CN116814682A - 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 - Google Patents
一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116814682A CN116814682A CN202211358915.0A CN202211358915A CN116814682A CN 116814682 A CN116814682 A CN 116814682A CN 202211358915 A CN202211358915 A CN 202211358915A CN 116814682 A CN116814682 A CN 116814682A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tmv
- vaccine
- seq
- mosaic virus
- tobacco
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 claims abstract description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims abstract description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 7
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 7
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 claims description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 3
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 claims description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 9
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 abstract description 9
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000028604 virus induced gene silencing Effects 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710145875 Replicase large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101800000116 Replicase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000037440 gene silencing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000009437 off-target effect Effects 0.000 description 1
- 210000003449 plasmodesmata Anatomy 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及一种防治烟草普通花叶病毒（TMV）的疫苗，包括pTRV1和至少一种重组表达载体pTRV2‑G‑目标基因，所述目标基因为TMV‑30、TMV‑126、TMV‑183或TMV‑CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。在烟草上使用时，先在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；在室温下遮光存放，将所得混合液兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。本发明菌液能够有效沉默外源侵入的烟草普通花叶病毒基因表达，基因沉默效率最高达43.9%，有效的抑制了烟草普通花叶病毒在植株体内的传播，发病时间推迟。
Description
技术领域
本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法。
背景技术
由植物病毒引起的病害素有“植物癌症”之称，其造成的经济损失非常严重。目前，烟草普通花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是一种在烟草及蔬菜等经济作物中广泛传播的病毒，对农业生产造成很大的危害。烟草普通花叶病毒是一种RNA单链病毒，该基因组至少编码4种蛋白，其中126kDa和183kDa蛋白是该病毒基因组RNA复制所必需的复制酶；病毒RNA上只要含有这两个蛋白中的一个就可以进行病毒的复制，尤其以183kDa最为重要，但只有两个蛋白同时存在的时候，病毒的复制效率是最高的。30kDa移动蛋白（MP）定位于胞间连丝中，促进病毒在宿主细胞之间的移动；外壳蛋白（CP）在该病毒形成过程中起着重要作用，以保护TMV-RNA不被宿主细胞中的核酸酶降解。
病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silence，VIGS）是一种对植物进行反向遗传操作的技术，是植物防御机制的表现。农杆菌介导的VIGS技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中，介导靶向同源基因的mRNA降解，引起目的基因沉默。
发明内容
为解决上述问题，本发明构建靶向相关基因片段的烟草脆裂病毒TRV载体并转化农杆菌感受态细胞，为随后TRV介导的防治烟草普通花叶病毒的VIGS体系的建立奠定基础。
为解决以上技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗，包括pTRV1和至少一种重组表达载体pTRV2-G-目标基因，所述目标基因为TMV-30、TMV-126、TMV-183或TMV-CP，序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述防治烟草普通花叶病毒的疫苗，包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2-G-目标基因，所述目标基因分别为TMV-30、TMV-126、TMV-183和TMV-CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
其中，所述重组表达载体pTRV2-G-目标基因由以下步骤构建：
（1）提取感染了烟草普通花叶病毒的烟株叶片的总RNA，将其反转成cDNA；
（2）再以所述cDNA为模板进行PCR 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；
（3）对pTRV2-GFP空载体质粒进行BamHI/KpnI双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体；
（4）将步骤（2）所得扩增产物目的片段与步骤（3）所得线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，（将测序正确的单克隆菌株）扩繁并提取质粒。
优选的，关于步骤（2）PCR 扩增中对应的引物：当目标基因为TMV-30时，引物对为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；当目标基因为TMV-126时，引物对为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8；当目标基因为TMV-183时，引物对为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；当目标基因为TMV-CP时，引物对为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
上述防治烟草普通花叶病毒的疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）将所述重组表达载体pTRV2-G-目标基因转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到原始菌液；将原始菌液均匀涂抹在LB（含有浓度为20-30mg/mL利福平和40-60mg/mL卡那霉素）固体培养基上，25-30℃下倒置培养40-50h，挑取单菌落经PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证，将验证正确的原始菌液扩繁后保存至超低温冰箱备用；
（2）将TRV1菌液和每种TRV2初始菌液分别接种到LB液体培养基上，25-30℃、150-250r/min过夜培养后，调整浓度为OD600≈0.8～1.0，然后将所培养的TRV1菌液分别和所培养的单种TRV2菌液混合摇匀，体积比为1：（0.8-1.2），之后再都混合在一起冻干，即得到防治烟草普通花叶病毒的疫苗。
上述防治烟草普通花叶病毒的疫苗的使用方法，包括以下步骤：在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；所述缓冲液与所述疫苗的体积比为1：（0.8-1.2）；在室温下遮光存放，将所得混合液按1：（8-12）兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。
本发明具有以下积极有益效果：
本发明菌液能够有效沉默外源侵入的烟草普通花叶病毒基因表达，基因沉默效率最高达43.9%，有效的抑制了烟草普通花叶病毒在植株体内的传播，发病时间推迟。
附图说明
图1 pTRV2-G载体图谱；
图2 目的基因扩增产物；
图3 接种病毒后TMV-30基因表达量；
图4 接种病毒后TMV-126基因表达量；
图5 接种病毒后TMV-183基因表达量；
图6 接种病毒后TMV-CP基因表达量。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
1、引物设计
根据已测定的TMV基因(GenBank登录号：NC_001367.1)，选取适合用来构建VIGS载体的片段，选取的原则为：序列长度在200-800bp之间；GC含量在45%-55%之间；序列特异性高，不和该病毒其它序列、所用载体序列以及烟草基因组序列发生重叠，防止发生“脱靶效应”；避免出现倒置重复，以防形成发卡结构。最终选取用来构建VIGS载体的片段序列SEQID NO.1-4。片段选取完成后，使用Oligo 7软件设计特异性引物，其序列见表1。
表1 本发明设计的引物序列
。
2、VIGS载体的构建
利用TRIzol法分别提取感染了烟草普通花叶病毒的烟株叶片的总RNA，具体操作方法依据天根生化科技（北京）有限公司的TRIzol产品的说明书。参照北京全式金生物技术有限公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书反转成cDNA。以获得的cDNA为模板，按照表1中相应的引物利用诺唯赞生物技术有限公司的P505高保真酶分别进行PCR 扩增，扩增体系：2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mmol/L) 1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，20μmol/L的cDNA模版1μL，加ddH2O补至50μL。反应条件为预变性95℃ 3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃ 5min。琼脂糖凝胶电泳检测，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶纯化试剂盒回收目的片段。对pTRV2-GFP空载体质粒进行BamHI/KpnI双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体。利用诺唯赞生物技术有限公司的ClonExpress®Ⅱ重组克隆试剂盒分别将扩增产物与线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存，得到重组表达载体pTRV2-G-TMV-30、pTRV2-G-TMV-126、pTRV2-G-TMV-183、pTRV2-G-TMV-CP。
