸达到大约50mm3时，将小鼠随机分组。将24只小鼠随机分派到3个研究组。将小鼠每周两次用10mg/kg的M106、抗小鼠PD-1抗体或同种型对照给药共5剂。图24描绘了在同种型对照组(图24A)、M106组(图24B)或抗PD-1组(图24C)中每只小鼠的肿瘤生长。图24D是同种型对照组在M106组上的叠加图，证实了在被认为是难以治疗的肿瘤模型中M106在减小肿瘤生长方面的明显益处。
接下来，使用作为多克隆细胞系的表达人类Her2的细胞系EMT6试验了单独的和与其他癌症治疗相组合的唾液酸酶治疗。将每只小鼠在右下胁区域中用0.1mL PBS中的5x105个肿瘤细胞皮下接种，以诱导肿瘤发生。当平均肿瘤尺寸达到大约100mm3时，将小鼠随机分组。将16只小鼠随机分派到2个研究组。将小鼠每周两次用10mg/kg的M106或同种型对照给药共5剂。图25描绘了在同种型对照组(图25A)或M106 FC组(图25B)中每只小鼠的肿瘤生长。8只M106治疗的小鼠中的4只表现出肿瘤生长的完全缓解(CR)，与此相比在同种型治疗组中8只小鼠中仅有1只表现出完全缓解。
因此，正如在本实施例中证实的，在各种不同的癌症类型中，用本文公开的唾液酸酶治疗导致癌症生长的减小，并在某些情况下导致完全缓解。
实施例13：单独的或与抗PD-L1抗体相组合的唾液酸酶治疗导致肿瘤生长的完全 和部分缓解
本实施例描述了M106和/或阿维单抗(抗PD-L1抗体)在A20同基因小鼠模型中的体内试验。小鼠A20细胞表达内源小鼠PD-L1，其被阿维单抗结合。将5-6周龄的雌性Balb/c小鼠在右下胁区域中用基质胶中的鼠类A20 B细胞淋巴瘤细胞(1:1体积比)皮下接种。当肿瘤达到大约100mm3(每组的平均肿瘤体积在86至90mm3的范围内)时，将小鼠随机分派到8只小鼠的组中。表15描述了所述研究的各个不同臂。将小鼠每周两次用5或10mg/kg M106、阿维单抗和/或抗体同种型对照(正如所指示的)腹膜内治疗共5剂。每周三次记录肿瘤体积和体重。
表15
Figure BDA0003508968760001021
图26描绘了每个组中每只小鼠的肿瘤生长。示出了每个组的完全响应者(CR)和部分响应者(PR)。正如可以看到的，单独的和与阿维单抗(“Ave”)组合的M106表现出抗肿瘤活性。
将从M106治疗组(单独的或与阿维单抗组合的)表现出CR的带有肿瘤的小鼠分组，用鼠类A20细胞重新激惹(均为大约12周龄)，并与用A20细胞注射的6或12周龄的幼稚对照小鼠进行比较。每周三次记录肿瘤体积和体重。正如预期的，在6周和12周的幼稚小鼠中肿瘤均生长，在重新激惹的小鼠中没有观察到肿瘤生长(数据未示出)。
因此，正如在本实施例中证实的，在B细胞淋巴瘤模型中，用本文公开的唾液酸酶治疗导致肿瘤生长的减少，并在某些情况下导致完全缓解。
实施例14：单独的或与抗PD-L1抗体组合的唾液酸酶治疗导致肿瘤生长的完全和 部分缓解
本实施例描述了M106和/或阿维单抗(抗PD-L1抗体)在A20同基因小鼠模型中的体内试验。除了给药6剂(每周两次共3周)之外，实验如实施例13中所述进行。表16描述了所述研究的各个不同臂。将小鼠每周两次用10mg/kg M106、阿维单抗和/或抗体同种型对照腹膜内治疗共6剂。每周三次记录肿瘤体积和体重。
表16
Figure BDA0003508968760001031
图27描绘了每个组中每只小鼠的肿瘤生长结果。基于阿维单抗的ASC表现出不同的效能程度。与实施例13中相同，M106表现出与M106和阿维单抗的组合相同的活性。
因此，正如在本实施例中证实的，在B细胞淋巴瘤模型中，单独的或与抗PD-L1抗体组合的使用本文公开的唾液酸酶的治疗导致肿瘤生长的减少，并在某些情况下导致完全缓解。
实施例15：在带有肿瘤的小鼠中与抗CD20抗体组合的唾液酸酶治疗导致存活率提 高
本实施例描述了在使用表达人类CD20(EL4 CD20细胞)的鼠类乳腺癌细胞系的小鼠同基因静脉内散布模型中，与抗CD20抗体(奥法木单抗)相组合的M106的体内给药。将6-8周龄的雌性C57/BL6小鼠用每只小鼠500,000个细胞IV注射。随后如表17中所述将小鼠用同种型对照、奥法木单抗或奥法木单抗与M106的组合给药。每天记录体重和临床观察。
表17
Figure BDA0003508968760001041
图28描绘了每个组中小鼠的存活曲线。图28A描绘了截至第28天的存活率，图28B描绘了总体存活率(截至第41天)。与同种型对照相比，用奥法木单抗治疗的小鼠表现出存活期迁移，其中50％存活率的点从17天迁移到24天。用奥法木单抗和M106的组合治疗的小鼠表现出甚至更大的存活期迁移，迁移到30天。
因此，本实施例显示，在用抗CD20抗体治疗的小鼠中，用本发明的唾液酸酶治疗导致存活率提高。
实施例16：唾液酸酶处理破坏T细胞上的Siglec-15活性
Siglec-15是一种重要的免疫抑制剂。在正常情况下Siglec-15仅在某些髓系细胞上表达，但在人类癌细胞和肿瘤浸润性髓系细胞上被广泛上调。Siglec-15充当配体并在体外和体内抑制抗原特异性T细胞应答。Siglec-15的遗传消融或抗体阻断提高肿瘤微环境(TME)中的抗肿瘤免疫力，并在某些小鼠模型中抑制肿瘤生长。
本实施例证实了神经氨酸酶处理除去Siglec-15配体，从而破坏Siglec-15结合活性。据信在体内Siglec-15结合活性的破坏将会导致TME中抗肿瘤免疫力的提高并抑制肿瘤生长。
将人类PBMC融化，并用完全RPMI培养基(增补有10％热失活FBS、非必需氨基酸和丙酮酸钠)中的终浓度为1μg/mL的抗CD3(OKT3克隆)和抗CD28(克隆CD28.2)抗体(均来自于eBiosciences,Thermo Fisher Scientific)刺激。第2天，收集漂浮的细胞并在新鲜的完全RPMI培养基中重新铺板，补充1μg/mL的抗CD3和抗CD28抗体，以继续刺激细胞。另外3天后，将细胞以106/ml的密度重新接种在15mL锥形管中，并用如下所述的不同组处理：(1)无处理；(2)终浓度为50μg/mL的失去功能的唾液酸酶(“LOF FC”，如前面的实施例中所述)；(3)终浓度为50μg/mL的M106；和(4)终浓度为2μg/mL的BiNanH2。BiNanH2是来自于婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)的强力唾液酸酶，其被用作阳性对照。
向细胞添加抗CD3和抗CD28抗体，并在37℃温箱中温育过夜。第二天(～14小时后)，将细胞离心下来，除去培养基，然后将细胞用PBS中的人类TruStain FcX Fc受体阻断剂(
Figure BDA0003508968760001051
)和LIVE/DEADTM可固定近红外死细胞染色剂阻断。然后将细胞用热失活人血清(5％，在PBS中)阻断。
将细胞用终浓度为1μM/100μg/mL的人类Siglec-15-Fc(由PalleonPharmaceuticals制备；MW：～100KDa)染色。将细胞在冰上温育15分钟，然后用PBS清洗。
接下来，将细胞用FACS染色缓冲液中的抗人类Fc-AF647抗体染色。将细胞在冰上温育5分钟，然后清洗。
然后，如较早的实施例中所述，将细胞在FACS染色缓冲液中对CD4和CD8标志物进行染色。将细胞在冰上温育15分钟，然后清洗。将细胞固定，在流式细胞仪(BDFACSCelestaTM(BD Biosciences))上运行并分析数据。
