CN116814664A - 一种扩展肿瘤识别表位的cea嵌合抗原受体t细胞的制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扩展肿瘤识别表位的CEA嵌合抗原受体T细胞的制备与应用，特别地，提供了一种分离的重组核酸分子，其编码：包含靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、IL‑7和XCL1多肽的嵌合抗原受体（CAR）多肽，以及提供了包含所述重组核酸分子的重组载体，表达所述CAR多肽的重组T淋巴细胞，制备所述重组T淋巴细胞的方法，包含所述重组核酸分子、重组载体和重组T淋巴细胞的用于治疗癌症的药物，以及所述重组核酸分子、重组载体和重组T淋巴细胞用于治疗癌症的应用。

Description

一种扩展肿瘤识别表位的CEA嵌合抗原受体T细胞的制备与 应用

技术领域

本发明涉及癌症的过继细胞免疫治疗，更特别涉及嵌合抗原受体T细胞。

背景技术

癌胚抗原（CEA）是机体在胚胎期组织分化产生的一种糖蛋白产物，在细胞质内合成后，通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面，在磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C作用下从细胞膜脱落，分泌到细胞外CEA。在出生后的产生与分泌受到抑制，但在一些上皮细胞恶变后，特别是结直肠癌（CRC）发生后CEA水平显著升高，被认为是一种肿瘤相关抗原（TAA），是CRC重要的肿瘤标志物之一（Beauchemin et al., ‘Carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecules (CEACAMs) in cancer progression and metastasis’, Cancermetastasis reviews, Vol.32, No.3-4, 2013, pp.643-71）。血清CEA水平的改变，是临床医生判断CRC治疗效果和预后的重要参考指标之一（Ishigami et al., ‘ClinicalImportance of Preoperative Carcinoembryonic Antigen and Carbohydrate Antigen19-9 Levels in Gastric Cancer’, Journal of Clinical Gastroenterology, Vol.32, No. 1, January 2001, pp. 41–44）。由于CRC的高表达，CEA曾作为肿瘤疫苗的靶蛋白激发抗肿瘤免疫（Hensel et al., ‘Recombinant AAV-CEA Tumor Vaccine inCombination with an Immune Adjuvant Breaks Tolerance and Provides ProtectiveImmunity’, Molecular therapy oncolytics, Vol.12, 2018, pp.41-48）。

CRC是严重威胁人类生命健康的疾病之一。CRC常规的治疗手段主要包括手术、放疗和化疗，但很多CRC患者诊断时已经处于疾病晚期，失去合适的治疗机会。针对免疫检查点的免疫治疗为CRC患者提供了新选择，但主要是肿瘤细胞微卫星不稳定患者有良好应答，而一般CRC患者的治疗有效率极低 （Morad et al., ‘Hallmarks of response,resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade’, Cell, Vol. 184, No.21, 2021, pp.5309-5337）。采用过继细胞免疫治疗成为CRC新的免疫治疗选择（Jogalekaret al., ‘CAR T-Cell-Based gene therapy for cancers: new perspectives,challenges, and clinical developments’, Frontiers in immunology, Vol. 13,2022, pp.1-15）。

过继细胞免疫治疗是将在体外活化扩增的自体或异体免疫效应细胞输注到患者体内的治疗方法。嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞是一种过继细胞免疫治疗方法，是将单克隆抗体对肿瘤细胞膜表面抗原的特异性识别与T细胞的杀伤作用相结合，其特点是具有肿瘤抗原识别特异性强、非MHC限制性及可在体外大量扩增。CAR-T细胞的嵌合抗原受体主要由胞外区、跨膜区和胞内区构成（图1），胞外区负责识别肿瘤细胞膜表面所表达的抗原，主要由针对肿瘤相关抗原（TAA）的特异性单链抗体的可变区（scFv）组成；常见的跨膜区主要由来源于CD8和CD28跨膜区基因序列构成，其功能是将scFv识别的抗原信号传递到胞内；胞内区主要由共刺激分子和CD3ζ组成，常见的共刺激分子主要有CD137、CD28、CD27、CD134和ICOS，能够将跨膜区传递的信息转化为生物信号，进而活化T细胞对肿瘤细胞的杀伤。为改善CAR-T细胞的肿瘤治疗效应，构建的CAR-T细胞经过了数代更新，为增强CAR-T细胞的杀伤活性，新一代构建的CAR-T细胞在胞内区增加了炎性细胞因子的表达基因（Jensen et al.,‘Design and Implementation of Adoptive Therapy with Chimeric AntigenReceptor-Modified T Cells’, Immunological Reviews, Vol. 257, No. 1, January2014, pp. 127–144）。大量的临床实践表明，CAR-T细胞对血液系统肿瘤，如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤疗效显著，已走向临床应用。这主要是由于肿瘤细胞在血液中呈现游离状态，针对肿瘤靶抗原的CAR-T细胞容易与之进行直接接触而将其清除，即CAR-T细胞的scFv对肿瘤细胞的膜抗原具有良好的可及性（Sterner et al., ‘CAR-T cell therapy: currentlimitations and potential strategies’, Blood Cancer J., Vol. 11, No. 4, 2021,pp.69-79）。

在中国开展的一项CEA CAR-T治疗CRC临床研究中（Zhang et al., ‘Phase IEscalating-Dose Trial of CAR-T Therapy Targeting CEA⁺ Metastatic ColorectalCancers’, Mol Ther., Vol. 25, No. 5, 2017, pp.1248-1258），入组10位患者，其中有7位患者疗效评价为病情稳定，后期随访发现，回输的CAR-T细胞不能有效在患者外周血中生存和扩增，且大部分患者外周血中的CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞高表达LAG3和TIM-3等免疫抑制分子，患者存在肿瘤复发的风险。在美国开展的一项CEA CAR-T治疗CRC肝转移研究中（Katz et al., ‘HITM-SIR: phase Ib trial of intraarterial chimeric antigenreceptor T-cell therapy and selective internal radiation therapy for CEA⁺liver metastases’, Cancer Gene Ther., Vol. 27, No. 5, 2020, pp.341-355），发现CEA阳性患者在接受CAR-T治疗后，肿瘤体积明显减小，生存期得到显著延长，但未能发现针对异质性的CEA阴性肿瘤细胞的作用。对于CRC等实体瘤而言，CAR-T细胞疗法一直不理想，未能达到预期效果（Zhang et al., ‘Hurdles of CAR-T cell-based cancerimmunotherapy directed against solid tumors’, Sci China Life Sci., Vol. 59,No. 4, 2016, pp.340-8；Sterner et al., ‘CAR-T cell therapy: currentlimitations and potential strategies’, Blood Cancer J., Vol. 11, No. 4, 2021,pp.69-79)。原因主要包括如下几个方面：

1）实体性肿瘤细胞周围存在大量基质细胞，包括非特异性免疫细胞、血管内皮细胞等，形成的屏障阻碍了CAR-T有效浸润肿瘤实质中，即CAR-T细胞的scFv无法识别肿瘤抗原，因此无法触发下游的杀伤活性；

2）作为靶抗原的CEA为一种糖蛋白，肿瘤细胞的异质性及变异发生糖基化改变，导致scFv识别的肿瘤抗原表位被遮蔽或发生改变，输注的CAR-T细胞的scFv无法识别特定的肿瘤抗原而脱靶，从而难以发挥作用；

3）肿瘤细胞周围存在的这些基质细胞产生多种不同的抑制性分子，导致所进入的CAR-T细胞功能抑制与功能的耗竭，从而难以发挥作用；

4）CRC微环境中的相关基质细胞的分泌产物如黏蛋白等，在肿瘤细胞表面形成保护层，遮蔽了CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原识别。

由于实体瘤的特点及其特殊的微环境，改善CAR-T细胞在实体瘤中的浸润和功能发挥，并通过扩展机体自身免疫细胞对肿瘤抗原的识别，重塑机体抗肿瘤免疫反应微环境是CAR-T细胞疗法治疗实体瘤的重要方向和治疗策略，由此可降低因肿瘤异质性及新变异而导致的肿瘤复发和进展，改善患者预后。

发明内容

本发明人发现使用具有靶向结直肠癌细胞标志物CEA的单链抗体以及IL-7和XCL1的CAR-T细胞，体外和体内实验结果显示所述CAR-T细胞在杀伤CEA表达型的CRC细胞的同时，可诱导机体自身产生针对其他肿瘤抗原的特异性T细胞例如无关的模型抗原β-gal特异性T细胞，通过扩展机体T细胞对肿瘤抗原的应答，而改善CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤效应，很好地解决肿瘤异质性问题所导致的肿瘤复发和进展。

本发明提供了一种分离的重组核酸分子，其编码包含针对CEA的特异性单链抗体多肽、白介素-7（IL-7）和淋巴细胞趋化因子（XCL1）多肽的CAR多肽。转染细胞后所产生的IL-7具有扩增纯真性和记忆性T细胞及前B细胞能力，局部产生的IL-7从而具有扩增所输注的CAR-T细胞的能力；淋巴细胞趋化因子（XCL1）能与趋化因子受体（XCR1）相结合，局部产生的XCL1具有募集在细胞表面独特性表达XCR1的I型经典树突状细胞。

在一个实施方案中，所述CAR多肽自N至C端包含：

（i）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、（ii）跨膜部分、（iii）以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、（iv）第一2A肽、（v）白介素-7（IL-7）、（vi）第二2A肽和（vii）结合趋化因子受体1（XCR1）的淋巴细胞趋化因子（XCL1），或者

（i）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、（ii）跨膜部分、（iii）以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、（iv）第一2A肽、（v）结合趋化因子受体1（XCR1）的淋巴细胞趋化因子（XCL1）、（vi）第二2A肽和（vii）白介素-7（IL-7）。

本发明还提供了一种重组载体，其包含编码上述CAR多肽的多核苷酸序列。

本发明还提供了一种制备重组T细胞的方法，包含用本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体转化T细胞。

本发明还提供了一种重组T细胞，其表达本发明所述的CAR多肽。

本发明还提供了用于治疗癌症的药物，其包含：本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞，以及药学可接受的载体。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括给需要的患者施用本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体在制备重组T细胞中的应用。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞用于治疗癌症。

附图说明

图1：不同结构的CAR结构模式图（Hartmann et al., ‘Clinical Development ofCAR T Cells-Challenges and Opportunities in Translating Innovative TreatmentConcepts’, EMBO Molecular Medicine, Vol. 9, No. 9, 2017, pp. 1183–1197）。

图2：流式检测抗CEA单链抗体对CEA抗原的识别能力

A. 人结肠腺癌细胞(LS180)细胞（购自ATCC）的细胞膜表面表达CEA抗原，流式检测发现CEA-scFv能有效识别LS180细胞。

B. 人正常的脐带静脉内皮细胞(HUVEC)细胞不表达CEA抗原，流式检测发现CEA-scFv不能识别HUVEC细胞。

结果显示CEA-scFv能够有效识别表达CEA的肿瘤细胞但不识别正常组织细胞。

图3A-3E：表达CEA-scFv的2种单链抗体（抗体重链与轻链两个亚基的链接方式）的结构

图3A. VL-VH链接顺序的CEA-scFv（CEA VL-VH）和VH-VL链接顺序的CEA-scFv（CEAVH-VL）单链抗体的模式图。

图3B. 利用RaptorX网站预测到的CEA VL-VH（上）和CEA VH-VL（下）单链抗体的空间结构。

图3C. 采用人IgG的Fc段（hIgG1-Fc）做标签，用PyMOL预测到的CEA VL-VH(上)和CEA VH-VL（下）单链抗体与hIgG1-Fc标签的相互作用，未发现hIgG1-Fc标签的氨基酸序列在空间上对CEA scFv产生空间位阻情况。

图3D和图3E. 所构建的分别表达CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体的质粒图谱。

图4：ELISA检测CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体对融合蛋白CEA蛋白的亲和力

A. 纯化转染细胞表达的CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体的流程示意图。

B. ELISA检测CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体对CEA蛋白的亲和力。

结果显示CEA-scFv以 VL-VH链接比以VH-VL链接对CEA的亲和力高。

图5A-5E：构建的CEA CAR和7×1 CEA CAR的结构和空间构象

图5A. CEA CAR和7×1 CEA CAR表达基因的结构模式图。

图5B. 利用RaptorX网站预测到的CEA CAR和7×1 CEA CAR的空间结构。

图5C. 利用PyMOL对各氨基酸序列进行不同颜色标记的空间结构图。

图5D和图5E. 构建的CEA CAR逆转录病毒载体和7×1 CEA CAR逆转录病毒载体图谱。

图6：感染不同CEA CAR逆转录病毒后，Jurkat细胞表面CEA-scFv的表达

A. 未感染细胞（Un-Jurkat）及感染CEA CAR逆转录病毒和7×1 CEA CAR逆转录病毒72h后，Jurkat细胞显微镜下的生长状态。

B. 未感染细胞（Un-Jurkat）及分别感染CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒48h后，流式检测各组细胞表面CEA-scFv的表达情况。

图7：感染不同CEA CAR逆转录病毒后，小鼠CAR-T细胞表达CEA-scFv情况

A. 未活化及活化48h后小鼠T细胞的显微镜下状态。

B. 未感染T细胞（Un-T）和感染CEA CAR及感染7×1 CEA CAR逆转录病毒72h后，显微镜下观察到的小鼠T细胞生长状态。

C. 小鼠T细胞感染不同的逆转录病毒72h后，分别采用CAE标签和标签对照检测CEA CAR-T细胞和7×1 CEA CAR-T细胞表面CEA-scFv的表达情况。

图8：与CEA表达阳性的LS180细胞共培养后，CEA CAR-T细胞及7×1 CEA CAR-T分泌IL-7(A)和XCL1(B)的分泌量。采用定量ELISA分析方法，分别检测共培养24h、48h和72h后的细胞上清中的含量。Un-T为未感染的活化T细胞。

图9：未感染的T细胞（Un-T）及CEA CAR-T细胞及7×1 CEA CAR-T细胞与CEA阳性细胞共培养72h后，采用流式细胞术检测其分泌产物对CD141⁺经典I型树突状细胞的趋化作用。采用重组人XCL1做为阳性对照。

图10：未感染的活化T细胞（Un-T）及CEA CAR-T和7×1 CEA CAR-T细胞在体外的增殖情况。在96孔培养板中分别接种同等数量的T细胞，每孔2×10⁵个细胞，每种细胞接种3孔，24h后分别统计各孔细胞数目。

图11：CEA CAR-T和7×1 CEA CAR-T细胞中的CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞亚群的分布。在逆转录病毒转染T细胞72h后，采用流式细胞术的检测结果。

图12：CEA CAR-T和7×1 CEA CAR-T细胞表面免疫检查点分子PD1、LAG3和TIM3的表达情况，在逆转录病毒感染后72h后，采用流式细胞术的检测结果。

图13A-13B：细胞膜表面表达人CEA的CT26.hCEA细胞的构建与鉴定

图13A. 表达人CEA的pCMV3-CEACAM5质粒图谱。

图13B. 流式细胞术检测CT26.hCEA细胞膜表面的CEA表达。选择不表达CEA蛋白的CT26.CL25和CT26细胞作为阴性对照。

图14：与CT26.hCEA细胞共培养72h后，流式细胞术检测不同CEA CAR-T细胞IFN-γ的表达

A. 未感染CAR逆转录病毒的T细胞（Un-T）内IFN-γ表达情况。

B. CEA CAR-T（感染CEA CAR逆转录病毒的T细胞）内IFN-γ的表达。

C. 7×1 CEA CAR-T（感染7×1 CEA CAR逆转录病毒的T细胞）内IFN-γ的表达。

图15：CEA CAR-T细胞与7×1 CEA CAR-T细胞对不同CT26细胞的体外杀伤效果。

A. 对CT26.hCEA（表达人CEA抗原CRC细胞）的杀伤作用。

B. 对CT26（不表达人CEA抗原的CRC细胞）的杀伤作用。

C. 对CT26.CL25（不表达人CEA抗原但表达其它抗原β-gal的CRC细胞）的杀伤作用。

未感染CAR逆转录病毒的T细胞（Un-T）为对照，每个杀伤检测的效靶比设置3管，数据表示为平均值±SD。

图16：可溶性的游离CEA对7×1 CEA CAR-T细胞杀伤功能的影响

在不同含量的可溶性游离CEA抗原存在时，流式细胞术检测7×1 CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA细胞的杀伤作用。

图17：CEA CAR-T细胞与7×1 CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA荷瘤小鼠的治疗作用

A. 实验流程示意图。

B. 相对于CEA CAR-T输注当天（肿瘤接种后第7天）的肿瘤体积倍数变化统计图。

C. 各组小鼠肿瘤体积倍数变化图。

采用未感染CAR逆转录病毒的T细胞（Un-T）为对照

图18：动物实验验证7×1 CEA CAR-T细胞扩展肿瘤识别表位的功能

A. 实验流程示意图。

B-D．在肿瘤接种后18天，分离经未感染CAR逆转录病毒的T细胞(B，Un-T)、CEACAR-T(C)和7×1 CEA CAR-T(D)治疗后的小鼠脾脏细胞，并采用CFSE标记T细胞，分别加入β-gal或无关抗原OVA刺激细胞72h，流式细胞术分析β-gal特异性T细胞产生情况，以抗原OVA作为无关对照。

E和F. 不同T细胞治疗后，小鼠体内β-gal特异性T细胞增殖情况。

图19：进行CEA CAR-T细胞与7×1 CEA CAR-T细胞治疗后的小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H＆E染色情况（A）;治疗后小鼠食管、胃、小肠和大肠的H＆E染色情况（B）。

图20：7×1 CEA CAR-T细胞在杀伤CEA表达阳性的肿瘤细胞后，对CEA表达阴性的CRC肿瘤识别表位扩展作用示意图

7×1 CEA CAR-T细胞识别并杀死表达CEA抗原的肿瘤细胞，肿瘤细胞死亡并释放大量新的肿瘤抗原（如β-gal）；同时，7×1 CEA CAR-T细胞能表达并分泌细胞因子IL-7和淋巴细胞趋化因子（XCL1）。IL-7能扩增所输注的CAR-T细胞；XCL1能募集表达XCR1的I型经典树突状细胞（cDC1s）进入肿瘤组织。肿瘤死亡释放的新的肿瘤抗原（如β-gal）被募集而来的专职抗原提呈细胞（如cDC1s）摄取、加工后，进入淋巴结，以MHC-I/多肽的形式交叉提呈给T细胞，诱导针对新释放的肿瘤抗原（如β-gal）的特异性T细胞的分化和扩增，进而杀伤CEA阴性CRC肿瘤细胞。

具体实施方式

虽然在此示出并描述了本发明的各个实施方案和各方面，但是本领域技术人员显然了解这些实施方案和各个方面只是举例说明本发明。本领域技术人员在不偏离本发明精神的范围内可以进行多种变化、改变和替代。应理解本文所述的本发明的实施方案的各种替代选择可用于本发明的实施中。

除非特别限定，本文使用的所有技术和学术术语均具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。另外，本文中使用的某些术语具有在本说明书中阐述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请及出版物均就如全文显示一样并入本文作参考。

除非另有说明，本文中核酸的书写从左至右为5′至3′方向；氨基酸序列的书写从左至右为氨基至羧基方向。

本发明提供了一种分离的重组核酸分子，其包含编码CAR多肽的多核苷酸序列。所述重组核酸分子任选包含编码信号肽的核苷酸序列。

术语“信号肽”在本文中是指其在本领域中的通常含义，是指具有大约5-30个氨基酸的肽。信号肽存在于新合成的组成分泌途径的一部分的蛋白质的N末端。分泌途径的蛋白质包括但不限于位于一些细胞器（内质网、高尔基体或内体）内部的蛋白质，从细胞分泌的蛋白质或者插入到细胞膜中的蛋白质。在一个实施方案中，所示信号肽例如SEQ ID NO：1所示。

本文所用术语“分离的”当用于核酸或蛋白质时，是指所述核酸或者蛋白质基本上没有在其天然环境与之联合的物质。“基本上没有”意味着要求至少50%，有利地至少70%，更有利地至少80%，甚至更有利地至少90%的这些物质没有了。已经被“分离的”生物组分包括那些通过常规纯化方法纯化的组分。该术语还包括重组核酸或蛋白质，以及化学方法合成的核酸或肽。

本文所用术语“重组”当用于指代细胞、核酸、蛋白质或载体时，是指所述细胞、核酸、蛋白质或载体已被修饰或者是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白质包括由实验室方法产生的蛋白质。重组蛋白质可以包括未在天然（非重组）形式的蛋白质中发现的氨基酸，或者可以包括已被修饰例如被标记的氨基酸残基。

本文所用术语“核酸”是指脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸及其单链或双链形式聚合物，及其互补序列。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”是指核苷酸线性序列。术语“核苷酸”典型地是指多核苷酸的单一单位，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者其修饰的版本。本文的核苷酸序列的例子包括单链和双链DNA，单链和双链RNA（包括siRNA），及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂交分子。本文所用核酸也指具有与天然发生的核酸相同的基本化学结构的核酸。这种类似物具有修饰的糖和/或修饰的环取代基，但是保持与天然发生的核酸相同的基本化学结构。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“氨基酸序列”可互换使用，指的是任意长度例如两个或更多个氨基酸残基的聚合物。该术语还包括天然地或人为干预地修饰的氨基酸聚合物；例如形成二硫键、糖基化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作与修饰，如与标签或具有生物活性的组分缀合。本文采用的是常规的单字母或三字母氨基酸残基编码。

术语“氨基酸”是指天然发生的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和以类似于天然发生的氨基酸的方式起作用的氨基酸模拟物。天然发生的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及被后来修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然发生的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸通常化学结构的结构但是以类似于天然发生的氨基酸的方式起作用的化合物。在本文中氨基酸可以通过已知的三字母符号代表，或者通过IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission推荐的单字母符号代表。类似地核苷酸可以用通常接受的单字母符号代表。

如本文所用，所述CAR多肽是针对CEA的CAR多肽。在一个实施方案中，所述CAR多肽包含如下部分：

（i）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、白介素-7（IL-7）、第二2A肽和结合趋化因子受体1（XCR1）的淋巴细胞趋化因子（XCL1），或者

（ii）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、XCL1多肽、第二2A肽和IL-7，

其中CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区可以以任意顺序连接，例如从N至C方向为CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区，或者CD3ζ胞浆功能区和CD137胞浆功能区。

本文所用术语“抗体”是指特异性结合和识别抗原的包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其部分。典型地，抗体的抗原结合区在决定结合的特异性和亲和性方面起显著作用。在一些实施方案中，抗体或抗体片段可以衍生自不同生物体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。抗体或其片段、其制备及使用是熟知的并且公开在例如Harlow et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1999。

scFv典型地是免疫球蛋白的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）经10到大约25个氨基酸的短接头肽连接的融合蛋白。接头通常富含甘氨酸以具有柔性，及具有丝氨酸或苏氨酸以具有溶解性。接头可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或者与之相反。连接VH与VL的接头可以是本领域已知的任何合适接头，例如(GGGS)_n（SEQ ID NO：31），其中n是1至10的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一个实施方案中，所述靶向分子scFv的VH和VL以任意顺序直接或通过接头连接，从N至C端例如是：VH-VL、VL-VH、VH-接头-VL或VL-接头-VH。

在一个实施方案中，所述scFv包含VL和VH，所述VL包含或由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成，和/或所述VH包含或由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中，所述scFv从氨基端至羧基端包含或由VL-接头-VH组成。

本领域技术人员已知的任何接头均可用于本发明中。接头部分可以是肽。接头不形成抗原性表位。用于接头的典型氨基酸残基是甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等等。举例的这种已知的接头部分包括但不限于(G)_nS(G)_n，其中n=4、5、6或7（SEQ ID NO：33-36），或者(G₄S)_n（SEQ ID NO：32），其中n=3、4、5、6、7、8或9。在一个优选的实施方案中，所述接头为(G₄S)₃（SEQ ID NO：19）。

优选地，所述scFv包含或由SEQ ID NO：20或21组成，优选包含或由SEQ ID NO：20组成。

在本发明中，术语“跨膜部分”和“跨膜区”可互换使用，具有本领域技术人员通常已知的含义，指跨膜蛋白中连接蛋白的胞外区和胞内区的部分，其跨越细胞膜，例如通常为α-螺旋结构，约20~25个氨基酸残基。构成蛋白质跨膜部分的氨基酸大部分是疏水性氨基酸。本文所述的跨膜部分能够将本文及其实施方案中提供的重组CAR基因编码的蛋白质锚定在生物学膜（例如T细胞的细胞膜）中。能够锚定本文及其实施方案中提供的重组CAR基因编码的蛋白质的任何跨膜结构域均包括在本发明中。

在一个实施方案中，可用于本发明CAR多肽的跨膜部分选自CD分子的跨膜部分，例如选自CD30分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分和CD3ζ分子的跨膜部分。

在一个实施方案中，本发明CAR多肽的跨膜部分是CD8分子的跨膜部分。本文提供的术语"CD分子跨膜部分"包括任何重组或天然发生形式的CD分子跨膜结构域，或者保持CD分子跨膜结构域活性(例如与CD分子跨膜结构域相比在至少50%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%活性内)的变体或同系物。在一些方面，所述变体或同系物与天然发生的CD分子跨膜结构域多肽相比在全序列或部分序列（例如50、100、150或200个连续氨基酸部分）范围内具有至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列相同性。

序列相同性可以通过商业可获得的计算机程序来确定，其采用任何适宜的算法计算出两个或多个序列间的相同性百分比，例如采用缺省参数。此类计算机程序的典型的例子是CLUSTAL。更有利地，应用BLAST算法，参数设置为缺省值。在National Center forBiotechnology Information (NCBI)网站上有BLAST算法的详细介绍。

在一个实施方案中，CD8跨膜结构域是包含SEQ ID NO：22或23所示氨基酸序列的蛋白质、其同系物或功能片段，任选地，编码CD8分子的跨膜部分的核酸序列例如包含或由SEQ ID NO：24或25所示序列组成。在一个实施方案中，所述CD8分子的跨膜部分包含或由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成。优选地，编码CD8分子的跨膜部分的核酸序列例如包含或由SEQ ID NO：25所示序列组成。

在一个实施方案中，本发明所述跨膜部分（例如CD8跨膜结构域）与所述针对CEA的scFv的C端（例如重链可变区或轻链可变区的C端）连接。

在一个实施方案中，所述靶向CEA的scFv和跨膜部分之间具有间隔子区。

本文所述“间隔子区”是连接靶向分子与跨膜部分的肽。在一些实施方案中，间隔子区连接重链恒定区与跨膜部分。在一些实施方案中，间隔子区包括Fc区，例如IgG Fc，如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。间隔子区的例子包括不限于免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)和/或包括影响Fc受体结合的突变的免疫球蛋白分子或其片段(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些实施方案中，间隔子区是IgG(例如IgG4)的片段，其中所述片段包括CH2结构域的缺失。间隔子区可以是肽接头。在一些实施方案中，间隔子区是丝氨酸-甘氨酸接头，例如GGSG（SEQ ID NO：26）或GSGSGSGS（SEQ ID NO：27）。在一些实施方案中，间隔子区是4到250个氨基酸长。间隔子区可以包括能够延长本文提供的蛋白质的体内（例如血浆）半衰期的残基。在一些实施方案中，间隔子区是10个氨基酸长，例如GGGSSGGGSG（SEQ ID NO：28）。在一些实施方案中，本发明重组核酸分子不包括编码所述间隔子区的核苷酸序列。

在本发明中，术语“胞浆部分”和“胞内区”可互换使用，包括能够提供应答抗原与本文实施方案中提供的抗原结合部分的结合的初级信号传导的氨基酸序列，导致表达CAR基因的T细胞的活化和/或增殖（细胞分裂）。

本发明所述CAR多肽的胞内区包含CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区。

CD137分子是肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族的成员，是除CD28/B7之外的另一重要的介导T细胞活化的共刺激分子。主要分布在活化的CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞和NK细胞表面。CD137分子的胞浆功能区含有5个氨基酸的保守序列，可介导T细胞活化的第二信号。本发明所述CD137分子的胞浆功能区是指能够介导T细胞活化的CD137分子胞浆区的全部或一部分。优选地，所述CD137分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：6所示的氨基酸组成，更优选地，编码CD137分子的胞浆功能区的核酸序列包含或由SEQ ID NO：7所示序列组成。

CD3ζ分子是一种T细胞刺激因子，也是T细胞共受体复合物的成员之一。CD3胞质段含三个ITAM，可引发T细胞的分裂和细胞因子的释放。本发明所述CD3ζ分子的胞浆功能区是指包含所述3个ITAM并可引发T细胞分裂和细胞因子释放的CD3ζ分子胞浆区的全部或一部分。优选地，所述CD3ζ分子的胞浆功能区包含或由SEQ ID NO：8所示的氨基酸组成，更优选地，编码CD3ζ分子的胞浆功能区的核酸序列包含或由SEQ ID NO：9所示序列组成。

本发明所述IL-7和XCL1多肽可以任意顺序与CAR多肽的胞浆功能区连接，例如可以为胞浆功能区-IL7-XCL1或胞浆功能区-XCL1-IL7。优选地，在胞浆功能区、IL7和XCL1的任意两个部分之间存在2A肽氨基酸序列，例如胞浆功能区-2A-IL7-2A-XCL1、胞浆功能区-2A-XCL1-2A-IL7。

在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的重组核酸分子，从5’至3’方向，其包含编码如下的核苷酸序列：

（i）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、白介素-7（IL-7）、第二2A肽和结合趋化因子受体1（XCR1）的淋巴细胞趋化因子（XCL1）；或

（ii）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、XCL1多肽、第二2A肽和IL-7。

任选地，所述重组核酸分子还包含编码信号肽的核苷酸序列。

IL-7由T区成纤维网状细胞产生，是形成和维持淋巴器官中T细胞区所必需的细胞因子（Link et al., ‘Fibroblastic Reticular Cells in Lymph Nodes Regulate theHomeostasis of Naive T Cells’, Nature Immunology, Vol. 8, No. 11, 2007, pp.1255–1265；Luther et al., ‘Differing Activities of Homeostatic ChemokinesCCL19, CCL21, and CXCL12 in Lymphocyte and Dendritic Cell Recruitment andLymphoid Neogenesis’, Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950), Vol. 169,No. 1, 2002, pp. 424–433）。IL-7能够显著改善T细胞的生存和增殖（Bradley et al.,‘IL-7: maintaining T-cell memory and achieving homeostasis’. Trends Immunol,Vol. 26 No. 3, 2005, pp.172-6）。

由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列组成的分子能够实现IL-7分子功能活性，因此包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的多肽可以发挥IL-7分子的功能活性。在一个实施方案中，所述IL-7的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：10所示氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，所述IL-7的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：11所示氨基酸序列组成。在更进一步的实施方案中，所述IL-7多肽可包括或由与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且具有IL-7分子功能活性的氨基酸序列组成。在更进一步的实施方案中，所述IL-7多肽可包括SEQ ID NO：10所示氨基酸序列并且与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且具有IL-7分子功能活性。在进一步的实施方案中，本发明所述IL-7多肽可包括或由与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失并且具有IL-7分子功能活性的氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，本发明所述IL-7多肽可包括SEQ ID NO：10所示氨基酸序列并且与SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失并且具有IL-7分子功能活性。

XCL1是C型趋化因子家族成员，其特异性受体是C趋化因子受体1（XCR1），其是G蛋白偶联受体家族成员。前体人XCL1（UniProtKB登录号：P47992）和小鼠XCL1（NP_032536.1或UniProtKB登录号：P47993）是含有114个氨基酸、分子量为12.5Kd左右的蛋白，其中氨基酸1-21是信号肽。

如本文所用，术语“XCL1”多肽包括XCL1前体蛋白以及不包含信号肽的成熟蛋白。在一个实施方案中，所述XCL1多肽是人或小鼠XCL1多肽。由SEQ ID NO：12所示氨基酸序列组成的分子能够实现XCL1分子功能活性，因此包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的多肽可以发挥XCL1分子的功能活性。在一个实施方案中，所述XCL1的氨基酸序列包含或由SEQ IDNO：12所示氨基酸序列组成。在进一步的实施方案中，所述IL-7的氨基酸序列包含或由SEQID NO：13所示氨基酸序列组成。在更进一步的实施方案中，所述XCL1多肽可包括具有与SEQID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且特异性结合XCR1的氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，所述XCL1多肽可包括SEQ ID NO：12所示氨基酸序列并且与SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且特异性结合XCR1。在进一步的实施方案中，本发明所述XCL1多肽可包括与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失并且特异性结合XCR1的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，本发明所述XCL1多肽可包括SEQ ID NO：12所示氨基酸序列并且与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列相比具有一或多个氨基酸置换、添加和/或缺失并且特异性结合XCR1。

自剪切2A(self-cleaving 2A peptide)肽最初是在口蹄疫病毒属口蹄疫病毒中发现和鉴别的一种“自切割”肽片段，长约18-22个氨基酸，能诱导细胞内含有2A肽的重组蛋白自我剪切（Carey et al., ‘Reprogramming of Murine and Human Somatic CellsUsing a Single Polycistronic Vector’, Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America, Vol. 106, No. 1, 2009, pp. 157–162）。目前生物研究中常用到的2A肽共有4种：F2A、E2A、P2A、T2A，其中F2A源于手足口病毒（Foot-and-mouth disease virus）、E2A源于马甲型鼻炎病毒（Equine rhinitis Avirus）、P2A源于猪捷申病毒（Porcine teschovirus）、T2A源于明脉扁刺蛾病毒（Thoseaasigna virus）。

在一个实施方案中，所述2A肽可以选自F2A、T2A、E2A和P2A肽（Carey et al. ,‘Reprogramming of Murine and Human Somatic Cells Using a Single PolycistronicVector’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, Vol. 106, No. 1, 2009, pp. 157–162）。

在一个实施方案中，所述2A肽可以包含或由如下序列所示：

F2A（例如VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO：14）

T2A（例如EGRGSLLTCGDVEENPGP，SEQ ID NO：15）

E2A（例如QCTNYALLKLAGDVESNPGP，SEQ ID NO：16）和

P2A（例如ATNFSLLKQAGDVEENPGP，SEQ ID NO：17）。

特别地，可以在2A肽序列的N端加上GSG（Gly-Ser-Gly）序列以提高2A肽诱导剪切的效率。

在一个实施方案中，所述2A多肽选自T2A和E2A多肽。在进一步的实施方案中，在CAR多肽的胞内区（例如CD3ζ胞浆功能区）和IL-7之间存在T2A多肽氨基酸序列，和/或在IL-7和XCL1之间存在E2A多肽氨基酸序列。优选地，所述T2A的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：15所示氨基酸序列组成，和/或所述E2A的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：16所示氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的重组核酸分子，从5’至3’方向，其包含编码靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、CD137胞浆功能区、CD3ζ胞浆功能区、T2A肽、IL-7、E2A肽和XCL1的核苷酸序列。任选地，所述重组核酸分子还包含编码信号肽的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的编码CAR多肽的重组核酸分子包括编码位于跨膜部分和胞内结构域之间的接头结构域的接头序列，如GGCGG（SEQ ID NO：29）或GGG。

在一个实施方案中，所述重组核酸分子，其自5’至3’包含编码如下的核苷酸序列：

（1）靶向CEA的scFv，其由VL-接头-VH组成，其中所述VL包含或由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成，所述VH包含或由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成；优选地，所述scFv包含或由SEQ ID NO：20组成；

（2）CD8分子跨膜部分，

（3）CD137胞浆功能区、CD3ζ胞浆功能区、T2A、IL-7、E2A和XCL1。

在一个实施方案中，所述重组核酸分子包含或由SEQ ID NO：18所示的序列组成。

本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子的多核苷酸序列，其是例如但不限于表达载体如杆状病毒表达载体、质粒、病毒载体如慢病毒或逆转录病毒载体、细菌载体、原生动物载体、昆虫载体、酵母载体、哺乳动物细胞载体。

所述载体可包括调控所述编码融合蛋白的核酸表达的调控序列，例如启动子、增强子等。所述启动子可以是在哺乳动物细胞中有功能的任何启动子，例如包括但不限于T7、CMV启动子等。

制备和/或施用载体或重组体或质粒的方法以体内或体外表达本发明的重组核酸的方法可以是任何所需的方法。如本文所用，“表达载体”是重组或者合成产生的核酸构建体，其具有一系列指定核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录，例如，表达载体除了编码要表达的核酸序列以外还可包括衍生自与用于表达的宿主相容的复制和控制序列例如增强子序列、稳定序列和允许蛋白质分泌的信号序列以及赋予转染的细胞可选择表型的选择标记。本发明CAR重组基因可以被掺入质粒、病毒例如慢病毒或逆转录病毒载体中。本发明的载体可以是慢病毒质粒载体，如pLent-EF1a，也可以是慢病毒载体。

依据本发明，可以进行使用能够表达本发明所述多肽的任何载体。在某些实施方案中，本发明的多肽可以在体外（如使用无细胞的表达系统）和/或在体外生长的培养细胞中表达。对于这样的应用，可使用任何允许在体外和/或在培养的细胞内表达多肽的载体。

本发明还提供了一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括用表达本发明所述的CAR多肽的载体转化T细胞，从而使得转化的T细胞表达所述CAR多肽。

在一个实施方案中，所述方法包括将T淋巴细胞用本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体转化。

术语“转化”是指将核酸分子或蛋白质导入细胞的方法。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸导入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。非病毒转化方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为将核酸分子导入细胞的输送系统的任何合适方法。举例的非病毒转化方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核染、超声处理、通过热休克转染、磁转染和电穿孔。在一些实施方案中，核酸分子根据本领域公知的标准程序用电穿孔导入细胞中。对于基于病毒的转化方法，在本文所述方法中可以使用任何有用的病毒载体。病毒载体的例子包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，核酸分子根据本领域公知的标准程序用逆转录病毒载体导入细胞中。用载体转化细胞的方法是本领域熟知的，例如可参见Sambrook et al. Molecular Cloning: ALaboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N. Y. (2001))所述。术语“转化”还指将蛋白质从外部环境导入细胞中。典型地，蛋白质转化依赖于能穿过细胞膜的肽或蛋白质附着于感兴趣的蛋白质。

在一个实施方案中，转化的T淋巴细胞在体外扩增至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天。培养扩增T淋巴细胞的方法为本领域技术人员所熟知，例如参见Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28（Cat. Nos: 11131D,11132D和11161D, Life Technologies AS, Norway）。

本发明还提供了一种重组T淋巴细胞，其表达本发明所述的CAR多肽。

在一个实施方案，所述T淋巴细胞可以用本发明制备重组T淋巴细胞的方法获得，例如包括用本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体转化T淋巴细胞，以及任选在体外扩增，如前所述。

本发明还提供了一种用于治疗癌症的药物，其包含：本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞，任选包含药学可接受的运载体。

“药学可接受的运载体”是指有助于活性物质给予对象且对象吸收的物质，其可以包括在本发明组合物中而不引起患者的显著毒副作用。药学可接受的运载体的非限制性例子包括水、NaCl、生理盐水、蔗糖、葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香味剂、盐溶液、醇、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸脂、羟甲基纤维素、聚乙烯比咯烷酮和着色剂等。本领域技术人员理解其它药物载体可以用于本发明。

如果需要，所述药物可以存在于药盒、包装瓶或分配器中，其例如可包含一或多个单位剂量形式的本发明所述的重组核酸分子、重组载体和/或重组T淋巴细胞。所述药盒、包装或分配器可以附有给药说明书。

本发明还提供了一种治疗癌症的方法，包括给有需要的对象施用本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞。

本文所用的术语“治疗”指缓解癌症的至少一种症状。该术语包括向对象给药和/或应用一种或多种本文所述重组核酸、载体或T细胞和/或包括其的药物以提供癌症的管理或治疗。用于本公开目的的“治疗”可以但不必须提供治愈；而是指，“治疗”可以是病症的管理形式。如本文所用，“治疗”患有癌症的对象是指对象的癌症部分或完全消除，或者在治疗后保持稳定不再进展。治疗包括预防、治疗和/或治愈。预防是指防止潜在癌症发生和/或防止癌症恶化或癌症的进展，防止癌症发生包括减轻或消除导致癌症发生的一或多种风险因子；因为通常不能确定癌症是否从未发生，因此防止还包括降低发生或患有癌症的风险。当本文用于处理有害的增殖细胞(包括癌)时，“治疗”包括部分或完全破坏所述有害的增殖细胞，但对正常细胞的破坏影响最小。

在一个实施方案中，施用所述重组T细胞诱导了针对癌症的免疫应答。术语“诱导免疫应答”涵盖了提供保护性免疫性和/或接种对象的预防目的，以及在有需要的对象中引起希望的免疫应答或治疗目的。

本文所述“患者”或者“有需要的对象”是指患有或者易于患有可以通过给予本文提供的组合物或药物组合物治疗的疾病或病症的生物体。非限制性例子包括人、其它哺乳动物例如牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者或对象是人。

如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指至少足以在对象中产生治疗作用的剂量配制品中的药剂、化合物、材料的量。精确量取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术确定（参见例如Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of PharmaceuticalCompounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999);和Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed.,Lippincott, Williams & Wilkins)。

如本文所用，术语“施用”是指通过任何合适途径给予，包括例如静脉内、小动脉内、心室内和淋巴组织内等。

在一些实施方案中，所述方法包括给患者多次施用所述T淋巴细胞。施用的剂量和间隔时间使得T细胞在体内持续存在并杀伤癌细胞，而且输注后的细胞因子风暴表现轻微。

在一些实施方案中，所述方法包括给患者施用2次、3次、4次或更多次所述T淋巴细胞，其中每次施用可以间隔合适的时间，例如7-60天，如约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40或约50天。

在一些实施方案中，每次施用的T淋巴细胞剂量为1×10⁵细胞/kg体重-1×10⁸细胞/kg体重，例如约5×10⁵细胞/kg体重、约1×10⁶细胞/kg体重、约5×10⁶细胞/kg体重、约1×10⁷细胞/kg体重、约5×10⁷细胞/kg体重。

在一些实施方案中，本发明所述T淋巴细胞是自体T淋巴细胞。

在一些实施方案中，本发明所述T淋巴细胞是异体T淋巴细胞。

在一个实施方案中，本发明所述治疗对象中癌症的方法包括如下步骤：

(i) 获得对象的T淋巴细胞；

(ii) 用本发明的本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体转化步骤(i)的T淋巴细胞，任选扩增转化的T淋巴细胞，例如至少7-14天，例如至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天或至少14天；以及

(iii) 将步骤(ii)获得的转化的、任选扩增的T淋巴细胞施用给对象，任选多次施用给患者，每次间隔例如7-30天，每次剂量例如为约1×10⁶细胞/kg体重。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体在制备重组T淋巴细胞中的应用。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用。

本发明还提供了本发明所述的编码CAR多肽的重组核酸分子、和/或本发明所述的包含编码CAR多肽的多核苷酸序列的重组载体和/或本发明所述的表达所述CAR多肽的重组T细胞用于治疗癌症。

在本发明中，所述癌症是CEA阳性癌症，例如选自结直肠癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肝癌、肺癌、卵巢癌。在一个实施方案中，所述癌症是结直肠癌。

如本文所用，“任选存在的”或“任选”意味着随后描述的事件或情况发生或不发生，以及所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社) 或者按照产品说明书进行。

实施例1：质粒的构建

1. 表达CEA scFv质粒的设计和构建

将抗人CEA抗体的轻链可变区（VL，SEQ ID NO：2）和重链可变区（VH，SEQ ID NO：3）序列通过接头(G₄S)₃：GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO：19）连接形成scFv序列，即CEA scFv(VL-(G₄S)₃-VH)（SEQ ID NO：20）和CEA scFv (VH-(G₄S)₃-VL)（SEQ ID NO：21），以pFUSE-hIgG1-Fc2（购于武汉淼灵生物科技有限公司）为载体，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，最终获得质粒pFUSE-CEA scFv(VL-VH)-hIgG1-Fc2和pFUSE-CEA scFv(VH-VL)-hIgG1-Fc2。

2. 表达CEA CAR质粒的设计和构建

以如下从CAR结构的5’LTR→3’LTR方向，构建CAR：人CD8信号肽（SEQ ID NO：1），CEA抗体的VL序列（SEQ ID NO：2），(G₄S)₃（SEQ ID NO：19），CEA抗体的VH序列（SEQ ID NO：3），人CD8跨膜区（SEQ ID NO：23），人CD137（SEQ ID NO：6）和人CD3ζ（SEQ ID NO：8）。表达载体为MSGV1（Addgene）。该质粒称为pMSGV-CEA CAR质粒，交由南京巴傲得生物科技有限公司合成。

3. 设计和构建7×1 CEA CAR质粒

在上述pMSGV-CEA CAR质粒的基础上，通过T2A和E2A肽链接IL-7和XCL1，构建表达IL-7和XCL1的pMSGV-7×1 CEA CAR质粒。从CAR结构的5’LTR→3’LTR方向，该CAR包含：人CD8信号肽（SEQ ID NO：1），CEA抗体的VL序列（SEQ ID NO：2），(G₄S)₃（SEQ ID NO：19），CEA抗体的VH序列（SEQ ID NO：3），人CD8跨膜区（SEQ ID NO：23），人CD137（SEQ ID NO：6），人CD3ζ（SEQ ID NO：8），T2A（SEQ ID NO：15），IL-7（SEQ ID NO：11），E2A（SEQ ID NO：16）和XCL1（SEQ ID NO：13）。将设计好的质粒，送至南京巴傲得生物科技有限公司合成。

结果：通过RaptorX网站和PyMOL软件对CEA CAR和7×1 CEA CAR进行空间结构预测，没有观察到CEA CAR或7×1 CEA CAR的氨基酸序列对CAR的抗原识别位点产生空间位阻情况（图5B和5C）。基于以上结果，合成了表达CEA CAR和7×1 CEA CAR的逆转录病毒载体，载体图谱见图5D和5E。

实施例2：细胞系的构建

1. 构建表达CEA scFv的293T细胞

按照Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）的操作说明书，分别加入pFUSE-CEAscFv(VL-VH)-hIgG1-Fc2或pFUSE-CEA scFv(VH-VL)-hIgG1-Fc2质粒转染293T细胞，培养72h后，更换含400μg/ml博来霉素（Zeocin，Invitrogen）的完全培养基，筛选获得稳定表达CEA scFv的293T细胞。

2. 构建细胞膜表面高表达人CEA抗原的CT26细胞（CT26.hCEA）

按照Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）的操作说明书，加入pCMV3-CEACAM5质粒（表达人CEA抗原，北京义翘神州生物技术有限公司）转染CT26细胞（购自ATCC），转染后每1-2天传代，72h后更换含100μg/ml 潮霉素B的完全培养基，筛选获得稳定表达CEA scFv的293T细胞。约2-3周，使用流式细胞术检测CT26细胞膜表面CEA表达情况。

结果：通过流式检测发现转染pCMV3-CEACAM5质粒（图13A）的CT26细胞（CT26.hCEA）细胞膜表面高表达CEA，但CT26细胞和CT26.CL25均不表达CEA（图13B）。由此构建获得细胞膜表面高表达人CEA抗原的CT26细胞，CT26.hCEA。

实施例3：CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体亲和性检测

将实施例2.1获得的表达CEA scFv（VL-VH）或CEA scFv（VL-VH）的293T细胞培养上清，根据厂商说明书使用Gravity flow Protein A Agarose Column–0.5mL抗体纯化柱（购自IBA Lifesciences GmbH）纯化抗体，测定抗体浓度，4℃暂存。

使用ELISA方法检测单链抗体的亲和性。在96孔酶标板中包被CEA抗原（购自北京义翘神州科技有限公司），2μg/ml，100μl/孔，4℃湿盒中过夜。洗板3次后，加入3%BSA室温封闭2h。洗板3次后，分别加入上述纯化后的CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体，100μl/孔，每组3个复孔，室温孵育2h。抗体浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25 μg/ml。洗板3次后，加入羊抗人IgG/HRP工作液（Bioss），100μl/孔，室温避光孵育45min。洗板5次后，加入TMB显色液，50μl/孔，待各组颜色呈明显梯度增加后，终止显色，并读取OD450-OD630，统计分析。

结果：如图2所示，scFv对CEA具有较强的识别和结合能力和良好的靶向CEA特异性。为评价CEA scFv在VL-VH和VH-VL 2种不同组合模式下对CEA的亲和力，设计了表达CEAVL-VH和CEA VH-VL单链抗体的2种质粒（图3A）。为了便于后续的检测，同时在2种质粒后面融合表达hIgG1-Fc标签(25.6kDa)。通过RaptorX网站和PyMOL软件对hIgG1-Fc标签与CEAscFv空间结构的分析发现，hIgG1-Fc标签在空间结构上并没有对CEA scFv产生空间位阻情况（图3B和5C）。基于以上结果，合成了表达CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体的2种质粒，质粒图谱见图3D和3E。

为了获得CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体，将表达CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体的2种质粒转染293T细胞，分别收集含有2种单链抗体的72h细胞培养上清，获得CEA VL-VH和CEA VH-VL单链抗体（图4A）。通过ELISA检测2种单链抗体在相同浓度下对CEA的亲和力，结果显示CEA scFv在VL-VH结构形式时对CEA的亲和力较强（图4B）。

实施例4：CAR逆转录病毒的包装

将293T细胞用DMEM+10%FBS完全培养基于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养呈对数生长、融合度达80%左右。将14µg CEA CAR载体质粒、10µg pCL-Eco（购自南京PPL质粒与蛋白共享库）和10µg pMD2.G（购自南京PPL质粒与蛋白共享库）包装质粒加入500µl OPTI-MEM内混匀（CEA CAR质粒混合物）。将16µg 7×1 CEA CAR载体质粒、10µg pCL-Eco和10µgpMD2.G包装质粒加入500µl OPTI-MEM内混匀（7×1 CEA CAR质粒混合物）。取144µlLipofectamine 2000（按照DNA(µg):Lip2000(µl)=1:2）加入1000µl OPTI-MEM内混匀，室温静置5 min。吸取570µl Lipofectamine 2000和Opti-MEM混合物缓慢分别加入CEA CAR质粒混合物和7×1 CEA CAR质粒混合物中，轻轻混匀，室温静置20 min。取2支15ml离心管，分别加入9ml DMEM+10% FBS完全培养基，将CEA CAR混合液和7×1 CEA CAR混合液分别加入对应15ml离心管中。吸弃293T细胞培养皿中的培养基，分别加入CEA CAR和7×1 CEA CAR混合液。收集48h和72h的CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒上清，0.45μm过滤后冻存于-80℃冰箱。

实施例5：CAR逆转录病毒感染效率

1. CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒感染Jurkat细胞

使用RetroNectin（Takara）包被24孔细胞培养板，15μg/ml，0.5ml/孔，4℃过夜。收集Jurkat细胞（购自ATCC），分别用293T细胞培养上清、CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒原液重悬细胞至5×10⁵/ml，接种到包被有RetroNectin（Takara）的24孔细胞培养板内，1ml/孔。培养72h后流式检测CAR的表达情况。

2. CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒感染小鼠T淋巴细胞

小鼠T淋巴细胞的分离与活化：无菌条件下分离6周龄雌性BALB/c小鼠的脾脏组织，在70μm细胞滤网（BD Falcon）上研磨并收集滤过的细胞，4℃、500g离心5min，弃上清；使用ACK裂解红细胞，洗涤2次。加入1ml MACS洗液（Miltenyi Biotec）重悬细胞，用70μm滤网过滤细胞悬液并计数。参照小鼠T淋巴细胞分离试剂盒（Pan T Cell Isolation Kit IImouse，购自Miltenyi Biotec）的操作说明，使用磁珠分选的方法分离小鼠T淋巴细胞，并进行细胞计数。取9×10⁶分选获得的CD3⁺ T细胞，4℃，300g离心10min，弃上清，加入含有40IU/ml 人IL-2（北京义翘神州生物技术有限公司）的RPMI-1640+10%FBS+1%PS完全培养基，调整细胞浓度为1×10⁶/ml。按照Dynabeads™ Mouse T-Activator CD3/CD28 for T-CellExpansion and Activation（Thermo Fisher）说明书所述活化T细胞，并接种在24孔细胞培养板中，1×10⁶/ml，1ml/孔；在细胞培养箱培养48h。

CAR逆转录病毒感染活化后的T细胞：取出包被RetroNectin的24孔板洗1遍，加入含2%BSA的PBS室温封闭30min。收集活化48h后的T细胞，3×10⁶ T细胞/组，4℃、300g离心10min，弃上清；分别用3ml 293T细胞培养上清、CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒原液重悬细胞，分别加入包被RetroNectin的24孔板对应孔位中。密封，32℃、2000g离心120min。离心后，弃上清，每孔加入1ml室温含40 IU/ml hIL-2的完全培养基，37℃，5% CO₂细胞培养箱培养72h。流式上机检测CAR表达情况。

细胞计数板计数法检测CAR-T细胞体外增殖情况：收集感染CAR逆转录病毒48h后的各组T细胞，计数，分别取2.1×10⁶ Un-T细胞（源自小鼠脾脏细胞的原代细胞）、CEA CAR-T和7×1 CEA CAR-T细胞，用含40IU/ml hIL-2的完全培养基重悬细胞调整细胞浓度0.7×10⁶/ml，1ml/孔，每组3孔，置于37℃、5% CO₂细胞培养箱培养24h。使用台盼蓝染色进行细胞计数。细胞计数公式为：细胞密度（单位：个/ml）=10⁴×稀释倍数×细胞总数÷4。

结果：为了验证2种CAR逆转录病毒的感染效率，选择Jurkat细胞作为靶细胞。CAR逆转录病毒感染Jurkat细胞72h后，显微镜下观察到CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒感染后的Jurkat细胞生长状态良好，未观察到细胞形态变化或细胞死亡现象的发生（图6A），显示其良好的安全性。此外，流式结果显示在CEA CAR-Jurkat细胞和7×1 CEA CAR-Jurkat细胞膜表面检测到CAR的高表达（图6B），以上结果说明2种CAR逆转录病毒对悬浮细胞具有良好的感染效率和安全性。

小鼠T淋巴细胞活化48h后显微镜下观察可见：相比活化前，活化后的T细胞体积变大，数量增加，并出现“分叶”状细胞形态（图7A），说明T细胞处于良好的活化状态。病毒感染后72h，各组T细胞生长状态良好，无明显差异（图7B），说明CEA CAR和7×1 CEA CAR逆转录病毒对小鼠T细胞具有良好的安全性。流式分析显示CEA CAR-T细胞CAR阳性率为84.60%，7×1 CEA CAR-T细胞CAR阳性率为78.50%，两者无明显差异（图7C），说明CEA CAR和7×1 CEACAR逆转录病毒对小鼠T细胞具有良好的感染能力和安全性。此外，在CAR的设计中引入IL-7和XCL1，对CAR逆转录病毒的感染效率及CAR的表达并无显著抑制作用。

通过细胞计数的方法检测3种T细胞体外扩增情况，结果显示7×1 CEA CAR-T细胞体外增殖明显优于Un-T细胞（P<0.001）和CEA CAR-T细胞（P<0.0001），此外，CEA CAR-T细胞和Un-T细胞之间的增殖无明显差异（P＞0.05）（图10），说明7×1 CEA CAR-T细胞分泌的IL-7能够显著改善7×1 CEA CAR-T细胞的增殖能力。

实施例6：ELISA检测CAR-T细胞分泌IL-7和XCL1的情况

病毒感染T细胞后24h、48h和72h，留取Un-T细胞、CEA CAR-T细胞和7×1 CEA CAR-T细胞培养上清，通过ELISA检测3种T细胞培养上清中IL-7和XCL1的浓度。具体操作：ELISA板中，分别包被Rabbit Anti-Human IL-7(IL-7, 1μg/ml, PeproTech)或Rabbit Anti-Human Lymphotactin (XCL1, 2μg/ml, PeproTech），100μl/孔，4℃孵育过夜。洗板3次，每孔加入200μl封闭液，室温封闭1h。洗板3次，每孔分别加入100μl对应待测样品和标准品，室温孵育2h。洗板3次，每孔分别加入100μl 0.5μg/ml的Biotinylated Rabbit Anti-HumanIL-7和1μg/ml的Biotinylated Rabbit Anti-Human Lymphotactin检测抗体，室温孵育1.5h。洗板3次，每孔加入100μl Avidin-HRP，室温孵育30-45min。洗板6次，每孔加入50μlTMB，室温显色约5min，标准品颜色呈梯度变化时，每孔加入50μl终止液，终止显色，酶标仪读板OD450-630。

结果：7×1 CEA CAR-T细胞上清中有IL-7（图8A）和XCL1（图8B）产生，且随着时间增加，浓度逐渐增加。CEA CAR-T细胞上清中仅检测到产生少量XCL1，而Un-T细胞和CEACAR-T细胞培养上清中未检测到IL-7的表达。以上结果表明7×1 CEA CAR逆转录病毒感染小鼠T细胞，能高效表达IL-7和XCL1。

实施例7：流式细胞术检测CAR-T细胞表型特征

病毒感染T细胞后72h，分别取1×10⁶的Un-T细胞、CEA CAR-T细胞和7×1 CEACAR-T细胞进行细胞表面染色，用100μl FACS洗液重悬细胞，按照流式抗体说明书推荐用量加入适量流式抗体，混匀，4℃，避光孵育30min。流式上机检测，用FlowJo软件分析CD4和CD8T细胞的比例，以及PD-1、LAG3和TIM-3的表达情况。

结果：CEA CAR-T细胞和7×1 CEA CAR-T细胞中，CAR阳性的CD4+T细胞和CD8+T细胞占比无明显差异（图11）。7×1 CEA CAR-T细胞表面PD-1、LAG3和TIM-3等免疫检查点分子表达均低于CEA CAR-T细胞；7×1 CEA CAR-T细胞PD-1表达低于Un-T细胞，但LAG3和TIM-3高于Un-T细胞（图12）。

实施例8：流式细胞术检测CAR-T细胞功能特征

1. 流式细胞术检测CAR-T细胞IFN-γ表达情况

收集7×1 CEA CAR-T、CEA CAR-T和Un-T细胞以及CT26.hCEA细胞，调整细胞浓度1×10⁶/ml，将T细胞与CT26.hCEA按照等比例混合后，终体积1ml/孔；加入Brefeldin A培养5h；通过胞内染色，检测T细胞内IFN-γ表达情况。

结果显示在与CT26.hCEA细胞共培养过程中，Un-T细胞没有检测到IFN-γ的表达（图14A），CEA CAR-T细胞和7×1 CEA CAR-T细胞均检测到IFN-γ的表达（图14B和14C），但二者无明显差异。

2. CFSE/PI法检测CAR-T细胞对CEA阳性的肿瘤细胞的杀伤效果

取对数生长期的靶细胞，按照常规操作对其进行CFSE标记，CFSE标记浓度为2μM。标记后，加入完全培养基调整细胞密度至1×10⁵/ml。在流式管中，每孔加入100μl靶细胞。收集Un-T细胞，CEA CAR-T和7×1 CEA CAR-T细胞，按照效应细胞（T细胞）:靶细胞的比例分别为20:1, 10:1, 5:1, 2.5:1, 1.25:1调整细胞浓度，加入对应的含有靶细胞的流式管中，终体积为200μl。37℃细胞培养箱中共孵育4h；同时设置靶细胞自然死亡对照管。上机前，每管加入10μl 0.01 mg/ml PI工作液，5min后流式细胞仪上机检测。

为了验证游离CEA是否影响CAR-T细胞体外杀伤功能，取CFSE标记的CT26.hCEA细胞，调整细胞密度为1×10⁵/ml，100μl/孔；分别加入0ng/ml、5ng/ml和500ng/ml CEA，混匀。按照效靶比为20：1加入CEA CAR-T细胞，每组3管，终体积为200μl。设置CT26.hCEA细胞自然死亡对照管。上机前，每管加入10μl 0.01 mg/ml PI工作液，5min后流式细胞仪上机检测。CAR-T细胞的细胞毒活性(%)=(实验组肿瘤靶细胞死亡率-肿瘤靶细胞自然死亡率)/(100-肿瘤靶细胞自然死亡率)×100。

结果：7×1 CEA CAR-T和CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA杀伤效果无明显差异，且随着效靶比的增加，对靶细胞的杀伤效果越显著，而Un-T细胞对CT26.hCEA细胞随着效靶比的增加，对靶细胞的杀伤效果并无显著性变化（图15A）。但7×1 CEA CAR-T、CEA CAR-T和Un-T细胞对CT26细胞（图15B）或CT26.CL25细胞（图15C）均无明显的杀伤效果，且无明显差异。说明7×1 CEA CAR-T细胞和CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA细胞杀伤作用是特异性的，与CT26细胞自然肿瘤细胞属性无显著关系，而是通过CAR-T细胞的识别CT26.hCEA细胞膜细胞表面CEA而发挥的杀伤作用。

理论上，将CEA CAR-T细胞输入到血清CEA阳性的CRC患者体内后，血清游离的CEA会与CEA CAR-T细胞表面的CEA scFv结合，阻断其与CEA阳性肿瘤细胞结合，进而抑制CEACAR-T细胞对CEA阳性肿瘤细胞的杀伤。正常人体内血清CEA≤5ng/ml，CRC患者血清CEA普遍在500ng/ml以下。本研究设置了3个CEA浓度：0ng/ml、5ng/ml和500ng/ml，来模拟CEA CAR-T回输到体内后，血清游离CEA对CEA CAR-T细胞杀伤CT26.hCEA细胞功能的影响。结果发现这3种不同CEA浓度下，CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA细胞的杀伤效果无显著差异（P＞0.05）（图16）。说明游离的CEA并不能抑制CEA CAR-T细胞对CT26.hCEA细胞的杀伤。

实施例9：趋化实验

无菌分离单个淋巴细胞：分离淋巴结组织并剔除脂肪组织。将淋巴结转入胶原酶D消化液中，用注射器针头充分撕碎组织，37℃消化25min，加入EDTA至终浓度10mM，继续消化5min。将组织转移到70μm滤网上轻柔研磨，收集滤出液，500g、4℃离心5min，弃上清。加入适量RPMI-1640培养基重悬细胞并计数。取1×10⁷细胞，500g、4℃离心5min后弃上清，加入1mlRPMI-1640完全培养基重悬细胞，细胞浓度1×10⁷/ml。选取7×1 CEA CAR-T细胞72h的培养上清（XCL1的浓度为4500pg/ml）、CEA CAR-T细胞和Un-T细胞72h的培养上清，体外检测XCL1对CD141⁺ DCs的趋化作用。分别吸取600μl 7×1 CEA CAR-T、CEA CAR-T和Un-T细胞72h培养上清，加入transwell下室，将transwell小室放入孔内，再吸取100μl淋巴细胞悬液加入上室，同时设置XCL1（100ng/ml）阳性对照组和RPMI-1640完全培养基阴性对照组，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养2h。流式检测下室中CD141⁺ DC细胞的数目，计算相对于培养基组，各细胞培养上清的趋化效果。

结果：与CEA CAR-T和Un-T细胞培养上清相比，7×1 CEA CAR-T细胞的培养上清趋化更多CD141⁺ DCs（图9），表明7×1 CEA CAR-T细胞能表达XCL1，且对CD141⁺ DC细胞具有显著的趋化效果。

实施例10：动物实验分析7×1 CEA CAR-T细胞的抗肿瘤效果

在CT26.hCEA细胞移植瘤小鼠模型中，分析7×1 CEA CAR-T细胞对CEA阳性荷瘤小鼠的抗肿瘤作用。选取6周龄雌性BALB/c小鼠（北京华阜康生物科技股份有限公司，体重约16-18克），腹腔注射三溴乙醇麻醉后，3Gy全身照射清除淋巴细胞。照射后第1天，右侧后背部皮下接种CT26.hCEA细胞，2×10⁶/ml，100μl/只。待皮下出现肉眼可见肿瘤时，将小鼠随机分为3组，3-5只/组。分别在照射后第7天和第9天时，通过尾静脉注射回输Un-T、CEA CAR-T或7×1 CEA CAR-T细胞，2×10⁶/只。每隔2-3天测量肿瘤体积，计算相对于第7天时肿瘤体积变化倍数。第28天处死小鼠。肿瘤体积（mm³）=肿瘤长径×肿瘤短径×肿瘤短径÷2。

结果：与Un-T细胞治疗组相比，7×1 CEA CAR-T和CEA CAR-T显著降低肿瘤生长速度，且7×1 CEA CAR-T细胞治疗能更好的控制肿瘤生长（图17）。

实施例11：分析7×1 CEA CAR-T细胞治疗的T细胞抗原识别表位扩展情况

为模拟体内CRC肿瘤的异质性，按照3：1的比例，将4×10⁵ CT26.hCEA细胞和CT26.CL25（表达β-gal抗原）细胞混悬液荷瘤至小鼠右侧皮下，建立荷瘤小鼠动物模型照射后第7天，尾静脉注射回输Un-T、CEA CAR-T或7×1 CEA CAR-T细胞，第19天处死小鼠分离脾脏组织（图18A）。无菌条件下分离小鼠脾脏单个细胞，使用ACK裂解红细胞，按照常规操作进行CFSE染色标记T细胞，调整细胞密度1×10⁶/ml，100μl/孔接种于圆底96孔板中，再分别加入100 μl浓度为2μg/ml的β-gal或OVA抗原（抗原终浓度均为1μg/ml），OVA作为无关对照。每组设置3个复孔，置于37℃，5% CO₂细胞培养箱培养72h。流式上机检测T细胞增殖情况。

结果：与无关抗原OVA刺激组相比，Un-T和CEA CAR-T细胞组β-gal特异性T细胞无显著性增殖（图18B，C），而7×1 CEA CAR-T细胞组β-gal刺激后的小鼠T细胞增殖百分比显著性高于OVA刺激后的小鼠T细胞（图18D）。7×1 CEA CAR-T细胞组β-gal特异性T细胞显著高于Un-T细胞组和CEA CAR-T细胞组（图18E，F）。

CAR-T治疗实体瘤所选择的靶点都是TAA，不仅在肿瘤细胞膜表面表达，同时也在正常组织细胞膜表面表达。CAR-T治疗导致的脱靶效应引起的对正常组织的损伤，严重限制了CAR-T治疗在实体瘤中的应用。在一项临床I期CAR-T治疗CRC研究中，CAR-T细胞识别正常结肠组织抗原，导致治疗的CRC出现严重的结肠炎不良反应(Parkhurst et al., ‘T cellstargeting carcinoembryonic antigen can mediate regression of metastaticcolorectal cancer but induce severe transient colitis’, Mol Ther., Vol. 19,No. 3, 2011, pp.620-626)。为了进一步评价7×1 CEA CAR-T细胞在体内的安全性，在荷瘤小鼠接受CAR-T细胞回输的第12天分析各组小鼠重要器官和消化道组织的组织病理情况。H＆E染色结果显示在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏重要组织中没有观察到明显的炎症浸润（图19A），说明7×1 CEA CAR-T细胞治疗对重要器官具有良好的安全性。在正常人群中，CEA主要表达于成年人的消化道组织细胞。为了进一步观察7×1 CEA CAR-T细胞治疗是否对消化道组织存在细胞毒性反应，通过病理切片和H＆E染色，在食道、胃、小肠和结肠中没有观察到明显的炎症浸润（图19B），进一步说明了7×1 CEA CAR-T细胞治疗CEA阳性CRC的安全性。

不受任何理论约束，上述结果说明7×1 CEA CAR-T细胞特异性杀伤CT26.hCEA细胞释放的“TAA”，被7×1 CEA CAR-T分泌的XCL1趋化而来的CD8α⁺ cDC1s摄取后，诱导体内产生针对这部分“TAA”的特异性T细胞，进而杀伤同样表达这部分“TAA”的CT26.CL25。CT26.CL25细胞裂解死亡释放β-gal抗原，被XCL1趋化而来的CD8α⁺ DCs摄取，进一步诱导体内产生针对β-gal特异性T细胞应答，起到一种级联放大的抗肿瘤特异性T细胞反应（图20）。

将治疗后的荷瘤小鼠体内产生针对β-gal特异性T细胞水平，作为评价CAR-T细胞治疗是否诱导产生疫苗效应的标准，通过体外β-gal刺激小鼠脾脏T细胞，分析β-gal特异性T细胞的增殖情况，以此来评价7×1 CEA CAR-T细胞在特异性杀伤肿瘤细胞的同时，是否起到了一种肿瘤疫苗的效应。然而，7×1 CEA CAR-T细胞治疗所诱导的疫苗效应，诱导体内产生针对这部分“TAA”的T细胞表位扩展，此外在正常消化道细胞中CEA呈低表达水平(Parkhurst et al., ‘T cells targeting carcinoembryonic antigen can mediateregression of metastatic colorectal cancer but induce severe transientcolitis’, Mol Ther., Vol. 19, No. 3, 2011, pp.620-626)。综合这些因素，7×1 CEACAR-T细胞治疗可能对正常组织器官产生脱靶毒性。为了观察7×1 CEA CAR-T细胞治疗，是否对肿瘤异质性荷瘤小鼠重要器官和消化道组织产生脱靶毒性，在CAR-T细胞治疗后的第12天对重要器官和消化道组织进行H＆E染色，在这些组织中未发现明显的炎症浸润，表明7×1 CEA CAR-T细胞治疗具有良好的安全性。

本申请所得数据均采用Graphpad Prism 8进行统计分析并做图。实验数据呈正态分布，方差齐，采用双尾、非配对T检验，细胞计数结果表示为均数±标准差(means±SEM)。细胞因子分泌水平检测结果采用T检验法。所有实验统计结果以P<0.05判定为有显著性统计学差异，且P<0.05标记为*，P<0.01标记为**，P<0.001标记为***。

序列信息：

SEQ ID NO：1，信号肽氨基酸序列

MALPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID NO：2，VL氨基酸序列

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWVYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNNNPYTFGGGTKVEI

SEQ ID NO：3，VH氨基酸序列

QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKHYYMHWVKQRPEQGLEWIGWINPENVDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNHYRYAGGGALDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：4，CEA VL-(G4S)3-VH-hCD8 hinge-hIgG FC氨基酸序列

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWVYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNNNPYTFGGGTKVEIGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKHYYMHWVKQRPEQGLEWIGWINPENVDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNHYRYAGGGALDYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：5，CEA VH-(G4S)3-VL-hCD8 hinge- hIgG FC氨基酸序列

QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKHYYMHWVKQRPEQGLEWIGWINPENVDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNHYRYAGGGALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWVYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNNNPYTFGGGTKVEITTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO：6，CD137胞内区氨基酸序列

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO：7，CD137胞内区核酸序列

aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg

SEQ ID NO：8，CD3zeta胞内区氨基酸序列

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO：9，CD3zeta胞内区核酸序列

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc

SEQ ID NO：10，IL-7最小氨基酸序列

DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

SEQ ID NO：11，IL-7氨基酸序列

MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH

SEQ ID NO：12，XCL1最小氨基酸序列

VGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG

SEQ ID NO：13，XCL1氨基酸序列

MRLLILALLGICSLTAYIVEGVGSEVSDKRTCVSLTTQRLPVSRIKTYTITEGSLRAVIFITKRGLKVCADPQATWVRDVVRSMDRKSNTRNNMIQTKPTGTQQSTNTAVTLTG

SEQ ID NO：18，CEA ScFv-CD8-CD137-CD3-T2A-IL-7-E2A-XCL1-TAG核酸序列

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatgacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatacactggtatcagcagaagtcaggcacctcccccaaaagatgggtttatgacacatccaaactggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacctcttactctctcacaatcagcaccatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggaataataacccatacacgttcggaggggggaccaaggtggagatcggcggcggaggaagcggaggcggaggatctgggggaggcggaagccaggtccaactgcagcagtctggggcagagcttgtgaggtcaggggcctcagtcaagttgtcctgcacagcttctggcttcaacattaaacactactatatgcactgggtgaaacagaggcctgaacagggcctggagtggattggatggattaatcctgagaatgttgatactgaatatgcccccaagttccagggcaaggccactatgactgcagacacatcctccaacacagcctacctgcagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgtaatcactataggtacgccggagggggtgctttggactactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcgagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcccggacccatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacttcgaacagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaatcccgggcccatgagacttctcatcctggccctccttggcatctgctctctcactgcatacattgtggaaggtgtagggagtgaagtctcagataagaggacctgtgtgagcctcactacccagcgactgccggttagcagaatcaagacctacaccatcacggaaggctccttgagagcagtaatttttattaccaaacgtggcctaaaagtctgtgctgatccacaagccacatgggtgagagacgtggtcaggagcatggacaggaaatccaacaccagaaataacatgatccagaccaagccaacaggaacccagcaatcgaccaatacagctgtgactctgactggctag

SEQ ID NO：20，scFv (VL-(G4S)3-VH)氨基酸序列

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWVYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNNNPYTFGGGTKVEIGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKHYYMHWVKQRPEQGLEWIGWINPENVDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNHYRYAGGGALDYWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO：21，scFv (VH-(G4S)3-VL)氨基酸序列

QVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKHYYMHWVKQRPEQGLEWIGWINPENVDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNHYRYAGGGALDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSGTSPKRWVYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCQQWNNNPYTFGGGTKVEI

SEQ ID NO：22，pFUSE-CEA scFv-hIgG1-Fc2中的CD8跨膜区氨基酸序列

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDRS

SEQ ID NO：23，pMSGV-7x1 CEA CAR 或pMSGV-CEA CAR中的CD8跨膜区氨基酸序列

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

SEQ ID NO：24，pFUSE-CEA scFv-hIgG1-Fc2中的CD8跨膜区核酸序列

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatagatct

SEQ ID NO：25，pMSGV-7x1 CEA或CAR pMSGV-CEA CAR中的CD8跨膜区核酸序列

accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc

SEQ ID NO：30，hIgG FC氨基酸序列

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

Claims (14)

1.一种分离的重组核酸分子，其编码嵌合抗原受体（CAR）多肽，所述CAR多肽包含：

（i）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、白介素-7（IL-7）、第二2A肽和结合趋化因子受体1（XCR1）的淋巴细胞趋化因子（XCL1），或者

（ii）靶向癌胚抗原（CEA）的单链抗体（scFv）、跨膜部分、以任意顺序连接的CD137胞浆功能区和CD3ζ胞浆功能区、第一2A肽、XCL1多肽、第二2A肽和IL-7，

其中所述第一2A肽和第二2A肽是相同或不同的。

2.权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述单链抗体（scFv）的轻链可变区（VL）包含或由SEQ ID NO：2所示氨基酸序列组成，并且重链可变区（VH）包含或由SEQ ID NO：3所示氨基酸序列组成。

3.权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述重组核酸分子还包含编码连接scFv和跨膜部分的间隔子区，和/或编码信号肽的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的重组核酸分子，其中：

所述scFv由SEQ ID NO：20或21组成；和/或

所述跨膜部分包含选自CD30分子的跨膜部分、CD8分子的跨膜部分、CD28分子的跨膜部分、41BB分子的跨膜部分或CD3ζ分子的跨膜部分，例如包含或由SEQ ID NO：22或23所示氨基酸序列组成；和/或

所述间隔子区的氨基酸序列包含或由选自SEQ ID NO：28-30和SEQ ID NO：4的第241-287位氨基酸的氨基酸序列组成；和/或

所述CD137胞浆功能区的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：6组成；和/或

所述CD3ζ胞浆功能区的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：8组成；和/或

所述第一2A肽和第二2A肽独立选自F2A、T2A、E2A和P2A肽，例如独立选自SEQ ID NO：14-17，例如包含或由SEQ ID NO：15或16组成；和/或

所述第一2A肽或第二2A肽在N端包含GSG序列；和/或

所述IL-7的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：10或11组成，包含或由与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且具有IL-7分子功能活性的多肽组成，或包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列并且与SEQ ID NO：11具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且具有IL-7分子功能活性；和/或

所述XCL1的氨基酸序列包含或由SEQ ID NO：12或13组成，包含或由与SEQ ID NO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且特异性结合XCR1的多肽组成，或包含SEQ ID NO：12所示氨基酸序列并且与SEQ IDNO：13具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更高序列相同性并且特异性结合XCR1。

5.权利要求1-4任一项所述的重组核酸分子，其包含或由SEQ ID NO：18所示的序列组成。

6.一种重组载体，其包含权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子的核苷酸序列。

7.一种制备重组T淋巴细胞的方法，包括将T淋巴细胞用权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子、或权利要求6所述的重组载体转化。

8.一种重组T淋巴细胞，其表达CAR多肽，其中CAR多肽如权利要求1-5中任一项所限定。

9.权利要求8所述的重组T淋巴细胞，其通过权利要求7的方法获得。

10.权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子、或权利要求6所述的重组载体在制备重组T淋巴细胞中的应用。

11.权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子、权利要求6所述的重组载体、或权利要求8或9所述的重组T淋巴细胞在制备用于治疗表达CEA的癌症的药物中的应用。

12.权利要求11所述的应用，其中所述癌症选自大肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌。

13.一种用于治疗表达CEA的癌症的药物，其包含：

权利要求1-5任一项所述的重组核酸分子、权利要求6所述的重组载体和/或权利要求8或9所述的重组T淋巴细胞，以及药学可接受的载体。

14.权利要求13所述的药物，其中所述癌症选自大肠癌、胰腺癌、宫颈癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌、肝癌、肺癌、卵巢癌和结直肠癌。