3、重组表达载体转化
参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌GV3101感受态细胞的使用说明书，将重组表达载体pTRV2-G-TMV-30、pTRV2-G-TMV-126、pTRV2-G-TMV-183、pTRV2-G-TMV-CP分别转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到原始菌液。将所得原始菌液均匀涂抹在LB（含有浓度为25mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素）固体培养基上，28℃下倒置培养48h；挑取单菌落经PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证。将验证正确的菌液分别扩繁后保存至-80℃超低温冰箱备用。
4、产品制备
将TRV1菌液和原始菌液TRV2-G-TMV-30、TRV2-G-TMV-126、TRV2-G-TMV-183、TRV2-G-TMV-CP分别接种到LB液体培养基上，28℃、200r/min过夜培养后，调整浓度为OD600≈0.8～1.0，再用培养过的TRV1菌液分别与培养过的TRV2-TMV-30、TRV2-TMV-126、TRV2-TMV-183、TRV2-TMV-CP菌液混合摇匀（等比例混合），之后再等比例将四种混合摇匀液混合在一起，然后按15ml/瓶分别装入西林瓶中使用冻干机冻干，即得到防治烟草普通花叶病毒的疫苗。
5、产品用量
产品使用之前需要加入缓冲液对其进行活化，将缓冲液用注射器注入西林瓶内（每瓶注射缓冲液15毫升），混合后摇匀。在室温下遮光存放12-24小时，不要超过24小时。之后将混合液按1:10兑水，然后使用喷雾器将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。
6、产品使用时间
在植株苗期进行叶面剪叶，然后喷洒接种疫苗。
7、基因沉默效率试验
分别将TRV2-G-TMV-30、TRV2-G-TMV-126、TRV2-G-TMV-183、TRV2-G-TMV-CP单独的产品注射入长势均匀一致的六叶一心烟苗，用1 mL注射器注射疫苗于烟株嫩叶背面，每株烟注射2片叶，每个产品注射20株烟，在接种后14天摩擦接种烟草普通花叶病毒，在接种病毒后7天，取新叶提取RNA测定各自产品对应的基因沉默效果。
基因沉默效率的计算公式为：[(对照组TMV基因表达量-处理组TMV基因表达量)/对照组TMV基因表达量]×100%。
见图3-6，TMV-CP基因沉默效率为19.3%，TMV-183基因沉默效率为22%，TMV-126基因沉默效率为43.9%，TMV-30基因沉默效率为28.9%。
8、烟田试验
在河南烟区平顶山进行大区试验，于烟苗移栽前进行剪叶喷洒该产品，在发病高峰期调查不同处理发病情况。根据《烟草病虫害分级及调查方法》（GB/T 23222—2008）以株为单位进行病级鉴定，根据下列公式计算发病率、病情指数和防治效果。
在移栽后60d、80d、100d调查烟草普通花叶病发病情况，结果表明喷洒接种该产品的和不接种该产品的相比，发病率降低，防治效果能够达到71.3%，整体来看防治效果较好。
发病率=（发病株数/调查总株数）×100%；
病情指数=（Σ各级病株数×病级）/（调查总株数×最高病级）×100；
防治效果=（对照病指 - 处理病指）/ 对照病指×100%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式的一部分，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗，其特征在于：包括pTRV1和至少一种重组表达载体pTRV2-G-目标基因，所述目标基因为TMV-30、TMV-126、TMV-183或TMV-CP，序列分别如SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的防治烟草普通花叶病毒的疫苗，其特征在于：包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2-G-目标基因，所述目标基因分别为TMV-30、TMV-126、TMV-183和TMV-CP。
3.根据权利要求1所述的防治烟草普通花叶病毒的疫苗，其特征在于：所述重组表达载体pTRV2-G-目标基因由以下步骤构建：
（1）提取感染了烟草普通花叶病毒的烟株叶片的总RNA，将其反转成cDNA；
（2）再以所述cDNA为模板进行PCR 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；
（3）对pTRV2-GFP空载体质粒进行BamHI/KpnI双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体；
（4）将步骤（2）所得扩增产物目的片段与步骤（3）所得线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒。
4. 根据权利要求3所述的防治烟草普通花叶病毒的疫苗，其特征在于：关于步骤（2）PCR 扩增中对应的引物：当目标基因为TMV-30时，引物对为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；当目标基因为TMV-126时，引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；当目标基因为TMV-183时，引物对为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；当目标基因为TMV-CP时，引物对为SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。
5.权利要求1-4任一项所述防治烟草普通花叶病毒的疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（一）将所述重组表达载体pTRV2-G-目标基因转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到原始菌液；将原始菌液均匀涂抹在LB固体培养基上，25-30℃下倒置培养40-50h，挑取单菌落经PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证，将验证正确的原始菌液扩繁后保存至超低温冰箱备用；
（二）将TRV1菌液和每种TRV2初始菌液分别接种到LB液体培养基上，25-30℃、150-250r/min过夜培养后，调整浓度为OD600≈0.8～1.0，然后将所培养的TRV1菌液分别和所培养的单种TRV2菌液混合摇匀，之后再都混合在一起冻干，即得到防治烟草普通花叶病毒的疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述LB固体培养基含有浓度为20-30mg/mL利福平和40-60mg/mL卡那霉素。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（二）混合摇匀所用培养的TRV1菌液和单种原始TRV2菌液混合的体积比为1：（0.8-1.2）。
8.权利要求1-4任一项所述防治烟草普通花叶病毒的疫苗的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
在烟草上使用时，在所述疫苗中加入缓冲液对其进行活化，混合均匀；在室温下遮光存放，将所得混合液兑水，然后将其均匀地喷洒到剪叶的烟苗上，喷洒量为叶面有肉眼可见的水珠即可。
9.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述缓冲液与所述疫苗的体积比为1：（0.8-1.2）。
10.根据权利要求8所述的使用方法，其特征在于：所述混合液按体积比1：（8-12）兑水。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211358915.0A CN116814682A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211358915.0A CN116814682A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116814682A true CN116814682A (zh) | 2023-09-29 |
Family
ID=88118949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211358915.0A Pending CN116814682A (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116814682A (zh) |
-
2022
- 2022-11-01 CN CN202211358915.0A patent/CN116814682A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109182292B (zh) | 一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用 | |
| CN110856493B (zh) | 一种植物病毒弱毒疫苗组合物、弱毒疫苗保存方法及其应用 | |
| CN107674873B (zh) | 小麦热激转录因子基因TaHsfA2i及其编码蛋白与应用 | |
| CN113105533B (zh) | 樟疫霉效应子蛋白Avh49及其应用 | |
| CN106244599B (zh) | 一种三七病程相关蛋白1家族基因PnPR1-2及应用 | |
| CN110923251A (zh) | 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用 | |
| CN110857439B (zh) | 一种高效产生siRNA的马铃薯Y病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用 | |
| CN110857438B (zh) | 一种高效产生siRNA的烟草花叶病毒基因片段、弱毒疫苗、制备方法及其应用 | |
| CN110819639A (zh) | 烟草低温早花相关基因NtDUF599及其应用 | |
| CN112979773B (zh) | 樟疫霉效应子蛋白RxLR29及其应用 | |
| CN111534501B (zh) | 一种水稻纹枯病菌MAPK蛋白激酶基因靶标片段Rsmapk及其应用 | |
| CN110819634B (zh) | 一种细叶百合基因LpNAC6的克隆及其应用 | |
| CN109053869B (zh) | 大豆核孔蛋白基因GmNup96在调节植物根瘤发育中的应用 | |
| CN111979251A (zh) | 一种促进植株生长的中山杉ThSHR3基因及其应用 | |
| CN115976050B (zh) | 猕猴桃感病基因及其适用的vigs沉默体系构建 | |
| CN116814682A (zh) | 一种防治烟草普通花叶病毒的疫苗及其制备方法 | |
| CN112662679B (zh) | 一种桃果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白PpPGIP1基因及其克隆方法和应用 | |
| CN110885796A (zh) | 一种抗马铃薯x病毒的弱毒疫苗、制备方法及其应用 | |
| CN116970636A (zh) | 一种防治马铃薯y病毒的疫苗及其制备方法 | |
| CN112195178B (zh) | 番茄抗晚疫病长链非编码RNA-lncRNA40787及其克隆方法与应用方法 | |
| CN116814681A (zh) | 一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法 | |
| CN111471689B (zh) | 一种提高大豆对胞囊线虫病抗性的基因及其应用 | |
| CN111500595A (zh) | 一种木麻黄基因CeDREB1及其应用 | |
| CN111304240A (zh) | 基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法 | |
| CN110643617A (zh) | 一种水稻粒重相关的OsGASR9基因及应用、蛋白质、表达载体和转基因水稻的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |