CN116723851A - 白介素-18变体和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了包含稳定化的IL‑18多肽的组合物和方法，其用于在治疗性和非治疗性应用中使用。在一些情况下，所述稳定化的IL‑18蛋白即使在存在抑制性分子诸如IL‑18BP的情况下也提供IL‑18信号传导活性。还提供了施用方法和用于制备活性多肽的方法。
Description
交叉引用
本申请要求2020年11月2日提交的美国临时申请号63/108,794的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术
白介素18(IL-18)是一种可以刺激T细胞、NK细胞和髓系细胞的促炎性细胞因子。鉴于它刺激抗肿瘤免疫细胞的能力，IL-18被提议作为用于治疗癌症的免疫治疗剂。然而，IL-18的临床功效有限。
因此，需要提供有效的IL-18信号传导活性以治疗和预防癌症和其他疾病和病症的组合物和方法。本公开满足了这些需要。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地且单独地指示通过引用并入。
序列表的援引并入
同此提供呈文本文件“SMCH-003PRV_SeqList_ST25.txt”的序列表，其创建于2020年11月2日并且大小为277KB。文本文件的内容以引用的方式整体并入本文。
发明内容
提供了包含变体(例如，稳定化的)IL-18多肽的组合物。稳定化的IL-18多肽是包含‘稳定化突变’的IL-18多肽，所述突变是相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)的两个半胱氨酸残基(C38和C68)的突变。令人惊讶的是，发现这两个氨基酸的突变与半胱氨酸突变的所有其他可能的组合相比更好地稳定IL-18，参见例如下文的工作实施例。在一些情况下，突变是C至S取代，并且因此在一些情况下，稳定化的IL-18多肽可以相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)包含突变C38S和C68S(在本文中也称为“突变对C38S/C68S”)。然而，在一些情况下，C68的突变导致免疫原性表位。因此，在一些实施方案中，在C68处的突变是非免疫原性取代。在一些此类情况下，突变是C68至G、A、V、D、E或N突变(在一些情况下，C68至G、A、D或N)。因此，在一些此类情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。
在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68D。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68G。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68A。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68S。
在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽是稳定化的IL-18变体多肽，即，包含稳定化突变(即，相对于人野生型IL-18的在位置C38和C68处的突变)的IL-18变体多肽。在一些此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽是稳定化的“诱饵抗性”(DR)IL-18变体，并且在其他此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽是稳定化的“诱饵-诱饵”(D2D)IL-18变体。在一些实施方案中，稳定化的IL-18变体多肽对IL-18BP的结合亲和力小于0.6nM。
在一些实施方案中，主题稳定化的IL-18多肽与具有不同序列的IL-18多肽相比表现出更高的稳定性，其中所述更高的稳定性导致在暴露于稳定性测定之后较少的二聚体、多聚体、聚集体和/或降解产物形成。在一些实施方案中，主题稳定化的IL-18多肽的稳定性高于野生型IL-18多肽。在一些实施方案中，更高的稳定性通过货架期稳定性进行测量。在一些实施方案中，更高的稳定性通过使修饰的IL-18多肽或本文所公开的包含修饰的IL-18多肽的制剂经受冻-融循环来确定。在一些实施方案中，更高的稳定性通过使稳定化的IL-18变体多肽经受搅拌来测量。
DR IL-18变体是这样的IL-18的变体/突变体，其结合IL-18受体(IL-18R)，从而诱导/增强/刺激IL-18信号传导活性，但是表现出与抑制性IL-18结合蛋白(IL-18BP)的结合减少(在一些情况下，几乎无结合)(相对于WT IL-18与IL-18BP的结合)。因此，DR IL-18变体是对IL-18BP的抑制具有抗性的IL-18R激动剂。人DR IL-18变体的实例包括但不限于SEQID NO:34-59、73-91和191-193所示的那些。小鼠DR IL-18变体的实例包括但不限于SEQ IDNO:60-72所示的那些。
D2D IL-18变体是这样的IL-18的变体/突变体，其结合IL-18BP，但是表现出与IL-18R的结合减少(在一些情况下，几乎无结合)(相对于WT IL-18与IL-18R的结合)。因此，D2DIL-18变体结合IL-18BP，从而拮抗IL-18BP对IL-18的作用。因此，D2D IL-18变体可用于增加通过IL-18R的信号传导，因为它们通过抑制抑制剂来起作用。人D2D IL-18变体的实例包括但不限于SEQ ID NO:92-125所示的那些。小鼠D2D IL-18变体的实例包括但不限于SEQID NO:126-190所示的那些。
在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含在氨基酸位置M51(例如，M51E、M51R、M51K、M51T、M51D或M51N)、K53(例如，K53G、K53S、K53T或K53R)、Q56(例如，Q56G、Q56R、Q56L、Q56E、Q56A、Q56V或Q56K)、D110(例如，D110S、D110N、D110G、D110K、D110H、D110Q或D110E)和N111(例如，N111G、N111R、N111S、N111D、N111H或N111Y)处的突变以及在位置C38(例如，C38S)和C68(例如，C68S、C68G、C68A、C68V、C68D、C68E或C68N)处的稳定化突变(例如，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N)(相对于人野生型IL-18，SEQ ID NO:30)。在一些此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽额外包含在氨基酸位置S105处的突变(例如，S105D、S105A、S105N、S105R、S105D或S105K)；并且在一些情况下，还包含在氨基酸位置P57(例如，P57A、P57L、P57G或P57K)和M60(例如，M60L、M60R、M60K或M60Q)处的突变。
在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含在氨基酸位置M51(例如，M51E、M51R、M51K、M51T、M51D或M51N)、K53(例如，K53G、K53S、K53T或K53R)、Q56(例如，Q56G、Q56R、Q56L、Q56E、Q56A、Q56V或Q56K)、D110(例如，D110S、D110N、D110G、D110K、D110H、D110Q或D110E)和N111(例如，N111G、N111R、N111S、N111D、N111H或N111Y)处的突变以及选自以下的稳定化突变对：C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D和C38S/C68N(相对于人野生型IL-18，SEQ ID NO:30)。在一些此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽额外包含在氨基酸位置S105处的突变(例如，S105D、S105A、S105N、S105R、S105D或S105K)；并且在一些情况下，还包含在氨基酸位置P57(例如，P57A、P57L、P57G或P57K)和M60(例如，M60L、M60R、M60K或M60Q)处的突变。
在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含在氨基酸位置M51(例如，M51E、M51R、M51K、M51T、M51D或M51N)、K53(例如，K53G、K53S、K53T或K53R)、Q56(例如，Q56G、Q56R、Q56L、Q56E、Q56A、Q56V或Q56K)、D110(例如，D110S、D110N、D110G、D110K、D110H、D110Q或D110E)和N111(例如，N111G、N111R、N111S、N111D、N111H或N111Y)处的突变以及选自以下的稳定化突变对：C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D和C38S/C68N(相对于人野生型IL-18，SEQID NO:30)。在一些此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽额外包含在氨基酸位置S105处的突变(例如，S105D、S105A、S105N、S105R、S105D或S105K)；并且在一些情况下，还包含在氨基酸位置P57(例如，P57A、P57L、P57G或P57K)和M60(例如，M60L、M60R、M60K或M60Q)处的突变。
在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含与SEQ ID NO:6和16-21中的任一个所示的氨基酸序列具有85％或更多同一性的氨基酸序列。在一些情况下，稳定化的DRIL-18变体多肽包含SEQ ID NO:6和16-21中的任一个所示的氨基酸序列。
在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含与SEQ ID NO:6、16、17、19和21中的任一个所示的氨基酸序列具有85％或更多同一性的氨基酸序列。在一些情况下，稳定化的DR IL-18变体多肽包含SEQ ID NO:6、16、17、19和21中的任一个所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，将稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)用于疾病或病症的治疗。在各种实施方案中，疾病或病症是癌症或感染性疾病，诸如编码IL-18BP直向同源基因(ortholog)的痘病毒；代谢疾病或病症(包括肥胖症和糖尿病)；或黄斑变性(例如，湿性黄斑变性，例如，湿性年龄相关黄斑变性，例如，IL-18蛋白可以用作抗血管生成剂，作为说明性实例，在一些情况下，稳定化的IL-18蛋白可减弱脉络膜新生血管形成)。因此，所提供的方法包括施用稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)以治疗疾病或病症，诸如但不限于癌症、或感染性疾病、代谢疾病或病症、或黄斑变性(例如，湿性黄斑变性，诸如，湿性年龄相关黄斑变性)。
在一些实施方案中，方法包括向有需要的对象施用包含稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)的组合物。在一些实施方案中，方法包括向有需要的对象施用包含稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)和额外剂的组合物。在一些此类实施方案中，额外剂包括免疫治疗剂，例如，改变的免疫细胞(例如，T细胞，诸如嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、武装的(armored)CAR-T细胞；NK细胞，诸如CAR-NK；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR-T细胞等等)、病毒、抗原、疫苗、抗体、免疫检查点抑制剂、小分子、化疗剂、干细胞等等。在一些实施方案中，稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)用于在被细菌、病毒或其他病原体感染之前、期间或之后增加免疫系统活性的方法。在一些实施方案中，稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体)用于在体外、体内或离体增加免疫细胞的数目和/或活性(诸如T细胞、NK细胞和/或髓系细胞的数目和/或活性)的方法。
主题多肽可以与免疫检查点抑制剂和/或肿瘤调理抗体组合或呈与它们的融合物来施用。主题多肽可以与细胞疗法(诸如，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、TCR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)疗法)组合施用。主题多肽还可以作为细胞疗法的一部分施用，例如，它可以是由细胞(例如，TRUCK细胞(“被重定向用于抗原无限制的细胞因子引发的杀伤的T细胞”)(其是CAR-T细胞、CAR-NK细胞、TIL细胞等的形式))分泌的蛋白质。
还提供了向个体施用IL-18多肽的方法，其中所述方法包括向个体施用IL-18多肽(例如，野生型IL-18或变体，诸如稳定化的、DR、D2D、稳定化的DR或稳定化的D2D IL-18变体)，其中施用频率为每周一次或更小。
还提供了用于产生IL-18多肽的方法和组合物。此类方法包括在细菌细胞的内部将外源性提供的融合蛋白与外源性提供的SUMO(小泛素样修饰物)蛋白酶接触，其中融合蛋白包括在N-末端与SUMO标签融合的感兴趣的多肽，其中在细菌细胞内，SUMO蛋白酶切割融合蛋白，从而从感兴趣的多肽去除SUMO标签。在一些情况下，感兴趣的多肽是IL-18多肽(例如，野生型人IL-18蛋白或IL-18变体，诸如稳定化的、DR、D2D、稳定化的DR或稳定化的D2D变体，参见例如上文所讨论的稳定化的和DR IL-18变体多肽)。
还提供了包含IL-18多肽(例如，野生型人IL-18蛋白或IL-18变体，诸如稳定化的、DR、D2D、稳定化的DR或稳定化的D2D变体，参见例如上文所讨论的稳定化的和DR IL-18变体多肽)的制剂。在一些情况下，除IL-18蛋白之外，制剂还包含：维持pH的缓冲剂(例如，在6.2与6.8之间，例如His/His-HCl)；糖(例如蔗糖，例如6-10％)；螯合剂(例如EDTA，例如0.05-1.5mM)；防止氧化的剂(例如，L-甲硫氨酸，例如，4-6mM)；和防止蛋白质吸收的剂(例如PS80，例如0.01-0.03％w/v)。
附图说明
结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施方案的以下详细描述。应当理解，本发明不限于图中所示的实施方案的精确布置和仪器。
图1A和图1B描绘了示例性实验的结果，说明IL-18通路是肿瘤免疫疗法的靶标。图1A提供一张图表，显示IL-18通路(包括IL-18及其受体亚基)在激活和功能失调的肿瘤T细胞程序中均被上调，如针对CD8+TIL中的细胞因子和受体的RNAseq表达分析所见。如图表中所见，与幼稚T细胞相比，基因被分配了“激活”和“功能失调”评分。标有菱形和黑色文本的数据点指示IL-18细胞因子、IL-18R1(Rα)和IL-18RAP(Rβ)。数据改编自Singer等人(Singer,M.等人,2016,Cell,166:1500-1511,e1509)。图1B提供以LCMV(左；CD4)或VSV-OVA(右；CD8)感染的结果。IL-18受体亚基IL-18Rα和IL-18Rβ是与长期抗原暴露相关联的基因表达程序的一部分，如以LCMV(左；CD4)或VSV-OVA(右；CD8)感染之后所见。数据来自ImmGen数据库。
图2A至图2C描绘了示例性实验的结果，说明IL-18BP具有“可溶性免疫检查点”的特征。图2A显示IL-18BP如何介导干扰素-γ(IFN-γ)驱动的IL-18负反馈，使人想起免疫检查点PD-L1。描绘了IL-18/IFN-γ/IL-18BP反馈回路的示意图。黑色箭头指示刺激，深灰色环形线指示抑制。图2B显示使用来自TCGA和Oncomine数据库的数据，IL-18BP在胃癌和乳腺癌中被上调。图2C说明PD-1和IL-18BP表达在大量乳腺癌和胃癌样品中密切相关(来自TCGA数据库)。分别为R＝0.78和0.65。
图3A至图3C描绘了示例性实验的结果，说明使用酵母展示，针对IL-18BP独立性工程化人IL-18变体。图3A提供结构导向的文库，所述文库被设计成将残基随机化在IL-18:IL-18BP界面上并且被引入到酵母展示系统中。酵母克隆使用磁性和荧光细胞分选进行选择，以实现与IL-18Rα的结合，并且针对IL-18BP对其进行反选择。图3B提供生成IL-18BP抗性IL-18变体的定向进化的总结。阳性选择条件是hIL18RαSA-珠子和hIL18Rα。反选择条件是单独的SA、hIL-18BP和nIL-18BP四聚体。图3C提供酵母展示的WT IL-18(左)或定向进化之后的变体(右)的流式细胞术分析。Y轴显示IL-18BP结合，x轴显示IL-18Rα结合。在5轮定向进化之后，剩余的克隆与IL-18BP相比更偏好IL-18Rα。
图4描绘了示例性实验的结果，说明对诱饵抗性人IL-18(“DR-IL-18”，也称为“DR-18”)变体的序列的总结。野生型人IL-18的成熟形式中每个突变的位置和对应的残基的位置指示在表的顶部。SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:58表示在用定向进化进行选择之后获得的序列。SEQ ID NO:34-SEQ ID NO:37是来源于选定序列中的共有序列。加阴影的残基表示观察到的五个最保守的突变。最上一行的序列(“WT hIL-18”)如SEQ ID NO:30所示。
图5A和图5B描绘了示例性实验的结果，说明人DR-IL-18变体的生物物理学表征。图5A提供关于酵母展示的DR-hIL-18变体的结合等温线。如图所示，酵母展示的DR-IL-18变体SEQ ID NO:34-37和SEQ ID NO:39能够结合hIL-18Rα，其结合等温线与WT人IL-18可比(左)。相比之下，以相同的变体和hIL-18BP观察到很少的结合(右)。图5B显示固定化生物素化的hIL-18BP与DR-IL-18变体之间的代表性表面等离子共振传感器(surface plasmonresonance sensor)图。重组的hIL-18(左)以极高的亲和力结合IL-18BP，KD＝2.0pM，而SEQID NO:34(右)显示衰减极大的结合，解离速率快得多并且KD＝15.2nM。此数据总结在表6和表7中。
图6A和图6B描绘了示例性实验的结果，说明人DR-IL-18变体不受IL-18BP的抑制。图6A提供了一个图表，显示重组的IL-18BP抑制生物素化的IL-18Rα结合酵母展示的WT IL-18，但不影响DR-IL-18变体SEQ ID NO:34-37和SEQ ID NO:39(示出于左边的图表中)。相比之下，IL-18BP有效地中和先前所述的IL-18E42A、K89A和E42A/K89A(Kim等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.,98(6):3304-3309)(示出于右边的图表中)(Kim等人的E42和K89分别是SEQ ID NO:30的E6和K53)。所有样品的生物素化的IL-18Rα保持在固定浓度100nM。图6B提供了HEK Blue IL-18信号传导测定的结果，显示WT IL-18以及SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37刺激IL-18HEK-Blue报告细胞，效力和功效是可比的(左)。野生型IL-18在此测定中对重组的IL-18BP的应用高度敏感(IC50＝3nM)，而SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:36不受重组的IL-18BP的抑制，即使在1μM的IL-18BP浓度下亦如此(右)。hIL-18保持在固定浓度5nM，并且SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:36保持在2.5nM。
图7A至图7C描绘了示例性实验的结果，说明使用酵母展示，针对IL-18BP独立性工程化额外的人IL-18变体(版本2变体)。图7A提供了2.0版本文库中随机化的人IL-18中位置的总结。针对每个位置都给出了简并密码子和编码的氨基酸的组。图7B提供了生成2.0版本IL-18BP抗性IL-18变体的定向进化的总结。阳性选择条件是hIL18RαSA-珠子和hIL18Rα。反选择条件是单独的SA、hIL-18BP和hIL-18BP四聚体。图7C提供了对产生2.0版本DR-IL-18变体中的进展的流式细胞术分析。第1轮、第4轮和第6轮之后获得的酵母同时用250nM IL-18BP链霉抗生物素蛋白-PE四聚体或100nM直接用AlexaFluor647标记的IL-18Rα染色。Y轴显示IL-18BP结合，x轴显示IL-18Rα结合。在6轮定向进化之后，剩余的克隆与IL-18BP相比更偏好IL-18Rα。
图8描绘了示例性实验的结果，说明2.0版本诱饵抗性人IL-18(DR-IL-18)变体的序列的总结。野生型人IL-18的成熟形式中每个突变的位置和对应的残基的位置指示在表的顶部。加阴影的行指示在第5轮和第6轮中获得的递归序列变体。最上一行的序列(“WThIL-18”)如SEQ ID NO:30所示。
图9描绘了示例性实验的结果，说明2.0版本人DR-IL-18变体的生物物理学表征。图9A显示酵母展示的2.0版本DR-IL-18变体能够结合hIL-18Rα，其结合等温线与WT人IL-18可比。图9B显示相比之下，以相同变体和hIL-18BP观察到非常少的结合。图9C提供了2.0版本DR-IL-18变体的热稳定性，如通过在一定温度范围内加热酵母展示的变体15分钟，然后以hIL-18Rα染色所评估。2.0版本DR-IL-18变体的热稳定性高于WT IL-18(Tm＝47.6C)和第一代共有序列(对于SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:35，分别为Tm＝50.9和40.2)。图9D提供了第二代DR-IL-18变体的受体结合性质和热稳定性的总结。NBD＝未检测到结合。N.D.＝未确定值。
图10A至图10C描绘了示例性实验的结果，说明使用酵母展示，针对IL-18BP独立性工程化鼠科动物IL-18变体。图10A提供生成IL-18BP抗性鼠科动物IL-18变体的定向进化的总结。阳性选择条件是mIL18RαSA-珠子和mIL18Rα。反选择条件是mIL-18BP和mIL-18BP四聚体。图10B显示在5轮定向进化之后酵母展示的鼠科动物IL-18变体的流式细胞术分析的结果。Y轴显示IL-18BP结合，x轴显示IL-18Rα结合。图10C提供诱饵抗性鼠科动物IL-18(DR-IL-18)变体的序列的总结。最上一行的序列(“mIL-18”)如SEQ ID NO:31所示。野生型鼠科动物IL-18的成熟形式中每个突变的位置和对应的残基的位置指示在表的顶部。SEQ IDNO:62至SEQ ID NO:72表示在用定向进化进行选择之后获得的序列。SEQ ID NO:60和SEQID NO:61是来源于选定序列中的共有序列。加阴影的残基表示观察到的五个最保守的突变。
图11A和图11B描绘了示例性实验的结果，说明鼠科动物DR-IL-18变体的生物物理学表征。图11A显示酵母展示的DR-IL-18变体SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61能够结合mIL-18Rα，其结合等温线与WT鼠科动物IL-18可比(左)。相比之下，用相同的变体和mIL-18BP观察到很少的结合(右)。图11B提供使用固定化生物素化的mIL-18BP与鼠科动物DR-IL-18变体之间的代表性表面等离子共振传感器图的对IL-18BP结合的测量结果。重组的mIL-18(左)以高亲和力结合mIL-18BP，KD＝0.8pM，而SEQ ID NO:61(右)显示结合大大降低，KD值大于10μM。此数据总结在表8和9中。
图12A至图12D描绘了示例性实验的结果，说明向小鼠施用的DR-IL-18的药效学。图12A是研究设计的示意图。向小鼠施用媒介物(PBS)、mIL-18(1mg/kg)或DR-IL-18变体SEQID NO:61(1mg/kg)，每天一次，共计七次剂量(描绘为注射器)。在实验之前两天以及在第0天、第3天和第6天，在注射后五小时取得血液样品。图12B显示第0天、第3天和第6天的CD4、CD8、NK细胞和单核细胞的外周血细胞计数。IL-18和SEQ ID NO:61到第3天时均将NK细胞和单核细胞扩大到相似的程度。对于每个时间点(天)，左条为PBS，中条为IL-18，并且右条为SEQ ID NO:61。图12C显示外周CD4、CD8和NK细胞上的CD69表达。SEQ ID NO:61刺激CD4和CD8细胞上的CD69表达，但IL-18不是这样。IL-18和SEQ ID NO:61增加了NK细胞上的CD69，但SEQ ID NO:61治疗造成持续的CD69表达，在第6天很明显，相比于IL-18，其恢复到基线CD69水平。对于每个时间点(天)，左条为PBS，中条为IL-18，并且右条为SEQ ID NI:61。图12D提供干扰素-g(IFN-g)、MIP-1b和G-CSF的血清细胞因子水平。SEQ ID NO:61治疗产生的IFN-g、MIP-1b和G-CSF的水平比mIL-18治疗高。
图13描绘了示例性实验的结果，说明DR-IL-18治疗降低小鼠的体脂组成。测量每三天以0.01、0.1或1mg/kg的DR-IL-18变体SEQ ID NO:61或1mg/kg WT mIL-18治疗的小鼠中的体脂和瘦体质量组成。SEQ ID NO:61治疗产生呈身体质量的总百分比的体脂的显著降低(上图)。这由脂肪质量减少或稳定(左图)，瘦体质量一致增加(右图)体现。媒介物治疗和mIL-18治疗的小鼠在相同的治疗期内显示体脂质量增加和瘦体质量稳定。
图14A至图14B描绘了示例性实验的结果，说明DR-IL-18在黑色素瘤模型中是有效的免疫治疗剂。图14A提供携带Yummer1.7黑色素瘤肿瘤的小鼠的肿瘤生长蜘蛛图，所述小鼠以盐水(对照)、WT IL-18(0.32mg/kg)、DR-IL-18变体SEQ ID NO:61(0.32mg/kg)、抗PD1(8mg/kg)、IL-18+抗PD1或SEQ ID NO:61+抗PD1治疗，每周两次。图14B提供来自与图14A中相同组的存活曲线。如图14B所示，在此模型中，SEQ ID NO:61作为单一疗法是有效的，并且与抗PD1组合是协同的。
图15A和图15B描绘了示例性实验的结果，说明DR-IL-18在图14的黑色素瘤模型中的有效性依赖于CD4和CD8淋巴细胞以及干扰素γ。图15A提供携带Yummer1.7黑色素瘤肿瘤的小鼠的肿瘤生长蜘蛛图，所述小鼠以盐水(对照)、或单独的DR-IL-18变体SEQ ID NO:61(0.32mg/kg)、或其与针对CD8、CD4、干扰素γ或NK1.1的耗竭抗体的组合治疗。图15B提供来自与图15A中相同组的存活曲线。
图16描绘了示例性实验的结果，说明DR-IL-18在MC38肿瘤模型中的剂量依赖性功效。携带MC38结肠癌肿瘤的小鼠的肿瘤生长蜘蛛图，所述小鼠每三天以PBS(对照)、1.0mg/kg WT IL-18、1.0mg/kg SEQ ID NO:61、0.1mg/kg SEQ ID NO:61或0.01mg/kg SEQ ID NO:61治疗。WT IL-18在1mg/kg下无效，而SEQ ID NO:61显示在0.1mg/kg下有部分功效并且在1.0mg/kg下有最大功效。
图17描绘了示例性实验的结果，说明单独的DR-IL-18与免疫检查点抑制剂抗PD1的组合在MC38肿瘤模型中的功效。显示了携带MC38结肠癌肿瘤的小鼠的肿瘤生长蜘蛛图，所述小鼠以PBS(对照)、0.32mg/kg WT IL-18、0.32mg/kg DR-IL-18变体SEQ ID NO:61、5mg/kg抗PD1、抗PD1与WT IL-18的组合或抗PD1与SEQ ID NO:61的组合治疗。所有剂每周两次腹膜内施用，共计多达6次剂量。
图18A和图18B描绘了示例性实验的结果，研究DR-IL-18在携带MC38肿瘤的小鼠中的抗肿瘤机制。图18A提供小鼠的肿瘤免疫表型分型实验的结果，所述小鼠以盐水、WT IL-18或DR-IL-18变体SEQ ID NO:61治疗，每周两次，共计四次剂量。DR-IL-18治疗导致每毫克肿瘤的CD8和NK细胞数目增加(左上两个图)和激活标志物颗粒酶B和KLRG1在CD8和NK细胞上的表达增加(右上两个图)。与盐水治疗相比，DR-IL-18治疗未提高CD8:Treg比率，而WTIL-18使比率不太有利。然而，DR-IL-18治疗增加了CD8细胞与抑制性髓系群体(包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)以及单核细胞和粒细胞髓系来源的抑制细胞(mMDSC和gMDSC))的比率。图18B提供与图18A相同的小鼠的血清Luminex细胞因子测量结果，在第4次治疗剂量之后24小时取得。DR-IL-18显示用WT IL-18治疗而显著改变的次要细胞因子释放曲线，将干扰素-γ、IL-7和IL-15水平显著增加多于100倍。
图19A至图19C描绘了示例性实验的结果，说明DR-IL-18通过损失表面MHC I类表达而有效治疗免疫检查点抑制剂难治的肿瘤的能力。图19A显示携带B2m缺陷型Yummer1.7肿瘤的小鼠的肿瘤生长蜘蛛图，所述小鼠以盐水、抗PD1+抗CTLA4或DR-IL-18变体SEQ IDNO:61治疗。图19B包括显示存活百分比相对于移植后天数的图表。DR-IL-18展示出关于肿瘤生长和存活的强大功效，在此模型中治愈了60％的经治疗的小鼠，所述模型甚至完全对以抗CTLA4+抗PD1的组合治疗具有抗性。此功效是NK细胞依赖性的，因为施用DR-IL-18与抗NK1.1(其耗竭NK细胞)消除了SEQ ID NO:61治疗效果。图19C提供比较肿瘤中干扰素-γ产生和Ki67水平的曲线图。从B2m缺陷型Yummer1.7分离的NK细胞是功能失调的，并且显示增殖(Ki67染色)和功能(干扰素-γ分泌)减少。然而，以DR-IL-18治疗逆转此表型，实现稳健的增殖和细胞因子分泌。
图20A至图20C描绘了示例性实验，说明使用酵母展示，将人IL-18变体工程化为IL-18BP拮抗剂(或“诱饵-诱饵”，D2D)。这些变体结合IL-18BP但不发出信号，从而拮抗IL-18BP对内源性IL-18的影响。图20A是D2D文库中随机化的人IL-18的位置的总结。针对每个位置都给出了简并密码子和编码的氨基酸的组。图20B提供生成D2D IL-18变体的定向进化的总结，所述变体结合并中和IL-18BP，但不通过IL-18R发出信号。阳性选择条件是mIL18BP。反选择条件是nIL18Rα、hIL18Rb和mIL18Rα。(图20C)对产生D2D hIL-18变体的进展的流式细胞术分析。在第1-4轮之后获得的酵母用1nM小鼠IL-18BP(左图)、1nM人IL-18BP(中图)或1μM IL18Rα加1μM IL18Rβ染色。选定的变体在多轮选择中显示IL-18BP结合增强，而IL18Rα或IL18Rβ结合没有增加。
图21描绘了示例性实验的结果，说明D2D人IL-18变体的序列的总结。野生型人IL-18的成熟形式中每个突变的位置和对应的残基的位置指示在表的顶部。最上一行的序列(“WT hIL-18”)如SEQ ID NO:30所示。
图22A至图22C描绘了示例性实验的结果，说明人诱饵-诱饵(D2D)IL-28变体的生物物理学表征。图22A显示酵母展示的D2D IL-8变体SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:101、SEQID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125能够结合hIL-18RBP，其结合等温线与WT人IL-18可比。图22B显示，相比之下，用相同变体和hIL-18Rα观察到非常少的结合。图22C提供D2D IL-18变体的受体结合性质的总结。NBD＝未检测到结合。
图23描绘了示例性实验的结果，说明D2D鼠科动物IL-18变体的序列的总结。野生型鼠科动物IL-18的成熟形式中每个突变的位置和对应的残基的位置指示在表的顶部。最上一行的序列(“WT mIL-18”)如SEQ ID NO:31所示。
图24描绘了使用表面等离子共振(SPR)，针对第二代DR-IL-18变体与IL-18Rα和IL-18BP的结合的生物物理学亲和力测量(传感图)的结果。最上一行：所指示的IL-18变体(可溶性分析物)对hIL-18Rα(固定化配体)的代表性传感图。最下一行：所指示的IL-18变体对人(hIL-18BP)的代表性传感图。x轴是以秒为单位的时间，并且y轴是响应单位(RU)。曲线是针对不同浓度(从1nM开始的2倍稀释)观察到的随时间推移的数据，与假设1:1朗缪尔结合模型的最佳拟合的曲线叠加。
图25A和图25B描绘了说明DR-IL-18对CT26结直肠肿瘤模型的功效的数据。皮下植入了250,000个CT26细胞，并且在第7天一旦肿瘤为平均-60mm3便开始治疗。WT IL-18和SEQID NO:61以0.32mg/kg给药，每周两次，共计5次剂量。在相同的时间表下，以10mg/kg给予抗PD1。图25A是蜘蛛图的重叠，以黑色线显示盐水(PBS)治疗的动物的肿瘤生长(圆形)，以深灰色显示WT IL-18治疗的动物的肿瘤生长(方形)，并且以灰色显示DR-IL-18(SEQ ID NO:61)治疗的动物的肿瘤生长(三角形)。仅用DR-IL-18的治疗导致动物的子组的肿瘤生长抑制和肿瘤清除，但WT IL-18不是这样。图25B包括用抗PD-1、WT IL-18和DR-IL-18(SEQ IDNO:61)治疗的小鼠的存活曲线。括号中指示完全响应的数目。DR-IL-18导致40％的小鼠的存活延长和肿瘤清除，是优于检查点抑制剂抗PD-1的改善，但WT IL-18不是这样。
图26A和图26B描绘了说明DR-IL-18在4T1乳腺癌模型和B16-F10黑色素瘤模型中的功效的数据。图26A显示在用盐水(PBS；黑色)、WT IL-18(深灰色)或DR-IL-18变体SEQ IDNO:61(灰色)治疗之后，移植到BALB/C小鼠中的4T1肿瘤的肿瘤生长曲线。图26B显示在用盐水(PBS；黑色)、WT IL-18/TA99(深灰色)或DR-IL-18变体SEQ ID NO:61(灰色)治疗之后，移植到C57BL/6小鼠中的B16-F10肿瘤的肿瘤生长曲线。在两种模型中，仅DR-IL-18导致肿瘤生长抑制，但WT IL-18不是这样。在肿瘤超过平均体积50mm3之后施用治疗，如通过用“t”标记的方框所指示。
图27A和图27B描绘了扩大图19A至19C的数据的数据。所描绘的数据说明DR-IL-18在治疗对免疫检查点抑制剂具有抗性的额外MHC I类缺陷型肿瘤模型中的功效。图27A提供植入B2m缺陷型MC38细胞的小鼠的肿瘤体积相对于植入后天数的图表，所述细胞如针对B2m缺陷型YUMMER细胞所述，使用CRISPR/Cas9介导的缺失所制备。皮下植入了B2m-/-MC38细胞，并且在第7天一旦肿瘤为平均-65mm3便开始治疗。SEQ ID NO:61以0.32mg/kg给药，每周两次，5次剂量。在相同的时间表下，以8mg/kg给予抗PD1和抗CTLA4。图27B显示植入RMA/S细胞的小鼠的肿瘤体积相对于植入后天数的图表。RMA/S是RMA淋巴瘤细胞系的变体，其包含Tapasin的自发突变。结果是抗原负载缺陷，并且因此MHC I类表面表达降低。它是C57BL/6同类系的并且是免疫检查点抑制剂难治的。小鼠皮下植入了1,000,000个RMA/S细胞，并且在第7天开始治疗。SEQ ID NO:61以0.32mg/kg给药，每周两次。在相同的时间表下，以8mg/kg给予抗PD1。在两项研究中，仅以DR-18变体SEQ ID NO:61的治疗表现出抗肿瘤功效，形式为肿瘤生长抑制(B2m-/-MC38)或肿瘤清除(RMA/S)。
图28描绘了说明DR-IL-18增强抗肿瘤抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的功效的数据。离体细胞毒性研究使用CFSE标记的Raji(B细胞淋巴瘤)细胞和分离的人外周血单核细胞(PBMC)。PBMC和标记的Raji细胞以效应子:靶标(E:T)比率1:10一起孵育25小时。将人DR-IL-18变体hCS-1(1μM)、利妥昔单抗(rituximab)(10μg/mL)或两种剂的组合应用于样品，如所指出的那样。细胞毒性通过流式细胞术进行测量并且计算为变为DAPI阳性的CFSE细胞的分数。DR-18呈单一剂刺激了显著的肿瘤细胞杀伤，并且显著增强了治疗性抗体利妥昔单抗的杀伤。*p<0.05，通过两因素ANOVA与Tukey的多重比较校正。
图29A和图29B描绘了说明DR-18变体SEQ ID NO:61对于治疗病毒感染(例如，在这种情况下，在治疗全身性疫苗病毒感染中)的抗病毒功效的数据。图29A显示实验设计方案。将C57BL/6小鼠腹膜内(IP)感染106PFU的牛痘病毒(VACV)，并且IP施用1mg/kg WT mIL-18或SEQ ID NO:61。处死小鼠并且在感染之后第3天通过RT-PCR测量血液和卵巢中的病毒滴度。图29B展示感染之后第3天，经治疗的小鼠的卵巢和血液中VACV病毒拷贝的定量。以SEQID NO:61的治疗显示病毒滴度的显著下降，而WT IL-18则是无效的。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图30描绘了说明第二代人DR-IL-18变体具有活性的数据。(图30)WT IL-18和人SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:87刺激IL-18HEK-Blue报告细胞。与WT hIL-18相比，人SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91显示效力增强，而SEQ ID NO:87的效力与WT hIL-18等同。因此，数据说明，所有测试的第二代人DR-IL-18变体都通过IL-18R主动地发出信号。
图31描绘了具有在各种半胱氨酸位置处的突变的IL-18变体，所述变体被制备，然后在SDS/PAGE凝胶上跑胶(使用Spyro-Ruby染色剂可视化)。R＝还原样品；N＝非还原样品；MW＝分子量。沿着底部的数字是指SEQ ID编号(见表13)。
图32描绘了去除C68S上潜在T细胞表位的不同C38S/C68突变体的SDS/PAGE凝胶分析。R＝还原样品。NR＝非还原样品
图33描绘了去除C68S上潜在T细胞表位的不同C38S/C68突变体的货架期稳定性研究的尺寸排阻色谱法数据。
图34描绘了使用HEK-Blue报告细胞系的剂量-响应数据。与WT IL-18相比，所有变体都显示效力增加，并且效力与亲本变体SEQ ID NO:89相似。
图35描绘了根据冻-融研究的比较SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:89的尺寸排阻色谱法数据。
图36描绘了根据搅拌研究的比较SEQ ID NO:19与SEQ ID NO:89的尺寸排阻色谱法数据。
图37A和图37B描绘了测试SEQ ID NO:19和野生型人IL-18对人和食蟹猴IL-18Rα(图37A)和IL-18BP(图37B)的亲和力的表面等离子共振实验的结果。
图38描绘了IL-18BP抗性测定的结果。WT hIL-18通过添加IL-18BP被有效抑制，而SEQ ID NO:19在所有IL-18BP浓度下都保留了强的信号传导能力。
图39描绘了根据给药实验(使用小鼠DR IL-18变体SEQ ID NO:61)的在小鼠中的肿瘤生长数据。
图40描绘了根据额外给药实验(使用小鼠DR IL-18变体SEQ ID NO:61)的在小鼠中的肿瘤生长数据。
图41A和图41B描绘了使用DR IL-18变体(在这种情况下，SEQ ID NO:89)在灵长类动物(食蟹猴)中的给药耐受性实验。
图42A和图42B描绘了使用切割掉IL-18蛋白的N-末端SUMO标签的无细胞SUMO蛋白酶来产生和纯化IL-18多肽(在这种情况下，DR IL-18SEQ ID NO:89)。
图43A和图43B描绘了通过RP-HPLC监测SUMO蛋白酶切割的结果。
图44描绘了使用在细菌细胞(在这种情况下，大肠杆菌)的内部切割掉IL-18蛋白的N-末端SUMO标签的外源性提供的SUMO蛋白酶来产生和纯化IL-18多肽(在这种情况下，DRIL-18SEQ ID NO:19)。
图45描绘了监测细菌细胞的内部的SUMO蛋白酶切割反应的RP-HPLC数据。
图46描绘了产生IL-18变体的酵母(例如，巴斯德毕赤酵母)分泌系统的示意图。
图47描绘了代表性还原SDS-PAGE凝胶，其显示DR-18(IL-18变体，在这种情况下，SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:87)的表达。
图48描绘了两色谱步骤过程(和相关联的数据)，所述过程有助于从酵母分泌表达系统(在这种情况下，巴斯德毕赤酵母)无标签地纯化IL-18。
具体实施方式
提供了变体(例如，稳定化的)IL-18多肽和使用方法(例如，治疗疾病或病症)。主题稳定化的IL-18多肽相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)包含两个半胱氨酸残基(C38和C68)的突变。在一些情况下，突变是C至S取代，并且因此稳定化的IL-18多肽在一些情况下可以包含突变C38S和C68S。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变对C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N(例如，在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；并且在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N)。
在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽是稳定化的IL-18变体多肽(例如，稳定化的“诱饵抗性”(DR)IL-18变体或稳定化的“诱饵-诱饵”(D2D)IL-18变体)，即，相对于人野生型IL-18在位置C38和C68处额外包含突变的IL-18变体。
提供了向个体(例如，皮下)施用IL-18多肽(例如，野生型IL-18或变体，诸如稳定化的、DR、D2D、稳定化的DR或稳定化的D2D IL-18变体)的方法，其中施用频率不多于每周一次。还提供了生产/制备多肽的方法。一些此类方法包括将细胞(例如，细菌细胞)内部的外源性提供的融合蛋白与SUMO蛋白酶接触，其中融合蛋白包括在N-末端与SUMO标签融合的感兴趣的蛋白，由此SUMO蛋白酶切割融合蛋白以从感兴趣的蛋白去除SUMO标签。
在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案，因为此类实施方案当然可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。
在提供值的范围的情况下，应理解此范围的上限与下限之间的各介入值(除非上下文另外清楚地指出，否则准确到下限的单位的十分之一)，以及此所述范围内的任何其他所述值或介入值涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括在这些较小范围内并且也涵盖于本发明内，从属于所陈述范围内的任何特定排除的限值。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值中的任一个或两者的范围也被包括在本发明内。
本文以在数值之前加上术语“约”提供某些范围。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字以及与所述术语之后的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数值是接近还是近似具体列举的数值时，接近或近似的未列举的数值可以是在其出现的上下文中提供与具体列举的数值大致等同的数值。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在描述有代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有公布和专利均以引用的方式并入本文，如同每个单独的公布或专利被具体地和单独地指示为以引用的方式并入并且以引用的方式并入本文中以公开和描述引用公布所结合的方法和/或材料。任何公布的引用是针对其申请日之前的公开内容，并且不应解释为承认本发明由于现有发明而无权先于这种公布。此外，所提供的出版日可能不同于可能需要独立确认的实际出版日期。
应注意，如本文和所附权利要求中所用，除非上下文另外清楚指示，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括多个指示物。还应注意，权利要求可撰写成排除任何任选的要素。因此，此陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的诸如“单独地”、“仅”的排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。
本领域技术人员在阅读本公开时将明白的是，本文所述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所叙述方法均可以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
虽然为了文法流畅性已经或将用功能解释描述设备和方法，但是应明确地理解，权利要求(除非根据35 U.S.C.§112所明确陈述)不应解释为必然以任何方式受到“手段”或“步骤”限制的构建的限制，而是应根据司法等同原则赋予权利要求所提供的定义的全部含义和等同物，并且在根据35U.S.C.§112明确陈述权利要求的情况下，应根据35U.S.C.§112赋予全部法定的等同物。
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的并且不意图具有限制性。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即，至少一个)。以举例的方式，“要素”意指一个要素或多于一个要素。
如本文所用，“约”在涉及可测量的值诸如量、持续时间等等时意指涵盖自指定值的±40％、或±20％、或±10％、±5％、±1％或±0.1％的非限制性变化(当此类变化适当时)。
术语“异常”当用于生物体、组织、细胞或其组分的情境中时，是指至少一种可观察或可检测的特征(例如，年龄、治疗、时刻等)与展示“正常”(预期)相应特征的那些生物体、组织、细胞或其组分不同的那些生物体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型来说正常或预期的特征可能对于不同的细胞或组织类型来说是异常的。
如本文所用，术语“抗体”是指能够特异性结合抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是来源于天然来源或来源于重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。本发明中的抗体可以呈多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体(scFv)、重链抗体诸如骆驼科动物抗体、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science242:423-426)。
如本文所用，“抗体重链”是指存在于所有抗体分子中的呈其天然存在的构象形式的两种类型的多肽链中的较大的链。
如本文所用，“抗体轻链”是指存在于所有抗体分子中的呈其天然存在的构象形式的两种类型的多肽链中的较小的链。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“合成抗体”意指使用重组DNA技术生成的抗体，例如像如本文所述的由噬菌体表达的抗体。所述术语应被解释为意指一种抗体或指定所述抗体的氨基酸序列，所述抗体通过合成编码所述抗体的DNA分子来生成并且所述DNA分子表达抗体蛋白，其中所述DNA或氨基酸序列使用本领域中可得到且熟知的合成DNA或氨基酸序列技术来获得。
如本文所用，“免疫测定”是指使用能够特异性结合靶分子的抗体检测和定量靶分子的任何结合测定。
如本文所用，术语“特异性结合”，例如关于IL-18变体多肽，意指识别并结合特定分子诸如IL-18R或者IL-18BP的IL-18变体多肽。例如，可以说野生型IL-18特异性结合IL-18R和IL-18BP。在一些情况下，IL-18变体多肽大幅减少了与IL-18BP的结合。例如，特异性结合来自一种物种的受体的IL-18变体多肽也可以结合来自一种或多种物种的受体。但是，此类跨物种反应性本身不改变IL-18变体多肽作为特异性的分类。在另一实例中，特异性结合受体的IL-18变体多肽也可以结合受体的不同等位基因形式。然而，此类交叉反应性本身不改变IL-18变体多肽作为特异性的分类。在一些情况下，术语“特异性结合(specificbinding)”或“特异性地结合(specifically binding)”可以关于抗体、蛋白质或肽与化学物质的相互作用使用，以意指相互作用依赖于化学物质上具体结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，IL-18变体多肽识别并结合特定蛋白质结构，而不是广泛地结合蛋白质。相似地，术语“靶标”(例如，在“靶向”特定抗原的抗体的情境中)用于指代给定分子的特异性结合配偶体。例如，“靶向”特定蛋白质/抗原的剂(例如，抗体)特异性地结合所述蛋白质/抗原，从某种意义上说，它结合所述特定蛋白质/抗原优先于结合其他蛋白质/抗原。
作为本文所用的术语，术语“施药器(applicator)”意指用于向对象施用本发明组合物的任何装置，包括但不限于皮下注射器、移液管、离子电渗疗法装置、贴片等等。
如本文所用，术语“编码序列”意指可以被转录和/或翻译以产生mRNA和/或多肽或其片段的核酸序列、或其互补序列、或其一部分。编码序列包括基因组DNA中的外显子或未成熟的初级RNA转录物，它们通过细胞的生化机制接合在一起以提供成熟的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，并且可以从它推导出编码序列。相比之下，如本文所用，术语“非编码序列”意指在体内不被翻译成氨基酸或者其中的tRNA不相互作用以放置或试图放置氨基酸的核酸序列、或其互补序列、或其一部分。非编码序列包括基因组DNA或未成熟的初级RNA转录本中的内含子序列和基因相关联的序列诸如启动子、增强子、沉默子等等。
如本文所用，术语“互补的”和“互补性”关于因碱基配对规则而相关的多核苷酸(即，核苷酸序列)使用。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”互补。互补性可为“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可能有“完全”或“总体”互补性。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间的杂交的效率和强度有显著影响。这在扩增反应以及取决于核酸之间的结合的检测方法中特别重要。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不可维持体内平衡，并且其中如果疾病得不到改善，则动物的健康状况将继续恶化。相比之下，动物的“病症”是动物能够维持体内平衡，但是动物的健康状态相比于没有病症的情况下不太有利的一种健康状态。即便不进行治疗，病症也不一定导致动物的健康状态进一步下降。
如本文所用的“有效量”意指提供治疗、预防或其他所需益处的量。
“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有性质，聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即，向导RNA、rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)都可以称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用，如对核酸所应用，术语“片段”是指较大核酸的子序列。核酸的“片段”的长度可以是至少约15个核苷酸；例如，至少约50个核苷酸至约100个核苷酸、至少约100至约500个核苷酸、至少约500至约1000个核苷酸、至少约1000个核苷酸至约1500个核苷酸、约1500个核苷酸至约2500个核苷酸或约2500个核苷酸(和它们之间的任何整数值)。如本文所用，如对蛋白质、多肽或肽所应用，术语“片段”是指较大蛋白质、多肽或肽的子序列。蛋白质、多肽或肽的“片段”的长度可以是至少约5个氨基酸；例如，至少约10个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约50个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约200个氨基酸或至少约300个氨基酸(和它们之间的任何整数值)。
术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，mRNA)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽可以由全长编码序列或由编码序列的任何部分来编码，只要全长或片段的所需活性或功能性质(例如，酶活性、受体结合、信号转导、免疫原性等)得以保留即可。所述术语还涵盖结构基因的编码区和以下序列，所述序列在5'和3'末端与编码区相邻定位，在任一末端的距离为约2kb或更长，使得基因对应于全长mRNA和影响基因的转录性质的5'调控序列的长度。位于编码区的5'并且存在于mRNA上的序列被称为5'-非翻译序列。5'-非翻译序列通常包含调控序列。位于编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3'-非翻译序列。术语“基因”涵盖cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列间断的编码区。内含子是转录到核RNA(hnRNA)中的基因区段；内含子可以包含调控元件，诸如增强子。内含子从核转录物或初级转录物中被去除或“剪除”；因此，信使RNA(mRNA)转录物中不存在内含子。mRNA在翻译期间起作用以指定新生多肽中的氨基酸的顺序或次序。
如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情境中所用，术语“同源”、“相同”或“同一性”意指，序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。百分比可以通过以下来计算：最佳地比对两个序列；在指定区域上比较两个序列；确定在两个序列中相同的残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目；以匹配的位置的数目除以在指定区域中的位置的总数；以及将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区仅包含单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法诸如BLAST或者BLAST 2.0来进行。
如本文中所用的术语“指导材料”包括可用于传达试剂盒中的本发明的核酸、肽、多肽和/或化合物用于鉴定、或减轻、或治疗本文所述的各种疾病或病症的有用性的出版物、录音、图表或任何其他表达媒介。任选地或替代地，指导材料可以描述一种或多种鉴定或减轻对象的细胞或组织中的疾病或病症的方法。试剂盒的指导材料可以例如附连到容纳本发明的核酸、多肽和/或化合物的容器或者与容纳所述核酸、多肽和/或化合物的容器一起运输。替代地，指导材料可以与容器分开运输，意图是让接收人配合地使用指导材料和化合物。
“分离的”意指从天然状态改变或去除。例如，在活动物体中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以在非天然环境例如宿主细胞中存在。
如本文所用，在蛋白质的情境中的术语“纯化”和“纯化的”是指允许例如在体外、离体或体内有效使用蛋白质的纯度水平。对于可用于给定应用的蛋白质，它应该基本上不含污染物、其他蛋白质和/或可能干扰所述蛋白质在此类应用中使用或者至少不希望包含与感兴趣的蛋白质一起包含在内的化学物质。此类应用包括治疗性组合物的制备、治疗性组合物中蛋白质的施用和本文所公开的其他方法。优选地，如本文所提及，“纯化的”蛋白质是以下蛋白质，它可以通过任何方法(即，通过从天然来源直接纯化、以重组方式或以合成方式)产生，并且它已经从其他蛋白质组分被纯化，使得所述蛋白质占给定组合物中总蛋白质的至少约75％重量/重量，占给定组合物中总蛋白质的80％重量/重量，并且更优选地，占给定组合物中总蛋白质的至少约85％重量/重量、并且更优选地至少约90％重量/重量、并且更优选地至少约91％重量/重量、并且更优选地至少约92％重量/重量、并且更优选地至少约93％重量/重量、并且更优选地至少约94％重量/重量、并且更优选地至少约95％重量/重量、并且更优选地至少约96％重量/重量、并且更优选地至少约97％重量/重量、并且更优选地至少约98％重量/重量、并且更优选地至少约99％重量/重量。例如，纯化的多肽是以下多肽，它已经与在其天然存在的状态下可能与它相关联的其他组分(例如，当所述蛋白质是天然存在的蛋白质时)并且与在细胞内部或在细胞外环境中时可能与它相关联的组分分开。例如，在一些情况下，可以从细胞裂解物(例如，从外源性表达蛋白质的细菌细胞裂解物)纯化蛋白质。又如，可以从细胞外培养基(例如从细胞(例如，酵母细胞)已经将蛋白质分泌到其中的培养基)纯化蛋白质。
“分离的核酸”是指已经与在天然存在的状态下在其侧翼的序列分开的核酸链段或片段，例如，已经从天然与之相邻的序列(例如，在片段天然存在的基因组中与片段相邻的序列)去除的DNA片段。所述术语还适用于已经基本上从天然伴随它的其他组分(例如，在细胞中天然伴随它的RNA或DNA或蛋白质)纯化的核酸。因此，所述术语包括例如被掺入到载体、自主复制质粒或病毒或者原核生物或真核生物的基因组DNA中或者作为独立于其他序列的单独的分子(例如，作为cDNA或者通过PCR或限制酶消化所产生的基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。它还包括作为编码额外多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
术语“标记”当在本文中使用时是指直接或间接与探针缀合以生成“标记的”探针的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如，放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物(例如，抗生物素蛋白-生物素)的化学改变。在一些情况下，可以标记引物以检测PCR产物。
如本文所用，术语“调节”意指介导对象中mRNA、多肽或反应的活性和/或水平与不存在治疗或化合物的对象中mRNA、多肽或反应的活性和/或水平相比并且/或者与在其他方面相同但未治疗的对象中mRNA、多肽或反应的活性和/或水平相比的可检测的增加或降低。所述术语涵盖激活、抑制和/或以其他方式影响天然信号或反应，从而介导对象(例如，人)中有益的治疗性、预防性或其他所需反应。如本文所用，“突变”、“突变体”或“变体”是指核酸或氨基酸序列相对于参考序列(其可以是天然存在的正常/“野生型”序列)的变化，并且包括易位、缺失、插入和取代/点突变。如本文所用，“突变体”或“变体”是指包含突变的核酸或蛋白质。
“核酸”是指多核苷酸，并且包括多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸。根据本发明的核酸可以包括嘧啶和嘌呤碱基的任何聚合物或寡聚物，优选地分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及腺嘌呤和鸟嘌呤。(参见Albert L.Lehninger,Principles ofBiochemistry,793-800(Worth Pub.1982)，其出于所有目的整体并入本文)。实际上，本发明设想任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分以及其任何化学变体，诸如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等等。聚合物或寡聚物在组成上可以是异质的或均质的，并且可以从天然存在的来源分离或者可以是以人工或合成方式产生的。此外，核酸可以是DNA或RNA或者其混合物，并且可以呈单链或双链形式永久地或过渡地存在，包括同源双链、异源双链和杂合状态。
“寡核苷酸”或“多核苷酸”是长度范围为至少2个，优选地至少8个、15个或25个核苷酸的核酸，但是可以长达50个、100个、1000个或5000个核苷酸，或者是与多核苷酸特异性杂交的化合物。多核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或者其模拟物的序列，其可以从天然来源分离、重组产生或人工合成。本发明的多核苷酸的另一实例可以是肽核酸(PNA)。(参见美国专利号6,156,501，其以引用的方式整体并入本文)。本发明还涵盖存在非传统碱基配对的情况，诸如Hoogsteen碱基配对，其已经被鉴定为在某些tRNA分子中并且假定存在于三螺旋中。“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本公开中可互换使用。应当理解，当核苷酸序列在本文中由DNA序列(例如，A、T、G和C)表示时，这还包括对应的RNA序列(例如，A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。
术语“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”在本文中可互换使用并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物对象，具体地，是人。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含通过肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对于可以构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链和较长链两者，短链在本领域中还通常称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长链在本领域中通常称为蛋白质，其中有许多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、突变多肽、变体多肽或其组合。
如本文所用，“多核苷酸”包括cDNA、RNA、DNA/RNA杂合体、反义RNA、核酶、基因组DNA、合成形式和混合聚合物，有义链和反义链，并且可以被化学或生物化学修饰以表现出非天然或衍生的、合成的或半合成的核苷酸碱基。另外，设想了野生型或合成基因的改变，包括但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入、取代或者与其他多核苷酸序列的融合。
如本文所用，“样品”或“生物样品”意指从对象分离的生物材料。生物样品可以含有任何适于检测对象中的生理或病理过程的mRNA、多肽或其他标志物的生物材料，并且可以包括从个体获得的流体、组织、细胞和/或非细胞材料。
如本文所用，术语“疗法”或“治疗方案”是指为预防、治疗或改变疾病或病症所采取的那些活动，例如旨在使用药理学、手术、膳食和/或其他技术减少或消除疾病或病症的至少一种体征或症状的治疗过程。治疗方案可包括规定剂量的一种或多种化合物或手术。疗法通常是有益的并且减少或消除病症或疾病状态的至少一种体征或症状，但是在一些情况下，疗法的效果将具有不希望的作用或副作用。疗法的效果还受到对象的生理状态的影响，例如，年龄、性别、遗传、体重、其他疾病状况等。
术语“治疗有效量”是指将引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在寻求的细胞、组织、器官、系统或对象的预期生物学、生理学、临床或医学响应的主题化合物或组合物的量。术语“治疗有效量”包括在施用时，足以治疗所治疗的病症或疾病的体征或症状中的一种或多种的化合物或组合物的量。治疗有效量将根据化合物或组合物、疾病及其严重程度以及待治疗的对象的年龄、体重等而变化。
如本文所用，术语“治疗”疾病或病症意指降低对象所经受的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等等在本文用于通常指获得所需药理学和/或生理学效果。就完全或部分地预防疾病或其症状而言，效果可以是预防性的，并且/或者就疾病和/或可归因于疾病的副作用的部分或完全稳定化或治愈而言，效果可以是治疗性的。术语“治疗”涵盖对哺乳动物(具体地讲，人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止可能易患疾病或症状，但是尚未被诊断为患有所述疾病或症状的对象中发生所述疾病和/或症状；(b)抑制疾病和/或症状，例如，减缓或阻止它们的发展(例如，停止肿瘤生长、减缓肿瘤生长速度、停止癌细胞增殖速度等)；或(c)减轻疾病症状，即，导致疾病和/或症状的消退(例如，导致肿瘤大小的减小、减少存在的癌细胞数等等)。需要治疗的对象包括已经患病的对象(例如，患有癌症的对象、有感染的对象、患有代谢紊乱的对象、患有黄斑变性的对象等)以及需要预防的对象(例如，癌症易感性增加的对象、感染的可能性增加的对象、怀疑有癌症的对象、怀疑藏有感染的对象、代谢疾病易感性增加的对象、黄斑变性易感性增加的对象等)。
如本文所用，术语“野生型”是指从天然存在的来源分离或具有天然存在的序列的基因或基因产物(例如，具有天然存在的氨基酸序列的野生型蛋白质可以从天然来源或从合成来源分离，但仍被视为野生型蛋白质)。相比之下，术语“修饰的”、“变体”或“突变体”是指与野生型基因或基因产物相比，具有在序列和或功能性质方面的修改(即，改变的特征)的基因或基因产物。
范围：在整个公开内容中，多个方面均可以以范围形式呈现。应理解，以范围形式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明的范围进行不可改变的限制。因此，范围的描述应当被视为具有确切公开的所有可能的子范围以及此范围内的单独数值。例如，应当认为对诸如1至6的范围的描述已经确切公开了诸如1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、2至6等的子范围以及所述范围内的单独数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
组合物和方法
如上文所总结，在一些实施方案中，本公开的组合物和方法包含相对于野生型IL-18(SEQ ID NO:30)在氨基酸位置C38和C68处具有突变的IL-18多肽。此类变体在本文被称为“稳定化的”IL-18变体。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法包含这样的IL-18变体多肽，它相对于野生型IL-18是突变的，使得它可以结合IL-18天然结合配偶体中的一个，但不结合另一个(或与另一个的结合减少)。例如，野生型IL-18结合IL-18R(通过受体发出信号)和IL-18BP(通过防止与IL-18R的结合来抑制IL-18)。在一些情况下，本文所讨论的IL-18变体多肽是“诱饵抗性IL-18”(“DR IL-18”)变体；此类变体结合IL-18R，但与IL-18BP的结合减少(并且在一些情况下，不结合)。在其他情况下，本文所讨论的IL-18变体多肽是“诱饵-诱饵IL-18”(“D2D IL-18”)变体；此类变体结合IL-18BP，但与IL-18R的结合减少(并且在一些情况下，不结合)。如本公开中所示，IL-18变体多肽可以显示与野生型IL-18可比的对IL-18Rα的结合亲和力，同时还表现出与野生型IL-18相比减少的对IL-18BP的结合亲和力。
在一些情况下，描述各种变体的术语之间存在重叠。例如，DR IL-18变体或D2DIL-18变体可以包括在C38和C68处的突变，并且在此类情况下，IL-18变体将是“稳定化的”变体。因此，术语“稳定化的”涵盖稳定化的野生型IL-18(具有C38和C68突变的WT IL-18)以及稳定化的变体蛋白，诸如具有C38和C68突变的DR IL-18和D2D IL-18变体。同样，术语“DRIL-18”变体涵盖具有和不具有C38/C68突变的此类变体，并且术语“D2D IL-18”变体涵盖具有和不具有C38/C68突变的此类变体。因此，在讨论具有C38/C68突变的DR IL-18变体时可以使用术语“稳定化的DR IL-18”变体，并且在讨论具有C38/C68突变的D2D IL-18变体时可以使用术语“稳定化的D2D IL-18”变体。
因此，下文将讨论“稳定化的”IL-18蛋白(各种C38/C68突变体)的各种实施方案。这种描述同样地适用于IL-18蛋白的任何类型(例如，野生型、DR IL-18变体、D2D IL-18变体等)。首先讨论C38/C68的突变，之后讨论DR IL-18变体和D2D IL-18变体。所有讨论的变体都可以用于本文所述的任何方法。
稳定化的IL-18多肽是包含‘稳定化突变’的IL-18多肽，所述突变是相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)的两个半胱氨酸残基(C38和C68)的突变。令人惊讶的是，发现这两个氨基酸的突变与半胱氨酸突变的所有其他可能的组合相比更好地稳定化IL-18，参见例如下文的工作实施例。在一些情况下，突变是C至S取代，并且因此在一些情况下，稳定化的IL-18多肽可以相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)包含突变C38S和C68S(在本文中也称为“突变对C38S/C68S”)。在一些情况下，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ IDNO:30包含在位置C38和C68处的突变。在一些情况下，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含在位置C38和C68处的突变。此类变体蛋白的实例包括如SEQ ID NO:6和16-21所示的那些，但是这些序列还包含使它们成为DR IL-18变体的额外突变(参见下文)，并且此类SEQ ID NO:6和16-21是稳定化的DR IL-18变体的实例。
在一些情况下，突变是C至S取代，并且因此在一些情况下，稳定化的IL-18多肽可以相对于人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)包含突变C38S和C68S(在本文中也称为“C38S/C68S”)。在一些情况下，C68的突变导致免疫原性表位。因此，在一些实施方案中，在C68处的突变是非免疫原性取代。在一些此类情况下，突变是C68至G、A、V、D、E或N突变(在一些情况下，C68至G、A、D或N)。因此，在一些此类情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68D。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68G。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68A。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68A。在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽包含突变C38S/C68N。
因此，在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ IDNO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68D。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ IDNO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQID NO:30包含突变C38S/C68A。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68N。
在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68D。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ IDNO:30包含突变C38S/C68A。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQID NO:30)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68N。
稳定化的DR IL-18或D2D IL-18变体
在一些情况下，主题稳定化的IL-18多肽是稳定化的IL-18变体多肽，即，包含稳定化突变(即，相对于人野生型IL-18在位置C38和C68处的突变)的IL-18变体多肽。在一些此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽是稳定化的“诱饵抗性”(DR)IL-18变体，并且在其他此类情况下，稳定化的IL-18变体多肽是稳定化的“诱饵-诱饵”(D2D)IL-18变体。人DR IL-18变体的实例包括但不限于SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193所示的那些，而人D2D IL-18变体的实例包括但不限于SEQ ID NO:92-125所示的那些；同样参见下文的工作实施例。下文详细描述了DR-IL18变体，并且此类变体中的任一个都可以包含如本文所述的C38/C68突变，以成为稳定化的DR-IL18。
在一些情况下，主题稳定化的DR IL-18变体包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，除了C38和C68是突变的(例如，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N)。稳定化的DR IL-18变体的实例包括如SEQ ID NO:6和16-21所示的那些(这些是如SEQ ID NO:89所示的DR-18变体的C38/C68突变型式)。本领域的普通技术人员将容易认识到，对于任何所需的IL-18变体(参见例如下文工作实施例)(例如，如SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193(例如，SEQ ID NO 87-91)所示的人DR-IL变体，或者如SEQ ID NO:92-125所示的人D2D IL-18变体中的任一个)，可以容易地产生等同的稳定化的变体。
因此，在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ IDNO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ IDNO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68D。
在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ IDNO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ IDNO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQID NO:30包含突变C38S/C68A。
在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ IDNO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有80％或更多序列同一性(例如，85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ IDNO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N。
在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ IDNO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQID NO:30包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68D。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68G。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68A。在一些实施方案中，主题IL-18多肽包含与人野生型IL-18(SEQ ID NO:30)(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、95％或更多、97％或更多、98％或更多或98.5％或更多序列同一性)的氨基酸序列，并且相对于SEQ ID NO:30包含突变C38S/C68N。
在一些实施方案中，IL-18变体多肽是DR IL-18变体(即，它结合IL-18R，并且表现出与IL-18BP的结合降低)。在一些实施方案中，DR IL-18变体结合IL-18BP，结合亲和力是野生型IL-18与IL-18BP的结合亲和力的95％或更小(例如，90％或更小、80％或更小、70％或更小、60％或更小、50％或更小、40％或更小、30％或更小、20％或更小、10％或更小、5％或更小、2％或更小、1％或更小、0.05％或更小或0.001％或更小)。在一些实施方案中，DRIL-18变体结合IL-18BP，结合亲和力是野生型IL-18与IL-18BP的结合亲和力的10％或更小(例如，5％或更小、2％或更小、1％或更小、0.05％或更小或0.001％或更小)。
在一些实施方案中，主题DR IL-18变体对IL-18BP的KD为10nM或更大(较高的KD意指较低的结合亲和力)。在一些实施方案中，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的KD为20nM或更大(例如，50nM或更大、100nM或更大、500nM或更大或1μM或更大)。
IL-18多肽(例如，相对于人野生型IL-18包含在位置C38和C68处的突变的DR IL-18多肽)可以表现出与具有不同序列的IL-18多肽(例如，野生型IL-18序列，或缺乏C38和C68突变但是以其他方式含有与主题IL-18多肽相同的序列的IL-18序列)相比增强的稳定性。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)的稳定性可以通过使多肽或含有多肽的本文所公开的制剂经受冻-融循环来评估，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或至少20个冻-融循环。冻-融循环可以包括冷冻多肽或包含多肽的制剂(例如，至约-20℃或-80℃)以及解冻多肽或制剂(例如，至约20℃、23℃、25℃或37℃)。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)的稳定性可以通过使多肽或含有多肽的本文所公开的制剂经受搅拌来评估。搅拌可以包括例如在以约100rpm、约150rpm、约200rpm或约250rpm的搅拌下孵育多肽或制剂(例如，在约20℃、约23℃、约25℃、约30℃、约37℃或约40℃下)。例如，可以在所述温度和搅拌速率下孵育约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约一周或约2周之后测试样品。
IL-18多肽(例如，DR IL-18)的稳定性可以通过比较在本文所公开的稳定性测定之前和之后(例如，在冻-融循环和/或搅拌之前和之后)通过尺寸排阻色谱法所测量的主要的IL-18峰的大小来评估。在一些实施方案中，在暴露于稳定性测定条件之后，主要的峰保持在暴露于测定条件之前的主要的峰的大小的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约95.5％、至少约96％、至少约96.5％、至少约97％、至少约97.5％、至少约98％、至少约98.5％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.1％、至少约99.3％、至少约99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、至少约99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.95％、至少约99.99％或约100％。
在一些实施方案中，在暴露于稳定性测定条件之后，主要的峰的保留比具有不同序列(例如，野生型IL-18序列，或缺乏C38和C68突变但是以其他方式含有与主题IL-18多肽相同的序列的IL-18序列)的IL-18多肽大至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。
IL-18多肽(例如，DR IL-18)的稳定性可以通过在本文所公开的稳定性测定之前和之后(例如，在冻-融循环和/或搅拌之前和之后)确定通过尺寸排阻色谱法所测量的指示二聚体、多聚体、聚集体或降解产物的形成的一个或多个峰的存在和大小来评价。在一些实施方案中，在将IL-18多肽(例如，本文所公开的制剂中的DR IL-18)暴露于稳定性测定条件之后，没有或基本上没有检测到指示二聚体的形成的峰。在一些实施方案中，在将IL-18多肽(例如，本文所公开的制剂中的DR IL-18)暴露于稳定性测定条件之后，没有或基本上没有检测到指示多聚体的形成的峰。在一些实施方案中，在将IL-18多肽(例如，本文所公开的制剂中的DR IL-18)暴露于稳定性测定条件之后，没有或基本上没有检测到指示聚集体的形成的峰。在一些实施方案中，在将IL-18多肽(例如，本文所公开的制剂中的DR IL-18)暴露于稳定性测定条件之后，没有或基本上没有检测到指示降解产物的形成的峰。
在一些实施方案中，在将IL-18多肽(例如，本文所公开的制剂中的DR IL-18)暴露于稳定性测定条件之后，IL-18多肽表现出与具有不同序列(例如，野生型IL-18序列，或缺乏C38和C68突变但是以其他方式含有与主题IL-18多肽相同的序列的IL-18序列)的IL-18多肽相比少至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的二聚体、多聚体、聚集体和/或降解产物形成，例如，如通过尺寸排阻色谱法所确定。
在一些实施方案中，所公开的DR IL-18变体对IL-18BP的KD为至少约100μM、至少约10μM、至少约1μM、至少约900nM、至少约800nM、至少约700nM、至少约600nM、至少约500nM、至少约400nM、至少约300nM、至少约200nM、至少约150nM、至少约100nM、至少约90nM、至少约80nM、至少约70nM、至少约60nM、至少约50nM、至少约40nM、至少约30nM、至少约20nM或至少约10nM。在一些实施方案中，所公开的DR IL-18变体不结合IL-18BP，基本上不结合IL-18BP，或以低于本文所公开的测定中的检测限的方式结合IL-18BP。
本文所公开的DR IL-18变体可以表现出与人IL-18R的结合，例如，可以与野生型人IL-18可比的亲和力结合人IL-18R，或者可以高于野生型人IL-18的亲和力结合人IL-18R。在一些实施方案中，本文所公开的DR IL-18变体以与野生型人IL-18对人IL-18R所表现出的亲和力至少可比的亲和力结合人IL-18R。
在一些实施方案中，本文所公开的DR IL-18变体结合人IL-18Rα或人IL-18R，KD为例如小于约100μM、小于约10μM、小于约1μM、小于约900nM、小于约800nM、小于约700nM、小于约600nM、小于约500nM、小于约400nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约150nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM或小于约1nM。
在一些实施方案中，本文所公开的DR IL-18变体结合人IL-18Rα或人IL-18R，KD为例如约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约400nM、约1pM至约300nM、约1pM至约200nM、约1pM至约100nM、约1pM至约50nM、约100pM至约1μM、约100pM至约500nM、约100pM至约400nM、约100pM至约300nM、约100pM至约200nM、约100pM至约100nM、约100pM至约50nM、约1nM至约1μM、约1nM至约500nM、约1nM至约400nM、约1nM至约300nM、约1nM至约200nM、约1nM至约100nM、约1nM至约75nM、约1nM至约50nM、约1nM至约40nM、约1nM至约30nM或约1nM至约10nM。
在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少2倍(需注意，解离常数比率增加意味着IL-18BP结合相对于IL-18R结合的相对减少)。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少20倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少200倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少2,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少20,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少200,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少2,000,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少20,000,000倍。
在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少3倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少30倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少300倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少3,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少30,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少300,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少3,000,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少30,000,000倍。
在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少10倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少100倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少1000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少10,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少100,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少1,000,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少10,000,000倍。在一些实施方案中，DR IL-18变体的IL-18BP/IL-18R解离常数比率是野生型IL-18的IL-18BP/IL-18R解离常数比率的约至少100,000,000倍。
在一些实施方案中，主题DR IL-18变体对IL-18BP的抑制剂常数(Ki)为大于3nM(例如，5nM或更大、10nM或更大、50nM或更大、100nM或更大、500nM或更大、750nM或更大或1μM或更大)。在一些实施方案中，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的Ki为500nM或更大。在一些实施方案中，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的Ki为1μM或更大。
在一些实施方案中，结合IL-15 18R并表现出与IL-18BP的结合减少的主题IL-18变体多肽(DR-IL-18)对IL-18BP的Ki为大于200nM(例如，500nM或更大、750nM或更大或1μM或更大)。在一些实施方案中，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的Ki为1μM或更大。
在一些实施方案中，结合IL-18R并表现出与IL-18BP的结合基本上减少的主题IL-18变体多肽(DR-IL-18)对IL-18BP的抑制剂常数(Ki)是野生型IL-18对IL-18BP的Ki的至少2倍(即，主题IL-18变体多肽对IL-18BP的Ki是相对于WT IL-18对IL-18BP的Ki的至少2倍)。例如，在一些情况下，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的Ki是野生型IL-18对IL-18BP的Ki的至少5倍(例如，至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或至少1000倍)。
在一些实施方案中，结合IL-18R并表现出与IL-18BP的结合基本上减少的主题IL-18变体多肽(DR-IL-18)对IL-18BP的EC50是野生型IL-18对IL-18BP的EC50的至少2倍(即，主题IL-18变体多肽对IL-18BP的EC50是相对于WT IL-18对IL-18BP的EC50的至少2倍)。例如，在一些情况下，主题DR-IL-18变体多肽对IL-18BP的EC50是野生型IL-18对IL-18BP的EC50的至少5倍(例如，至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍或至少1000倍)。
在上文情况中任一种中，DR IL-18变体可以包含上文呈现的组合中任一个中的C38/C68突变(例如，在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S)。
同样，对于下文中任一种，DR IL-18变体可以包含上文呈现的组合中任一个中的C38/C68突变(例如，在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S)。
在一些实施方案中，DR-IL-18变体包含在选自以下的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)：Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155。在各种实施方案中，人IL-18变体多肽包含在选自以下的氨基酸位置处的至少4个突变：Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155。在各种实施方案中，人IL-18变体多肽包含在选自以下的氨基酸位置处的至少6个突变：Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155。在各种实施方案中，人IL-18变体多肽包含在选自以下的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)：Y1、L5、K8、S55、Q56、P57、G59、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155。在一些实施方案中，人IL-18变体多肽包含在选自以下的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)：Y1H、Y1R、L5H、L5I、L5Y、K8Q、K8R、M51T、M51K、M51D、M51N、M51E、M51R、K53R、K53G、K53S、K53T、S55K、S55R、Q56E、Q56A、Q56R、Q56V、Q56G、Q56K、Q56L、P57L、P57G、P57A、P57K、G59T、G59A、M60K、M60Q、M60R、M60L、E77D、Q103E、Q103K、Q103P、Q103A、Q103R、S105R、S105D、S105K、S105N、S105A、D110H、D110K、D110N、D110Q、D110E、D110S、D110G、N111H、N111Y、N111D、N111R、N111S、N111G、M113V、M113R、M113T、M113K、V153I、V153T、V153A、N155K和N155H。
在一些实施方案中，DR IL-18变体多肽包含SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，DR IL-18变体多肽包含与SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列具有80％或更多(例如，85％或更多、90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多或100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DR IL-18变体多肽包含与SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列具有85％或更多(例如，90％或更多、95％或更多、98％或更多、99％或更多或100％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，DR IL-18变体多肽包含与SEQID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列具有90％或更多(例如，95％或更多、98％或更多、99％或更多或100％)序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自以下的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)：M51、M60、S105、D110和N111。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自以下的氨基酸位置处的至少3个突变：M51、M60、S105、D110和N111。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少3个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为T或K；M60为K或L；S105为D、N或A；D110为K、N、S或G；并且N111为H、Y、G或R。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在氨基酸位置M51、M60、S105、D110和N111处的突变。例如，在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ IDNO:30包含突变M51、M60、S105、D110和N111，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、M60、S105、D110和N111，其中M51为T或K；M60为K或L；S105为D、N或A；D110为K、N、S或G；并且N111为H、Y、G或R。换句话讲，在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含突变{M51T或M51K}；{M60K或M60L}；{S105D、S105N、S105A}；{D110K、D110N、D110S或D110G}；和{N111H、N111Y、N111R或N111G}。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自以下的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)：M51、K53、Q56、S105和N111。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在选自以下的氨基酸位置处的至少3个突变：M51、K53、Q56、S105和N111。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、S105和N111的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；S105为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、S105和N111的至少3个突变，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；S105为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、S105和N111的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；S105为S、N或G；并且N111为G或R。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在氨基酸位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。例如，在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；D110为S、N、G或K；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。换句话讲，在一些情况下，主题DR-IL-18变体相对于SEQ IDNO:30包含突变{M51K}；{K53G或K53S}；{Q56G、Q56R或Q56L}；{D110S、D110N或D110G}；和{N111R或N111G}。
在一些情况下，除前一段的突变之外，DR IL-18变体还包含在位置P57和M60处的突变，并且在一些情况下，还包含在位置S105处的突变。例如，在一些情况下，P57为A、K、G或L；M60为L或R，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D。在一些情况下，P57为A(即，P57A)并且M60为L(即，M60L)，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D(在一些情况下，S105D)。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)的氨基酸序列。因此，在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ IDNO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于野生型IL-18(例如，人IL-18)包含至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)(例如，参见上文全部突变组合)。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含与SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)的氨基酸序列。因此，在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个所示的氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于野生型IL-18(例如，人IL-18)包含至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155的氨基酸位置处的至少4个突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155的氨基酸位置处的至少6个突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自Y1、L5、K8、S55、Q56、P57、G59、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个突变)。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少3个突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、M60、S105、D110和N111的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少3个突变，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、M60、S105、D110和N111的氨基酸位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为T或K；M60为K或L；S105为D、N或A；D110为K、N、S或G；并且N111为H、Y、G或R。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、M60、S105、D110和N111处的突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、M60、S105、D110和N111，其中M51为T、K、D、E、R或N；M60为K、Q、L或R；S105为R、D、K、A或N；D110为H、K、N、Q、E、N、S或G；并且N111为H、D、Y、R、S或G。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、M60、S105、D110和N111，其中M51为T或K；M60为K或L；S105为D、N或A；D110为K、N、S或G；并且N111为H、Y、G或R。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、K53、Q56、D110和N111的位置处的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在选自M51、K53、Q56、D110和N111的位置处的至少3个突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、D110和N111的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；D110为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、D110和N111的至少3个突变，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；D110为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含选自M51、K53、Q56、D110和N111的至少一个突变(例如，至少2个、至少3个或至少4个突变)，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。
在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；D110为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ IDNO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。
在一些情况下，除前一段的突变之外，DR IL-18变体还包含在位置P57和M60处的突变，并且在一些情况下，还包含在位置S105处的突变。例如，在一些情况下，P57为A、K、G或L；M60为L或R，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D。在一些情况下，P57为A(即，P57A)并且M60为L(即，M60L)，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D(在一些情况下，S105D)。
鼠科动物IL-18变体多肽(在这种情况下，DR IL-18变体)的实例包括但不限于mCS1(SEQ ID NO:60)、mCS2(SEQ ID NO:61)、mC1(SEQ ID NO:62)、mA12(SEQ ID NO:63)、mE8(SEQ ID NO:64)、mC10(SEQ ID NO:65)、mB7(SEQ ID NO:66)、mB1(SEQ ID NO:67)、mD1(SEQ ID NO:68)、mH7(SEQ ID NO:69)、mA7(SEQ ID NO:70)、mE1(SEQ ID NO:71)和mH3(SEQID NO:72)。
如上文所说明，本文的任何IL-18变体都可以通过相对于SEQ ID NO:30进一步突变C38和C68来‘稳定化’。作为说明性实例，在一些情况下，主题稳定化的DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；(ii)相对于SEQ ID NO:30(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变；并且(iii)包括在C38和C68处的突变(例如，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N)。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ IDNO:89)具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为E、R或K；K53为G、S或T；Q56为E、A、R、V、G、K或L；D110为N、S、K或G；并且N111为R、S、G或D；并且(iii)包括在C38和C68处的突变(例如，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N)。在一些情况下，主题DR-IL-18变体包含以下氨基酸序列，其(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列(或SEQ ID NO:6和16-21中的任一个，或SEQ ID NO:34-59、73-91和191-193中的任一个，或SEQ ID NO:87-91中的任一个，或SEQ ID NO:89)具有85％或更多序列同一性(例如，90％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；(ii)相对于SEQ ID NO:30包含突变M51、K53、Q56、D110和N111，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R；并且(iii)包括在C38和C68处的突变(例如，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、8S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N；在一些情况下，C38S/C68D；在一些情况下，C38S/C68G；在一些情况下，C38S/C68A；在一些情况下，C38S/C68N)。
在一些情况下，除前一段的突变之外，DR IL-18变体还包含在位置P57和M60处的突变，并且在一些情况下，还包含在位置S105处的突变。例如，在一些情况下，P57为A、K、G或L；M60为L或R，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D。在一些情况下，P57为A(即，P57A)并且M60为L(即，M60L)，并且在一些此类情况下，S105为A、N或D(在一些情况下，S105D)。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G、20 C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68V、C38S/C68D、C38S/C68E或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68S、C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G、C38S/C68A、C38S/C68D或C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68D(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68D(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68G(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68A(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68A(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置P57和M60处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变。
在一些情况下，主题DR IL-18变体(i)包含突变C38S/C68N(相对于SEQ ID NO:30)；(ii)与如SEQ ID NO:30所示的野生型人IL-18氨基酸序列具有90％或更多序列同一性(例如，92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或99％或更多序列同一性)；并且(iii)相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变，其中M51为K；K53为G或S；Q56为G、R或L；D110为S、N或G；并且N111为G或R。在一些此类情况下，变体还包含在其中P57为A、K、G或L；并且M60为L或R的位置处的突变。在一些此类情况下，变体还包含在位置S105处的突变，其中S105为A、N或D。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基78处的半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基N78处的突变(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基121处的半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基E121处的突变(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基144处的半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基L144处的突变(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基157处的半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基D157处的突变(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基78、残基121、残基144或残基157处的半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有在残基N78、残基E121、残基L144或残基D157处的突变(例如，相对于SEQ ID NO:30、89和/或19)。
本公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可包含如本文所公开的对C38和C68的突变，并且可缺乏将非天然半胱氨酸残基引入到多肽序列中的任何突变。例如，在一些实施方案中，IL-18多肽(例如，DR IL-18)仅包含在位置76和/或127处的半胱氨酸(例如，相对于SEQID NO:30、89或19)。在一些实施方案中，IL-18多肽(例如，DR IL-18)不含有除在位置76和/或127之外的任何半胱氨酸(例如，相对于SEQ ID NO:30、89或19)。非天然半胱氨酸残基的缺乏可促成本公开的IL-18多肽的有利性质，例如，因为半胱氨酸残基可例如通过允许形成分子内或分子间二硫键、二聚体、聚集体等等而负面影响IL-18的稳定性和/或生物活性。
本公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可缺乏或基本上缺乏表面暴露或溶剂暴露的半胱氨酸残基。缺乏表面暴露或溶剂暴露的半胱氨酸残基可促成本公开的IL-18多肽的有利性质，例如，因为表面暴露或溶剂暴露的半胱氨酸残基可例如通过允许形成分子内或分子间二硫键、二聚体、聚集体等等而负面影响IL-18的稳定性和/或生物活性。本公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可以缺乏或基本上缺乏表面暴露或溶剂暴露的半胱氨酸残基，如通过例如结构建模或检测游离硫醇的测定(诸如Ellman滴定)所确定。本公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可缺乏或基本上缺乏游离或表面暴露的硫醇。
本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可通过其分子量来表征。例如，IL-18多肽的分子量可为约18kDa。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽的分子量为约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa、约19kDa、约20kDa、约21kDa、约22kDa或约23kDa。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽的分子量为至少约10kDa、至少约11kDa、至少约12kDa、至少约13kDa、至少约14kDa、至少约15kDa、至少约16kDa、至少约17kDa、至少约18kDa、至少约19kDa或至少约20kDa。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽的分子量为至多约17kDa、至多约18kDa、至多约19kDa、至多约20kDa、至多约21kDa、至多约22kDa、至多约23kDa、至多约24kDa、至多约25kDa、至多约30kDa、至多约40kDa、至多约50kDa或至多约100kDa。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽的分子量为约18.15153kDa、约18.1515kDa、约18.152kDa、约18.15kDa、约18.2kDa或约18kDa。
本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)可以包含例如约130、约135、约140、约145、约150、约151、约152、约153、约154、约155、约156、约157、约158、约159、约160、约161、约162、约163、约1645、约165、约170、约175、约180、约185或约190个氨基酸。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)包含至少约130、至少约135、至少约140、至少约145、至少约150、至少约151、至少约152、至少约153、至少约154、至少约155、至少约156、至少约157、至少约158、至少约159或至少约160个氨基酸。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)包含至多约155、至多约156、至多约157、至多约158、至多约159、至多约160、至多约161、至多约162、至多约163、至多约1645、至多约165、至多约170、至多约175、至多约180、至多约185或至多约190个氨基酸。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18)包含约150至约170、约152至约162、约155至约159、约156至约158或157个氨基酸。
本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开制剂中的DR IL-18)所具有的生物活性或效力的水平可通过针对生物活性的测定来测量。可用于测量本文所公开的IL-18多肽的效力或生物活性的水平的测定的非限制性实例为IL-18HEK-Blue效力测定。HEK-Blue IL-18细胞被设计来通过监测NFκβ和AP-1通路的激活来检测生物活性IL-18。这些报告细胞通过用编码IL-18Rα和IL-18Rβ的基因稳定转染HEK293衍生细胞所生成。对人TNF-α和IL-1β的响应也被阻断，所以细胞对IL-18有特异性响应。这些细胞在与五个NFκβ和五个AP-1结合位点融合的IFN-β最小启动子的控制下表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因。生物活性IL-18与HEK-Blue IL-18细胞表面上的异二聚体IL-18受体的结合触发信号传导级联，导致SEAP的产生，这可以用比色测定来量化。
可以将本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开制剂中的DR IL-18)的生物活性或效力与参考(例如，野生型IL-18)或先前产生并表征的相同IL-18多肽的参考标准相比较。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开的制剂中的DR IL-18)的生物活性或效力(例如，EC50)是参考值的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开的制剂中的DR IL-18)的生物活性或效力(例如，EC50)是参考值的至多105％、至多110％、至多115％、至多120％、至多125％、至多130％、至多135％、至多140％、至多145％、至多150％、至多155％、至多160％、至多165％、至多170％、至多175％、至多180％、至多185％、至多190％、至多195％、至多200％、至多250％或至多300％。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开的制剂中的DR IL-18)的生物活性或效力(例如，EC50)是参考值的约30％至约500％、约30％至约250％、约30％至约200％、约30％至约175％、约30％至约150％、约30％至约140％、约30％至约130％、约30％至约120％、约30％至约110％、约30％至约105％、约50％至约500％、约50％至约250％、约50％至约200％、约50％至约175％、约50％至约150％、约50％至约140％、约50％至约130％、约50％至约120％、约50％至约110％、约50％至约105％、约60％至约500％、约60％至约260％、约60％至约200％、约60％至约175％、约60％至约160％、约60％至约140％、约60％至约130％、约60％至约120％、约60％至约110％、约60％至约105％、约70％至约500％、约70％至约250％、约70％至约200％、约70％至约175％、约70％至约150％、约70％至约140％、约70％至约130％、约70％至约120％、约70％至约110％、约70％至约105％、约90％至约500％、约90％至约250％、约90％至约200％、约90％至约175％、约90％至约150％、约90％至约140％、约90％至约130％、约90％至约120％、约90％至约110％或约90％至约105％。在一些实施方案中，生物活性或效力(例如，EC50)是参考值的至少60％且至多140％。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽(例如，DR IL-18，诸如本公开的制剂中的DR IL-18)的生物活性或效力(例如，EC50)是人野生型IL-18的生物活性或效力的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％、至少97.5％、至少100％、至少102.5％、至少105％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少140％、至少150％、或至少200％、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍，例如，如通过IL-18HEK-Blue效力测定所确定。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽表现出小于约100μM、小于约10μM、小于约1μM、小于约900nM、小于约800nM、小于约700nM、小于约600nM、小于约500nM、小于约400nM、小于约300nM、小于约200nM、小于约100nM、小于约50nM、小于约30nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约300pM、小于约200pM、小于约100pM、小于约50pM、小于约10pM或小于约1pM的EC50，例如，如通过IL-18HEK-Blue效力测定所确定。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽表现出约1pM至约1μM、约1pM至约500nM、约1pM至约400nM、约1pM至约300nM、约1pM至约200nM、约1pM至约100nM、约1pM至约50nM、约1pM至约10pM、约10pM至约1μM、约10pM至约500nM、约10pM至约400nM、约10pM至约300nM、约10pM至约200nM、约10pM至约100nM、约10pM至约50nM、约50pM至约1μM、约50pM至约500nM、约50pM至约400nM、约50pM至约300nM、约50pM至约200nM、约50pM至约100nM、约100pM至约1μM、约100pM至约500nM、约100pM至约400nM、约100pM至约300nM或约100pM至约200nM的EC50，例如，如通过IL-18HEK-Blue效力测定所确定。
核酸
本文还提供了编码本文所述的任何蛋白质(例如，具有在C38和C68处的突变IL-18蛋白)的核酸。此类核酸可以采取任何方便的形式(例如，PCR产物、载体(诸如病毒载体)、质粒、粘粒、微环等等)。在一些情况下，编码主题IL-18蛋白的核苷酸序列可操作地连接到启动子(在其控制下)(例如，在原核细胞中是功能性的，或在一些情况下，在真核细胞诸如酵母或免疫细胞诸如T细胞、NK细胞、TIL等等中是功能性的)。
本文还提供了包含此类核酸和/或包含主题IL-18蛋白(例如，稳定化的蛋白质)的细胞。在一些情况下，细胞是原核细胞，诸如细菌细胞(例如，出于繁殖核酸的目的或出于生产主题蛋白质的目的)；在一些情况下，细胞是真核细胞，诸如酵母细胞(例如，出于生产主题蛋白质的目的)；并且在一些情况下，细胞是免疫细胞，诸如T细胞(例如，CAR-T细胞，诸如TRUCK细胞)、TIL、TCR-T细胞(具有工程化TCR的T细胞，例如，被工程化成与天然TCR相比以增加的亲和力结合靶抗原)或NK细胞(例如，CAR-NK细胞)，例如，此类细胞可以被工程化成表达(例如，分泌)主题IL-18蛋白(例如，稳定化的蛋白质，诸如SEQ ID NO:19)。
细胞因子抑制剂
在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种细胞因子的抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子的抑制剂包括抑制一种或多种细胞因子的表达、活性或两者的化合物、蛋白质、肽、拟肽、抗体、核酶、小分子化合物或反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)。在一些实施方案中，抑制剂抑制IL-17、IL-5或IL-3的表达、活性或两者。在一些实施方案中，细胞因子抑制剂降低毒性。在一些实施方案中，细胞因子抑制剂增加施用的IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DRIL-18变体和稳定化的D2D IL-18变体)。
治疗
在各种实施方案中，本公开包括包含IL-18活性的激活剂(例如，稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体和稳定化的D2D IL-18变体)的组合物，其在诸如在细胞、组织、器官、系统或有需要的对象中通过至少一种IL-18R刺激信号传导活性的方法中使用。在各种实施方案中，本发明的IL-18活性组合物的激活剂和治疗方法增加IL-18R信号传导的量、免疫细胞活性的量或两者。在各种实施方案中，IL-18R信号传导的增加可改善治疗结局的疾病和病症包括但不限于癌症、感染性疾病、黄斑变性和代谢疾病或病症。
上文讨论了各种IL-18多肽(例如，具有C38/C68突变的IL-18多肽)，并且此处不重复，因为上文所讨论的任何蛋白质都可以用于本文所讨论的方法。例如，在一些情况下，使用稳定化的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18变体多肽，诸如稳定化的DR IL-18变体和稳定化的D2D IL-18变体)例如治疗疾病或病症，诸如癌症或感染(例如，对免疫检查点抑制剂具有抗性的癌症、与MHC I类的表达减少或不存在的肿瘤相关联的癌症、与高水平IL-18BP(例如，循环或肿瘤表达)相关联的癌症、与IL-18R在浸润T细胞或NK细胞上表达的肿瘤相关联的癌症、代谢疾病或病症、感染性疾病、病毒感染(诸如HIV)等等)。
在一些情况下，施用的多肽是野生型IL-18多肽(例如，野生型人IL-18蛋白)。在一些情况下，施用的多肽是主题稳定化的IL-18多肽(例如，相对于SEQ ID NO:30包含在位置C38和C68处的氨基酸突变的多肽)。在一些情况下，施用的多肽是IL-18变体多肽，诸如DRIL-18变体或D2D IL-18变体。在一些情况下，施用的多肽是稳定化的IL-18变体多肽(例如，稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体，参见，例如，上文所讨论的稳定化的DRIL-18变体多肽)。
融合/缀合
在一些实施方案中，本公开的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与另一分子缀合(例如，与另一蛋白质融合)，即，IL-18变体多肽可以与第二多肽(融合配偶体)同框地融合。在一些实施方案中，第二多肽(融合配偶体)能够增加融合蛋白的总体大小，例如，使得融合蛋白将不被迅速从循环清除。在一些情况下，IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)不与第二多肽融合。
在一些实施方案中，第二多肽(IL-18变体多肽或其片段的融合配偶体)是免疫球蛋白Fc区(即，抗体Fc序列)的一部分或全部。在其他实施方案中，第二多肽是与Fc基本相似(例如，提供增加的大小、多聚化结构域和/或与Ig分子的额外结合或相互作用)的任何合适的多肽。在一些实施方案中，第二多肽是人血清白蛋白(HSA)的一部分或全部。在一些实施方案中，第二多肽是抗体、抗体片段、骆驼科动物抗体或“纳米抗体”的一部分或全部或与HSA结合或相互作用的其他亲和试剂。这些融合蛋白可以促进纯化、多聚化并且显示出增加的体内半衰期。在一些情况下，具有二硫键连接的多聚体结构的融合蛋白也可以更有效地结合和中和其他分子。
当与异源多肽融合时，对应于IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的部分可被称为主题IL-18变体多肽的“IL-18变体多肽部分”。
在一些情况下，第二多肽是标志序列(例如，亲和标签)，诸如促进融合的多肽的纯化的肽。例如，标志氨基酸序列可以是六组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN,Inc.,9259EtonAvenue,Chatsworth,Calif.,91311)中提供的标签等，其中许多是可商购获得的。如Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824,1989中所述，例如，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利。可用于纯化的另一肽标签，“HA”标签，对应于来源于流感血凝素蛋白的表位。Wilson等人,Cell 37:767,1984。添加肽部分以促进多肽的处理是本领域中熟悉且常规的技术。主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2DIL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)可以被修饰，例如，与广泛多种其他寡肽、蛋白质和/或非蛋白质分子接合/缀合以实现多种目的。例如，通过例如异戊烯化、乙酰化、酰胺化、羧化、糖基化、聚乙二醇化(聚乙二醇(PEG)聚合物链的共价附接)等进行翻译后修饰。此类修饰还包括糖基化的修饰，例如通过在其合成和加工过程中或在进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化形式而进行的那些修饰；例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶(诸如哺乳动物糖基化酶或脱糖基化酶)而进行的那些修饰。在一些实施方案中，主题IL-18变体多肽具有一个或多个磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽是糖基化的。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽是非糖基化的。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽与水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽与以下缀合：聚乙二醇均聚物、聚乙二醇共聚物、聚丙二醇均聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚(N-2-(羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚(唾液酸)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或葡聚糖。
在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽不与水溶性聚合物缀合。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽不是聚乙二醇化的。在一些实施方案中，本文所公开的IL-18多肽不与以下缀合：聚乙二醇均聚物、聚乙二醇共聚物、聚丙二醇均聚物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚(乙二醇-共-丙二醇)、聚(N-2-(羟丙基)甲基丙烯酰胺)、聚(唾液酸)、聚(N-丙烯酰基吗啉)或葡聚糖。
在一些其他实施方案中，本公开的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)包括进一步修饰以改善它们对蛋白水解降解的抗性、或优化溶解性、或使它们更适合用作治疗剂的试剂。例如，本公开的变体还包括含有除天然存在的L-氨基酸之外的残基的类似物，例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。D-氨基酸可以取代一些或所有氨基酸残基。
共同施用和多特异性IL-18变体多肽
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与额外剂一起施用。术语“共同施用(co-administration)”、“共同施用(co-administer)”和“组合”包括两种或更多种治疗剂(例如，主题稳定化的IL-18)在没有特定时间限制的情况下同时、并行或顺序施用。在一些实施方案中，各剂同时存在于细胞或对象体内或者同时发挥它们的生物学或治疗作用。在一些实施方案中，治疗剂在相同的组合物或单位剂型中。在其他实施方案中，治疗剂在单独的组合物或单位剂型中。在某些实施方案中，第一剂可以在施用第二治疗剂之前(例如，之前数分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用。
在一些情况下，主题IL IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)(例如，配制为药物组合物)与癌症治疗药物、治疗感染的治疗药物或癌症导向的抗体一起共同施用。此类施用可能涉及相对于本公开的一种或多种剂的施用并行(即，同时)、在先或后续施用药物/抗体。本领域的普通技术人员将不难确定本公开的特定药物和组合物的适当施用时间、顺序和剂量。
在一些实施方案中，治疗是通过施用主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与另一剂(例如，免疫刺激剂、治疗慢性感染的剂、细胞毒性剂、抗癌剂等等)的组合来完成。可以使用的一类示例性细胞毒性剂是化学治疗剂。示例性化学治疗剂包括但不限于阿地白介素(aldesleukin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、博来霉素(bleomycin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、克拉屈滨(cladribine)、西沙必利(cisapride)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(DTIC，dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、多西紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、屈大麻酚(dronabinol)、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷(etoposide)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、吉西他滨(gemcitabine)、格拉司琼(granisetron)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、干扰素α、伊立替康(irinotecan)、兰索拉唑(lansoprazole)、左旋咪唑(levamisole)、亚叶酸(leucovorin)、甲地孕酮(megestrol)、美司钠(mesna)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奥美拉唑(omeprazole)、昂丹司琼(ondansetron)、紫杉醇(paclitaxel)(TaxolTM)、毛果芸香碱(pilocarpine)、丙氯拉嗪(prochloroperazine)、利妥昔单抗、saproin、他莫昔芬(tamoxifen)、紫杉酚(taxol)、盐酸托泊替康(topotecan hydrochloride)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)和酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)。
主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)不一定但任选地与一种或多种加强活性或以其他方式增加治疗效果的剂一起配制。在一些实施方案中，治疗是通过施用主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与调理靶细胞的剂的组合(共同施用)来完成。因此，本文还设想了包含以下的组合物(以及使用组合物的方法)：(a)主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)；和(b)调理靶细胞的剂。在一些情况下，调理靶细胞的剂是利妥昔单抗。在一些情况下，调理靶细胞的剂是西妥昔单抗(Cetuximab)。
“调理靶细胞的剂”(“调理剂”)是可以结合靶细胞(例如，癌细胞、携带细胞内病原体的细胞等)并调理靶细胞(例如，标记细胞以实现吞噬作用和/或实现抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC))的任何剂。例如，可以结合靶细胞(例如，癌细胞，诸如肿瘤细胞)的任何抗体，其中抗体具有FC区，被认为是调理靶细胞的剂。在一些情况下，调理靶细胞的剂是结合靶细胞的抗体(例如，抗肿瘤抗体、抗癌抗体、抗感染抗体等等)。
例如，对肿瘤细胞标志物、辐射、手术和/或激素剥夺具有选择性的抗体，参见Kwon等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,96:15074-9,1999。
血管生成抑制剂也可以与本发明的方法组合。许多抗体目前已在临床上用于治疗癌症，而其他抗体则处于不同的临床开发阶段。例如，有许多抗原和对应的单克隆抗体用于治疗B细胞恶性肿瘤。一种靶抗原是CD20。利妥昔单抗是针对CD20抗原的嵌合未缀合单克隆抗体。CD20在B细胞激活、增殖和分化中具有重要的功能作用。CD52抗原由单克隆抗体阿仑单抗(alemtuzumab)靶向，所述抗体被指示用于治疗慢性淋巴细胞白血病。CD22由许多抗体靶向，并且最近在化学疗法抗性毛细胞白血病中证明了与毒素组合的功效。靶向CD20的两种新的单克隆抗体托西莫单抗(tositumomab)和替伊莫单抗(ibritumomab)已提交给美国食品和药物管理局(FDA)。这些抗体与放射性同位素缀合。阿仑单抗(Alemtuzumab)(Campath)用于治疗慢性淋巴细胞白血病；吉妥珠单抗(Gemtuzumab)(Mylotarg)用于治疗急性骨髓性白血病；替伊莫单抗(Zevalin)用于治疗非霍奇金淋巴瘤；帕尼单抗(Panitumumab)(Vectibix)用于治疗结肠癌。
已用于实体瘤的可用于本公开的方法的单克隆抗体包括但不限于依决洛单抗(edrecolomab)和曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin))。依决洛单抗靶向结肠癌和直肠癌中出现的17-1A抗原，并且已被批准在欧洲用于这些适应症。曲妥珠单抗靶向HER-2/neu抗原。西妥昔单抗(Erbitux)也可用于本公开的方法中。所述抗体结合EGF受体(EGFR)，并且已用于治疗实体瘤，包括结肠癌和头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)。
主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)可以与上文提及的剂中的任一种(例如像作为调理靶细胞的抗体的剂)。因此，在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)与一种或多种对癌细胞(例如，肿瘤细胞)具有选择性的调理剂一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)。在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)与以下中的一种或多种一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)：西妥昔单抗(cetuximab)(结合EGFR)、帕尼单抗(panitumumab)(结合EGFR)、利妥昔单抗(rituximab)(结合CD20)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(结合HER2)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(结合HER2)、阿仑单抗(alemtuzumab)(结合CD52)、本妥昔单抗(brentuximab)(结合CD30)、托西莫单抗(tositumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)和依决洛单抗(edrecolomab)(结合17-1A)或其组合。
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与癌细胞调理剂(例如，包含靶向以下的抗原结合区的那些：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD45、CD47、CD51、CD52、CD56、CD62L、CD70、CD74、CD79、CD80、CD96、CD97、CD99、CD123、CD134、CD138、CD152(CTLA-4)、CD200、CD213A2、CD221、CD248、CD276(B7H3)、B7H4、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、CD319、SIRPa、EGFR、EPCAM、17-1A、HER1、HER2、HER3、CD117、C-Met、HGFR、PDGFRA、AXL、TWEAKR、PTHR2、HAVCR2(TIM3)、GD2神经节苷脂、MUC1、粘蛋白CanAg、间皮素、内皮糖蛋白、路易斯-Y抗原、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CA-125、PSMA、BAFF、FGFR2、TAG-72、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、连接素-4、BCMA、CSF1R、SLAMF7、整联蛋白αvβ3、TYRP1、GPNMB、CLDN18.2、FOLR1、CCR4、CXCR4、MICA、C242抗原、DLL3、DLL4、EGFL7、波形蛋白、纤连蛋白额外结构域-B、TROP-2、LRRC15、FAP、SLITRK6、NOTCH2、NOTCH3、肌腱蛋白-3、STEAP1或NRP1或其任何组合)共同施用。
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与靶向选自以下的一种或多种抗原的剂共同施用：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD47、SIRPA、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、EGFR、17-1A、HER2、CD117、C-Met、PTHR2和HAVCR2(TIM3)。
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与便利的免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂或免疫激动剂)一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)。如上文所说明的，免疫检查点抑制剂的靶标的实例包括但不限于：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR和LILRB2。因此，免疫检查点抑制剂的实例包括抑制诸如以下的蛋白质的剂(例如，抗体)：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR和LILRB2。在一些情况下，主题稳定化的IL-18变体多肽(例如，DR-IL-18变体、D2D-IL-18变体)(例如，SEQ ID NO:19)与抑制以下的免疫检查点抑制剂(例如，抗体)共同施用：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR、LILRB2或其任何组合。
在一些情况下，主题稳定化的IL-18变体多肽(例如，DR-IL-18变体、D2D-IL-18变体)(例如，SEQ ID NO:19)与免疫激动剂共同施用。免疫激动剂的实例包括激动诸如以下的蛋白质的剂(例如，激动抗体)：肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)；免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)；TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)；核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(DDX58))。免疫激动剂的实例还包括但不限于：炎性小体激活剂(激动剂)、T细胞接合器(例如，将CD3和/或CD28与肿瘤抗原交联的多特异性剂，例如BiTE)和细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)。
因此，在一些情况下，主题稳定化的IL-18变体多肽(例如，DR-IL-18变体、D2D-IL-18变体)(例如，SEQ ID NO:19)与诸如以下的免疫激动剂共同施用：激动肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)的剂(例如，抗体)；激动免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)的剂(例如，抗体)；激动TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)的剂；激动核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(DDX58))的剂；炎症小体激活剂；T细胞接合器(例如，将CD3和/或CD28与肿瘤抗原交联的多特异性剂，例如，BiTE)；细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)；或其任何组合。
在一些情况下，主题稳定化的IL-18变体多肽(例如，DR-IL-18变体、D2D-IL-18变体)(例如，SEQ ID DO:19)与以下共同施用：TGFβ拮抗剂，诸如抗TGFβ抗体；干扰素，诸如干扰素α、干扰素β或干扰素γ；TNF；TRAIL；淋巴毒素；LIGHT/TNSF14；等等。
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与BTLA和/或CD160的抑制剂一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)。在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与抗CD47/SIRPA剂(例如，抗CD47、抗SIRPA、高亲和力CD47结合剂、高亲和力SIRPA结合剂等等)一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)。在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ IDNO:19)与TIM3和/或CEACAM1的抑制剂一起以组合疗法的形式使用(与其共同施用)。
在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与另一蛋白质(即，“融合配偶体”、“第二多肽”)融合。在一些实施方案中，第二多肽(主题IL-18变体多肽的融合配偶体)特异性结合除融合蛋白的IL-18变体多肽部分所结合的靶分子之外(例如，除结合IL-18R的变体的IL-18R之外；或除结合IL-18BP的变体的IL-18BP之外)的靶分子。
因此，在一些实施方案中，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)是多特异性的(例如，双特异性的)。术语“多特异性”或“双特异性”通常当指代以下剂(例如，配体或抗体)时使用，所述剂凭借拥有至少一个对第一靶标具有特异性的区域(例如，配体或第一抗体的Fab)和至少对第二靶标具有特异性的第二区域(例如，配体或第二抗体的Fab)来识别两个或更多个不同抗原。双特异性剂特异性结合两个靶标，并且因此是一种类型的多特异性剂。
在一些实施方案中，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)是多特异性的(例如，双特异性的)，使得多肽的第一区域包含主题IL-18变体多肽序列(即，第一区域包含IL-18变体多肽)和特异性结合另一靶分子(例如，抗原)的第二区域。例如，在一些情况下，IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)与第二多肽融合，第二多肽特异性结合除IL-18变体多肽所结合的靶分子之外的靶分子。
在共同施用的情境中，上文所讨论的任何一种剂都可以与主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQID NO:19)缀合。如本文所用，术语“共同施用”意在涵盖此类缀合的化合物。例如，当剂1与剂2共同施用时，所述术语意在涵盖其中剂1和剂2未彼此缀合的实施方案，并且还意在涵盖其中剂1和剂2彼此缀合(例如，其中剂1和剂2都是蛋白质，并且剂1与剂2融合)的实施方案。
在一些情况下，多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域包含检查点抑制剂。在一些情况下，多特异性IL-18变体多肽的第二区域抑制选自以下的一种或多种蛋白质：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR和LILRB2。
在一些情况下，多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域包含免疫激动剂。在一些情况下，多特异性IL-18变体多肽的第二区域激动选自以下的一种或多种蛋白质：ICOS、GITR、41BB、OX40和CD40。可用作多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域(或作为其一部分)的免疫激动剂的额外实例包括但不限于：激动肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)的剂(例如，抗体或其抗原结合区)；激动免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)的剂(例如，抗体或其抗原结合区)；激动TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)的剂；激动核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(D DX58))的剂；炎症小体激活剂；T细胞接合器(例如，将CD3和/或CD28与肿瘤抗原交联的多特异性剂，例如BiTE)；细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)；等等。
在一些情况下，多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域是癌细胞调理剂。在一些情况下，多特异性IL-18变体多肽的第二区域靶向选自以下的一种或多种蛋白质：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD47、SIRPA、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、EGFR、17-1A、HER2、CD117、C-Met、PTHR2和HAVCR2(TIM3)。在一些情况下，多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域是靶向选自以下的一种或多种蛋白质的调理剂：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD47、SIRPA、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、EGFR、17-1A、HER2、CD117、C-Met、PTHR2和HAVCR2(TIM3)。
例如，在一些情况下，多特异性IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的第二区域包含胞外域，例如来自PD-1、PD-L1、CD47(例如，亲和力CD47变体/多肽)或SIRPA(例如，高亲和力SIRPA变体/多肽)的胞外域。在一些情况下，多特异性IL-18变体多肽的第二区域特异性结合选自以下的抗原：CTLA-4、Lag-3、BTLA、Tim-3、CD244、CD40、CD40L、CD47、SIRPA、PD-1和PD-L1。
在一些实施方案中，IL-18变体多肽的生物活性相对于野生型IL-18增加。在一些实施方案中，相对于天然存在于野生型IL-18中的半胱氨酸残基，IL-18变体不包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，IL-18变体多肽包含不具有聚乙二醇化氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，主题IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)包含接头(例如，接头多肽)。例如，在一些实施方案中，主题IL-18变体多肽和融合配偶体由接头(例如，接头多肽)分开。接头多肽可以具有多个氨基酸序列中的任一个。蛋白质可以通过接头多肽连接，接头多肽可以具有柔性性质(例如，柔性接头多肽)，但不排除其他化学键联。合适的接头包括长度在约6个氨基酸与约40个氨基酸之间或长度在约6个氨基酸与约25个氨基酸之间的多肽。这些接头可以通过使用合成的接头编码寡核苷酸与蛋白质偶联来产生。可以使用具有一定程度柔性的肽接头。连接肽实际上可以具有任何氨基酸序列，应记住在一些情况下，接头将具有产生总体上柔性的肽的序列。使用小氨基酸(诸如甘氨酸和丙氨酸)用于产生柔性肽。对于本领域技术人员来说，产生此类序列是常规的。多种不同的接头是可商购获得的并且被认为适用。
在一些实施方案中，IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)与免疫细胞共同施用，免疫细胞诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、CAR-T、TCR-T细胞(具有工程化的TCR(例如，被工程化成以与天然TCR相比增加的亲和力结合靶抗原)的T细胞)、CAR-NK细胞或用工程化T细胞受体转导的T细胞或NK细胞。在其他实施方案中，IL-18变体多肽与溶瘤病毒共同施用。
在一些实施方案中，编码IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)的核酸包含在工程化(“改变的”)免疫细胞内，免疫细胞诸如CAR-T、TCR-T细胞或CAR-NK细胞或者用工程化T细胞受体或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)转导的T细胞或NK细胞。在这种情况下，工程化细胞(例如，改变的T细胞、改变的NK细胞、改变的TIL)会分泌IL-18变体多肽。分泌IL-18变体肽的能力可以以上下文的方式(例如，在肿瘤微环境内开启)，例如通过合成NOTCH受体来调控。
在一些实施方案中，编码IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)的核酸包含在溶瘤病毒中。在这种情况下，被溶瘤病毒感染的细胞会分泌IL-18变体多肽。
在一些实施方案中，将IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)施用于细胞、组织、器官、系统或治疗疾病或病症的对象。在一些实施方案中，将人IL-18变体多肽施用于细胞、组织、器官、系统或对象。在一些实施方案中，将编码至少一种人IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)的核酸(例如，DNA、cDNA、mRNA等)施用于细胞、组织、器官、系统或对象。
在一些实施方案中，将本发明的组合物施用于鼠科动物细胞、组织、器官、系统或治疗或预防疾病或病症的对象。在一些实施方案中，将鼠科动物IL-18变体多肽或其片段施用于细胞、组织、器官、系统或对象(例如，人细胞、组织、器官、系统或对象)。在一些实施方案中，将编码至少一种鼠科动物IL-18变体多肽的核酸(例如，DNA、cDNA、mRNA等)施用于细胞、组织、器官、系统或对象。如本文其他地方所述，鼠科动物IL-18变体多肽(在这种情况下，DR IL-18变体)的实例包括但不限于：SEQ ID NO:60-72。还如本文其他地方所指出的，鼠科动物IL-18变体(在这种情况下，D2D IL-18变体，其结合IL-18BP，但与IL-18R的结合减少)的实例包括但不限于SEQ ID NO:126-190。
在一些实施方案中，所述方法包括向对象、细胞或组织施用编码一种或多种本文所述的IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)的分离的核酸分子。IL-18信号传导水平的增加，包括通过使用IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)，可以使用多种方法(包括本文所公开的那些方法)以及本领域已知或将来开发的方法来评估。即，按程序操作的人员基于本文所提供的公开内容将理解，增加IL-18信号传导的水平或活性可以容易地使用评估编码IL-18或IL-18变体多肽或其片段的核酸(例如，mRNA)的水平、IL-18或IL-18变体多肽或片段多肽的水平和/或获自对象的生物样品中IL-18或IL-18变体多肽或片段活性的水平来评估。
本领域技术人员基于本文所提供的公开内容将理解，本公开的组合物(IL-18变体多肽，诸如稳定化的IL-18)可用于整体(例如全身)或部分(例如，局部、细胞、组织、器官)正在或将要治疗疾病或病症(其中IL-18信号传导活性的增加将是有益的)的对象。技术人员基于本文提供的教导将理解，可通过本文所述的组合物和方法治疗的疾病和病症包括其中IL-18信号传导的增加将促进积极的生物学、生理学、临床或治疗结局的任何疾病或病症。
在一些实施方案中，一种方法包括向有需要的对象施用包含至少一种IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的组合物以及向对象施用包含额外剂的组合物。在一个此类实施方案中，额外剂包括免疫治疗剂，其包括选自以下的至少一种但不限于此：改变的T细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)、武装的CAR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)、TCR-T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、病毒、抗原、疫苗、抗体、免疫检查点抑制剂、小分子、化疗剂和干细胞。在一些实施方案中，包含至少一种IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的组合物用于在被细菌、病毒或其他病原体感染之前、期间或之后增加免疫系统活性的方法。在一些实施方案中，包含至少一种IL-18变体多肽的组合物用于在体外、体内或离体增加免疫细胞的数目和/或活性(诸如T细胞、NK细胞和/或髓系细胞的数目和/或活性)的方法。
在一些实施方案中，额外剂包括一种或多种细胞因子的抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种细胞因子的抑制剂包括抑制一种或多种细胞因子的表达、活性或两者的化合物、蛋白质、肽、拟肽、抗体、核酶、小分子化合物或反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)。在一些实施方案中，抑制剂抑制IL-17、IL-5或IL-3的表达、活性或两者。在一些实施方案中，细胞因子抑制剂的施用降低了毒性。在一些实施方案中，施用细胞因子抑制剂增加施用的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的功效。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意指以下化学组合物，其可以合并适当的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)，并且在合并之后，其可以用于向对象施用IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQID NO:19)。
IL-18变体的产生
SUMO蛋白酶
提供了用于通过使用SUMO(小泛素样修饰物)蛋白酶从感兴趣的多肽切割SUMO标签来制备感兴趣的多肽(例如，非活性蛋白质)的组合物和方法。SUMO标签可以放置在感兴趣的蛋白质的N-末端，并且SUMO蛋白酶(例如，ULP1)可以经由切割反应来无痕去除SUMO标签。在一些情况下，切割将在细胞中(例如，在细菌细胞中，在酵母细胞中)发生，而在其他情况下，切割将无细胞地在体外发生。
例如，在一些情况下，将融合蛋白(包括在其N-末端与SUMO标签融合的感兴趣的蛋白质)引入到细菌细胞中(例如，经由编码融合蛋白的核酸)，并且还将SUMO蛋白酶引入到同一细胞(在此类情况下，两种蛋白质都可以称为是外源引入的)，并且因此，切割反应将在细胞内部发生。在一些情况下，蛋白酶将由整合到细胞基因组中的核酸编码，而在一些情况下，核酸将不被整合(例如，可以是质粒)。SUMO蛋白酶可以从组成型启动子表达或者可以可操作地连接诱导型启动子(诸如鼠李糖-诱导型启动子)(在其控制下)。可以使用任何方便的诱导型启动子。因此，在一些此类情况下，使融合蛋白与细胞(例如，细菌细胞)中的SUMO蛋白酶接触可以包括诱导SUMO蛋白酶的表达。
在一些情况下，融合蛋白和SUMO蛋白酶由相同核酸(例如质粒)编码。在一些此类情况下，两种蛋白质都可操作地连接至相同启动子(例如，它们可以从双顺反mRNA翻译)，而在其他情况下，两种蛋白质可操作地连接至单独的启动子。
在一些情况下，融合蛋白在无细胞体外环境中与SUMO蛋白酶接触。例如，可以纯化/分离融合蛋白，然后将其与纯化的SUMO蛋白酶(很容易获得)接触。
当感兴趣的多肽是IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体，等等)(例如，SEQID NO:19)时，当N-末端氨基酸是甲硫氨酸时，此类蛋白质不是全部都具有活性(例如，人野生型IL-18蛋白通常被半胱天冬酶-1切割以露出N-末端酪氨酸，因此获得活性成熟形式)。因此，本公开的方法可用于产生活性IL-18多肽。在此类情况下，SUMO(小泛素样修饰物)标签可用于促进大量融合蛋白(IL-18加SUMO标签)的产生，之后去除SUMO标签以露出在N-末端激活的IL-18蛋白(例如，具有非甲硫氨酸(例如酪氨酸)的蛋白质)。可以通过将融合蛋白与SUMO蛋白酶(例如，酵母ULP1)接触来去除SUMO标签，所述蛋白酶切割掉标签以露出天然N-末端氨基酸(在人IL-18的情况下，Tyr)。在一些情况下，接触在细胞(诸如，细菌细胞)内部进行。在一些此类情况下，然后可以例如从细胞裂解物纯化产生的活性蛋白(参见下文进一步细节)。
可以使用任何方便的SUMO标签，并且一个此类实例如SEQ ID NO:26所示。在一些情况下，例如，出于后续纯化的目的(参见下文)，需要在SUMO标签上包含额外标签(例如，6XHis标签)。SEQ ID NO:27提供了这种加标签的SUMO标签的一个非限制性实例。
纯化步骤
在一些实施方案中，主题‘制备方法’/‘产生’还包括在去除了SUMO标签之后纯化感兴趣的多肽(例如，IL-18多肽，诸如稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等)(例如，SEQ ID NO:19)。在一些此类情况下，切割(SUMO标签去除)无细胞地在体外发生，并且纯化可以包括去除SUMO标签和SUMO蛋白酶。例如，在一些情况下，SUMO蛋白酶和/或SUMO标签可以加标签(例如，加His标签)，这在一些情况下，这可以促进切割之后这些成分的去除，例如，以用于纯化感兴趣的多肽，例如，使用固定化金属亲和色谱法(IMAC)，诸如镍柱。
在一些情况下，切割(SUMO标签去除)在细胞(例如，如上所讨论的细菌细胞)中发生，并且从细胞裂解物纯化感兴趣的多肽。在一些情况下，感兴趣的多肽被分泌到培养基中(例如，在一些情况下，当使用酵母细胞时)，然后从培养基纯化。可以使用任何方便的步骤或一系列步骤以从例如细菌裂解物或已分泌了蛋白质的培养基纯化蛋白质。在一些情况下(例如，在感兴趣的多肽是IL-18多肽，诸如稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等的一些情况下)(例如，SEQ IDNO:19)，纯化包括离子交换色谱法(例如，Capto Q)、IMAC(例如，以去除任何残留的加his标签的SUMO、未切割的蛋白质和/或蛋白酶)、多模式色谱法(例如，Capto MMC色谱法，CaptoMMC是多模式耐盐树脂，用于通过填充床色谱法从大量进料捕获和中间纯化蛋白质)和疏水相互作用色谱法(HIC)(例如，在一些情况下，苯基琼脂糖凝胶HIC)。在一些情况下，还进行高效Q色谱法。在一些此类情况下，在每个色谱法步骤之前进行超滤(UF)和渗滤(DF)步骤。作为一种可能的纯化过程的实例，参见图48。
本领域技术人员将理解，当配备了包括本文详述的方法的本公开时，本发明不限于疾病或病症一旦确定后的治疗。特别是，疾病或病症的症状不必表现到对对象有害的程度；事实上，在施用治疗之前，不需要在对象中检测到疾病或病症。即，来自疾病或病症的显著病理学不必在本发明可以提供益处之前发生。因此，如本文更全面描述的，本发明包括用于预防对象的疾病和病症的方法，因为如本文别处所讨论的IL-18活性的激活剂可在疾病或病症发作之前施用于对象，从而防止疾病或病症的发展。
本公开的药物组合物
包含如本文别处所述的多肽、多肽片段、IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的组合物可以被配制并施用于对象，如现在所描述的。通过非限制性实例，用于治疗和/或预防疾病或病症的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)可以被配制并施用于对象，以任何方便的方式，例如，如现在所描述的。
本公开涵盖药物组合物的制备和用途，所述药物组合物包含可用于治疗或预防疾病或病症的组合物，在本文中公开为活性成分(IL-18多肽，例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)。此类药物组合物可以仅由活性成分组成，呈适于施用于对象的形式，或者药物组合物可以包含活性成分和一种或多种药学上可接受的载剂、一种或多种额外成分或这些的一些组合。活性成分可以呈生理上可接受的酯或盐的形式存在于药物组合物中，诸如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合，如本领域所熟知的。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”意指以下化学组合物，适当的IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)可以与其组合并且在组合之后，其可用于施用于对象。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含大型、缓慢代谢的大分子诸如蛋白质、多糖诸如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(诸如乳胶官能化SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。
用于实施主题方法的药物组合物(例如，IL-18多肽，诸如野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ IDNO:19)可以被施用以递送每千克约0.1ng至100mg(例如，每千克1ng至100mg、100ng至100mg、1ug至100mg、100ug至100mg、1mg至100mg、25mg至100mg、50mg至100mg、1ng至80mg、100ng至80mg、1ug至80、100ug至80mg、1mg至80mg、25mg至80mg、50mg至80mg、1ng至50mg、100ng至50mg、1ug至50mg、100ug至50mg、1mg至50mg、25mg至50mg、50mg至50mg、1ng至50mg、100ng至50mg、1ug至50mg、100ug至50mg、1mg至50mg或25mg至50mg)的剂量。给药在本文别处更详细地描述。
在各种实施方案中，可用于本发明方法中的药物组合物可以如下施用，例如全身、肠胃外、皮下、腹膜内或局部，诸如以口服制剂、吸入制剂包括固体或气溶胶，和通过局部或其他相似的制剂，或眼内。除了适当的治疗性组合物之外，此类药物组合物可以包含药学上可接受的载剂和已知增强并促进药物施用的其他成分。根据本发明的方法，还可以使用其他可能的制剂，诸如纳米颗粒、脂质体、含有活性成分的其他制剂和基于免疫学的系统施用其合适的调节剂。
载剂可以以多种方式携带主题剂(例如，IL-18变体多肽)，包括直接或经由接头基团的共价结合以及非共价缔合。合适的共价键载剂包括蛋白质诸如白蛋白、肽和多糖诸如氨基葡聚糖，它们中的每一个都具有多个用于连接部分的位点。载剂还可以通过非共价缔合(诸如非共价键合或通过封装)携带IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DRIL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)。出于本发明的目的，载剂的性质可以是可溶的或不可溶的。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属复合物(例如，锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。待用于体内施用的制剂必须为无菌的。这易于通过无菌过滤膜过滤来实现。
活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微胶囊中，例如分别在胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著.(1980)中。
组合物可以制备成可注射的药，呈液体溶液或混悬液；也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。如上文所讨论，制剂还可以被乳化或封装在脂质体或微颗粒中，诸如聚交酯、聚乙交酯或共聚物，以实现增强的佐剂作用。Langer,Science 249:1527,1990和Hanes,Advanced Drug Delivery Reviews 28:97119,1997。本发明的剂可以可以允许活性成分持续或脉动释放的方式配制的储槽注射液或植入制剂形式施用。药物组合物通常配制呈无菌、大致上等渗并且完全遵循美国食品药品管理局的所有药品生产质量管理规范(GMP)条例。
如本文所用，术语“生理上可接受的”酯或盐意指与药物组合物的任何其他成分相容，对组合物待施用的对象无害的活性成分的酯或盐形式。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域中已知或此后开发的任何方法来制备。一般来讲，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与载剂或一种或多种其他辅助成分缔合，然后如果必要或希望，将产品成形或包装为所需的单剂量或多剂量单位。
虽然本文提供的药物组合物的描述主要涉及适用于向人伦理施用的药物组合物，但是熟练的业内人士将理解，此类组合物通常适用于向所有种类的动物施用。改变适用于向人施用的药物组合物以便使得组合物适用于向各种动物施用为众所周知的，并且普通兽医药理学家可仅仅通过普通实验(如果需要)来设计和进行此种改变。
可用于本发明的方法的药物组合物可以以适于口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、肺部、鼻内、颊部、静脉内、透皮、病灶内、皮下、肌内、眼部、鞘内和其他已知的施用途径的制剂的形式制备、包装或出售。其他设想的制剂包括计划的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的其他制剂和基于免疫学的制剂。
本发明的药物组合物可以呈散装的形式、呈单一单位剂量或呈多个单一单位剂量来制备、包装或销售。如本文所使用，“单位剂量”为包含预先确定的量的活性成分的药物组合物的离散的量。活性成分的量通常等于将要向对象施用的活性成分的剂量或这种剂量的合宜分数，例如像这种剂量的一半或三分之一。
本发明的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的载剂和任何额外成分的相对量将根据所治疗的对象的身份、体型和/或病状并且进一步根据待施用组合物的途径而改变。以举例的方式，组合物可以包含0.1％至100％(w/w)的活性成分。
除了活性成分之外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种额外药物活性剂。
可以使用常规技术制备本发明的药物组合物的控制释放或持续释放制剂。
适于口服施用的本发明的药物组合物的制剂可以呈离散的固体剂量单位的形式制备、包装或销售，包括但不限于片剂、硬或软胶囊、扁囊剂、锭剂或菱形锭，每种都含有预先确定的量的活性成分。适于口服施用的其他制剂包括但不限于粉状或颗粒状制剂、水性或油性混悬液、水性或油性溶液或乳液。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、制粒和崩解剂、粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括但不限于马铃薯淀粉和羟基乙酸淀粉钠。已知的表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的制粒和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合剂包括但不限于明胶、阿拉伯树胶、预先胶凝化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石。
本发明的药物组合物的液体制剂可以呈液体形式或呈干燥产品的形式制备、包装和销售，旨在用于在使用之前用水或另一合适的媒介物重构。
可以使用常规方法制备液体混悬液以实现活性成分在水性或油性媒介物中的悬浮。水性媒介物包括例如水和等渗盐水。油性媒介物包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、分级植物油、以及矿物油(诸如液体石蜡)。液体混悬液还可包含一种或多种额外成分，包括但不限于悬浮剂、分散或润湿剂、乳化剂、镇静剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油性混悬液还可包含增稠剂。
已知的悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆、氢化食用脂肪、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、以及纤维素衍生物，诸如羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素和15羟丙基甲基纤维素。已知的分散或润湿剂包括但不限于天然存在的磷脂(诸如卵磷脂)、氧化烯与脂肪酸、与长链脂肪醇、与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯、或与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，分别是聚氧乙烯硬脂酸酯、十七亚乙基氧基鲸蜡醇、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、以及聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯树胶。已知的防腐剂包括但不限于甲基、乙基、或正丙基-对-羟基苯甲酸酯、抗坏血酸以及山梨酸。已知的甜味剂包括例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。用于油性混悬液的已知增稠剂包括例如蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。
活性成分在水性或油性溶剂中的液体溶液可以以与液体混悬液基本上相同的方式制备，主要区别在于活性成分被溶解，而不是悬浮在溶剂中。本发明的药物组合物的液体溶液可以包含关于液体混悬液描述的每一种组分，应理解悬浮剂不一定有助于活性成分在溶剂中的溶解。水性溶剂包括例如水和等渗盐水。油性溶剂包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、分级植物油、以及矿物油(诸如液体石蜡)。
可以使用已知的方法制备本发明的药物制剂的粉末和颗粒制剂。此类制剂可直接施用于对象，用于例如形成片剂，填充胶囊或通过向其中添加水性或油性媒介物来制备水性或油性混悬液或溶液。这些制剂中的每一种还可以包含分散或润湿剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。这些制剂中还可以包含额外赋形剂，诸如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂。
本发明的药物组合物还可以呈水包油乳液或油包水乳液的形式制备、包装或销售。油相可以是植物油(诸如橄榄油或花生油)、矿物油(诸如液体石蜡)或它们的组合。此类组合物还可以包含一种或多种乳化剂，诸如：天然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶或黄蓍树胶；天然存在的磷脂，诸如大豆或卵磷脂磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的组合的酯或偏酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯；以及此类偏酯与环氧乙烷的缩合产物，诸如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。这些乳液还可以包含额外成分，包括例如甜味剂或调味剂。
用化学组合物浸渍或涂覆材料的方法是本领域已知的，并且所述方法包括但不限于将化学组合物沉积或结合到表面上的方法、在合成材料期间将化学组合物掺入到材料(即，诸如用可生理降解的材料)结构中的方法以及将水性或油性溶液或悬浮液吸收到吸收材料中的方法，随后干燥或不干燥。
如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何施用途径，其特征在于物理破坏对象的组织并且通过组织中的裂缝施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过以下来施用药物组合物：注射组合物；通过手术切口应用组合物；通过组织穿透性非手术伤口应用组合物；等等。具体地说，肠胃外施用设想为包括但不限于皮肤、皮下、腹膜内、静脉内、肌内、脑池内注射和肾透析输注技术。在一些情况下，主题IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)是皮下施用的。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与药学上可接受的载剂结合的活性成分，药学上可接受的载剂诸如无菌水或无菌等渗盐水。此类制剂可以呈适于推注施用或连续施用的形式制备、包装或出售。可注射制剂可以呈单位剂型制备、包装或销售，诸如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于混悬液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的持续释放或可生物降解的制剂。此类制剂还可以包含一种或多种额外成分，包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的一些实施方案中，活性成分以干燥(即，粉末或颗粒)形式提供，以便用合适的媒介物(例如，无菌无热原水)重构，之后肠胃外施用重构的组合物。
药物组合物可以呈无菌可注射水性或油性混悬液或溶液的形式制备、包装或销售。此混悬液或溶液可以根据已知技术配制，并且除活性成分之外，还可以包含额外成分，诸如本文所述的分散剂、润湿剂或悬浮剂。此类无菌可注射制剂可以使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂制备，诸如像水或1,3-丁二醇。其他可接受的稀释剂和溶剂包括但不限于林格氏溶液、等渗氯化钠溶液和固定油诸如合成单甘油酯或二甘油酯。其他可用的可肠胃外施用的制剂包括呈微晶形式、呈脂质体制剂或呈可生物降解的聚合物系统的组分包含活性成分的那些。用于持续释放或植入的组合物可以包含药学上可接受的聚合物材料或疏水性材料，诸如乳液、离子交换树脂、微溶的聚合物或微溶的盐。
适于局部施用的制剂包括但不限于液体或半液体制剂诸如擦剂、洗剂、水包油或油包水乳液诸如霜剂、软膏和糊剂和溶液或混悬液。可局部施用的制剂可例如包含约1％至约10％(w/w)活性成分，虽然活性成分的浓度可如活性成分在溶剂中的溶解度极限那么高。用于局部施用的制剂可进一步包含本文描述的一种或多种额外成分。
本发明的药物组合物可以呈适于经由口腔进行肺施用的制剂形式制备、包装或销售。此类制剂可以包含有包含活性成分并且直径在约0.5至约7纳米、优选地约1至约6纳米范围内的干燥颗粒。此类组合物便利地以待施用的干粉形式存在，所述干粉使用包括可指导推进剂流向其分散粉末的干粉储器的装置或使用自推进溶剂/粉末分散容器如包含溶解或悬浮于密封容器中的低沸点推进剂中的活性成分的装置来施用。优选地，此类粉末包含颗粒，其中至少98重量％的颗粒的直径大于0.5纳米并且至少95数目％的颗粒的直径小于7纳米。更优选地，至少95重量％的颗粒的直径大于1纳米并且至少90数目％的颗粒的直径小于6纳米。干粉组合物优选地包括固体精细粉末稀释剂诸如糖并且便利地以单位剂型提供。
低沸点推进剂通常包括在大气压力下沸点低于65°F的液体推进剂。通常，推进剂可占组合物的50至99.9％(w/w)，并且活性成分可占组合物的0.1至20％(w/w)。推进剂还可以包含额外成分，诸如液体非离子或固体阴离子表面活性剂或固体稀释剂(优选地，其粒子大小与包含活性成分的颗粒的数量级相同)。
被配制用于肺部递送的本发明的药物组合物还可以提供呈溶液或混悬液的液滴形式的活性成分。此类制剂可以呈任选地无菌、包含活性成分的水性或稀释醇溶液或混悬液来制备、包装或销售，并且可便利地使用任何喷雾或雾化装置来施用。此类制剂还可以包含一种或多种额外成分，包括但不限于调味剂诸如糖精钠、挥发油、缓冲剂、表面活性剂或防腐剂诸如羟基苯甲酸甲酯。通过此施用途径提供的液滴的平均直径优选地在约0.1至约200纳米范围内。作为可用于肺部递送的本文所述的制剂也可用于本发明的药物组合物的鼻内递送。适于鼻内施用的另一种制剂是包含活性成分并且平均颗粒为约0.2至500微米的粗粉。
此类制剂以采用鼻吸的方式施用，即通过从置于鼻子附近的粉末容器快速吸入穿过鼻通道。适于鼻施用的制剂可例如包含少至0.1％(w/w)并且多至100％(w/w)的活性成分，并且可还包含一种或多种本文描述的额外成分。
本发明的药物组合物可以呈适于颊部施用的制剂形式制备、包装或销售。此类制剂可例如以使用常规方法制得的片剂或菱形锭的形式存在，并且可例如包含0.1至20％(w/w)活性成分，其余包含经口可溶解或可降解的组合物和任选地一种或多种本文描述的额外成分。替代地，适于颊部施用的制剂可包括包含活性成分的粉末或气溶胶化或雾化溶液或混悬液。此类粉状、气溶胶化和/或气溶胶化制剂在分散时优选地具有在约0.1纳米至约200纳米范围内的平均粒子或液滴大小，并且还可包含一种或多种本文描述的额外成分。
本发明的药物组合物可以呈适于眼科施用的制剂形式制备、包装或销售。此类制剂可以例如呈滴眼液的形式，包括例如活性成分在水性或油性液体载剂中的0.1-1.0％(w/w)溶液或混悬液。此类滴剂还可以包含缓冲剂、盐或本文所述的一种或多种其他额外成分。可用的其他可眼科施用的制剂包括呈微晶形式或呈脂质体制剂的包含活性成分的那些。
如本文所用，“额外成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒和崩解剂；粘结剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理学可降解的组合物诸如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散或润湿剂；乳化剂、镇静剂；缓冲液；盐；增稠剂；填充物；乳化剂；抗氧化剂；抗菌素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合或疏水材料。可包含在本发明的药物组合物中的其他“额外成分”是本领域中已知的，并且描述于例如Genaro编著.,1985,Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.中，其以引用的方式并入本文。
示例性制剂
在一些实施方案中，制剂包含：包含IL-18多肽的活性成分；一种或多种控制pH的缓冲剂；一种或多种稳定剂；一种或多种溶剂；表面活性剂；预防氧化的试剂；和稳定剂。在一些实施方案中，IL-18多肽的制剂包含以下中的一种或多种：L-组氨酸(His)、L-组氨酸盐酸盐(His-HCl)、蔗糖、聚山梨醇酯80、L-甲硫氨酸和EDTA二钠盐。
经由实验获得的针对IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的适当制剂的一个实例包含：(1)IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)；(2)将pH维持在6.2与6.8之间(例如，在一些情况下，6.5)的缓冲剂(例如，His/His-HCl，8-12mM，例如，10mM)；(3)糖(例如，蔗糖，例如，6-10％；在一些情况下，8％)；(4)螯合剂(例如，EDTA，例如，0.05-1.5mM，例如，在一些情况下，0.1mM)；(5)防止氧化的剂(例如，L-甲硫氨酸，例如，4-6mM，例如，在一些情况下，5mM)；和(6)防止蛋白质吸附的剂(例如，PS80，例如，0.01-0.03％w/v，例如，0.02％)。
因此，在一些情况下，制剂包含：(1)IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)；(2)约10mM His/His-HCl；(3)约8％蔗糖；(4)约0.1mM EDTA；(5)约5mM L-甲硫氨酸；和(6)约0.02％(w/v)PS80。
在上文实施方案中的一些中(例如，在皮下施用制剂时)，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)将以在10-100mg/ml范围内的浓度(例如，10-90、10-75、10-60、10-50、10-40、10-30、25-100、25-90、25-75、25-60、25-50、25-40、25-30、30-100、30-90、30-75、30-60、30-50、30-40、40-100、40-90、40-75、40-60、40-50、50-100、50-90、50-75或50-60mg/ml)存在。在上文实施方案中的一些中(例如，在皮下施用制剂时)，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)将以在50-60mg/ml范围内的浓度存在。在上文实施方案中的一些中(例如，在皮下施用制剂时)，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18、DR IL-18、D2D IL-18、稳定化的DR IL-18、稳定化的D2D IL-18等等)(例如，SEQ ID NO:19)将以在20-30mg/ml范围内的浓度存在。
在一些实施方案中，药物产品是分批配制的。在一些实施方案中，各批次为1.5L。在其他实施方案中，各批次为10.5L。各批次可以包含例如SEQ ID NO:19的IL-18多肽、L-组氨酸、L-组氨酸盐酸盐、蔗糖、聚山梨醇酯80、L-甲硫氨酸、EDTA二钠盐和注射用水。在一些实施方案中，批次包含：40至50g SEQ ID NO:19；1.00至2.00g L-组氨酸；0.25至1.00g L-组氨酸盐酸盐；100.00至150.00g蔗糖；0.01至0.60g聚山梨醇酯80；1至1.5g L-甲硫氨酸；0.005至0.1g EDTA二钠盐；和足够约1.5L的量的水。在一些实施方案中，批次包含：约45gSEQ ID NO:19；约1.91g L-组氨酸；约0.57g L-组氨酸盐酸盐；约120.0g蔗糖；约0.30g聚山梨醇酯80；约1.13g L-甲硫氨酸；约0.06g EDTA二钠盐；和足够约1.5L的量的水。在一些实施方案中，10.5L批次包含：300至350g SEQ ID NO:19；10.00至15.00g L-组氨酸；3.50至4.50g L-组氨酸盐酸盐；800.00至900.00g蔗糖；1.5至2.5g聚山梨醇酯80；7.00至8.00g L-甲硫氨酸；0.1至0.6g EDTA二钠盐；和足够约10.5L的量的水。在一些实施方案中，10.5L批次包含：约315g SEQ ID NO:19；约13.34g L-组氨酸；约3.99g L-组氨酸盐酸盐；约840.0g蔗糖；约2.1g聚山梨醇酯80；约7.88g L-甲硫氨酸；约0.42g EDTA二钠盐；和足够约1.5L的量的水。
本公开的制剂可以维持在例如帮助稳定或维持本文所公开的化合物或多肽的活性的pH。所公开的制剂的pH可以在例如约3至约12的范围内。组合物的pH可以是例如约3至约4、约4至约5、约5至约6、约6至约7、约7至约8、约8至约9、约9至约10、约10至约11或约11至约12个pH单位。组合物的pH可以是例如约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11或约12个pH单位。组合物的pH可以是例如至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9个pH单位。组合物的pH可以是例如至多5、至多6、至多7、至多8、至多9、至多10、至多11或至多12个pH单位。
本文所公开的制剂的pH可以为约5.5至约8。例如，本公开的制剂的pH可以为约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9或约8.0。在一些实施方案中，pH为6.5±0.6、6.5±0.5、6.5±0.4、6.5±0.3、6.5±0.2、6.5±0.1、约6.5或6.5。在一些实施方案中，pH为6.2±0.6、6.2±0.5、6.2±0.4、6.2±0.3、6.2±0.2、6.2±0.1、约6.2或6.2。在一些实施方案中，pH为6.8±0.6、6.8±0.5、6.8±0.4、6.8±0.3、6.8±0.2、6.8±0.1、约6.8或6.8。在一些实施方案中，pH为7.4±0.6、7.4±0.5、7.4±0.4、7.4±0.3、7.4±0.2、7.4±0.1、约7.4或7.4。在一些实施方案中，pH为约6.2至约6.8。如果pH超出配制人员所需的范围，则可以通过使用足够的药学上可接受的酸和碱来调整pH。
在一些实施方案中，本文所公开的制剂可以包含缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂用于维持稳定的pH并且帮助稳定化本文所公开的化合物或多肽。在一些实施方案中，缓冲液系统包含至少一种缓冲剂，其缓冲范围完全或部分地重叠pH 5.5-7.4的范围。在一些实施方案中，缓冲液的pKa为约6.5±0.5或6.2±0.5。
给药
通常，可以向动物(优选地，人)施用的IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的剂量的量在0.001mg至约10mg/千克(mpk)动物体重的范围内。在一些实施方案中，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ IDNO:19)以在0.01-4mpk范围内的剂量(例如，0.01-3.5、0.01-3.3、0.01-3、0.01-1.5、0.01-2、0.01-1.5、0.01-1、0.01-0.5、0.01-0.35、0.025-4、0.025-3.5、0.025-3.3、0.025-3、0.025-1.5、0.025-2、0.025-1.5、0.025-1、0.0250.5、0.025-0.35、0.05-4、0.05-3.5、0.05-3.3、0.05-3、0.05-1.5、0.05-2、0.05-1.5、0.05-1、0.05-0.5、0.05-0.35、0.1-4、0.1-3.5、0.1-3.3、0.1-3、0.1-1.5、0.1-2、0.1-1.5、0.1-1、0.1-0.5、0.1-0.35、0.25-4、0.25-3.5、0.25-3.3、0.25-3、0.25-1.5、0.25-2、0.25-1.5、0.25-1、0.25-0.5、0.25-0.35、0.5-4、0.5-3.5、0.5-3.3、0.5-3、0.5-1.5、0.5-2、0.5-1.5或0.5-1mpk)施用于个体。在一些实施方案中，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)以在0.05-3.5mpk范围内的剂量(例如，0.05-3.3、0.05-3、0.05-1.5、0.05-2、0.05-1.5、0.05-1、0.05-0.5、0.05-0.35、0.1-3.5、0.1-3.3、0.1-3、0.1-1.5、0.1-2、0.1-1.5、0.1-1、0.1-0.5、0.1-0.35、0.25-3.5、0.25-3.3、0.25-3、0.25-1.5、0.25-2、0.25-1.5、0.25-1、0.25-0.5、0.25-0.35、0.5-3.5、0.5-3.3、0.5-3、0.5-1.5、0.5-2、0.5-1.5或0.5-1mpk)施用于个体。在一些情况下，化合物可以每天多次施用于动物，或者它可以以较低频率施用，诸如每天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或甚至更低的频率，诸如每几个月一次或甚至每年一次或更少。
但是，如上文所说明，在一些情况下，它每周递送一次或更少。
施用方法
施用频率
本领域技术人员将理解，本文所讨论的IL-18蛋白可以短期(例如，在短时间段内)或长期(例如，在长时间段内，诸如几个月或一年或更长时间)施用。本领域技术人员将理解，它们可以单一地或与呈其他剂的任何组合施用。此外，本文所述的IL-18蛋白可以单一地或在时间意义上呈任何组合的方式施用，因为它们可以在彼此同时、和/或之前、和/或之后施用。基于本文所提供的公开内容，本领域普通技术人员将理解，IL-18蛋白组合物可以用于治疗有需要的对象的疾病或病症，并且此类蛋白质可以单独地或呈与影响治疗结果的另一剂的任何组合使用。
如以下工作实施例中令人惊讶地证明的那样，在一些情况下，如果施用地过于频繁，例如，每周多于一次，则施用IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DRIL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)可能是有害的(例如，有毒的，可能造成贫血)。例如，以下工作实施例表明，在灵长类动物(猴子)中每周施用DR-18两次具有相对于盐水治疗的猴子，血红蛋白的剂量依赖性减少。相比之下，相对于盐水治疗，每周一次施用不导致血红蛋白水平降低。
因此，在一些实施方案中，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DRIL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)以每周一次(每周一剂)或更小(例如，每两周一次或更小，每个月一次或更小)的频率施用于个体。在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)以在每周一次至每6个月一次的范围内(例如，每周一次至每4个月一次、每周一次至每2个月一次或每周一次至每个月一次)的频率施用于个体。在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)以在每周一次至每个月一次的范围内的频率施用于个体。
在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ IDNO:19)约每周一次施用于个体。在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)约每两周一次施用于个体。在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)约每个月一次施用于个体。在一些情况下，IL-18多肽(例如，野生型IL-18、稳定化的IL-18变体、DR IL-18变体、D2D IL-18变体、稳定化的DR IL-18变体、稳定化的D2D IL-18变体等等)不多于每周一次施用于个体。
疾病
在一些实施方案中，本公开的方法可用于治疗或预防已经损失MHC I类的表面表达的肿瘤或癌症肿瘤；诸如已经损失B2m(MHC基因座)的肿瘤或者在抗原呈递和/或抗原加载复合物的其他成员(诸如tapasin)中具有突变的肿瘤。
代谢疾病和病症包括各种代谢和内分泌相关的疾病和病症。以下是可以通过本发明的方法和组合物治疗或预防的代谢和内分泌相关的疾病和病症的非限制性实例：肥胖症(obesity)、糖尿病(diabetes)、前驱糖尿病(prediabetes)、II型糖尿病(type IIdiabetes)、青年成熟期发病型糖尿病(mature onset diabetes of the young，MODY)、高血糖(hyperglycemia)、代谢综合征(metabolic syndrome)、血脂紊乱(dyslipidemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)和高胆固醇血症(hypercholesterolemia)。
可以使用本发明的组合物和方法治疗或预防的其他疾病和病症的非限制性实例包括病毒感染、细菌感染、寄生虫感染和低免疫活性。在一些实施方案中，病毒感染是痘病毒、天花病毒、传染性软疣、HPV感染和由病毒引起的疣中的至少一种。在一些实施方案中，感染是全身感染。在一些实施方案中，病毒感染是牛痘病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染是全身性牛痘病毒感染。在一些实施方案中，细菌感染是败血症。在一些实施方案中，低免疫活性是中性粒细胞减少症，例如，如在化疗的情况下可能发生的。
可以使用本发明的组合物和方法治疗或预防的其他疾病和病症的非限制性实例包括黄斑变性。例如，在一些情况下，疾病或病症是湿性黄斑变性，并且在一些情况下，疾病或病症是湿性年龄相关的黄斑变性。在一些此类情况下，IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)可以用作抗血管生成剂。例如，在一些情况下，主题IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)可以减弱脉络膜新血管形成。
在一些情况下，IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)可用于治疗或预防疾病或病症。在各种实施方案中，疾病或病症是癌症或代谢疾病或病症，包括肥胖症和糖尿病(例如，主题方法可造成体脂减少)。因此，在一些实施方案中，组合物包含至少一种IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ IDNO:19)。在其他实施方案中，进行施用至少一种IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)的方法以治疗疾病或病症，诸如但不限于癌症或代谢疾病或病症。
以下是可以通过本公开的方法和组合物治疗或预防的癌症的非限制性实例：急性成淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)、急性髓系白血病(acute myeloidleukemia)、肾上腺皮质癌(adrenocortical carcinoma)、阑尾癌(appendix cancer)、基底细胞癌(basal cell carcinoma)、胆管癌(bile duct cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、骨癌(bone cancer)、脑和脊髓肿瘤(brain and spinal cord tumors)、脑干胶质瘤(brainstem glioma)、脑肿瘤(brain tumor)、乳腺癌(breast cancer)、支气管肿瘤(bronchialtumors)、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、类癌瘤(carcinoid tumor)、中枢神经系统非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤(central nervous system atypical teratoid/rhabdoidtumor)、中枢神经系统胚胎性瘤(central nervous system embryonal tumors)、中枢神经系统淋巴瘤(central nervous system lymphoma)、小脑星形细胞瘤(cerebellarastrocytoma)、星形细胞瘤/恶性胶质瘤(cerebral astrocytoma/malignant glioma)、星形细胞瘤/恶性胶质瘤(cerebral astrocytoma/malignant glioma)、子宫颈癌(cervicalcancer)、儿童视觉通路肿瘤(childhood visual pathway tumor)、脊索瘤(chordoma)、慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia)、慢性髓性白血病(chronicmyelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性病症(chronic myeloproliferativedisorders)、结肠癌(colon cancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、皮肤癌(cutaneous cancer)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous t-celllymphoma)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、成室管膜细胞瘤(ependymoblastoma)、室管膜瘤(ependymoma)、食管癌(esophageal cancer)、ewing肿瘤家族(ewing family oftumors)、颅外癌(extracranial cancer)、性腺外生殖细胞肿瘤(extragonadal germ celltumor)、肝外胆管癌(extrahepatic bile duct cancer)、肝外癌(extrahepatic cancer)、眼癌(eye cancer)、蕈样病(fungoides)、胆囊癌(gallbladder cancer),胃癌(gastric(stomach)cancer)、胃肠道癌(gastrointestinal cancer)、胃肠道类癌瘤(gastrointestinal carcinoid tumor)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumor)(gist)、生殖细胞瘤(germ cell tumor)、妊娠期癌症(gestational cancer)、妊娠期滋养层肿瘤(gestational trophoblastic tumor)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、胶质瘤(glioma)、毛细胞白血病(hairy cell leukemia)、头颈癌(head and neck cancer)、肝细胞(肝)癌(hepatocellular(liver)cancer)、组织细胞增多病(histiocytosis)、霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)、下咽癌(hypopharyngeal cancer)、下丘脑和视觉通路胶质瘤(hypothalamic and visual pathway glioma)、下丘脑肿瘤(hypothalamic tumor)、眼内(眼)癌(intraocular(eye)cancer)、眼内黑色素瘤(intraocular melanoma)、胰岛细胞瘤(islet cell tumors)、卡波西肉瘤(kaposi sarcoma)、肾(肾细胞)癌(kidney(renalcell)cancer)、朗格汉斯细胞癌(langerhans cell cancer)、朗格汉斯细胞组织细胞增多病(langerhans cell histiocytosis)、喉癌(laryngeal cancer)、白血病(leukemia)、唇和口腔癌(lip and oral cavity cancer)、肝癌(liver cancer)、肺癌(lung cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤(malignant fibrous histiocvtoma of bone and osteosarcoma)、成髓细胞瘤(medulloblastoma)、髓上皮瘤(medulloepithelioma)、黑色素瘤(melanoma)、梅克尔细胞瘤(merkel cell carcinoma)、间皮瘤(mesothelioma)、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症(metastatic squamous neck cancer with occult primary)、口腔癌(mouth cancer)、多发性内分泌腺瘤综合征(multiple endocrine neoplasia syndrome)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、霉菌病(mycosis)、骨髓增生异常综合征(myelodysplasticsyndromes)、骨髓增生异常/骨髓增殖性疾病(myelodysplastic/myeloproliferativediseases)、髓性白血病(myelogenous leukemia)、髓系白血病(myeloid leukemia)、骨髓瘤(myeloma)、骨髓增殖性病症(myeloproliferative disorders)、鼻腔和鼻窦癌(nasalcavity and paranasal sinus cancer)、鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、成神经细胞瘤(neuroblastoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma)、非小细胞肺癌(non-smallcell lung cancer)、口部癌(oral cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、口咽癌(oropharyngeal cancer)、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤(osteosarcoma and malignantfibrous histiocytoma)、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤(osteosarcoma and malignantfibrous histiocytoma of bone)、卵巢癌(ovarian,ovarian cancer)、卵巢上皮癌(ovarian epithelial cancer)、卵巢生殖细胞瘤(ovarian germ cell tumor)、卵巢低度恶性潜能肿瘤(ovarian low malignant potential tumor)、胰腺癌(pancreaticcancer)、乳头瘤病(papillomatosis)、副神经节瘤(paraganglioma)、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、阴茎癌(penile cancer)、咽癌(pharyngeal cancer)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、中分化松果体实质瘤(pineal parenchymal tumors ofintermediate differentiation)、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤(pineoblastoma and supratentorial primitive neuroectodermal tumors)、垂体瘤(pituitary tumor)、浆细胞赘瘤(plasma cell neoplasm)、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤(plasma cell neoplasm/multiple myeloma)、胸膜肺母细胞瘤(pleuropulmonaryblastoma)、原发性中枢神经系统癌(primary central nervous system cancer)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma)、前列腺癌(prostatecancer)、直肠癌(rectal cancer)、肾细胞(肾)癌(renal cell(kidney)cancer)、肾盂和输尿管癌(renal pelvis and ureter cancer)、涉及15号染色体坚果基因的呼吸道癌(respiratory tract carcinoma involving the nut gene on chromosome 15)、成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、唾液腺癌(salivary glandcancer)、肉瘤(sarcoma)、塞扎里综合征(sezary syndrome)、皮肤癌(黑色素瘤)(skincancer(melanoma))、皮肤癌(非黑色素瘤)(skin cancer(nonmelanoma))、皮肤癌(skincarcinoma)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、小肠癌(small intestine cancer)、软组织癌(soft tissue cancer)、软组织肉瘤(soft tissue sarcoma)、鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma)、鳞状颈癌(squamous neck cancer)、胃癌(stomach(gastric)cancer)、幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorial primitiveneuroectodermal tumors)、幕上原始神经外胚层肿瘤和成松果体细胞瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumors and pineoblastoma)、T细胞淋巴瘤(T-celllymphoma)、睾丸癌(testicular cancer)、喉癌(throat cancer)、胸腺瘤和胸腺癌(thymoma and thymic carcinoma)、甲状腺癌(thyroid cancer)、移行细胞癌(transitional cell cancer)、肾盂和输尿管的移行细胞癌(transitional cell cancerof the renal pelvis and ureter)、滋养层肿瘤(trophoblastic tumor)、尿道癌(urethral cancer)、子宫癌(uterine cancer)、子宫肉瘤(uterine sarcoma)、阴道癌(vaginal cancer)、视觉通路和下丘脑胶质瘤(visual pathway and hypothalamicglioma)、外阴癌(vulvar cancer)、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom macroglobulinemia)和维尔姆瘤(Wilms Tumor)。
在一些非限制性实例中，癌症不由起源的组织学组织定义，而是由其分子特征定义。例如，具有高肿瘤突变负荷(TMB)的肿瘤、具有微卫星不稳定性(MSI)的肿瘤、MHC I类的表面表达缺乏或减少的肿瘤(例如，由于β2微球蛋白或Tapasin缺失)或表达高水平IL-18BP的肿瘤。在一些情况下，那些分子特征通过下一代测序(例如，使用TMB/MSI)确定。在一些情况下，那些分子特征通过免疫组织化学、免疫荧光或流式细胞术确定。因此，可以通过本公开的方法和组合物治疗或预防的癌症的非限制性实例包括实体瘤癌症、液体癌症、血癌、畸胎瘤、肉瘤和癌。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗对免疫检查点抑制剂(ICI)具有抗性的肿瘤或癌症。免疫检查点抑制剂的实例包括但不限于：抗PD1剂诸如抗PD1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab))、抗PD-L1剂诸如抗PD-L1抗体抗CTLA4(例如，伊匹单抗(ipilimumab))、抗TIM3、抗TIGIT、抗LAG3、抗B7H3、抗B7H4、抗VISTA、抗BTLA、抗CD47、抗SIRPα、抗CD48、抗CD155、抗CD160、抗TREM2、抗IDO1、抗腺苷2A受体、抗芳基烃受体、抗KIR和抗LILRB2。免疫检查点抑制剂的靶标的实例包括但不限于：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR和LILRB2。
因此，免疫检查点抑制剂的实例包括抑制诸如以下的蛋白质的剂：PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR和LILRB2。在一些情况下，主题稳定化的IL-18变体多肽(例如，DR-IL-18变体、D2D-IL-18变体)(例如，SEQ ID NO:19)与免疫检查点抑制剂(例如，抑制PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR、LILRB2或其任何组合的剂)共同施用。
在一些实施方案中，本公开的组合物和方法可用于治疗与高水平IL-18BP(例如，循环的或由肿瘤表达的)相关联的癌症或与在浸润T细胞或NK细胞上表达IL-18R的肿瘤相关联的癌症。
因此，本发明涉及通过向细胞、组织、器官或有需要的对象施用治疗有效量的IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)、重组IL-18变体多肽、活性IL-18变体多肽片段(例如，IL-18变体肽等)来预防和治疗疾病或病症，以便治疗疾病或病症，或其相关体征、症状或病理。在一个实施方案中，本发明提供一种将治疗有效量的IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)、重组IL-18变体多肽、活性IL-18变体多肽片段(例如，IL-18变体肽等)施用于患有本文所述的疾病或病症、怀疑患有本文所述的疾病或病症或处于患有本文所述的疾病或病症的风险中的对象的方法。在一个实施方案中，本发明提供一种将治疗有效量的IL-18变体多肽(例如，稳定化的IL-18)、重组IL-18变体多肽、活性IL-18变体多肽片段(例如，IL-18变体肽等)施用于患有本文所述的疾病或病症、怀疑患有本文所述的疾病或病症或处于患有本文所述的疾病或病症的风险中的对象的细胞、组织或器官的方法。
试剂盒
本发明还涉及用于本发明方法中的试剂盒。此类试剂盒包括：可用于本文别处描述的任一方法的组分的各种组合，包括例如IL-18多肽(例如，稳定化的IL-18，诸如稳定化的DR IL-18变体或稳定化的D2D IL-18变体等等)(例如，SEQ ID NO:19)；和/或用于定量分析IL-18变体多肽或IL-18变体核酸的材料；和/或用于评估IL-18变体多肽或IL-18变体核酸的活性的材料；和/或说明材料。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括可用于定量生物样品中的IL-18变体核酸的组分。在另一实施方案中，试剂盒包括可用于定量生物样品中的IL-18变体多肽的组分。在另一实施方案中，试剂盒包括可用于评估生物样品中的IL-18变体多肽的活性(例如，酶活性、配体结合活性等)的组分。
在另一实施方案中，试剂盒包括用于监测向有需要的对象施用的治疗的有效性的测定的组分，其含有说明材料和用于确定从对象获得的生物样品中IL-18信号传导的水平在治疗期间或之后是否被调节的组分。在各种实施方案中，为了确定从对象获得的生物样品中IL-18信号传导的水平是否受到调节，将IL-18信号传导的水平与试剂盒中所含的至少一种比较对照物的水平进行比较，诸如阳性对照、阴性对照、历史对照、历史标准或生物样品中另一个参考分子的水平。在某些实施方案中，确定IL-18信号传导与参考分子的比率以帮助监测治疗。
实施例
参考以下实验实施例对本发明进行进一步详述。这些实施例仅出于说明目的而提供，且并非旨在进行限制，除非另外指明。因此，本发明不应以任何方式被解释为局限于以下实施例，而是应被解释为涵盖因本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变型。
无需进一步描述，据信本领域的普通技术人员可使用先前的描述和以下说明性实施例，制备和利用本发明并实施所要求保护的方法。因此，以下工作实施例不应当被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：IL-18变体多肽
IL-18是一种可以刺激T细胞、NK细胞和髓系细胞的促炎性细胞因子。鉴于它刺激抗肿瘤免疫细胞的能力，它被提议作为针对癌症的免疫治疗剂。如本文所证明的，重组IL-18治疗的治疗功效可能受到其天然内源性可溶性抑制剂IL-18BP的上调的极大限制。本公开部分基于表现出与IL-18BP的结合最小的人和小鼠IL-18的变体的开发。细胞因子变体表现出对受体(IL-18Rα和IL-18BP)的相对偏好改变了数十万倍至超过百万倍。这些变体在临床前肿瘤模型中具有强大的抗肿瘤活性，无论是呈单一疗法还是与免疫检查点抑制剂(诸如抗PD-1)组合。作为额外应用，IL-18还具有公认的抗肥胖症作用，并且本文证明了与WTIL-18治疗相比，施用变体大大减少了体脂组成。因此，除肿瘤免疫疗法之外，新变体还具有内分泌学/新陈代谢/肥胖症的适应症。
本文还描述了额外一组IL-18变体，它们通过排外地结合IL-18BP来充当IL-18BP拮抗剂，与IL-18Rα的结合不存在或大大减少。设想这些蛋白质可用于通过中和IL-18BP来增强内源性IL-18的活性。
现在描述这些实验中采用的材料和方法。
蛋白质表达和纯化
将人IL-18、小鼠IL-18(氨基酸1-157)及其变体组装为gBlocks(Integrated DNATechnologies，IDT)并且克隆到pET28a-smt载体中以用于在大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta菌株中表达N-末端加sumo标签和C-末端加六组氨酸标签的蛋白质。在16℃下用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达，持续20小时。融合蛋白首先使用Ni螯合树脂进行纯化，然后用sumo蛋白酶切割sumo标签。然后通过连续的硫酸铵切割将蛋白质与聚集体分离，聚集体在20％硫酸铵中沉淀，并且靶蛋白质在70％硫酸铵中沉淀。将蛋白质沉淀物重新悬浮并再次应用于Ni螯合树脂以去除sumo标签，并用0.1％ Triton X-114进行内毒素去除洗涤。最后，将洗脱的蛋白质通过PD-10柱(GE Healthcare)缓冲液交换到PBS。使用FPLC(Bio-Rad)和SEC650柱(Bio-Rad)，通过尺寸排阻色谱法测试蛋白质样品的单分散性。
经由杆状病毒表达系统分泌并纯化人IL-18Rα胞外域(氨基酸19-329)、IL-18Rβ胞外域(氨基酸15-356)和IL-18BP(氨基酸31-194)。简而言之，将所有构建体序列克隆到具有N-末端gp67信号肽以及C-末端AviTagTM和六组氨酸标签的pAcBN-BH3载体(BDBiosciences)中。将在27℃下于SF900 II SFM培养基(Invitrogen)中培养的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)昆虫细胞用质粒构建体转染，以建立高滴度重组病毒，随后对其进行扩增。将在27℃下于Insect Xpress培养基(Lonza)中生长的粉纹夜蛾(Trichopulsia ni)(High-Five)昆虫细胞(Invitrogen)用病毒感染，以表达重组蛋白。感染之后三天，将蛋白质经由Ni-NTA(QIAGEN)亲和色谱法提取，浓缩并且用在10mM HEPES(pH7.5)和150mM NaCl中平衡的SEC650尺寸排阻柱(Bio-Rad)纯化至>98％均一性。
小鼠IL-18Rα胞外域(氨基酸19-329)和IL-18BP(氨基酸31-194)使用Expi293表达系统(Thermo Fisher)呈分泌蛋白而产生。简而言之，将所有构建体序列克隆到具有N-末端H7信号肽以及C-末端AviTagTM和六组氨酸标签的BacMam表达载体pEZT_D_Lux中。根据制造商的说明，使用ExpiFectamine 293转染试剂盒(Thermo Fisher)，用质粒转染在37℃下于Expi293表达培养基(Thermo Fisher)中培养的Expi293细胞。转染之后3-5天收获细胞。蛋白质纯化程序与人蛋白质相同。
对于蛋白质生物素化，C-末端生物素受体肽(AviTag)-GLNDIFEAQKIEWHE与所有IL-18受体构建体融合。在0.1mM Bicine(pH 8.3)、10mM ATP、10mM乙酸镁和0.5mM生物素(Sigma)中用可溶性BirA接合酶进行蛋白质生物素化。如上文所述，通过在SEC650柱上进行尺寸排阻来纯化蛋白质。
IL-18的酵母展示
合成了人和小鼠IL-18基因块(IDT)并且将它们克隆到载体pYAL中并在酿酒酵母菌株EBY100上展示。使IL-18酵母的单个菌落在30℃下于SDCAA液体培养基中生长过夜，并且在20℃下于SGCAA液体培养基中诱导1天。使用抗cMyc标签抗体(抗myc-PE；CellSignaling Technologies)，通过流式细胞术验证了酵母上的IL-18展示水平。在冰上于补充有0.5％ BSA和2mM EDTA(PBE)的PBS中进行用生物素化IL-18Rα(具有或不具有IL-18Rβ)或生物素化IL-18BP的受体染色。所有分析均在Sony SA3800流式细胞仪上进行。
人IL-18文库构建和选择
对于第一个人诱饵抗性IL-18文库，通过将hIL-18/hIL-18Rα/hIL-18Rβ复合物(蛋白质数据库(PDB ID)代码3OW4)的结构与IL-18/IL-18BP(PDB ID 3F62)的结构进行比对，从同源位置验证了hIL-18中的十四个hIL-18Rα和hIL-18BP接触残基(表1)。以表2中所列出的简并引物，使用组装PCR构建了将这些残基随机化的文库。文库的理论多样性为约1.96×1011个独特的蛋白质序列。用与pYAL载体具有同源性的引物进一步扩增PCR产物，并且将其与线性化的pYAL一起共同电穿孔到EBY100酵母中。所得文库含有2.5×108个转化体。对于第二个V2.0人诱饵抗性IL-18文库，选择了hIL-18中的十一个hIL-18Rα和hIL-18BP接触残基，理论多样性为3.44x 109个变体(描述于图7A中)。以简并引物，使用组装PCR构建将这些残基随机化的文库，并且将其与pYAL一起共同电穿孔到EBY100酵母中。所得文库的多样性为6x 108个转化体。
表1显示第一个人IL-18文库设计
表2显示第一个人IL-18文库组装引物
对于两个文库，将转化的酵母回收，并且在30℃下于具有酪蛋白氨基酸的液体合成右旋糖培养基(SDCAA)中扩大，并且通过1:10稀释到具有酪蛋白氨基酸的液体合成半乳糖培养基(SGCAA)中诱导，并且在20℃下培养24小时。每轮中使用适当数目的诱导的酵母，以确保在每个步骤中文库的预期多样性的至少10倍覆盖，并且不少于108个细胞。所有选择步骤都在4℃下使用PBE缓冲液(具有0.5％BSA和2mM EDTA的PBS)进行。对于第一代文库，每一轮的选择试剂列举于表3中。对于第1轮，用抗Cy5/AlexaFluor 647微珠(Miltenyi)和LSMACS柱(Miltenyi)反选择酵母，以去除非特异性珠子结合剂。通过在4℃下用1μM生物素化的hIL-18Rα标记酵母1小时，之后进行以SA/AlexaFluor 647微珠和LS MACS柱的磁性选择来进行正选择。对于第2轮，以1μM生物素化的IL-18BP进行反选择，正选择与第1轮相同。对于第3-5轮，通过将酵母与100nM(第3-4轮)或10nM(第5轮)生物素化的IL-18Rα和250nM预成形的生物素封端的hIL-18BP/SA-PE四聚体一起孵育来进行选择。在竞争结合之后，将酵母洗涤并用SA AlexaFluor 647标记以检测IL-18Rα。通过用AlexaFluor 488缀合的抗cMyc(Cell Signaling Technologies)染色来确定展示水平，并且使用FACS，以Sony SA3800细胞分选仪分离前1％的展示归一化的IL-18Rα结合剂(在IL-18BP非结合剂中)。每轮选择之后，将回收的酵母在30℃下于SDCAA培养基中扩大过夜，稍后在20℃下通过1:10稀释到SGCAA培养基中诱导24小时。
V2.0人DR-IL-18文库以相似方式进行选择，具体选择步骤示于图7B中。
小鼠IL-18文库构建和选择
构建和选择程序与人IL-18相似，有以下变化。文库构建通过计算机建模的小鼠IL-18/受体复合结构(由Phyer2.0预测)提供信息。使用表4中所述的引物，选择了十三个位置以进行随机化(表3)。与pYAL共同电穿孔产生4×108个转化体的文库。每轮所用的选择试剂列于表5中。
表3显示小鼠IL-18文库设计
表4显示小鼠IL-18文库组装引物
表5显示文库选择试剂的总结
表面等离子共振
实验使用Biacore T100进行并且在25℃下进行。将生物素化的IL-18Rα或IL-18BP固定到Biacore生物素捕获芯片(S系列CAP传感器芯片，GE Healthcare)上，得到约50RU(IL-18Rα)或约10RU(IL-18BP)的Rmax。以在HEPES缓冲盐水-P+缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中的IL-18变体的连续稀释进行测量。通过三次60秒注射再生缓冲液(3/4(v/v)8M盐酸胍与1/4(v/v)1M氢氧化钠)使表面再生。实验同时在多个通道中进行，以增加观察结果。以Biacore T100评估软件2.0版本，利用1:1朗缪尔结合模型分析所有数据。
细胞系
将HEK-Blue IL-18传感细胞(InvivoGen)维持在补充有100μg/mL Normocin、30μg/mL Blasticidin、180μg/mL Zeocin和200μg/mL Hygromycin的完全培养基(含有10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM)中。培养并制备YUMMER1.7黑色素瘤细胞，如先前所述(Wang等人,2017,Pigment Cell Melanoma Res.,30(4):428-435)。
HEK-Blue细胞因子活性测定
对于细胞因子活性测量，将平底96孔板的每孔50,000个HEK-Blue IL-18传感细胞在总体积200μL完全培养基中与浓度逐渐降低的重组人IL-18一起孵育。在37℃和5％ CO2下孵育20-24小时之后，将30μL细胞培养上清液与170μL QUANTI-Blue检测培养基(InvivoGen)混合并且在37℃和5％ CO2下孵育，直到可检测到从粉色到蓝色的颜色变化(0.5-4小时)。使用分光光度计，在655nm波长下量化碱性磷酸酶的水平。通过计算测定中每种细胞因子的相对吸光度值(在655nm下测量的最大吸光度值的百分比)来确定细胞因子活性。
对于IL-18BP封锁实验，将固定浓度的重组人IL-18与浓度逐渐降低的重组人IL-18BP一起在4℃下预孵育1小时。随后，将蛋白质混合物添加到HEK-Blue IL-18传感器细胞中，并且如所述进行测定。
小鼠
将来自Jackson Laboratory的C57BL/6野生型小鼠(6-9周龄)用于体内小鼠实验。实验组按体重、性别和年龄进行匹配。所有动物实验均依照耶鲁实验动物管理和使用委员会(Yale Institutional Animal Care and Use Committee)的批准进行。
体内药效学和药代动力学研究
小鼠(每组n＝9)每天接受腹膜内(i.p.)注射1mg/kg重组IL-18(WT或变体SEQ IDNO:61)或作为媒介物对照的PBS。在实验的第1天、第4天和第7天，注射后5小时杀死每组3只小鼠，以便经由心脏穿刺进行血液收集，并且进行随后的对血浆或白细胞的分析(参见小鼠IL-18BP ELISA、用于小鼠细胞因子分析的基于Luminex的多重免疫测定以及经由流式细胞术的免疫表型分型)。在整个7天实验中，每天使用啮齿动物温度计BIO-TK8851(Bioseb)和用于小鼠的RET 3直肠探针(Braintree Scientific Inc.)监测体温。每天监测体重。
从全血制备血浆
根据制造商的说明，使用涂覆EDTA的Microtainer血浆分离管(BD)从全血制备血浆。在用于分析测定之前，血浆样品在-20℃下冷冻一次。
IFN-γ和IL-18BP ELISA
为了测量细胞培养上清液中人IFN-γ的水平，根据制造商的说明，使用灵敏度为4pg/mL且检测范围为7.8-500pg/mL的人IFN-γELISA MAX豪华配套(BioLegend)。对于细胞培养上清液中人IL-18BP的定量，使用灵敏度为7.52pg/mL且检测范围为26.6-1,700pg/mL的Quantikine人IL-18BP免疫测定(R&D Systems)。使用灵敏度为0.156ng/mL且检测范围为0.156-10ng/mL的小鼠IL-18BP ELISA试剂盒(R&D systems)量化血浆中的小鼠IL-18BP水平。根据制造商的说明进行所有测定，包括样品制备。
用于小鼠细胞因子分析的基于Luminex的多重免疫测定
为了量化血浆中的多种小鼠细胞因子水平，包括IFN-γ和IL-12，使用Bio-Plex200系统(Bio-Rad)进行了基于luminex的Bio-Plex Pro多重免疫测定(Bio-Rad)。按照制造商的说明，使用在DMEM中重构的Bio-Plex Pro小鼠细胞因子标准品23-Plex(I组)分析感兴趣的细胞因子。
经由流式细胞术的免疫表型分型
对于白细胞分析，将100μL全血收集到额外含有50μL肝素溶液的涂覆EDTA的Microtainer血浆分离管(BD)中，并且通过倒置数次来混合。通过添加ACK裂解缓冲液(VWR)并在室温下孵育3-5分钟来进行红细胞裂解。在添加MACS缓冲液(2mM EDTA，2％ FBS，在PBS中)之后，通过离心(5分钟，400×g，4℃)并抽吸上清液来收集白细胞。白细胞用冷MACS缓冲液洗涤一次，并且如所述再次收集。将细胞沉淀物重新悬浮于200μL含有10％(v/v)大鼠血清(STEMCELL Technologies Inc.)和特定荧光标记的抗体的MACS缓冲液中，以染色以用于后续流式细胞术分析。使用以下抗体在4℃下染色30分钟：αCD4-AF700(BioLegend)、αCD8-APC(BioLegend)、B220-APC-Cy7(BioLegend)、CD11b-PB(BioLegend)、NK1.1-PE(BioLegend)、NKp46-PE(BioLegend)和CD69-FITC(BioLegend)。此后，将白细胞用MACS缓冲液洗涤两次，如前所述。最后，将细胞重新悬浮于100μL MACS缓冲液中，并使用流式细胞仪(Sony SA3800)采集样品。取10μL的等分试样，使用Invitrogen Countess II自动细胞计数器(Thermo Fisher Scientific)进行细胞计数。将FlowJo v10.3软件用于数据分析，并且使用前向和侧向散射，针对白细胞和单个事件对细胞进行门控。
肿瘤治疗实验
将0.5×106个YUMMER1.7细胞皮下植入到C57BL/6J小鼠中。在植入之后7天，当肿瘤为大约50mg时，开始治疗。将小鼠划分到各治疗队列中，其包括：1)媒介物(盐水)；2)抗PD1(大鼠克隆RMP1-14，Bio X Cell，West Lebanon，New Hampshire，US)；3)野生型IL-18，4)SEQ ID NO:61；5)野生型IL-18+抗PD-1；和6)SEQ ID NO:61IL-18+抗PD1。抗PD-1、野生型IL-18和SEQ ID NO:61IL-18分别以8mg/kg、0.32mg/kg和0.32mg/kg每周两次经由腹膜内注射来施用。监测小鼠的临床毒性体征，并且使用卡尺测量每周两次跟踪肿瘤生长。当肿瘤直径的最大尺寸达到或超过1.5cm时将小鼠安乐死；这被认为是生存分析的终点。
B2m缺陷型YUMMER1.7研究以相似的方式进行，有细微的变化。移植了1.0x106个细胞，因为肿瘤比亲本株生长得慢。治疗由盐水、抗PD1加抗CTLA4和SEQ ID NO:61组成，其时间表和剂量与上文研究相同。
现在描述实验结果。
作为癌症免疫疗法的靶标的IL-18轴
为了鉴别免疫治疗干预的潜在信号传导节点，针对细胞因子通路组分的表达，分析了来自肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞RNAseq数据(Singer等人,2016,Cell,166:1500-1511,e1509)。IL-18的受体亚基，IL-18Rα(即，IL-18R1)和IL-18Rβ(即，IL-18RAP)，以及IL-18本身在激活的和功能失调的淋巴细胞程序中均被上调(图1A)。对免疫基因组(ImmGen)数据库的进一步分析显示，两种IL-18受体亚基的表达与长期抗原暴露之后CD4和CD8细胞中T细胞“耗尽”标记物(包括PD-1、Tim3、Lag3和TIGIT)的表达相关，如图1B所示。这些表达特征表明，IL-18通路可用于选择性地刺激肿瘤内激活的和功能失调/耗尽的T细胞，作为免疫治疗范例。IL-18是一种Th1细胞因子，最初被称为“干扰素γ诱导因子”(IGIF)，因为它能够强烈地刺激T细胞和NK细胞释放干扰素γ(IFN-γ)。IL-18的反馈抑制通过IFN-γ驱动的对IL-18BP的诱导而实现，IL-18BP是IL-18的高亲和力分泌型诱饵受体，在空间上阻碍IL-18结合和激活其受体的能力(图2A)。不希望受任何特定理论的束缚，这种机制使人想起IFN-γ对PD-L1的诱导，表明IL-18BP可能充当“可溶性免疫检查点”。与这种假设一致，发现在TCGA和Oncomine数据库中，IL-18BP在若干种类型的癌症中被上调，最显著的是乳腺癌、胃癌和脑癌(图2B)。此外，IL-18BP表达与关键性的免疫检查点PD-1在肿瘤中的表达密切相关(在胃癌和乳腺癌中分别为r＝0.65和0.78，图2C)，表明IL-18BP同样可能导致肿瘤免疫逃逸和淋巴细胞耗尽。
重组IL-18已在多项临床试验中施用于癌症患者。发现即使在2mg/kg的高剂量下，它也被良好耐受，药效学输出文件，包括激活的CD69+自然杀伤细胞(NK)的扩大和血清IFN-γ水平的急剧增加。然而，针对黑色素瘤患者的II期试验因缺乏功效而中止。对这些临床试验的所报告的药效学结果的检查表明，rIL-18的有效性随着重复给药而减弱，关于外周NK细胞激活/扩大和细胞因子释放(包括IFN-γ和GM-CSF)观察到快速免疫。rIL-18的有效性减弱与血清IL-18BP水平的显著增加相吻合，比治疗前水平高两个数量级以上并且通常超过100ng/mL。不希望受任何特定理论的束缚，假设IL-18BP限制rIL-18疗法的有效性，并且不受IL-18BP抑制影响的IL-18变体可能是有效的肿瘤免疫疗法。此外，IL-18BP的抑制剂可能对肿瘤免疫疗法有效。
工程化对IL-18BP抑制具有抗性的IL-18变体(人DR-IL-18变体)
为了获得可以通过IL-18Rα/IL-18Rf3发出信号，但不受IL-18BP的抑制影响的IL-18变体，利用了以酵母表面展示的定向进化。首先分析了人IL-18:IL-18Rα:IL-18Rf3的三元信号传导复合物的结构(PDB＝3OW4)，并且鉴定了具有与信号传导复合物和IL-18BP的共享界面的IL-18的残基(图3A)。由于hIL-18:hIL-18BP的结构尚未确定，因此使用了IL-18与IL-18BP的病毒(外源性病毒)直系同源物之间的相关复合物(PDB＝3F62)。使用简并寡核苷酸引物和组装PCR产生将这组残基随机化到确定的替代物组的组合文库(参见表1)。将此文库与N-末端酵母展示载体pYAL一起电穿孔到酵母中，以获得具有2.5×108个转化体的文库。使用这种文库，通过使用以重组的hIL-18Rα的磁性和荧光细胞分选(FACS)和以hIL-18BP的反选择进行连续数轮选择来进行定向进化，如图3B中所总结。在五轮选择之后，绝大多数文库克隆完全交换了它们对hIL-18BP和hIL-18Rα与WT hIL-18相比的相对偏好(图3C)。这些克隆被指定为“DR-hIL-18”变体，其中“DR”代表“诱饵抗性”。
对来自第五轮后池的96个克隆的测序显示21个独特的序列，对其进行分析以产生四个“共有序列”，SEQ ID NO:34-37(图4)。为了估计这些变体对hIL-18Rα和hIL-18BP的结合亲和力，使用酵母展示的细胞因子变体和流式细胞术建立了hIL-18Rα和IL-18BP结合的结合等温线。如图5A中所见，DR-hIL-18变体以与WT IL-18可比的亲和力结合hIL-18Rα，但显示与hIL-18BP的结合严重减弱，表观结合EC50值显著大于1μM。为了额外表征DR-IL-18变体的受体结合活性，使细胞因子重组表达并进行IL-18Rα和IL-18BP的表面等离子共振(参见图5B的代表性迹线)。这些结果总结于表6和7中，并且说明DR-hIL-18变体对IL-18BP相比于IL-18Rα的偏好显著降低若干数量级。
表6通过酵母上结合等温线描绘了人IL-18变体的IL-18Rα和IL-18BP结合亲和力。
NBD，未检测到结合(20μM用于比率计算)，------未确定值
表7通过SPR描绘了人IL-18变体的IL-18Rα和IL-18BP结合亲和力
------指示值未确定
人DR-IL-18变体的功能表征
Kim等人的先前报告(Kim等人,2001,Proc Natl Acad Sci U S A98(6):3304-9)描述了3种活性增强并且据称被IL-18BP的抑制降低的hIL-18变体：E42A、K89A和E42A/K89A。将这些细胞因子变体在酵母上展示，并且通过流式细胞术评估IL-18BP对IL-18Rα结合的抑制。如图6A中所见，尽管DR-hIL-18变体不受hIL-18BP对hIL-18Rα结合的抑制的影响，但是Kim等人变体显示与WT hIL-18相比大致等同的hIL-18BP中和。这些结果指示，DR-hIL-18变体不依赖于IL-18BP，而Kim等人变体对IL-18BP抑制高度敏感，与WT hIL-18相似。
为了确认DR-hIL-18可以在细胞情境中通过IL-18受体产生有效的信号传导，使用HEK-blue IL-18报告细胞系进行了浓度-响应实验。在此系统中，通过NFκb/AP1启动子下游的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)的表达读出IL-18R信号传导。在不存在IL-18BP的情况下，DR-hIL-18变体产生与WT hIL-18相称的信号传导EC50值。然而，DR-hIL-18变体事实上不受hIL-18BP抑制，在1μM IL-18BP下没有可检测的抑制(图6B)。综上所述，这些研究证明，DR-hIL-18变体具有生物活性，并且在细胞信号传导情境中不受IL-18BP中和的影响。
对IL-18BP抑制具有抗性的第二代人IL-18变体(人v2.0 DR-IL-18变体)的工程化
和表征
为了获得额外的、潜在增强的人DR-IL-18变体，设计了在11个位置处随机化的人IL-18的第二文库(图7A)，并且如上文所述转化酵母。如图7B中所示选择6x108个转化体的所得文库，在连续选择步骤的情况下，与IL-18BP相比，产生对IL-18Rα的稳健偏好(图7C)。在5-6轮选择之后，恢复了17个独特的序列(图8)。如图9A中所示，与WT IL-18相比，克隆SEQID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:87与IL18Rα的结合相等或稍强，如通过以生物素化的IL18Rα的酵母结合等温线所测量。然而，如图9B中所示，这些克隆不显示任何与IL-18BP的明显结合。图9C描绘了通过向酵母展示的克隆应用一定范围的温度的对热稳定性的测量，显示它们的热稳定性比WT IL-18高7-13℃。这些结果总结于图9D中。工程化 对IL-18BP抑制具有抗性的IL-18变体(鼠科动物DR-IL-18变体)
因为IL-18对IL-18Rα的人和小鼠物种间交叉反应差，所以产生了可用于在小鼠中的研究的DR-IL-18变体的鼠科动物等同物。与上文针对hIL-18采取的方法相似，产生了随机化相似的mIL-18Rα/mIL-18BP接触残基组的mIL-18变体的组合文库(表3)，得到4×108个转化体的文库。对此文库进行定向进化，与以人IL-18文库进行的相似；选择策略总结于图10A中。在完成六轮选择之后，相对于mIL-18BP，剩余的克隆几乎完全偏好mIL-18Rα(图10B)。对96个克隆的分析显示11个独特的序列，从中得到了两个共有序列SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61(图10C)。酵母结合等温线和表面等离子共振实验确认，这些DR-IL-18克隆对于IL-18BP的独立性与本文所述的人IL-18变体相比甚至更大，mIL-18BP结合KD远高于1μM，mIL-18Rα结合保持与WT mIL-18大致相等(图11A、图11B、表8和9)。
表8通过酵母上结合等温线描绘了小鼠IL-18变体的IL-18Rα和IL-18BP结合亲和力
NBD，未检测到结合(10μM用于比率计算)
表9通过SPR描绘了小鼠IL-18变体的IL-18Rα和IL-18BP结合亲和力
NBD，未检测到结合(30μM用于比率计算)
DR-IL-18变体的体内药效学研究
为了评估体内施用DR-IL-18变体的生物学效果，在小鼠中进行了药效学研究，将WT mIL-18与SEQ ID NO:61进行了比较。在第一项研究中，小鼠用媒介物(PBS)、mIL-18(1mg/kg/天)或SEQ ID NO:61(1mg/kg/天)治疗，共计七次注射(图12A)。通过流式细胞术对外周血表型的分析显示，与媒介物治疗相比，WT mIL-18和SEQ ID NO:61均使外周NK细胞数增加高于十倍，并且使外周单核细胞计数增加高于五倍；CD4和CD8细胞总计数没有受到显著影响(图12B)。通过CD69诱导对细胞激活状态的检查显示，与mIL-18或媒介物治疗相比，SEQ ID NO:61治疗极大地增加了CD4和CD8细胞上的CD69水平；CD4和CD8子组分别达到高于30％和高于50％的阳性率(图12C)。尽管mIL-18和SEQ ID NO:61均刺激外周NK细胞上的CD69表达，到第3天时高于20％阳性，但是到第6天时，mIL-18的CD69水平降低到不显著的水平，而以SEQ ID NO:61治疗保持显著升高(图12C)。还以多重Luminex组套测量了外周细胞因子水平。如图12D中所示，与媒介物治疗相比，mIL-18和SEQ ID NO:61均使血清IFN-g、MIP1b和G-CSF增加，但是到第6天时对于这些细胞因子中的每一种，SEQ ID NO:61达到的水平比mIL-18高得多，因为mIL-18表现出快速免疫，在后续施用的情况下，诱导的细胞因子水平趋于平稳或降低。
SEQ ID NO:61对体脂组成的影响
为了评估DR-IL-18变体对体脂组成的影响，我们每三天通过腹膜内注射向C57BL/6小鼠施用1mg/kg的WT IL-18或0.01、0.1或1mg/kg SEQ ID NO:61。通过echoMRI监测体脂和瘦体质量组成。到第12天时，所有测试的SEQ ID NO:61剂量(1mg/kg、0.1mg/kg和0.01mg/kg)都导致体脂的总体百分比的明显减小，而媒介物和mIL-18治疗的小鼠的总体脂组成没有显著变化(图13，上图)。具体来说，在实验期间，SEQ ID NO:61治疗的小鼠的总脂肪质量水平降低或稳定(图13，左下图)，但是它们总瘦体质量基本上增加(图13，右下图)。这些结果指示，SEQ ID NO:61和本文所公开的其他变体可用于治疗性地减少体脂组成(例如，用于治疗肥胖症、糖尿病和/或代谢综合征)。
DR-IL-18变体的抗肿瘤功效
使用可移植的、同系的YUMMER1.7恶性黑色素瘤肿瘤模型评估DR-IL-18(SEQ IDNO:61)的抗肿瘤功效。在与或不与抗PD1抗体共同施用(8mg/kg/q3d)的情况下，以0.32mg/kg的剂量每两周一次向携带YUMMER1.7肿瘤的小鼠腹膜内施用WT mIL-18和SEQ ID NO:61。与之前关于其在小鼠和人类中使用的报告一致，与媒介物(盐水)相比，WT IL-18不影响肿瘤生长或存活，并且当组合施用时，仅略微提高抗PD1的功效。然而，SEQ ID NO:61呈单一疗法治愈了27％经治疗的小鼠，并且在另外27％小鼠中产生了部分响应，效果与抗PD1治疗相称。SEQ ID NO:61与抗PD1的组合治愈了80％经治疗的小鼠(图14A和图14B)。
为了确定DR-IL-18对YUMMER1.7肿瘤的作用机制，使用针对CD8、CD4、NK1.1和干扰素-γ的抗体进行了细胞耗竭研究。如图15A和图15B中所见，CD8细胞的耗竭或干扰素-γ的中和完全消除了DR-IL-18的有效性。CD4细胞的耗竭不影响DR-IL-18关于肿瘤生长的初始活性，但是，在CD4治疗的小鼠中，治疗响应不持续，表明CD4细胞在支持和维持抗肿瘤免疫方面的作用。NK细胞的耗竭不影响YUMMER1.7细胞中的肿瘤生长或存活。
在免疫原性MC38结直肠肿瘤模型中额外评估了DR-IL-18的活性。首先进行剂量探索研究，施用盐水、WT IL-18(1mg/kg，每周两次)或一系列DR-IL-18剂量(0.01mg/kg、0.1mg/kg或1mg/kg，每周两次)。如图16中所见，WT IL-18对肿瘤生长没有影响，而DR-IL-18(SEQ ID NO:61)显示剂量依赖性功效，在0.1mg/kg下减缓肿瘤生长并且在1mg/kg下产生肿瘤消退。然后扩大队列并评估与免疫检查点抑制的潜在协同。同样，WT IL-18呈单一疗法没有效果，并且没有显示出抗PD1功效的增强。相比之下，DR-IL-18显示稳健的单一治疗活性，与抗PD1相称或比其优异，并且一起给予两种疗法显示出众的协同，在所有经治疗的小鼠中产生完全消退，如图17中所见。
为了进一步表征DR-IL-18的机制，对来自用盐水、WT IL-18或DR-IL-18(SEQ IDNO:61)治疗的小鼠的MC38肿瘤的免疫浸润进行了流式细胞术研究。相对于盐水或WT IL-18，DR-IL-18治疗增加了每毫克肿瘤的CD8和NK细胞浸润，并且额外导致效应细胞的激活标志物(诸如颗粒酶B和KLRG1)的上调(图18A，上行)。与其他细胞因子疗法(诸如IL-2或IL-15)不同，与盐水治疗相比，DR-IL-18不增加肿瘤内的CD8:Treg比率。然而，DR-IL-18治疗通过增加CD8细胞与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)以及单核细胞和粒细胞髓系来源的抑制细胞(MDSC)的比率，导致更有利的肿瘤免疫微环境。还使用Luminex测定，从相同小鼠的血清测量了次要细胞因子释放曲线。如图18B中所见，相对于WT IL-18治疗，DR-IL-18治疗使干扰素-γ、IL-7和IL-15的全身水平增加高于100倍。综合来看，这些结果指示DR-IL-18通过与IL-2、IL-15或WT IL-18治疗不同的独特的作用机制产生抗肿瘤功效。
预计通过DR-IL-18疗法诱导的一些次要细胞因子可能导致毒性和/或有效性降低。例如，IL-17通过DR-IL-18被上调>100倍，导致结肠炎和牛皮癣，并且额外刺激粒细胞，所述粒细胞可成为免疫抑制性髓系来源的抑制细胞。IL-5和IL-13是2型细胞因子，也通过DR-IL-18被上调，并且可能导致过敏、哮喘加重或过敏反应。Th2 T细胞不导致免疫治疗响应，并且可能促进免疫抑制性Treg发育。因此，在某些情况下，DR-IL-18的有效性和安全性可以通过选择性抑制不需要的次要细胞因子(诸如IL-17、IL-5和IL-13)来增强，例如通过中和抗体。
许多肿瘤对免疫检查点抑制具有抗性，无论是在最初出现时(原发性抗性)还是在对治疗产生初始响应后(继发性抗性)。检查点抑制剂的抗性的最普遍原因是通过MHC I类的抗原呈递的损失。表面MHC I类的损失通常与NK细胞介导的细胞溶解相关联，然而，NK细胞可在MHC I缺陷型肿瘤内变得耗尽。由于NK细胞表达IL-18R并且我们先前在MC38中的结果指示NK细胞通过DR-IL-18被扩大并且激活，因此我们测试了DR-IL-18是否可刺激NK细胞针对MHC I缺陷型肿瘤的攻击。我们使用CRISPR/cas9敲除Yummer1.7细胞系中的B2m，并且发现植入的B2m缺陷型YUMMER1.7肿瘤即使用抗CTLA4和抗PD1的组合治疗也是难治的(图19A和图19B)，所述组合通常治愈接近100％亲本Yummer1.7肿瘤。然而，以DR-IL-18(SEQ IDNO:61)的单剂治疗以NK细胞依赖性方式治愈了60％的B2m缺陷型Yummer1.7肿瘤，因为以抗NK1.1的耗竭消除了效果(图19A和图19B)。进行实验以了理解DR-IL-18在MHC I类缺陷型肿瘤的情况下对肿瘤内NK细胞的影响。以流式细胞术对来自用盐水或DR-IL-18治疗的小鼠的B2m缺陷型Yummer.17肿瘤进行免疫表型分型研究。第3剂治疗之后24小时，处死小鼠，将肿瘤解离，并且将细胞悬浮液用PMA/离子霉素处理四小时。然后以Ki67和干扰素-γ，通过细胞内流式细胞术分析NK细胞的增殖指数和功能能力。如图19C中所见，来自盐水治疗的B2m缺陷型Yummer1.7肿瘤的NK细胞的干扰素-γ产生和Ki67水平不足，指示表型耗尽。相比之下，来自用DR-IL-18治疗的肿瘤的NK细胞具有稳健的干扰素-γ产生和Ki67水平，大多数NK细胞对这两种标记物呈阳性。因此，这些结果证明，DR-IL-18在治疗以NK细胞依赖性方式对免疫检查点封锁难治的MHC I类缺陷型肿瘤中有效。
这些结果证明DR-IL-18为非常有前景的肿瘤免疫治疗剂，并且提供了强有力的证据，即鉴于SEQ ID NO:61DR-IL-18变体的活性大大改善，IL-18BP大大限制了IL-18疗法的有效性。根据这些结果，预计其他策略，诸如用抗体、小蛋白质和/或小分子阻断IL-18BP，可增强IL-18疗法和其他免疫治疗方案。
已作出了努力以通过产生“诱饵-诱饵”(D2D)或特异性结合IL-18BP但不结合IL-18Rα并且因此不发出信号的IL-18变体来工程化IL-18BP拮抗剂。此类剂的潜在优势在于，它可用于中和IL-18BP并增强内源性IL-18的活性，而不系统地驱动IL-18R信号传导。因此，针对IL-18Rα在接触位置处随机化IL-18(图20A)，并且如先前针对人和小鼠DR-IL-18所述制备酵母展示的文库。如图20B中所指示，选择3.9x 108个转化体的所得文库以进行3轮，选择保留的IL-18BP结合，同时针对IL-18Rα进行反选择。如图20C中所见，每轮选择都赋予针对与IL-18BP(人和小鼠)的结合的富集，但没有获取IL-18Rα结合。对96个克隆进行测序，得到31个独特的序列，从中得到三个共有序列SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125(图21)。所得克隆的生物物理学表征指示，它们显示出与WT IL-18相似的与IL-18BP的结合等温线(图22A)，但是与IL-18Rα的结合大大降低/不存在(图22B)。这些数据总结于图22C中。针对鼠科动物IL-18进行了相同的选择过程，产生了2.0x 108个转化体的文库，我们选择它获得51个独特的序列，总结在图23中。
实施例2：第二代变体的结合亲和力测量
使用表面等离子共振(SPR)进行对第二代DR-IL-18变体的生物物理学亲和力测量(与IL-18R相对于IL-18BP的结合)。实验使用Biacore T100仪器进行并且在25℃下进行。将生物素化的IL-18Rα或IL-18BP固定到Biacore生物素捕获芯片(S系列CAP传感器芯片，GEHealthcare)上，得到约50RU(IL-18Rα)或约10RU(IL-18BP)的Rmax。以在HEPES缓冲盐水-P+缓冲液(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，0.005％表面活性剂P20)中的IL-18变体的连续稀释进行测量。通过三次60秒注射再生缓冲液(3/4(v/v)8M盐酸胍与1/4(v/v)1M氢氧化钠)使表面再生。实验同时在多个通道中进行，以增加观察结果。以Biacore T100评估软件2.0版本，利用1:1朗缪尔结合模型分析所有数据。
结果确认了，本公开的DR-IL-18变体表现出对IL-18BP的亲和力大大减小，并且以至少与WT IL-18可比的亲和力结合IL-18Rα(所生成的传感图参见图24，表10为所测量的动力学的总结，表11为亲和力测量结果的总结，并且表12为大体总结，包括针对第二代DR-IL-18变体的解离常数比率的结果)。
表10为针对第二代hDR-IL-18变体的SPR数据的总结(动力学)
表11为针对第二代hDR-IL-18变体的SPR数据的总结(亲和力)
表12为第二代hDR-IL-18变体对IL-18Rα和IL-18BP的SPR亲和力测量结果的总结。IL-18BP:Rα解离常数比率为对IL-18BP的KD与对IL-18Rα的KD的比率，其归一化到WT IL-18的相同比率。此比率的数字较高指示与WT IL-18相比，IL-18变体相对于IL-18BP对结合IL-18Rα的偏好增强。*2项研究的平均值。k为1,000的倍数。m为1,000,000的倍数。
实施例3：针对癌症治疗的功效
使用多种不同的癌症模型测试了DR-IL-18变体的功效，模型包括结直肠肿瘤、乳腺癌、黑色素瘤和对免疫检查点抑制剂具有抗性的MHC I类缺陷型肿瘤的模型。结果显示，偏向结合IL-18R而不是IL-18BP的DR-IL-18变体可用于治疗范围广泛的癌症(不仅限于已测试的那些)。
为了DR-IL-18在结直肠癌模型中的功效，皮下植入250,000个CT26细胞，并且在第7天，一旦肿瘤为平均约60mm3便开始治疗。WT IL-18和SEQ ID NO:61以0.32mg/kg皮下给药，每周两次，共计5次剂量。在相同的时间表下，以10mg/kg给予抗PD1。仅用DR-IL-18治疗在动物子组中导致肿瘤生长抑制和肿瘤清除(图25A，提供蜘蛛图的重叠，显示用盐水(PBS，圆圈)、WT IL-18(正方形)和DR-IL-18(SEQ ID NO:61，三角形)治疗的动物的肿瘤生长)，但WT IL-18不是这样。DR-IL-18导致存活延长(图25B，显示用抗PD-1、WT IL-18或DR-IL-18(SEQ ID NO:61)治疗的小鼠的存活曲线；完全响应的数目指示在括号中)，但WT IL-18不是这样。40％的以DR-IL-18治疗的小鼠表现出肿瘤清除，这是优于检查点抑制剂抗PD-1的改善。提供以抗PD-1、WT IL-18和DR-IL-18(SEQ ID NO:61)治疗的小鼠的存活曲线。完全响应的数目指示在括号中，并且在40％的小鼠中有肿瘤清除，这是优于检查点抑制剂抗PD-1的改善。
在4T1乳腺癌模型和B16-F10黑色素瘤模型中，仅DR-IL-18导致肿瘤生长抑制，但WT IL-18不是这样。在肿瘤超过平均体积50mm3之后施用治疗，如通过用“t”标记的方框所指示。
使用4T1乳腺癌模型和B16-F10黑色素瘤模型评估DR-IL-18对于其他癌症类型的功效。将500,000个4T1细胞皮下植入在BALB/C小鼠中，并且将500,000个B16-F10细胞皮下植入在C57BL/6小鼠中。在肿瘤超过平均体积50mm3之后施用治疗。在两种模型中，仅DR-IL-18导致肿瘤生长抑制，但WT IL-18不是这样，如图26A(4T1肿瘤)和图26B(B16-F10)中所示。在肿瘤超过平均体积50mm3之后施用治疗，如通过用“t”标记的方框所指示。还在MHC I类缺陷型肿瘤模型中评估了DR-IL-18的功效。使用CRISPR/Cas9介导的缺失制备B2m缺陷型(和因此MHC I类缺陷型)MC38细胞，如针对B2m缺陷型YUMMER细胞所述。将B2m-/-MC38细胞皮下植入，并且在第7天肿瘤为平均约65mm3时开始治疗。SEQ ID NO:61以0.32mg/kg给药，每周两次，5次剂量。在相同的时间表下，以8mg/kg给予抗PD1和抗CTLA4。MHC I类缺陷型肿瘤对以抗PD1和抗CTLA4的免疫检查点抑制具有抗性，但是DR-IL-18治疗导致肿瘤生长抑制(图27A)。
RMA/S是RMA淋巴瘤系的变体，它包含Tapasin的自发突变，导致抗原负载的缺陷，并且因此导致MHC I类表面表达减少。将同类系C57BL/6小鼠皮下植入1,000,000个RMA/S细胞，并且在第7天开始治疗。SEQ ID NO:61以0.32mg/kg给药，每周两次。在相同的时间表下，以8mg/kg给予抗PD1。RMA/S肿瘤对以抗PD-1的免疫检查点抑制具有抗性，而以DR-IL-18的治疗导致肿瘤生长抑制(图27B)。
实施例4：单独的DR-IL-18或其与治疗性抗体组合对癌细胞杀伤的促进
进行了离体细胞毒性研究以评估DR-IL-18促进癌细胞杀伤的能力。将CFSE标记的Raji(B细胞淋巴瘤)细胞用作靶细胞。分离人外周血单核细胞(PBMC)并将其与CFSE标记的Raji细胞一起以1:10的效应物:靶标(E:T)比率孵育25小时。人DR-IL-18变体hCS-1(1μM)、抗CD20抗体利妥昔单抗(10μg/mL)或两种剂的组合。细胞毒性通过流式细胞术进行测量并且计算为变为DAPI阳性的CFSE细胞的分数。DR-IL-18治疗导致靶细胞的杀伤，并且DR-IL-18与利妥昔单抗的组合导致癌细胞杀伤的水平高于单独的任一剂，表明DR-IL-18可以增强抗肿瘤抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC；图28；*p<0.05，通过两因素ANOVA与Tukey的多重比较校正)。这些数据表明，DR-IL-18可以与调理剂(诸如肿瘤靶向抗体)结合使用，以增强对癌细胞的杀伤。
实施例5：DR-IL18对病毒感染的功效
此实施例证明，DR-IL-18可用于治疗感染性疾病，诸如病毒感染。C57BL/6小鼠腹膜内(IP)感染106PFU的牛痘病毒(VACV)，并且IP施用1mg/kg WT mIL-18或DR-IL-18(SEQID NO:61)，如图29A中所总结。在感染之后第3天处死小鼠并且通过RT-PCR测量血液和卵巢中的病毒滴度。以DR-IL-18治疗导致血液和卵巢中的病毒载量的显著降低，而野生型mIL-18不是这样(图29B，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。DR-IL-18在这种全身性病毒感染模型中的功效表明，DR-IL-18可用于控制感染性疾病。
实施例6：第二代人DR-IL-18变体诱导IL-18R信号传导
使用IL-18HEK-Blue报告细胞评估了第二代人DR-IL-18变体SEQ ID NO:89、SEQID NO:90、SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:87经由IL-18受体诱导信号传导的能力。实施例1中描述了这些DR-IL-18变体的生成，并且实施例2中描述了它们对IL-18Rα和IL-18BP的亲和力。
将HEK-Blue IL-18传感细胞(InvivoGen)维持在补充有100μg/mL Normocin、30μg/mL Blasticidin、180μg/mL Zeocin和200μg/mL Hygromycin的完全培养基(含有10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的DMEM)中。对于细胞因子活性测量，将平底96孔板的每孔50,000个HEK-Blue IL-18传感细胞在总体积200μL完全培养基中与浓度逐渐降低的重组人IL-18或DR-IL-18变体一起孵育。在37℃和5％ CO2下孵育24小时之后，将30μL细胞培养上清液与170μL QUANTI-Blue检测培养基(InvivoGen)混合并且在37℃和5％ CO2下孵育，直到可检测到从粉色到蓝色的颜色变化(0.5-4小时)。使用分光光度计，在655nm波长下量化碱性磷酸酶的水平。
人SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:91显示与WT hIL-18相比增强的效力，而SEQ ID NO:87展现出与WT hIL-18大致等同的效力(图30)。因此，数据说明，所有测试的第二代人DR-IL-18变体都通过IL-18R主动地发出信号。
实施例7：增强IL-18变体稳定性的半胱氨酸突变
SEQ ID NO:89比WT IL-18更稳定，然而，它可形成二硫键连接的二聚体，以及分子内二硫键。因此，生成了单、双、三和四重半胱氨酸到丝氨酸突变的所有组合，以测试在这些位置处的突变是否可以稳定化IL-18分子，并确定哪些突变组合提供最佳稳定性。
进行了在SEQ ID NO:89中所有4个半胱氨酸残基向丝氨酸的系统性突变，如表13中所示。
表13显示所测试的SEQ ID NO:89的半胱氨酸变体。
克隆SEQ ID NO:1-15(它们是SEQ ID NO:89的变体)通过Twist合成，并且被克隆到含有n-末端aga2前导序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体中，以用于分泌性表达。将质粒转化到毕赤酵母中，并且在30℃下通过甲醇诱导60小时来表达。在诱导之后，将上清液在SDS/PAGE凝胶上跑胶，并且使用Spyro-Ruby染色剂进行可视化。
克隆SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6给出了最佳表达，而没有分子间或分子内二硫键形成的证据(图31；例如，分别地，非还原样品中约35kDa的二聚体谱带和低于18kD的较低双谱带)。这两个克隆包含C38S和C68S突变的组合。任何具有C127突变的克隆都表现出较低的表达产量。在图31中，R＝还原样品；N＝非还原样品；MW＝分子量。沿着底部的数字是指SEQID编号。
结论：在位置C38和C68处的突变(参见例如SEQ ID NO:6)提供了最大程度的稳定化(例如，在DR-IL-18变体SEQ ID NO:89的情况下)。SEQ ID NO:6(C38S/C68S)尤其显示增强的表达和大大增加的稳定性，但是效力稍差(但仍然可以接受)。
实施例8：预测的T细胞表位的去除
实施例7中所生成的C68S突变导致预测的新表位(例如，T细胞表位)。因此，构建了在位置C68处的6个额外非免疫原性取代(SEQ ID NO:16-21)，然后测试了它们的稳定性/效力。
通过Twist合成了含有在C68处的替代突变(G、A、V、D、E或N)的克隆SEQ ID NO:16-21，并且将它们克隆到具有N-末端6xHis-SUMO标签的大肠杆菌细胞质表达载体中。使大肠杆菌在摇瓶中的100mL Terrific Broth中生长，并且在20℃下用IPTG诱导16小时。在诱导之后，通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)柱纯化蛋白质；通过添加加his标签的Ulp1蛋白酶实现SUMO标签去除。然后通过第二个IMAC柱去除游离的加his标签的SUMO和加his标签的Ulp1。通过SDS/PAGE评估产量和纯度。
变体以高滴度表达(表14)并且通过非还原SDS-PAGE凝胶分析，未显示出二硫键形成的证据(图32；R＝还原样品；NR＝非还原样品)。
表14总结了在位置38和68处筛选的额外突变、对应的序列和DR-IL-18变体的蛋白质产量。
如图33中所示，进行了加速的“货架期稳定性”研究以进一步评估DR-IL-18变体的稳定性。在PBS中以1mg/mL配制蛋白质制剂，并且在51℃下保持48小时。在若干时间点取得样品，通过0.45μm过滤器过滤，并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析。DR-IL-18变体在这些条件下表现出一定范围的稳定性，其中SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:17以相对于t＝0的主峰的百分比显示最大停留(图33)。使用IL-18报告分子测定测量了WT IL-18相对于DR-IL-18变体的活性，在所述测定中IL-18受体信号传导导致分泌型碱性磷酸酶(来自InVivoGen的HEK-Blue IL-18)的表达。培养报告细胞，进行刺激，并且测量分泌型碱性磷酸酶，如实施例6中所述。与WT IL-18相比，所有变体都显示IL-18R信号传导诱导的效力增加，并且效力与亲本变体SEQ ID NO:89相似(表15和图34)。
表15显示DR-IL18变体对于诱导IL-18R信号传导的EC50值，如通过HEK-Blue报告细胞系测定所确定(还参见图34)。
表16总结了通过此实施例中的测定所确定的DR-IL-18变体的产量、效力和稳定性的排名
实施例9：本公开的DR-IL-18的稳定性、亲和力和效力的表征
基于其有利的效力、稳定性和免疫原性概况，选择SEQ ID NO:19以用于进一步表征(参见实施例7和8)。进行额外测定以比较SEQ ID NO:19(C38S/C68D)与SEQ ID NO:89(亲本C38/C68分子)和野生型人IL-18的稳定性、亲和力和效力。
测试了冻-融循环对SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:89的影响。在20mM乙酸盐pH 5.0、8％蔗糖、0.1mM EDTA和0.02％聚山梨醇酯(PS)80中配制蛋白质。然后将制剂在-80℃下冷冻并在25℃下解冻五次。然后通过尺寸排阻色谱法分析蛋白质。观察到SEQ ID NO:89主峰的减少，同时观察到二聚体峰的出现(由箭头指示)(图35，上图)。相比之下，对于SEQ IDNO:19没有检测到变化或检测到最小变化(图35，下图)，表明此DR-IL-18变体在暴露于冻-融循环之后的稳定性优异。
在37℃下暴露于搅拌之后，进行使用搅拌研究的稳定性比较。在20mM乙酸盐pH5.0、8％蔗糖、0.1mM EDTA和0.02％ PS80中配制SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:89蛋白。将样品在37℃下摇动搅拌72小时。在t＝0、24(d1)和72(d3)小时取得样品，并且通过尺寸排阻色谱法分析。观察到SEQ ID NO:89主峰的减少，如箭头所指示的二聚体/HMW(高分子量)物质的相对增加(图36，上图)。相比之下，对于SEQ ID NO:19没有检测到变化或检测到最小变化。图36描绘了根据搅拌研究的比较SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:89的尺寸排阻色谱法数据。
IL-18受体亲和力。使用表面等离子共振测定人IL-18和SEQ ID NO:19对人和食蟹猴IL-18Rα和IL-18BP的亲和力。将生物素化的受体蛋白固定在链霉抗生物素蛋白捕获芯片上，并且应用IL-18或SEQ ID NO:19作为游离分析物。使用单细胞动力学确定结合。在此测定中，WT hIL-18和SEQ ID NO:19对IL-18Rα的结合亲和力相似(图37A)。然而，WT IL-18以极高的亲和力(<1nM)结合IL-18BP，而SEQ ID NO:19未表现出可检测的与IL-18BP的结合(图37B)。
使用IL-18报告分子测定评估了WT IL-18和SEQ ID NO:19在存在IL-18BP的情况下的活性，在所述测定中IL-18受体信号传导导致分泌型碱性磷酸酶(来自InVivoGen的HEK-Blue IL-18)的表达。培养报告细胞并且测量分泌型碱性磷酸酶水平，如实施例6中所述，除了在存在10-6至10-9M的IL-18BP浓度范围的情况下，分别以固定浓度1.0或0.1ng/mL将WT IL-18或SEQ ID NO:19应用于HEK-BLUE IL-18报告细胞。根据制造商的说明，测量下游分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)活性。WT hIL-18通过添加IL-18BP被有效抑制，而SEQ IDNO:19在所有IL-18BP浓度下均保留对IL-18R信号传导的强诱导(图38)。
实施例10：IL-18多肽的给药
进行了第一项给药研究，以比较在癌症模型中每天一次、每隔一天、每周两次和每周一次以DR-IL-18给药的功效和耐受性。此项研究在小鼠中进行的，并且因此使用SEQ IDNO:61，它是一种小鼠DR IL-18变体多肽(即，结合并激活小鼠IL-18R但不被小鼠抑制IL-18BP的小鼠IL-18)。未使用人类变体，因为人IL-18蛋白不与小鼠IL-18R发生交叉反应(即，它不结合并激活小鼠IL-18R)。
皮下植入250,000个MC38细胞，并且一旦肿瘤为80mm3便开始治疗。给药为qD(每天一次)、qoD(每隔一天一次)、BiW(每周两次)或qW(每周一次)，皮下给予2周。所有剂量和时间表都显示出功效(图39)。大多数方案耐受良好。然而，每日给药在0.1mpk(mg/kg)和更高时显示出毒性。肿瘤生长通常发生在治疗中止之后。一旦达到终点，便以之前进行的最后一个点描绘肿瘤生长曲线。一旦50％或更多的动物达到终点，曲线便终止。结果：以0.1mpk(mg/kg)和更高的每日给药看起来是有毒的，并且与体重减轻相关联。DR-IL-18在所有其他给药时间表中均有效。功效优于抗PD-1疗法，这在所有测试的剂量下甚至在每周一次给药时都是明显的。
进行了第二项给药实验，以比较在癌症模型中每周一次和每周两次的给药。如上，使用SEQ ID NO:61，因为这些研究在小鼠中进行。皮下植入250,000个MC38细胞，并且一旦肿瘤达到100mm3(第7天)便开始治疗。通过皮下注射，动物以每周一次(qW)的频率施用四次剂量或以每两周一次(q2W)的频率施用两次剂量。测试了100倍范围的剂量(0.01至1.0mg/kg)。所有剂量和时间表都显示出功效，即使在0.01mg/kg下亦如此。在qW和q2W给药时，最大有效剂量(MaxED)为约0.32mg/kg(图40)。即使在不频繁的脉冲给药情况下也观察到了强的DR IL-18功效。即使每2周一次给药也比每周两次抗PD-1治疗更有效。鉴于需要延长半衰期或频繁给药(例如，IL-2的TID给药)的其他白介素(例如，IL-2/IL-15、IL-10)的给药要求，这是非常令人惊讶的。
进行猴子耐受性测定以确定DR-IL-18在各种剂量下并且使用每周一次(qW)或每周两次(BiW)给药方案的耐受情况。用DR-IL-18(SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:19)皮下治疗食蟹猴，每周(qW)或每周两次(BiW)，剂量范围为0.001mg/kg至3.2mg/kg。定期抽血并测量血液中的血红蛋白水平。说明性给药和取样方案提供于图41A中。结果显示，在研究中，给药频率超过1x/周引起血红蛋白浓度的不理想的下降。每周两次用SEQ ID NO:89皮下治疗的食蟹猴相对于盐水治疗的猴子表现出剂量依赖性血红蛋白减少(图41B，上图)。相比之下，每周一次用DR-18(SEQ ID NO:89或SEQ ID NO:19)治疗，即使高达3.2mg/kg，相对于对照盐水治疗也不导致血红蛋白水平降低(图41B，上图和下图)。
实施例11：在细菌(大肠杆菌)中产生DR-IL-18变体
过程1：采用SUMO-蛋白酶的无细胞体外切割
在此实施例中，DR-IL-18(在这种情况下，SEQ ID NO:89)用加His标签的SUMO标签加标签，在大肠杆菌中表达，并且使用加His标签的SUMO蛋白酶切割SUMO标签，产生活性IL-18蛋白。
将DR-IL-18克隆到具有N-末端6xHis-SUMO标签的大肠杆菌细胞质表达载体中。使大肠杆菌在摇瓶中的100mL Terrific Broth中生长，并且在20℃下用IPTG诱导16小时。使用固定化金属亲和色谱法(IMAC)从细菌裂解物中初步捕获融合蛋白(加His标签的SUMO标签与DR-IL-18的融合物)。这是高效的，在>90％的纯度下步骤产量高。在用加His标签的Ulp1 SUMO蛋白酶进行切割反应以去除SUMO标签之后，以耗竭模式，使用IMAC有效地去除经去除的加His标签的SUMO标签和加His标签的SUMO蛋白酶。通过SDS/PAGE评估产量和纯度。在此步骤之后，所得蛋白质纯度>90％(通常>95％)(图42A)。切割是有效的，并且可以以1:500或更高的比率进行。注意：在较低温度(21℃)下表达大大提高可溶性产量(此项具体研究在26℃下进行)。图42B总结处理和纯化步骤。
图43A和图43B提供切割反应的结果，如通过RP-HPLC测定所监测。RP-HPLC测定还可用于计算步骤产量和滴度。
过程2：用共同表达的SUMO-蛋白酶在细菌细胞内部的切割
此实施例证明，加SUMO标签的IL-18(在这种情况下，稳定化的DR IL-18SEQ IDNO:19)和SUMO-蛋白酶可以在细菌(在这种情况下，大肠杆菌)中共同表达，导致经由细菌细胞内部的切割去除SUMO标签。SUMO蛋白酶在鼠李糖-诱导型启动子的控制下表达。蛋白酶的鼠李糖诱导允许蛋白酶相对于IL-18(例如，DR-IL-18)的单独定时和可调诱导。表达加SUMO标签的DR-IL-18的大肠杆菌用0.1至2mM L-鼠李糖处理，导致SUMO蛋白酶表达的诱导，以及SUMO标签的切割，释放未加标签的SEQ ID NO:19(图44)。注意：在非还原凝胶上，SUMO标签跑胶超过DR-18；由于启动子“渗漏”，在没有鼠李糖处理的情况下可观察到一些切割。
经切割的产物的总表达与SUMO-融合物可比(在考虑SUMO质量之后)。使用RP-HPLC监测体内(在细菌细胞中)切割(图45，显示鼠李糖处理的培养物的SUMO标签的切割)。0.2-0.5mM L-鼠李糖看起来这些具体实验中提供了良好的结果。
通过将SUMO-蛋白酶以双顺反子形式放置于IL-18(例如，DR-IL-18)下游，并且通过例如在诱导型启动子(诸如鼠李糖-诱导型启动子)下，从单独的启动子(例如，从单独的质粒)表达SUMO蛋白酶，获得了成功的结果，如在此实施例中那样。
下游过程可用于捕获和纯化切割的产物(即，活性DR-IL-18蛋白)(参见，例如，实施例12)。
使用RP-HPLC监测体内(在细菌细胞中)切割。图45提供体内(在细菌细胞中)切割的色谱图。注意：鼠李糖启动子的“渗漏”产生了足够的SUMO蛋白酶来切割大部分融合蛋白。0.2-0.5mM L-鼠李糖看起来是这些具体实验中的最佳浓度范围。
实施例12：使用酵母(巴斯德毕赤酵母)产生IL-18变体
使用巴斯德毕赤酵母(酵母)开发了表达和分泌DR-IL-18的系统。将信号肽添加到DR-IL-18并且克隆到表达载体中(图46，上图)。此系统导致DR-IL-18的分泌和信号肽酶/Kex2对信号肽的切割，避免了去除标签对蛋白酶的需要。
在此说明性实施例中，测试了DR-IL-18变体SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:87。DR-IL-18变体通过Twist Biosciences合成，并且被克隆到含有n-末端aga2前导序列的巴斯德毕赤酵母表达载体中，以用于分泌性表达。将质粒转化到毕赤酵母中，并且在30℃下通过甲醇诱导60小时来表达，导致以高滴度产生DR-IL-18，在一些情况下包括>1g/L。将具有活性天然N-末端(在人IL-18的情况下，酪氨酸)的DR-IL-18直接分泌到培养基中(图47)。
使用2色谱步骤过程，以便将IL-18(在这种情况下，DR IL-18SEQ ID NO:89)无标签纯化至纯度>97％，单分散性96％，<2EU/mg(图46和图48；UFDF＝超滤(UF)和渗滤(DF))。“Capto MMC”是一种多模式耐盐树脂，用于通过填充床色谱法从大量进料中捕获和中间纯化蛋白质。HIC＝疏水相互作用色谱法(例如，此图中描绘了苯基琼脂糖凝胶HIC)。
进行DR-18纯化。图48显示了显示DR-18的纯化(例如，从巴斯德毕赤酵母或从细菌)的SDS-PAGE凝胶。2色谱步骤过程有助于将IL-18(在这种情况下，DR IL-18SEQ ID NO:89)无标签纯化至纯度>97％，单分散性96％，<2EU/mg。UFDF＝超滤(UF)和渗滤(DF)。“CaptoMMC”是一种多模式耐盐树脂，用于通过填充床色谱法从大量进料中捕获和中间纯化蛋白质。HIC＝疏水相互作用色谱法(例如，此图中描绘了苯基琼脂糖凝胶HIC)。
实施例13：用于产生DR IL-18变体的细胞库的生成
此实施例说明用于产生SEQ ID NO:19(在位置C38和C68处具有突变的本公开的DRIL-18变体)的质粒系统和细胞库的生成。
生成了双质粒系统以用于在大肠杆菌中表达SEQ ID NO:19。对于全活性，IL-18(例如，DR IL-18，诸如SEQ ID NO:19)可能需要其天然N-末端而不是N-末端甲硫氨酸。因此，使用小泛素相关修饰物(SUMO)表达系统设计质粒，所述系统在N-末端利用来自酿酒酵母的SUMO前导序列，使得SUMO前导序列可以被SUMO蛋白酶ULP1切割掉。
具有SUMO前导肽的DR IL-18的表达由高拷贝质粒中的T7启动子驱动，以最大化表达。使用pD451-SR质粒主链。此质粒含有卡那霉素抗性基因、pUC复制起点，并且具有T7启动子，其存在以在异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导之后表达SEQ ID NO:19蛋白。
使用第二较低拷贝数的质粒以实现通过鼠李糖启动子驱动的SUMO蛋白酶的表达，其相对较弱，使得表达可以通过改变向培养物中添加的鼠李糖的量来调整。将SUMO蛋白酶基因克隆到质粒pD883-SR中。此质粒包含氯霉素抗性基因、p15a复制起点，并且具有鼠李糖启动子作为rhaBAD调控序列的一部分，以实现在鼠李糖诱导之后SUMO蛋白酶的受控表达。
将两种质粒同时转化到大肠杆菌菌株T7 Express中，并且使用含有卡那霉素和氯霉素的琼脂板选择具有质粒的克隆。T7 Express为在IPTG诱导之后利用T7启动子实现非常高的基因表达的菌株。它在乳糖操纵子中包含T7聚合酶，并且不含λ原噬菌体。具有不同复制起点和不同抗生素抗性基因的两个质粒的系统允许两个质粒以稳定的方式被维持并且独立地进行测试。SUMO蛋白酶和SUMO前导肽都具有N-末端His标签，从而允许通过固定化金属亲和色谱法去除它们。此表达系统被设计成允许非常高地表达正确加工的SEQ ID NO:19，其已被例如2-3g/L的SUMO蛋白酶正确切割。
用两种质粒各1μL转化大肠杆菌菌株T7 Express感受态细胞。使转化的细胞在补充有50μg/mL卡那霉素(KAM)和50μg/mL氯霉素(CAM)的LB琼脂板上于37℃下生长过夜。将单个生长良好的菌落接种到10mL培养基中，并且使其在30℃下生长过夜。通过将等体积的过夜培养物与30％(v/v)无菌甘油溶液混合来制备细胞库，然后将混合的溶液等分到合适的小瓶中(以200μL)，并且在-20℃下储存。
将一个小瓶解冻，继代培养到含有50μg/mL KAM和50μg/mL CAM的TBA(TerrificBroth Agar)板上，并且在30℃下孵育20至24小时。将单个菌落接种到50mL培养基中，并且在摇床培养箱中以30℃、220rpm孵育过夜。将此培养物以0.2至0.3OU，在OD 600nm下接种，并且在摇床培养箱中以30℃、220rpm孵育。最终培养物OD 600nm为1.9(甘油之前)。通过将56mL细胞培养物与8mL80％无菌甘油(10％最终浓度)混合并等分到50个冷冻小瓶(每个1mL)中，制备新的细胞库。将小瓶贴上标签并直接储存在-80℃的冰箱中。在冷冻之前和之后都对此细胞库进行测试，证明质粒的稳定性和高浓度活细胞的保留(表17)。
表17：冷冻之前和之后细胞库样品的活力、纯度和质粒稳定性
将一个小瓶在2℃至8℃下温和地解冻≤30min。在解冻之后，将1mL细胞悬液转移到0.5L具有制备的TB培养基的摇瓶中，所述培养基中添加了盐和抗生素(卡那霉素和氯霉素)。将此培养物在37℃、300rpm的搅拌速率下孵育15至18h，直至达到≥5.0OU的目标光密度。之后，将来自第一次生长的所需量的细胞悬浮液转移至1L摇瓶中以用于进一步培养，持续至少3至4小时，直至达到1.50OU至3.50OU的所需光密度。将160mL第二生长细胞培养物与160mL50％甘油溶液合并并且混合，并且将1.0mL细胞悬浮液等分到无菌低温小瓶中并且适当地贴上标签。将来自此第二细胞库的小瓶在-80±10℃下冷冻。细胞库制备的过程中控制是冷冻之后的培养物纯度、冷冻之后的总活细胞计数和冷冻之后的质粒稳定性。测试显示，不存在噬菌体污染，并且质粒拷贝数为288.15。IL-18编码质粒保留了与最初设计的序列的100％序列同一性，并且限制性酶消化得到期望的质粒片段大小，指示质粒结构或插入序列没有变化。
实施例14：游离硫醇的Ellman滴定
此实施例证明，天然SEQ ID NO:19，本公开的在位置C38和C68位处具有突变的DRIL-18变体，含有非常少的游离半胱氨酸。
使用Ellman试剂(5,5'-二硫-双-[2-硝基苯甲酸]/DTNB)以通过与含硫氢基的化合物的标准曲线相比较来估计样品中的硫氢基。DTNB在与蛋白质的游离硫醇反应之后，生成有色产物2-硝基-5-硫代苯甲酸酯(TNB)，它在412nm处有吸收。对于与DTNB反应的每摩尔硫醇，产生一摩尔TNB，并且通过量化TNB的量，可以估计每摩尔蛋白质存在的游离半胱氨酸的数目。测定结果显示，天然SEQ ID NO:19中存在非常少的游离半胱氨酸(表18)，与以下一致：C38和C68突变为其他残基；SEQ ID NO:19中的两个剩余残基缺少溶剂暴露；以及对于实施例7和8中具有此类突变的多肽观察到分子内和分子间二硫键的形成减少。
表18：SEQ ID NO:19的样品中的游离硫醇基确定。
实施例15：制剂开发
进行制剂开发以选择用于毒理学和临床研究的原料药和药物产品制剂。SEQ IDNO:19原料药制剂开发过程包括评估最佳pH、蛋白质浓度和赋形剂筛选。制剂旨在支持以下产品属性：液体形式、无菌、适于皮下注射以及在2℃至8℃或-20℃的温度下至少24个月的货架期。通过稳定性研究评估制剂。稳定性研究的详情提及如下：
1.针对在选定pH值下蛋白质完整性的可能改变，将受应力的样品与初始样品进行比较。应力条件为40±2℃/25％ RH，长达3周。
2.进行冻-融循环以评估蛋白质对重复冷冻和解冻的敏感性。在以下条件下进行了多达五个冻-融循环：-80℃长达16小时，然后在室温下持续8小时。
3.进行摇动搅拌以评估蛋白质降解通路和速率(在150rpm下，25℃/60％ RH，长达2周)。SEQ ID NO:19原料药制剂开发研究总结于表19中。
表19
缩写：AEX-HPLC＝阴离子交换液相色谱法；MFI＝微流成像；RP-HPLC＝反相高效液相色谱法；PS80＝聚山梨醇酯80；SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；SE-HPLC＝尺寸排阻液相色谱法。
在研究1期间，在热应力条件下比较了六种浓度和pH不同的制剂。在40±2℃/25％RH下3周之后，pH较低的制剂较不稳定。因此，为研究2选择pH 6.5和7.0。此外，在研究1期间的蛋白质纯度未显示出对蛋白质浓度的依赖性。因此，在研究2中使用20mg/mL和30mg/mL的蛋白质浓度。在研究2期间，将额外赋形剂添加到制剂中，乙二胺四乙酸和L-甲硫氨酸，以维持最佳的蛋白质稳定性并防止其氧化。在所有测试的条件下均未观察到制剂之间的差异。根据制剂开发结果，最终选定的组成为在pH 6.5的10mM L-组氨酸/L-组氨酸-HCl、8％蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80中的30mg/ml SEQ ID NO:19蛋白。
实施例16：确定治疗剂量的人类施用
这项研究的主要目的是确定SEQ ID NO:19在复发或难治性实体瘤的患者中的MTD和RP2D。次要目标是评估SEQ ID NO:19的总体安全性和耐受性，以及表征SEQ ID NO:19呈单一剂的药代动力学(PK)曲线。研究人员通过查看以下来监测研究的安全性：DLT和不良影响(AE)的发生率、临床实验室参数的变化、生命体征、ECG测试和参数、体格检查以及抗SEQID NO:19抗体的发生率。研究人员还监测患者发展细胞因子风暴的可能性，因为SEQ IDNO:19是免疫激动剂。
在剂量递增研究中入组了复发性或难治性实体瘤患者，以确定SEQ ID NO:19的最大耐受剂量(MTD)和推荐的2期剂量(RP2D)。符合条件的患者为18岁或更大，并且被诊断为患有实体瘤，所述实体瘤通过标准疗法具有疾病进展，或者延长生存的其标准护理疗法不可用或不适合。患者接受皮下(SC)剂量的SEQ ID NO:19，每周一次，持续28天(一个周期)。剂量的范围可以是30μg SEQ ID NO:19/kg患者(μg/kg)至1200μg/kg。进一步的剂量递增可以包括1200μg/kg至1.5mg/kg的范围。初始测试剂量为30μg/kg。那两个范围内的任何剂量都可以在研究中进行测试，以确定MTD和RP2D。剂量递增遵循mTPI模型，最初有2名患者的队列，主要剂量限制毒性(DLT)监测期为第一剂之后28天。在新患者可以接受新剂量之前，在第一剂新剂量之后监测患者7天。
mTPI模型使用简单的β-二项式分层模型，其中决策规则基于计算对应于剂量不足、适当和过量的3个给药间隔的单位概率质量(UPM)。mTPI方法计算3个给药间隔的UPM，并且具有最大UPM的那个意味着对应的剂量发现决策，并且所述决策提供了用于未来患者的剂量水平。目标毒性概率为25％，可接受的DLT间隔为20-30％。如果第一个周期中的初始两名患者没有经历DLT，那么下一个队列的入组将从下一个周期的下一个剂量水平开始。如果两个初始患者中的一个经历了DLT，则剂量将降低到下一个最低剂量。如果当队列扩大到6名患者时，在较低剂量水平下未观察到额外的DLT，则将恢复剂量递增。一旦观察到第一个DLT，仅将≤33％剂量递增应用于所有剩余的队列。
在研究结束时对MTD的估计来自保序回归。具体而言，MTD估计是DLT率的保序估计小于或等于25％的剂量水平，并且它是DLT率的保序估计最接近目标DLT率的剂量水平。如果已经实现42名患者的最大样本量，则停止剂量递增，以预测MTD的剂量水平入组6至12名患者，或者探索的所有剂量看起来毒性过大并且不可确定MTD。
从所有人收集用于PK分析的血液样品，并且研究人员使用这些样品计算PK参数。在第1周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第15天和第22天，第2周期的第1天和第15天，以及从第3周期开始的交替周期的第1天收集血液样品，直至研究完成。患者还在最后一剂SEQID NO:19之后30天以及在患者开始新疗法之前提供血液样品。使用非房室分析(如果可能的话)，从血浆浓度-时间数据估计PK参数Cmax、tmax、AUC0-1、AUCτ、AUC0-∞和t1/2。在适当时，可以考虑额外PK参数。研究人员还使用血液样品监测患者是否发展抗药抗体。
实施例17：实体瘤患者的功效测试。
此项研究的主要目的是评估SEQ ID NO:19在复发实体瘤队列中在RP2D下的抗肿瘤活性。此项研究的主要功效终点是通过RECIST 1.1观察具有完全响应(CR)或部分响应(PR)的患者的确认客观响应。次要功效终点将包括：最佳客观响应、疾病控制率(DCR)(CR、PR或疾病稳定(SD)≥12周)、响应持续时间(DOR)、响应时间(ToR)、无进展存活(PFS)和总体存活(OS)。
在一项研究中入组了实体瘤类型不同的患者，以评估SEQ ID NO:19治疗在这些肿瘤类型中的效率。符合条件的患者为18岁或更大，并且患有以下实体瘤类型之一：黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)或微卫星不稳定高(MSI-Hi)肿瘤。在第一次剂量之后的28天内，患者接受强制性肿瘤活检。对于RCC、TNBC、NSCLC和MSI-Hi，每种肿瘤类型可入组至多25名患者；转移性黑色素瘤和SCCHN癌症类型可以每种癌症类型入组至多28名患者。如果研究人员在癌症类型队列中没有观察到任何客观响应，则队列中将不再入组额外患者。
患者接受一次皮下剂量的SEQ ID NO:19，每周一次，持续28天(一个周期)。所述剂量是来自人类剂量递增研究的RP2D。在研究期间，患者每8或12周接受疾病评估，并且可能包括计算机断层摄影术(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描和/或正电子发射断层摄影术(PET)扫描。研究人员使用实体瘤响应评估标准(RECIST 1.1)评估来自扫描的所有目标和非目标病变。在第2周期开始之前，患者接受第二次强制性肿瘤活检。如果在研究中发生疾病进展，则患者可在疾病进展时要求进行任选的活检。
从所有患者收集用于PK分析的血液样品，并且研究人员使用这些样品计算PK参数。在第1周期的第1天和第15天，第2周期的第1天和第15天，以及从第3周期开始的交替周期的第1天收集血液样品，直至研究完成。患者还在最后一剂SEQ ID NO:19之后30天以及在患者开始新疗法之前提供血液样品。使用非房室分析(如果可能的话)，从血浆浓度-时间数据估计PK参数Cmax、tmax、AUC0-1、AUCτ、AUC0-∞和t1/2。在适当时，可以考虑额外PK参数。研究人员还使用血液样品监测患者是否发展抗药抗体。
氨基酸序列
野生型IL-18氨基酸序列
人白介素-18(成熟形式)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:30)
小鼠白介素-18(成熟形式)
NFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYMYKDSEVRGLAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS(SEQ ID NO:31)
Q14116|IL18_人白介素-18(未切割的前体)
MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:32)
P70380|IL18_小鼠白介素-18(未切割的前体)
MAAMSEDSCVNFKEMMFIDNTLYFIPEENGDLESDNFGRLHCTTAVIRNINDQVLFVDKRQPVFEDMTDIDQSASEPQTRLIIYMYKDSEVRGLAVTLSVKDSKMSTLSCKNKIISFEEMDPPENIDDIQSDLIFFQKRVPGHNKMEFESSLYEGHFLACQKEDDAFKLILKKKDENGDKSVMFTLTNLHQS(SEQ ID NO:33)
第1代人白介素-18诱饵抗性变体氨基酸序列
第2代人白介素-18诱饵抗性变体氨基酸序列
小鼠白介素-18诱饵抗性变体氨基酸序列
人诱饵-诱饵(D2D)变体氨基酸序列
小鼠诱饵-诱饵(D2D)变体氨基酸序列
SEQ ID NO:89(本文还称为“6-12”)
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SEQ ID NO:6
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68S)
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(SEQ ID NO:6)
SEQ ID NO:16
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68G)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKGEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDT
KSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ IDNO:16)
SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68A)
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SEQ ID NO:18
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68V)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKVEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:18)
SEQ ID NO:19
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68D)
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKDEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:19)
SEQ ID NO: 20
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68E)
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SEQ ID NO:21
SEQ ID NO:89的变体(C38S/C68N)
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SEQ ID NO: 1
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SEQ ID NO: 2
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SEQ ID NO: 3
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SEQ ID NO:4
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKSEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLASEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:5
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKSEKISTLSSENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:5)
SEQ ID NO:7
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSSENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:7)
SEQ ID NO:8
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLASEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:8)
SEQ ID NO:9
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKSEKISTLSSENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:9)
SEQ ID NO: 10
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKSEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLASEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:10)
SEQ ID NO: 11
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSSENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLASEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:11)
SEQ ID NO: 12
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDSRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:12)
SEQ ID NO: 13
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKSEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:13)
SEQ ID NO: 14
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSSENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:14)
SEQ ID NO:15
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISKYSDSLARGLAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRDVPGHSRKMQFESSSYEGYFLASEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED(SEQ ID NO:15)
示例性SUMO标签
DSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ ID NO:26)
示例性加His标签的SUMO标签
MGHHHHHHGSLQDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG(SEQ ID NO:27)
示例性SUMO蛋白酶
LVPELNEKDDDQVQKALASRENTQLMNRDNIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNLSERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKKKTIGYVDSLSNGPNAMSFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLDCPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFDYKDAIRMRRFIAHLILTDALK(SEQ ID NO:28)
示例性加His标签的SUMO蛋白酶
MGSSHHHHHHSSGSLVPELNEKDDDQVQKALASRENTQLMNRD
NIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNL
SERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKK
KTIGYVDSLSNGPNAMSFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLD
CPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFDYKDAIRMRRFIAHLI
LTDALK
(SEQ ID NO:29)
本公开的示例性非限制性方面
上文所述的本发明主题的方面(包括实施方案)可单独地有益或与一个或多个其他方面或实施方案组合地有益。在不限制前述描述的情况下，本公开的某些非限制性方面提供在下文A组和B组中。对于本领域普通技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，每个单独编号的方面可与前面或后面的任何单独编号的方面一起使用或组合。这意图为所有此类方面的组合提供支持，并且不限于下文明确提供的方面的组合。对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下可以进行各种变化和修改。
序列表
<110> 西姆查IL-18公司
耶鲁大学
亚伦·林
汤姆·布恩
<120> 白介素-18变体和使用方法
<130> SMCH-003PRV
<160> 222
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 1
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 2
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 2
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 3
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 3
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 4
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 4
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 5
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 5
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 6
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 6
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ser Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 7
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 7
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 8
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 8
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 9
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 9
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155
<210> 10
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 10
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
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35 40 45
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145 150 155
<210> 11
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 11
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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130 135 140
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145 150 155
<210> 12
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 12
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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145 150 155
<210> 13
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 13
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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115 120 125
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145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 14
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Ser Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 15
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 15
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Ser Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 16
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 16
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Gly Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 17
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 17
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Ala Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 18
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 18
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Val Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 19
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 19
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Asp Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 20
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 20
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Glu Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 21
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 21
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Ser Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Leu Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Asn Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Ser Arg Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 22
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 22
Ala Ala Ala Ala
1
<210> 23
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 23
Ala Ala Ala Ala
1
<210> 24
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 24
Ala Ala Ala Ala
1
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 25
Ala Ala Ala Ala
1
<210> 26
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 26
Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val
1 5 10 15
Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu
20 25 30
Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu
35 40 45
Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu
50 55 60
Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp
65 70 75 80
Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
85 90 95
<210> 27
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 27
Met Gly His His His His His His Gly Ser Leu Gln Asp Ser Glu Val
1 5 10 15
Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Val Lys Pro Glu Thr
20 25 30
His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser Ser Glu Ile Phe Phe Lys
35 40 45
Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu Met Glu Ala Phe Ala Lys
50 55 60
Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Gly Ile
65 70 75 80
Arg Ile Gln Ala Asp Gln Ala Pro Glu Asp Leu Asp Met Glu Asp Asn
85 90 95
Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile Gly Gly
100 105
<210> 28
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 28
Leu Val Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu
20 25 30
Ile Thr Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn
35 40 45
Asp Thr Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro
50 55 60
Asn Thr Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg
65 70 75 80
Gly Tyr Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile
85 90 95
Asp Lys Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser His
100 105 110
Trp Ala Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val
115 120 125
Asp Ser Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr
130 135 140
Asp Leu Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly Glu
145 150 155 160
Asp Phe Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr
165 170 175
Asp Cys Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp
180 185 190
Ala Pro Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe
195 200 205
Ile Ala His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys
210 215
<210> 29
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 29
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Ser Leu Val
1 5 10 15
Pro Glu Leu Asn Glu Lys Asp Asp Asp Gln Val Gln Lys Ala Leu Ala
20 25 30
Ser Arg Glu Asn Thr Gln Leu Met Asn Arg Asp Asn Ile Glu Ile Thr
35 40 45
Val Arg Asp Phe Lys Thr Leu Ala Pro Arg Arg Trp Leu Asn Asp Thr
50 55 60
Ile Ile Glu Phe Phe Met Lys Tyr Ile Glu Lys Ser Thr Pro Asn Thr
65 70 75 80
Val Ala Phe Asn Ser Phe Phe Tyr Thr Asn Leu Ser Glu Arg Gly Tyr
85 90 95
Gln Gly Val Arg Arg Trp Met Lys Arg Lys Lys Thr Gln Ile Asp Lys
100 105 110
Leu Asp Lys Ile Phe Thr Pro Ile Asn Leu Asn Gln Ser His Trp Ala
115 120 125
Leu Gly Ile Ile Asp Leu Lys Lys Lys Thr Ile Gly Tyr Val Asp Ser
130 135 140
Leu Ser Asn Gly Pro Asn Ala Met Ser Phe Ala Ile Leu Thr Asp Leu
145 150 155 160
Gln Lys Tyr Val Met Glu Glu Ser Lys His Thr Ile Gly Glu Asp Phe
165 170 175
Asp Leu Ile His Leu Asp Cys Pro Gln Gln Pro Asn Gly Tyr Asp Cys
180 185 190
Gly Ile Tyr Val Cys Met Asn Thr Leu Tyr Gly Ser Ala Asp Ala Pro
195 200 205
Leu Asp Phe Asp Tyr Lys Asp Ala Ile Arg Met Arg Arg Phe Ile Ala
210 215 220
His Leu Ile Leu Thr Asp Ala Leu Lys
225 230
<210> 30
<211> 157
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 31
<211> 157
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 32
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 32
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1 5 10 15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn
20 25 30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile
35 40 45
Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
50 55 60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg
65 70 75 80
Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
85 90 95
Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
100 105 110
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
115 120 125
Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
130 135 140
His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe
145 150 155 160
Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
165 170 175
Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
180 185 190
Asp
<210> 33
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 33
Met Ala Ala Met Ser Glu Asp Ser Cys Val Asn Phe Lys Glu Met Met
1 5 10 15
Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Pro Glu Glu Asn Gly Asp Leu
20 25 30
Glu Ser Asp Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg
35 40 45
Asn Ile Asn Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe
50 55 60
Glu Asp Met Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg
65 70 75 80
Leu Ile Ile Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val
85 90 95
Thr Leu Ser Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn
100 105 110
Lys Ile Ile Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp
115 120 125
Ile Gln Ser Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn
130 135 140
Lys Met Glu Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys
145 150 155 160
Gln Lys Glu Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu
165 170 175
Asn Gly Asp Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
180 185 190
<210> 34
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 34
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 35
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 35
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Ala Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 36
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 36
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 37
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 37
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asn Val Pro Gly His Lys Tyr Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 38
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 38
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Gln Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Thr Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Arg Val Pro Gly His His Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 39
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 39
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Ala Gln Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 40
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (60)..(60)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 40
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Asp Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Ala Xaa Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 41
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 41
Tyr Phe Gly Lys His Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Asn Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Thr Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 42
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 42
Tyr Phe Gly Lys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Ala Gln Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Lys Val Pro Gly His Gln His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 43
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 43
Tyr Phe Gly Lys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 44
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 44
Tyr Phe Gly Lys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Thr Gln His Glu Asp
145 150 155
<210> 45
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 45
Tyr Phe Gly Lys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Lys Gln Pro Arg Ala Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 46
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 46
Tyr Phe Gly Lys Ile Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
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100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 47
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 47
Tyr Phe Gly Lys Tyr Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 48
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 48
His Phe Gly Lys Tyr Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 49
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 49
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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Ile Ser Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Ala Lys Ala Val Thr Ile
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Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
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100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ala Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 50
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 50
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Asp Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Arg Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
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100 105 110
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln His Glu Asp
145 150 155
<210> 51
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 51
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Gln Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Lys Arg Arg Val Pro Gly His Asn His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 52
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 52
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Asp Val Pro Gly His Lys His Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 53
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 53
Arg Phe Gly Lys His Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Thr Tyr Arg Asp Ser Gln Pro Arg Gly Lys Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 54
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (155)..(155)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 54
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
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50 55 60
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Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Xaa Glu Asp
145 150 155
<210> 55
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 55
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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<210> 56
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 56
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Ile Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 57
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 57
Arg Phe Gly Lys His Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 58
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 58
Arg Phe Gly Lys Tyr Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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145 150 155
<210> 59
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 59
Arg Phe Gly Lys Leu Glu Ser Arg Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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100 105 110
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Lys Glu Asp
145 150 155
<210> 60
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 60
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu
100 105 110
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Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 61
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 61
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Ala Tyr Gly Asp Ser Arg Ala Arg Gly Lys Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 62
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 62
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Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ala Tyr Val Asp Arg Arg Leu Arg Gly Lys Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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<220>
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<211> 157
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 67
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 合成的序列
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<220>
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<213> 人工序列
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<223> 合成的序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 73
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 75
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 76
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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<220>
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<220>
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<210> 79
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 79
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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<210> 80
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 80
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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145 150 155
<210> 81
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 81
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 82
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 82
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
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35 40 45
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ala Arg Ser Val Pro Gly His Gly Arg Lys
100 105 110
Thr Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 83
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 83
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Arg Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ala Arg Asp Val Pro Gly His Ser Gly Lys
100 105 110
Arg Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 84
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 84
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Thr Asp Ser Arg Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Glu Arg Asp Val Pro Gly His Ser Ser Lys
100 105 110
Lys Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 85
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 85
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Thr Asp Ser Arg Ala Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Glu Arg Asp Val Pro Gly His Asn Asp Lys
100 105 110
Arg Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 86
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 86
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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35 40 45
Ile Ser Arg Tyr Lys Asp Ser Gly Lys Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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Val Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 87
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Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 88
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 88
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Ile Ser Lys Tyr Gly Asp Ser Arg Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
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65 70 75 80
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 89
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 89
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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145 150 155
<210> 90
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 90
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 91
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 91
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 92
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Lys Asp
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130 135 140
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<210> 93
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 93
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 94
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 94
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 95
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 95
Leu Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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145 150 155
<210> 96
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 96
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<210> 97
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 97
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 98
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 98
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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<211> 157
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 99
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 100
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145 150 155
<210> 101
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 101
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
20 25 30
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65 70 75 80
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 102
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 102
Asp Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 103
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 103
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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145 150 155
<210> 104
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 104
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ile Arg Ser Val Pro Gly Pro Asp Asn Lys
100 105 110
Phe Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 105
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 105
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
20 25 30
Met Lys Ala Lys Ala Cys Arg Ser Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Phe Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Phe Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Leu Arg Ser Val Pro Gly Ala Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 106
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 106
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
His Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
20 25 30
Met Ala Asp Asn Ala Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Phe Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ile Arg Ser Val Pro Gly Asp Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 107
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 107
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
20 25 30
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35 40 45
Ile Ser Phe Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Ile Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ile Arg Ser Val Pro Gly Asp Asp Asn Lys
100 105 110
Ile Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 108
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 108
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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Met Ala Ala Ser His Cys Arg Asp Ser Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 109
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65 70 75 80
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 110
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 110
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
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Met Ala Ser Asn His Cys Arg Tyr Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Leu Arg Ser Val Pro Gly Ala Asp Asn Lys
100 105 110
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 111
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 111
His Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
20 25 30
Met Thr Asp Asn Pro Cys Arg Ser Arg Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 112
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 112
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
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100 105 110
Phe Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 113
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 113
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
20 25 30
Met Glu Tyr Arg Leu Cys Arg Ala Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Phe Tyr Lys Asp Ser His Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 114
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 114
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
20 25 30
Met Glu Ser Ser Leu Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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115 120 125
Lys Glu Arg Ser Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 115
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 115
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Lys Asp
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65 70 75 80
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 116
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 116
Asp Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
20 25 30
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65 70 75 80
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100 105 110
Phe Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 117
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 117
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Gly Asp
20 25 30
Met Thr Ala Lys His Cys Arg Ala Arg Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ile Arg Ser Val Pro Gly Ala Asp Asn Lys
100 105 110
Phe Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 118
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 118
Phe Phe Gly Lys Phe Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Thr Asp
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Met Glu Ser Lys Asp Cys Arg Asp Arg Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
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Ile Ser Phe Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Leu Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Leu Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 119
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 119
Phe Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
20 25 30
Met Ala Ser Asn His Cys Arg Ala Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Leu Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ile Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 120
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 120
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 121
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 121
Leu Phe Gly Lys His Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Gly Asp
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Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
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<210> 122
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 122
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
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Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 123
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 123
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 124
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 124
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
20 25 30
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 125
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 125
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Ala Asp
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115 120 125
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130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 126
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 126
Tyr Phe Gly Arg Tyr His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gln Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
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35 40 45
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Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Glu Val Pro Gly His Arg Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 127
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 127
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Gly Ser Ile Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Tyr Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly Asp Asn Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Thr Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 128
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 128
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Ala Asp Thr Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Ala Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 129
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 129
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Glu Tyr Thr Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Ala Val Pro Gly Asp Arg Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asn Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 130
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 130
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Ala Asp Lys Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Pro Val Pro Gly Asp Thr Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Phe Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 131
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 131
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Gly Asp Arg His Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Ala Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 132
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 132
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Gly Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Asp Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Val Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 133
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 133
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ser Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Gly Ser Ile Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Arg Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 134
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 134
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ser Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Glu Asp Thr Pro Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Arg Val Pro Gly Asp Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Phe Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 135
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 135
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Gly Asp Met
20 25 30
Thr Ala Thr Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Asp Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asn Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 136
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 136
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asn Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Glu Tyr Thr Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Asp Asn Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Tyr Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 137
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 137
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Glu Ala Thr Arg Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Ala Asn Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Asn Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 138
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 138
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Arg Ala Ile Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Arg Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 139
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 139
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Glu Ala Thr Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Ala Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 140
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 140
Leu Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Gly Ala Thr Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Pro Val Pro Gly Asp Thr Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Ser Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 141
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 141
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Ala Tyr Thr Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Asp Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Tyr Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 142
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 142
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Glu Ser Lys Pro Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly Ala Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Asn Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 143
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 143
Leu Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Gly Asp Lys Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
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Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
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Asp Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Thr Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 144
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 144
Tyr Phe Gly Arg His His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gln Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 145
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 145
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gln Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Glu Ser Ile Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly Ala Asn Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Ser Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 146
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 146
Phe Phe Gly Arg His His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Gly Asp Met
20 25 30
Gly Asp Arg Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Ala Val Pro Gly Asp Ser Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 147
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 147
Val Phe Gly Arg His His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Thr Tyr Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly Asp Thr Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Gln Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Ile Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 148
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 148
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Thr Ala Thr Arg Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gln Val Pro Gly Ala Asn Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Phe Arg Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 149
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 149
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Gly Asp Met
20 25 30
Ala Tyr Ile Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Ala Val Pro Gly His Ser Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ser Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 150
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 150
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Gly Ser Ile Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Ala Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Asn Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 151
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 151
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Glu Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Asp Arg Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 152
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 152
Phe Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asn Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Glu Tyr Arg Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Pro Val Pro Gly Ala Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ser Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 153
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 153
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asn Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Glu Asp Arg Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp His Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 154
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 154
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Gly Tyr Ile Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Leu Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Glu Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Pro Val Pro Gly Asp Thr Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asn Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 155
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 155
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Gly Asp Met
20 25 30
Ala Asp Thr Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Asp Ser Lys Met Glu
100 105 110
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115 120 125
Ala Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 156
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 156
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Ala Tyr Ile Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Asp Ser Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 157
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 157
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Ser Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Lys Tyr Ile Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
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85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Met Glu
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115 120 125
Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 158
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 158
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Ala Tyr Ile Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Glu Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Ala Val Pro Gly Asp Ser Lys Leu Glu
100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 159
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 159
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asn Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Glu Ser Thr Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Ala Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Ala Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 160
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 160
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Glu Ala Ile Gly Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Glu Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Asp Thr Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Ala Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 161
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 161
Ile Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Arg Tyr Ile Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Glu Val Pro Gly Ala Ser Lys Leu Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 162
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 162
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ala Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Gly Tyr Thr Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Leu Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly His Asn Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Arg Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 163
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 163
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Asn Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
20 25 30
Ala Ser Thr Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Gly Val Pro Gly Ala Asn Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 164
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 164
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Lys Asp Arg Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
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85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly His Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Glu Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 165
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 165
Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
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Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
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Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Asn Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 166
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 166
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 167
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 167
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Met Glu
100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 168
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 168
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Glu Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Ala Asp Met
20 25 30
Thr Asp Thr Leu Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Gly Val Pro Gly Asp Asn Lys Met Glu
100 105 110
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115 120 125
Asp Thr Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 169
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 169
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Lys Tyr Ile Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly His Ser Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Ser Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 170
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 170
His Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Lys Asp Met
20 25 30
Lys Tyr Ile Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Leu Lys Ala Val Pro Gly His Ser Lys Ile Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Ser Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 171
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 171
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Lys Ala Lys Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
85 90 95
Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Ala Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 172
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 172
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
20 25 30
Lys Ala Lys Ala Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
35 40 45
Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile
65 70 75 80
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Asp Leu Ile Phe Phe Ile Lys Pro Val Pro Gly Ala Ser Lys Met Glu
100 105 110
Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
115 120 125
Asp Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 173
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 173
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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50 55 60
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145 150 155
<210> 174
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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<211> 157
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
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145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 176
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 177
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 177
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Ser Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 178
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130 135 140
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145 150 155
<210> 179
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 179
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
1 5 10 15
Gly Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Thr Asp Met
20 25 30
Gly Ala Arg Val Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
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Tyr Phe Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50 55 60
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 180
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130 135 140
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 181
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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130 135 140
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145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 182
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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Ser Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
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145 150 155
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 183
Asp Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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Ser Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Arg Asp Met
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 184
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 185
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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115 120 125
Phe Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser
145 150 155
<210> 186
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 186
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 187
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 188
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<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 189
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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<210> 190
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 190
Tyr Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn
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Ser Gly Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130 135 140
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145 150 155
<210> 191
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 191
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130 135 140
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145 150 155
<210> 192
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 192
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1 5 10 15
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20 25 30
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115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 193
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 193
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Lys Tyr Ser Asp Ser Arg Ala Arg Gly Leu Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Ala Arg Asp Val Pro Gly His Ser Gly Lys
100 105 110
Arg Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 194
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 194
cattttcatt aagatgcagt tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagc 58
<210> 195
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (31)..(31)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (42)..(42)
<223> n是a, c, g或t
<400> 195
aattacggat gaccgaaagt ykggattcaw ncttgccgaa anrtgctaaa acgctagcaa 60
taacagaaaa tattgaaaaa 80
<210> 196
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 196
actttcggtc atccgtaatt tgaacgacca agtccttttt attgaccagg g 51
<210> 197
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 197
actatccgtc atatcctcga ataagggacg attgccctgg tcaataaaaa ggact 55
<210> 198
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 198
cttattcgag gatatgacgg atagtgattg ccgtgacaac gccc 44
<210> 199
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (22)..(22)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (46)..(46)
<223> n是a, c, g或t
<400> 199
actgagattg ttaccgcchb tnyacggggt tgwyyatcty tatasnyaga gatgatgaaa 60
attgtacgag gggcgttgtc acgg 84
<210> 200
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 200
ggcggtaaca atctcagtta agtgcgaaaa aatctcgaca ctttcttgtg aa 52
<210> 201
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 201
ggttcatttc cttgaacgaa atgatcttgt tttcacaaga aagtgtcgag att 53
<210> 202
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 202
catttcgttc aaggaaatga acccgccgga taatatcaag gatacaaaat cagatattat 60
tt 62
<210> 203
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (27)..(27)
<223> n是a, c, g或t
<400> 203
tgatgagctc tcgaattgca tcttatnwtb gtgtccaggc acwyyacgwt bgaagaaaat 60
aatatctgat tttgtatcct tgatatta 88
<210> 204
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 204
ataagatgca attcgagagc tcatcatacg aaggttactt tttagcctgc g 51
<210> 205
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 205
aattaactta aacaggtcgc gctccttctc gcaggctaaa aagtaacctt 50
<210> 206
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 206
gcgacctgtt taagttaatt cttaagaaag aagatgagtt gggggatcg 49
<210> 207
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 207
ccagaaccac cgtcctcwtb ctgadyggta aacatgatgc tacgatcccc caactcatct 60
t 61
<210> 208
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 208
gaggacggtg gttctggatc cgaacaaaag cttatctccg aagaagactt gg 52
<210> 209
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 209
ccaccagatc caccaccacc caagtcttct tcggagataa g 41
<210> 210
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 210
cattttcatt aagatgcagt tacttcgctg tttttcaata ttttctgtta ttgctagcgt 60
tt 62
<210> 211
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (25)..(25)
<223> n是a, c, g或t
<400> 211
ttgtacagtg aagtcggcca aaawntgcta aaacgctagc aataacagaa aatat 55
<210> 212
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 212
gccgacttca ctgtacaacc gcagtaatac ggaatataaa tgaccaagtt ctcttcgtt 59
<210> 213
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 213
ttgatcaata tcagtcatat cctcgaacac aggctgtctt ttgtcaacga agagaacttg 60
gtcattt 67
<210> 214
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 214
gtgttcgagg atatgactga tattgatcaa agtgccagtg aaccccagac caga 54
<210> 215
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (24)..(24)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (30)..(30)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (32)..(32)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (42)..(42)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (44)..(44)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (46)..(46)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (48)..(48)
<223> n是a, c, g或t
<400> 215
tcacagagag ggtcacagcy hbtnywbybn bnybwyygtc snbnynsnyg tatattatca 60
gtctggtctg gggttcac 78
<210> 216
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 216
gctgtgaccc tctctgtgaa ggatagtaaa atgtctaccc tctcctgtaa gaacaaga 58
<210> 217
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 217
gtatatcatc aatattttca ggtggatcca tttcctcaaa ggaaatgatc ttgttcttac 60
aggagaggg 69
<210> 218
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<220>
<221> misc_特征
<222> (59)..(59)
<223> n是a, c, g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (74)..(74)
<223> n是a, c, g或t
<400> 218
aatggatcca cctgaaaata ttgatgatat acaaagtgat ctcatattct ttcagaaand 60
hgttccagga cacnataaga tggagtttga atcttcact 99
<210> 219
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 219
ccttttggca agcaagaaag tgtccttcat acagtgaaga ttcaaactcc atcttat 57
<210> 220
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 220
ctttcttgct tgccaaaagg aagatgatgc tttcaaactc attctgaaaa aaaaggatga 60
<210> 221
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 221
ccaccacttt gatgtaagtt agtrdbagtg aacattacag atttatcccc attttcatcc 60
ttttttttca gaatgag 77
<210> 222
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的序列
<400> 222
actaacttac atcaaagtgg tggttctgga tccgaacaaa agcttatctc cgaagaaga 59
Claims (96)
1.一种修饰的白介素-18(IL-18)多肽，其相对于IL-18结合蛋白(IL-18BP)优先结合IL-18受体(IL-18R)，所述多肽包含：(i)与如SEQ ID NO:30所示的野生型(WT)IL-18或与SEQ ID NO:6、87-91和16-21中的任一个所示的IL-18变体氨基序列具有85％或更多序列同一性的氨基酸序列；以及(ii)相对于SEQ ID NO:30在氨基酸位置C38和C68处的突变，其中所述修饰的IL-18相对于IL-18BP优先结合IL-18R。
2.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68S、C68G、C68A、C68V、C68D、C68E或C68N。
3.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68S、C68G、C68A、C68D或C68N。
4.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68G、C68A、C68V、C68D、C68E或C68N。
5.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68G、C68A、C68D或C68N。
6.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68S。
7.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68G。
8.如权利要求1-7中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述IL-18多肽是诱饵抗性(DR)IL-18变体或诱饵-诱饵(D2D)IL-18变体。
9.如权利要求1-7中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述IL-18多肽是DRIL-18，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在以下位置中的至少两个处的突变：Y1、L5、K8、M51、K53、S55、Q56、P57、G59、M60、E77、Q103、S105、D110、N111、M113、V153和N155。
10.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在以下位置中的至少两个处的突变：M51、K53、Q56、P57、M60、Q103、S105、D110、N111和M113。
11.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在以下位置中的至少五个处的突变：M51、K53、Q56、P57、M60、Q103、S105、D110、N111和M113。
12.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含在位置M51、K53、Q56、D110和N111处的突变。
13.如权利要求12所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体相对于SEQ ID NO:30还包含在位置P57和M60处的突变。
14.如权利要求13所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体相对于SEQ ID NO:30还包含在位置S10处的突变。
15.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含以下18个突变中的至少5个：(1)Y1H或Y1R；(2)L5H、L5I或L5Y；(3)K8Q或K8R；(4)M51T、M51K、M51D、M51N、M51E或M51R；(5)K53R、K53G、K53S或K53T；(6)S55K或S55R；(7)Q56E、Q56A、Q56R、Q56V、Q56G、Q56K或Q56L；(8)P57L、P57G、P57A或P57K；(9)G59T或G59A；(10)M60K、M60Q、M60R或M60L；(11)E77D；(12)Q103E、Q103K、Q103P、Q103A或Q103R；(13)S105R、S105D、S105K、S105N或S105A；(14)D110H、D110K、D110N、D110Q、D110E、D110S或D110G；(15)N111H、N111Y、N111D、N111R、N111S或N111G；(16)M113V、M113R、M113T或M113K；(17)V153I、V153T或V153A；以及(18)N155K或N155H。
16.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含以下10个突变中的至少5个：(1)M51T、M51K、M51D、M51N、M51E或M51R；(2)K53R、K53G、K53S或K53T；(3)Q56E、Q56A、Q56R、Q56V、Q56G、Q56K或Q56L；(4)P57L、P57G、P57A或P57K；(5)M60K、M60Q、M60R或M60L；(6)Q103E、Q103K、Q103P、Q103A或Q103R；(7)S105R、S105D、S105K、S105N或S105A；(8)D110H、D110K、D110N、D110Q、D110E、D110S或D110G；(9)N111H、N111Y、N111D、N111R、N111S或N111G；以及(10)M113V、M113R、M113T或M113K。
17.如权利要求9所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DRIL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含以下七个突变中的至少五个：
(1)M51E、M51R、M51K、M51T、M51D或M51N；
(2)K53G、K53S、K53T或K53R；
(3)Q56G、Q56R、Q56L、Q56E、Q56A、Q56V或Q56K；
(4)D110S、D110N、D110G、D110K、D110H、D110Q或D110E；
(5)N111G、N111R、N111S、N111D、N111H或N111Y；
(6)P57A、P57L、P57G或P57K；以及
(7)M60L、M60R、M60K或M60Q。
18.如权利要求17所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体相对于SEQ ID NO:30还包含突变S105D、S105A、S105N、S105R、S105D或S105K。
19.如权利要求1-7中任一项所述的修饰的IL-18多肽，其中所述IL-18多肽是特异性结合IL-18受体(IL-18R)但与所述WTIL-18相比，表现出与IL-18结合蛋白(IL-18BP)的结合减少的DR IL-18变体，其中所述DR IL-18变体相对于SEQ ID NO:30包含突变M51K、K53S、Q56L、D110S和N111R。
20.如权利要求19所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体还包含突变P57A、M60L和S105D。
21.如权利要求20所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68G、C68A、C68D或C68N。
22.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述在位置C38处的突变为C38S，并且所述在位置C68处的突变为C68G。
23.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体包含SEQ ID NO:1-21中的任一个所示的氨基酸序列。
24.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体包含SEQ ID NO:6和16-21中的任一个所示的氨基酸序列。
25.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体包含SEQ ID NO:6、16、17、19和21中的任一个所示的氨基酸序列。
26.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体包含与SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列具有85％或序列同一性的氨基酸序列。
27.如权利要求21所述的修饰的IL-18多肽，其中所述DR IL-18变体包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列。
28.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽不包含所述IL-18多肽非天然的半胱氨酸残基。
29.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述IL-18多肽对IL-18BP的结合亲和力小于0.6nM。
30.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽与具有不同序列的IL-18多肽相比表现出更高的稳定性。
31.如权利要求30所述的修饰的IL-18多肽，其中所述修饰的IL-18多肽在暴露于稳定性测定、冻-融循环或搅拌之后显示较少的二聚体、多聚体、聚集体和/或降解产物形成。
32.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述与WT IL-18具有85％或更多序列同一性的氨基酸序列不包含聚乙二醇化的氨基酸。
33.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述与WTIL-18具有85％或更多序列同一性的氨基酸序列不包含非天然半胱氨酸残基。
34.如权利要求1所述的修饰的IL-18多肽，其中所述与WTIL-18具有85％或更多序列同一性的氨基酸序列不包含聚乙二醇化的半胱氨酸残基。
35.一种药物组合物，其包含如权利要求1-34中任一项所述的修饰的IL-18多肽和药学上可接受的赋形剂。
36.如权利要求35所述的组合物，其还包含抑制PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR、LILRB2或其任何组合的免疫检查点抑制剂。
37.如权利要求35所述的组合物，其还包含选自以下的免疫激动剂：激动肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)的剂；激动免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)的剂；激动TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)的剂；激动核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(DDX58))的剂；炎性小体激活剂；T细胞接合器；细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)；或其任何组合。
38.如权利要求35所述的组合物，其还包含靶向一种或多种选自以下的抗原的癌细胞调理剂：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD45、CD47、CD51、CD52、CD56、CD62L、CD70、CD74、CD79、CD80、CD96、CD97、CD99、CD123、CD134、CD138、CD152(CTLA-4)、CD200、CD213A2、CD221、CD248、CD276(B7-H3)、B7-H4、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、CD319、EGFR、EPCAM、17-1A、HER1、HER2、HER3、CD117、C-Met、HGFR、PDGFRA、AXL、TWEAKR、PTHR2、HAVCR2(TIM3)、GD2神经节苷脂、MUC1、粘蛋白CanAg、间皮素、内皮糖蛋白、路易斯-Y抗原、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CA-125、PSMA、BAFF、FGFR2、TAG-72、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、连接素-4、BCMA、CSF1R、SLAMF7、整联蛋白αvβ3、TYRP1、GPNMB、CLDN18.2、FOLR1、CCR4、CXCR4、MICA、C242抗原、DLL3、DLL4、EGFL7、波形蛋白、纤连蛋白额外结构域-B、TROP-2、LRRC15、FAP、SLITRK6、NOTCH2、NOTCH3、肌腱蛋白-3、STEAP1和NRP1。
39.如权利要求35所述的组合物，其中所述白介素-18(IL-18)多肽与所述免疫检查点抑制剂、与所述免疫激动剂或与所述癌细胞调理剂缀合。
40.如权利要求35-39中任一项所述的组合物，其还包含工程化的T细胞或NK细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、工程化的TCR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
41.一种药物制剂，其包含如权利要求1-40中任一项所述的修饰的IL-18多肽。
42.如权利要求41所述的药物制剂，其还包含浓度为15-100mg/mL的所述IL-18多肽。
43.如权利要求41或权利要求42所述的药物制剂，其中所述药物制剂被配制用于皮下注射。
44.如权利要求41-43中任一项所述的药物制剂，其包含：
将pH维持在6.2与6.8之间的缓冲剂，
糖，
螯合剂，
防止氧化的剂，和
防止蛋白质吸收的剂。
45.一种核酸，其包含编码如权利要求1-34中任一项所述的IL-18多肽的核苷酸序列。
46.如权利要求45所述的核酸，其中所述核酸是质粒或病毒载体。
47.如权利要求45或权利要求46所述的核酸，其中编码所述IL-18多肽的所述核苷酸序列紧接着编码小泛素样修饰物(SUMO)标签的核苷酸序列的3'融合并且与所述核苷酸序列同框，所述小泛素样修饰物(SUMO)标签可被SUMO蛋白酶切割。
48.如权利要求47所述的核酸，其中所述SUMO蛋白酶是ULP1。
49.如权利要求48所述的核酸，其中所述SUMO标签包含SEQ ID NO:26或27所示的氨基酸序列。
50.一种细胞，其包含如权利要求45-49中任一项所述的核酸。
51.如权利要求50所述的细胞，其包含有包含编码SUMO蛋白酶的核苷酸序列的核酸。
52.如权利要求50或权利要求51所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
53.如权利要求50所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
54.如权利要求50所述的细胞，其中所述细胞是工程化的T细胞或NK细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、工程化的TCR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其表达编码的白介素-18(IL-18)多肽。
55.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用如权利要求1-34中任一项所述的修饰的IL-18多肽，从而治疗所述个体的疾病或病症。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述疾病或病症选自：癌症；对免疫检查点抑制剂(ICI)具有抗性的癌症；与MHC I类的表面表达减少或不存在的肿瘤相关联的癌症；与高水平的IL-18BP相关联的癌症；肿瘤突变负荷(TMB)高的癌症；具有微卫星不稳定性(MSI)的肿瘤的癌症；与IL-18R在浸润T细胞或NK细胞上表达的肿瘤相关联的癌症；代谢疾病或病症；以及感染性疾病。
57.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用免疫检查点抑制剂和免疫激动剂或癌细胞调理剂。
58.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用抑制PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR、LILRB2或其任何组合的免疫检查点抑制剂。
59.如权利要求55或权利要求56所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用选自以下的免疫激动剂：激动肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)的剂；激动免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)的剂；激动TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)的剂；激动核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(DDX58))的剂；炎性小体激活剂；T细胞接合器；细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)；或其任何组合。
60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用靶向一种或多种选自以下的抗原的癌细胞调理剂：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD45、CD47、CD51、CD52、CD56、CD62L、CD70、CD74、CD79、CD80、CD96、CD97、CD99、CD123、CD134、CD138、CD152(CTLA-4)、CD200、CD213A2、CD221、CD248、CD276(B7-H3)、B7-H4、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、CD319、EGFR、EPCAM、17-1A、HER1、HER2、HER3、CD117、C-Met、HGFR、PDGFRA、AXL、TWEAKR、PTHR2、HAVCR2(TIM3)、GD2神经节苷脂、MUC1、粘蛋白CanAg、间皮素、内皮糖蛋白、路易斯-Y抗原、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CA-125、PSMA、BAFF、FGFR2、TAG-72、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、连接素-4、BCMA、CSF1R、SLAMF7、整联蛋白αvβ3、TYRP1、GPNMB、CLDN18.2、FOLR1、CCR4、CXCR4、MICA、C242抗原、DLL3、DLL4、EGFL7、波形蛋白、纤连蛋白额外结构域-B、TROP-2、LRRC15、FAP、SLITRK6、NOTCH2、NOTCH3、肌腱蛋白-3、STEAP1和NRP1。
61.如权利要求55-60中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用工程化的T细胞或NK细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、工程化的TCR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用溶瘤病毒。
63.一种制备活性多肽的方法，所述方法包括：
在细菌细胞的内部，将外源性提供的融合蛋白与外源性提供的SUMO(小泛素样修饰物)蛋白酶接触，其中所述融合蛋白包含在N-末端与SUMO标签融合的感兴趣的多肽，
其中，在所述细菌细胞内，所述SUMO蛋白酶切割所述融合蛋白，从而从所述感兴趣的多肽去除所述SUMO标签，其中所述感兴趣的多肽是如权利要求1-34中任一项所述的IL-18多肽，所述IL-18多肽通过去除所述SUMO标签来激活。
64.如权利要求63所述的方法，其中在被所述SUMO蛋白酶切割之后，所述IL-18多肽的N-末端氨基酸是酪氨酸。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述IL-18多肽是诱饵抗性(DR)IL-18变体或诱饵-诱饵(D2D)IL-18变体。
66.如权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述SUMO蛋白酶是ULP1。
67.如权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述SUMO标签包含SEQ ID NO:26或27所示的氨基酸序列。
68.如权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述接触包括将编码所述融合蛋白的核酸引入到所述细菌细胞中。
69.如权利要求63-68中任一项所述的方法，其中所述接触包括将编码所述SUMO蛋白酶的核酸引入到所述细菌细胞中。
70.如权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述接触包括诱导所述细菌细胞中的所述SUMO蛋白酶从诱导型启动子表达。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述诱导型启动子是鼠李糖-诱导型启动子。
72.如权利要求63-71中任一项所述的方法，其还包括在去除所述SUMO标签之后，纯化所述感兴趣的多肽。
73.如权利要求64-65中任一项所述的方法，其还包括在去除所述SUMO标签之后，纯化所述IL-18多肽，其中所述纯化包括离子交换色谱法、固定化金属亲和色谱法(IMAC)、多模式色谱法(MMC)和疏水相互作用色谱法(HIC)。
74.如权利要求63-73中任一项所述的方法，其中所述接触在细胞的内部发生。
75.如权利要求63-73中任一项所述的方法，其中所述接触无细胞地在体外发生。
76.一种治疗方法，所述方法包括向有需要的个体施用如权利要求1-34中任一项所述的修饰的IL-18多肽，从而治疗所述个体的疾病或病症，其中所述施用的频率是每周一次或更小。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述施用的频率是每两周一次或更小。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述施用的频率在每周一次至每月一次的范围内。
79.如权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述IL-18多肽是根据权利要求1-34中任一项所述的IL-18多肽。
80.如权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述IL-18多肽是诱饵抗性(DR)IL-18变体或诱饵-诱饵(D2D)IL-18变体。
81.如权利要求76-80中任一项所述的方法，其中所述施用包括皮下施用。
82.如权利要求76-80中任一项所述的方法，其中所述施用包括以在0.025-3.5mg/kg的范围内的剂量施用所述IL-18多肽。
83.如权利要求76-82中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症选自：癌症；对免疫检查点抑制剂(ICI)具有抗性的癌症；与MHC I类的表面表达减少或不存在的肿瘤相关联的癌症；与高水平的IL-18BP相关联的癌症；与IL-18R在浸润T细胞或NK细胞上表达的肿瘤相关联的癌症；代谢疾病或病症；以及感染性疾病。
84.如权利要求74-81中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用免疫检查点抑制剂或癌细胞调理剂。
85.如权利要求74-81中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用抑制PD-L1、PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT、LAG3、B7H3、B7H4、VISTA、BTLA、CD47、SIRPα、CD48、CD155、CD160、TREM2、IDO1、腺苷2A受体、芳基烃受体、KIR、LILRB2或其任何组合的免疫检查点抑制剂。
86.如权利要求74-81中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用选自以下的免疫激动剂：激动肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)蛋白(例如，GITR、41BB、OX40、CD27、CD40、HVEM)的剂；激动免疫球蛋白超家族(IgSF)蛋白(例如，CD28、ICOS、CD226、NKG2D)的剂；激动TLR(例如，TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR9)的剂；激动核酸传感器(例如，STING、cGAS、RIG-I(DDX58))的剂；炎性小体激活剂；T细胞接合器；细胞因子或细胞因子变体(例如，IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-27、IL-33、TNF、TL1A、IFNA、IFNB、IFNG)；或其任何组合。
87.如权利要求74-81中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用靶向一种或多种选自以下的抗原的癌细胞调理剂：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD44、CD45、CD47、CD51、CD52、CD56、CD62L、CD70、CD74、CD79、CD80、CD96、CD97、CD99、CD123、CD134、CD138、CD152(CTLA-4)、CD200、CD213A2、CD221、CD248、CD276(B7-H3)、B7-H4、CD279(PD-1)、CD274(PD-L1)、CD319、EGFR、EPCAM、17-1A、HER1、HER2、HER3、CD117、C-Met、HGFR、PDGFRA、AXL、TWEAKR、PTHR2、HAVCR2(TIM3)、GD2神经节苷脂、MUC1、粘蛋白CanAg、间皮素、内皮糖蛋白、路易斯-Y抗原、CEA、CEACAM1、CEACAM5、CA-125、PSMA、BAFF、FGFR2、TAG-72、明胶酶B、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3、连接素-4、BCMA、CSF1R、SLAMF7、整联蛋白αvβ3、TYRP1、GPNMB、CLDN18.2、FOLR1、CCR4、CXCR4、MICA、C242抗原、DLL3、DLL4、EGFL7、波形蛋白、纤连蛋白额外结构域-B、TROP-2、LRRC15、FAP、SLITRK6、NOTCH2、NOTCH3、肌腱蛋白-3、STEAP1和NRP1。
88.如权利要求74-85中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用工程化的T细胞或NK细胞、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)、工程化的TCR-T细胞、嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
89.如权利要求74-86中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用溶瘤病毒。
90.一种药物制剂，其包含：
如权利要求1-34中任一项所述的IL-18多肽，
缓冲剂，
糖，
螯合剂，
防止氧化的剂，和
防止蛋白质吸收的剂。
91.如权利要求90所述的药物制剂，其中所述缓冲剂包括His/His-HCl。
92.如权利要求91所述的药物制剂，其中所述缓冲剂将pH维持在6.2与6.8之间。
93.如权利要求90至92中任一项所述的药物制剂，其中所述糖包括蔗糖。
94.如权利要求90至93中任一项所述的药物制剂，其中所述螯合剂包括EDTA或其盐。
95.如权利要求90至94中任一项所述的药物制剂，其中所述防止氧化的剂是L-甲硫氨酸。
96.如权利要求90至95中任一项所述的药物制剂，其中所述防止蛋白质吸收的剂是聚山梨醇酯80。
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