图29描绘了在各种不同处理后CD4+细胞(图29A)和CD8+细胞(图29B)的Siglec-15-Fc染色结果。还示出了作为对照的同种型IgG1染色。正如所示，与无处理或用LOF FC处理相比用，用M106 FC或BiNaNH2(阳性对照)处理活化的CD4和CD8细胞降低Siglec-15-Fc染色。图30描绘了使用来自于第二个健康供体的PBMC的CD4+细胞(图30A)和CD8+细胞(图30B)的Siglec-15-Fc染色结果。这些结果证实，Siglec-15与活化的T细胞的结合是唾液酸依赖性的，并且通过神经氨酸酶除去唾液酸破坏了这种相互作用。
因此，本实施例证实了使用本发明的唾液酸酶的神经氨酸酶处理除去了Siglec-15配体，从而破坏了Siglec-15的结合活性。据信在体内Siglec-15结合活性的破坏将会导致TME中抗肿瘤免疫力的提高并抑制肿瘤生长。
通过引用并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部内容为所有目的通过引用并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定方式体现，而不背离其精神或本质特征。因此，上述实施方式在所有情况下应该被当作是说明性的，而不是对本文描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由上述描述指明，并打算将在权利要求书的等同性意义和范围之内的所有变化涵盖在其中。
序列表
Figure BDA0003508968760001061
Figure BDA0003508968760001071
Figure BDA0003508968760001081
Figure BDA0003508968760001091
Figure BDA0003508968760001101
Figure BDA0003508968760001111
Figure BDA0003508968760001121
Figure BDA0003508968760001131
Figure BDA0003508968760001141
Figure BDA0003508968760001151
Figure BDA0003508968760001161
Figure BDA0003508968760001171
Figure BDA0003508968760001181
Figure BDA0003508968760001191
Figure BDA0003508968760001201
Figure BDA0003508968760001211
Figure BDA0003508968760001221
Figure BDA0003508968760001231
Figure BDA0003508968760001241
Figure BDA0003508968760001251
Figure BDA0003508968760001261
Figure BDA0003508968760001271
Figure BDA0003508968760001281
Figure BDA0003508968760001291
Figure BDA0003508968760001301
Figure BDA0003508968760001311
Figure BDA0003508968760001321
Figure BDA0003508968760001331
Figure BDA0003508968760001341
Figure BDA0003508968760001351
Figure BDA0003508968760001361
Figure BDA0003508968760001371
Figure BDA0003508968760001381
Figure BDA0003508968760001391
Figure BDA0003508968760001401
Figure BDA0003508968760001411
Figure BDA0003508968760001421
Figure BDA0003508968760001431
Figure BDA0003508968760001441
Figure BDA0003508968760001451
Figure BDA0003508968760001461
Figure BDA0003508968760001471
Figure BDA0003508968760001481
Figure BDA0003508968760001491
Figure BDA0003508968760001501

Claims (78)

1.一种药物组合物，其包含与在给药到受试者时增加唾液酸酶的血清半衰期的血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶不与结合与癌细胞相关的癌抗原的癌抗原靶向剂偶联。
3.权利要求1-2所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶是全长唾液酸酶的功能性片段，其表现出所述全长唾液酸酶的至少50％的活性。
4.权利要求1-3中的任一项所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶是表现出野生型唾液酸酶的至少50％的活性的变体。
5.权利要求1-4中的任一项所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂在融合蛋白中共价连接在一起。
6.权利要求1-4中的任一项所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂被化学偶联在一起。
7.权利要求1-6所述的药物组合物，其中所述血清半衰期增强剂选自Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、XTEN、氨基酸均聚物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)、白蛋白结合结构域、CTP融合体、GLK融合体和聚乙二醇。
8.权利要求1-7所述的药物组合物，其中所述血清半衰期增强剂是Fc结构域。
9.权利要求1-7所述的药物组合物，其中所述血清半衰期增强剂不是Fc结构域或聚乙二醇。
10.权利要求1-9所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶相对于模板野生型唾液酸酶包含一个或多个突变。
11.权利要求1-10所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；
(b)在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；或
(d)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
或任何上述替换的组合。
12.权利要求11所述的药物组合物，其中在所述唾液酸酶中：
(a)所述对应于野生型人Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸替换(M1A)或被天冬氨酸替换(M1D)；
(b)所述对应于野生型人Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸替换(V6Y)；
(c)所述对应于野生型人Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸替换(I187K)；或
(d)所述对应于野生型人Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸替换(C332A)；
或者所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
13.权利要求1-11所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；
(b)在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(d)在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(e)在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；
(f)在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(g)在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；
(h)在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(i)在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(j)在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(k)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
(l)或任何上述替换的组合。
14.任何前述权利要求所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶包含选自下述的替换组合：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、C332A；
(b)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R、C332A；
(c)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A；
(d)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、C332A；和
(e)A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A。
15.权利要求14所述的药物组合物，其中所述与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶包含选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
16.任何前述权利要求所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；
(b)在对应于野生型人Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；
(d)在对应于野生型人Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；
(e)在对应于野生型人Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；
(f)在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(g)在对应于野生型人Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；
(h)在对应于野生型人Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；
(i)在对应于野生型人Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；
(j)在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(k)在对应于野生型人Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；
(l)在对应于野生型人Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；
(m)在对应于野生型人Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；
(n)在对应于野生型人Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；
(o)在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(p)在对应于野生型人Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；
(q)在对应于野生型人Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；
(r)在对应于野生型人Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；
(s)在对应于野生型人Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；
(t)在对应于野生型人Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；
(u)在对应于野生型人Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；
(v)在对应于野生型人Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；
(w)在对应于野生型人Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；
(x)在对应于野生型人Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；
(y)在对应于野生型人Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；
(z)在对应于野生型人Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；
(aa)在对应于野生型人Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；
(bb)在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；
(cc)在对应于野生型人Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；
(dd)在对应于野生型人Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；
(ee)在对应于野生型人Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；
(ff)在对应于野生型人Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；
(gg)在对应于野生型人Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；
(hh)在对应于野生型人Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；
(ii)在对应于野生型人Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；
(jj)在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(kk)在对应于野生型人Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；
(ll)在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(mm)在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(nn)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
(oo)在对应于野生型人Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或
(pp)在对应于野生型人Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；
或任何上述替换的组合。
17.权利要求1-16所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶选自细菌唾液酸酶、病毒唾液酸酶和哺乳动物唾液酸酶。
18.权利要求17所述的药物组合物，其中所述哺乳动物唾液酸酶是人唾液酸酶。
19.权利要求18所述的药物组合物，其中所述人唾液酸酶选自neu1、neu2、neu3和neu4。
20.权利要求19所述的药物组合物，其中所述人唾液酸酶是neu2。
21.权利要求1-20中的任一项所述的药物组合物，其包含约0.01mg/kg至约100mg/kg的所述唾液酸酶。
22.权利要求1-21中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含第二治疗剂。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗炎药剂、抗血管生成药剂、抗纤维化药剂或抗增殖化合物(例如细胞毒性药剂或检查点抑制剂)。
24.权利要求1-23中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含起稳定作用量的唾液酸酶稳定剂。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述唾液酸酶稳定剂是阳离子。
26.权利要求25所述的药物组合物，其中所述阳离子选自钙和镁。
27.权利要求1-26中的任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被安置在无菌容器(例如瓶或小管)中。
28.权利要求27所述的药物组合物，其中所述药物组合物被冷冻干燥在所述无菌容器中。
29.权利要求28所述的药物组合物，其中所述药物组合物作为溶液存在于所述无菌容器中。
30.权利要求27-29中的任一项所述的药物组合物，其中所述无菌容器用隔膜密封。
31.权利要求27-30中的任一项所述的药物组合物，其中所述无菌容器具有安置在其上的识别包含在所述容器中的药物组合物的标签。
32.一种在需要的受试者中治疗唾液酸相关障碍的方法，所述方法包括向所述受试者给药包含有效量的唾液酸酶和给药到受试者时增加所述唾液酸酶的血清半衰期的血清半衰期增强剂的药物组合物，从而治疗所述障碍。
33.权利要求32所述的方法，其中所述唾液酸相关障碍是癌症。
34.权利要求33所述的方法，其中所述唾液酸酶不与结合与癌细胞相关的癌抗原的癌抗原靶向剂偶联。
35.权利要求32-34中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶是全长唾液酸酶的功能性片段，其表现出所述全长唾液酸酶的至少50％的活性。
36.权利要求32-35中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶是表现出野生型唾液酸酶的至少50％的活性的变体。
37.权利要求32-36中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂在融合蛋白中共价连接在一起。
38.权利要求32-36中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶和血清半衰期增强剂被化学偶联在一起。
39.权利要求32-37中的任一项所述的方法，其中所述血清半衰期增强剂选自Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、XTEN、氨基酸均聚物(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)、弹性蛋白样肽(ELP)和聚乙二醇。
40.权利要求32-39中的任一项所述的方法，其中所述血清半衰期增强剂是Fc结构域。
41.权利要求32-39中的任一项所述的方法，其中所述血清半衰期增强剂不是Fc结构域或聚乙二醇。
42.权利要求32-41中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶相对于模板野生型唾液酸酶包含一个或多个突变。
43.权利要求32-42中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；
(b)在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；或
(d)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
或任何上述替换的组合。
44.权利要求43所述的方法，其中在所述唾液酸酶中：
(a)所述对应于野生型人Neu2的第1位的位置处的甲硫氨酸残基被缺失(ΔM1)、被丙氨酸替换(M1A)或被天冬氨酸替换(M1D)；
(b)所述对应于野生型人Neu2的第6位的位置处的缬氨酸残基被酪氨酸替换(V6Y)；
(c)所述对应于野生型人Neu2的第187位的位置处的异亮氨酸残基被赖氨酸替换(I187K)；或
(d)所述对应于野生型人Neu2的第332位的位置处的半胱氨酸残基被丙氨酸替换(C332A)；
或者所述唾液酸酶包含任何上述替换的组合。
45.权利要求32-44中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第1位的位置处甲硫氨酸残基(M1)的替换或缺失；
(b)在对应于野生型人Neu2的第6位的位置处缬氨酸残基(V6)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(d)在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(e)在对应于野生型人Neu2的第187位的位置处异亮氨酸残基(I187)的替换；
(f)在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(g)在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；
(h)在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(i)在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(j)在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(k)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
(l)或任何上述替换的组合。
46.权利要求32-45中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶包含选自下述的替换组合：
(a)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、C332A；
(b)M1D、V6Y、P62G、A93E、I187K、S301A、W302R、C332A；
(c)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A；
(d)M1D、V6Y、P62G、A93E、Q126Y、I187K、C332A；和
(e)A93E、Q126Y、I187K、A242F、Q270T、C332A。
47.权利要求46所述的方法，其中所述与血清半衰期增强剂偶联的唾液酸酶包含选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：115、152、180、184和188的氨基酸序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
48.权利要求32-47中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的替换；
(b)在对应于野生型人Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的替换；
(c)在对应于野生型人Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的替换；
(d)在对应于野生型人Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的替换；
(e)在对应于野生型人Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的替换；
(f)在对应于野生型人Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的替换；
(g)在对应于野生型人Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的替换；
(h)在对应于野生型人Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的替换；
(i)在对应于野生型人Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的替换；
(j)在对应于野生型人Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的替换；
(k)在对应于野生型人Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的替换；
(l)在对应于野生型人Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的替换；
(m)在对应于野生型人Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的替换；
(n)在对应于野生型人Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的替换；
(o)在对应于野生型人Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的替换；
(p)在对应于野生型人Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的替换；
(q)在对应于野生型人Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的替换；
(r)在对应于野生型人Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的替换；
(s)在对应于野生型人Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的替换；
(t)在对应于野生型人Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的替换；
(u)在对应于野生型人Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的替换；
(v)在对应于野生型人Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的替换；
(w)在对应于野生型人Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的替换；
(x)在对应于野生型人Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的替换；
(y)在对应于野生型人Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的替换；
(z)在对应于野生型人Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的替换；
(aa)在对应于野生型人Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的替换；
(bb)在对应于野生型人Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的替换；
(cc)在对应于野生型人Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的替换；
(dd)在对应于野生型人Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的替换；
(ee)在对应于野生型人Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的替换；
(ff)在对应于野生型人Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的替换；
(gg)在对应于野生型人Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的替换；
(hh)在对应于野生型人Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的替换；
(ii)在对应于野生型人Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的替换；
(jj)在对应于野生型人Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的替换；
(kk)在对应于野生型人Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的替换；
(ll)在对应于野生型人Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的替换；
(mm)在对应于野生型人Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的替换；
(nn)在对应于野生型人Neu2的第332位的位置处半胱氨酸残基(C332)的替换；
(oo)在对应于野生型人Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的替换；或
(pp)在对应于野生型人Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的替换；
或任何上述替换的组合。
49.权利要求32-48中的任一项所述的方法，其中所述唾液酸酶选自细菌唾液酸酶、病毒唾液酸酶和哺乳动物唾液酸酶。
50.权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物唾液酸酶是人唾液酸酶。
51.权利要求50所述的方法，其中所述人唾液酸酶选自neu1、neu2、neu3和neu4。
52.权利要求51所述的方法，其中所述人唾液酸酶是neu2。
53.权利要求32-52中的任一项所述的方法，其中将约0.01mg/kg至约100mg/kg的所述唾液酸酶给药到所述受试者。
54.权利要求32-53中的任一项所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系肿瘤或转移性病变。
55.权利要求54所述的方法，其中所述实体肿瘤是肉瘤、腺癌或癌。
56.权利要求54或55所述的方法，其中所述实体肿瘤是头颈部(例如咽)、甲状腺、肺(例如小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴、胃肠道(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖或泌尿生殖道(例如肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞，例如神经母细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑色素瘤)肿瘤。
57.权利要求56所述的方法，其中所述造血系肿瘤是白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓系白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转移CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或Richter’s综合征(Richter’s转化)。
58.权利要求56所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
59.权利要求56所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
60.权利要求32-59中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物的给药提高所述受试者中颗粒酶B、IFNγ、IL-10、IL-6或IL-17A的表达。
61.权利要求32-60中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物与另一种治疗剂联合给药到所述受试者。
62.权利要求61所述的方法，其中所述治疗剂选自抗炎药剂、抗血管生成药剂、抗纤维化药剂或抗增殖化合物(例如细胞毒性药剂或检查点抑制剂)。
63.权利要求32-62中的任一项所述的方法，其中所述药物组合物还包含起稳定作用量的唾液酸酶稳定剂。
64.权利要求63所述的方法，其中所述唾液酸酶稳定剂是阳离子。
65.权利要求64所述的方法，其中所述阳离子选自钙和镁。
66.权利要求65所述的方法，其中所述药物组合物在给药之前被安置在无菌容器(例如瓶或小管)中。
67.一种在需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-31中的任一项所述的药物组合物。
68.一种从受试者中的细胞除去唾液酸的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-31中的任一项所述的药物组合物，从而从所述细胞除去唾液酸。
69.权利要求68所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞、树突状细胞(DC)或单核细胞。
70.权利要求69所述的方法，其中所述细胞是单核细胞，并且所述方法导致所述单核细胞上MHC-II分子的表达提高。
71.一种在受试者中提高肿瘤细胞的吞噬作用的方法，所述方法包括以有效地从所述肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者给药有效量的权利要求1-31中的任一项所述的药物组合物，从而提高所述肿瘤细胞的吞噬作用。
72.一种在受试者中活化树突状细胞(DC)的方法，所述方法包括以有效地从所述受试者中的肿瘤细胞除去唾液酸的量向所述受试者给药权利要求1-31中的任一项所述的药物组合物，从而在所述受试者中活化所述DC。
73.一种降低Siglec-15结合活性，从而提高患者的肿瘤微环境中的抗肿瘤活性的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的权利要求1-31中的任一项所述的药物组合物，从而在所述受试者中提高抗肿瘤活性(例如T细胞活性)。
74.一种表达重组唾液酸酶的方法，所述方法包括：
(a)提供包含编码所述重组唾液酸酶的核酸的细胞；和
(b)在稳定剂存在下表达所述重组唾液酸酶。
75.权利要求74所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述在步骤(b)中产生的重组唾液酸酶。
76.权利要求75所述的方法，其中所述纯化在稳定剂存在下进行。
77.权利要求74-76中的任一项所述的方法，其中所述稳定剂是阳离子。
78.权利要求77所述的方法，其中所述阳离子选自钙和镁。
CN202080058195.9A 2019-07-03 2020-07-03 重组唾液酸酶及其使用方法 Pending CN114269937A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962870336P 2019-07-03 2019-07-03
US62/870,336 2019-07-03
US202062957027P 2020-01-03 2020-01-03
US62/957,027 2020-01-03
PCT/US2020/040827 WO2021003468A2 (en) 2019-07-03 2020-07-03 Recombinant sialidases and methods of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114269937A true CN114269937A (zh) 2022-04-01

Family

ID=74100201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080058195.9A Pending CN114269937A (zh) 2019-07-03 2020-07-03 重组唾液酸酶及其使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220362351A1 (zh)
EP (1) EP3994271A4 (zh)
JP (1) JP2022538895A (zh)
KR (1) KR20220034812A (zh)
CN (1) CN114269937A (zh)
AU (1) AU2020300680A1 (zh)
BR (1) BR112021026852A2 (zh)
CA (1) CA3145772A1 (zh)
IL (1) IL289431A (zh)
MX (1) MX2022000032A (zh)
WO (1) WO2021003468A2 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3087529A1 (en) 2018-01-03 2019-07-11 Palleon Pharmaceuticals Inc. Recombinant human sialidases, sialidase fusion proteins, and methods of using the same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8512710B2 (en) * 2002-11-22 2013-08-20 Ansun Biopharma, Inc. Class of therapeutic protein based molecules
WO2017123745A1 (en) * 2016-01-12 2017-07-20 Palleon Pharma Inc. Use of siglec-7 or siglec-9 antibodies for the treatment of cancer
DK3478314T3 (da) * 2016-07-01 2023-06-19 Univ Leland Stanford Junior Konjugater til målrettet celleoverflade-editering
CA3087529A1 (en) * 2018-01-03 2019-07-11 Palleon Pharmaceuticals Inc. Recombinant human sialidases, sialidase fusion proteins, and methods of using the same
EP3906096A4 (en) * 2019-01-03 2023-03-01 Palleon Pharmaceuticals Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER WITH IMMUNE CELLS
AU2020301037A1 (en) * 2019-07-03 2022-02-03 Palleon Pharmaceuticals Inc. Recombinant human sialidases, sialidase fusion proteins, and methods of using the same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021003468A3 (en) 2021-02-11
EP3994271A4 (en) 2023-07-19
EP3994271A2 (en) 2022-05-11
US20220362351A1 (en) 2022-11-17
WO2021003468A2 (en) 2021-01-07
KR20220034812A (ko) 2022-03-18
IL289431A (en) 2022-02-01
BR112021026852A2 (pt) 2022-02-22
MX2022000032A (es) 2022-06-15
CA3145772A1 (en) 2021-01-07
JP2022538895A (ja) 2022-09-06
AU2020300680A1 (en) 2022-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112135904A (zh) 重组人唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法
CN114258431A (zh) 重组人唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法
US20220089772A1 (en) Anti-glyco-muc1 antibodies and their uses
CN114302897A (zh) 唾液酸酶-her2抗体融合蛋白及其使用方法
CN114269937A (zh) 重组唾液酸酶及其使用方法
US20220372458A1 (en) Sialidase-pd-l1-antibody fusion proteins and methods of use thereof
WO2023202035A1 (zh) 受体偏向的peg化il-2变体组合及其应用
CN115803047A (zh) 具有降低的蛋白酶敏感性的重组唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法
US20220380742A1 (en) Sialidase-cd20-antibody fusion proteins and methods of use thereof
CN116867896A (zh) 唾液酸酶-pd-1抗体融合蛋白及其使用方法
KR102608763B1 (ko) 항-글리코-muc1 항체 및 이의 용도
CN116940675A (zh) 唾液酸酶-her2-抗体融合蛋白及其使用方法
CN116829188A (zh) 抗pd-l1抗体及其融合蛋白
US20240059792A1 (en) Sialidase-her2-antibody fusion proteins and methods of use thereof
JP2024517130A (ja) グリア芽腫を治療するための方法および組成物
CN116507633A (zh) 糖基化il-2蛋白及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination