CN116536271A - 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用 - Google Patents

一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116536271A
CN116536271A CN202310350458.9A CN202310350458A CN116536271A CN 116536271 A CN116536271 A CN 116536271A CN 202310350458 A CN202310350458 A CN 202310350458A CN 116536271 A CN116536271 A CN 116536271A
Authority
CN
China
Prior art keywords
psma
cells
amino acid
acid sequence
immune cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310350458.9A
Other languages
English (en)
Inventor
李妮
刘谦
赵葵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Wishing Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Wishing Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Wishing Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Wishing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310350458.9A priority Critical patent/CN116536271A/zh
Publication of CN116536271A publication Critical patent/CN116536271A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001195—Prostate specific membrane antigen [PSMA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本发明属于药物制备技术领域，涉及一种基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其和雄激素受体抑制剂的应用。本发明所述基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞中嵌合抗原受体相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果。本发明所述基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞与雄激素受体抑制剂（如阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺）组合可用于治疗表达PSMA的实体肿瘤，克服CAR‑T在PSMA阳性实体肿瘤疗效的局限性，进一步扩大CAR‑T的治疗领域。

Description

一种基于PSMA的CAR基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受 体抑制剂的应用
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，具体涉及一种基于前列腺特异性膜抗原（Prostate specific membrane antigen，PSMA）的嵌合抗原受体（Chimeric antigenreceptor，CAR）基因修饰的免疫细胞及其和雄激素受体抑制剂在制备治疗PSMA表达阳性的疾病的药物中的应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法 （Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T）成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的单链片段可变 （Sing le cha in f ragmentvariable，scFv）区或对肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细胞效应物功能触发（例如CD3ζ）部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导的过继性免疫疗法允许CAR-T移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿瘤细胞上的TAA。
前列腺特异性膜抗原（Prostate specific membrane antigen，PSMA）是明确的、高限制性前列腺癌相关细胞膜抗原。PSMA在前列腺癌细胞中的表达比正常前列腺上皮表达高1000倍（Su等，Cancer Res.199544:1441-1443）。随着前列腺癌的进展，PSMA的表达也随之提高，并且在转移性疾病、激素难治性病症 和 高 级 病 变 中 达 到 最 高（Israeli等 Cancer Res.1994,54:1807-1811；Wright等，Urologic Oncology:Seminars andOriginal Investigations(《内分泌肿瘤学：研讨会和原始调查》)19951:18-28 ；Wright等，Urology199648:326-332；Sweat等，Urology199852:637-640）。且PSMA在去势抵抗性前列腺癌中显著过表达，其过表达与高肿瘤分级、疾病进展和复发、临床预后较差和患者生存期缩短相关。另外，PSMA在其它各种实体瘤的新血管系统中大量表达，该实体瘤包括膀胱癌、胰腺癌、黑素瘤、肺癌和肾癌，但PSMA在正常的新血管系统中不表达（Chang 等，Urology57:801-805；Divgi等，Clin.Cancer Res.19984:2729-3279）。已显示PSMA是免疫学方法，例如疫苗或单克隆抗体定向疗法的重要靶标。与作为分泌蛋白（PSA，前列腺酸性磷酸酶）的其它前列腺限制性分子不同，PSMA是不被分泌的完整细胞表面膜蛋白，这使其成为免疫疗法的理想靶标。
前列腺癌是男性患癌的主要原因，并且是癌引发的死亡的第二大原因。目前用于前列腺癌的治疗方法主要包括手术、放射和激素治疗。然而，大部分肿瘤细胞通常因对雄激素不敏感而导致耐药。鉴于PSMA的物理特性及其表达模式与前列腺癌进展相关，PSMA是包含前列腺癌在内的多种癌症靶向治疗的理想靶点，也是CAR研究的热点。已有超过10项PSMA嵌合抗原受体细胞治疗进入临床研究，但由于肿瘤血管系统和细胞外基质等恶性组织的特定性阻碍了CAR-T细胞的渗透，CAR-T用于实体瘤治疗处于探索阶段。截至目前暂无有效的PSMA CAR-T疗法应用于PSMA阳性肿瘤患者治疗，靶向PSMA治疗肿瘤仍然面临挑战。故需要更有效的治疗方法，或改进现有靶向PSMA相关治疗方法的疗效以满足前列腺癌及其他PSMA阳性癌症患者治疗需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其和雄激素受体抑制剂的应用。本发明所述免疫细胞联合雄激素受体抑制剂能够实现PSMA表达阳性的疾病的有效治疗。
本发明提供了一种基于前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞，所述嵌合抗原受体包括能够结合前列腺特异性膜抗原的抗原结合结构域，以及与所述抗原结合结构域串联的跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、铰链区和信号肽；所述抗原结合结构域选自scFv、Fab、Fab’和F（ab’）2中的任意一种；
所述scFv的氨基酸序列如（I）、（II）或（III）所示：
（I）具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（II）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有结合前列腺特异性膜抗原功能的氨基酸序列；
（III）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或两个以上氨基酸获得的具有结合前列腺特异性膜抗原功能的氨基酸序列。
优选的是，所述跨膜结构域选自CD8、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε的跨膜结构域中的一种或两种以上；；所述CD8包括CD8α。
所述共刺激信号传导结构域选自CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的细胞内结构域中的一种或两种以上；
所述铰链区包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区；
所述信号肽包括CD8α信号肽。
优选的是，所述跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域，所述CD8α的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述共刺激信号传导结构域为串联的CD3ζ的细胞内结构域和4-1BB的细胞内结构域，所述CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述铰链区为CD8α铰链区，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述信号肽为CD8α信号肽，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选的是，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
优选的是，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
将表达所述嵌合抗原受体的病毒感染未经修饰的细胞，得到所述免疫细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述的免疫细胞或上述技术方案所述制备方法制备得到的免疫细胞联合雄激素受体抑制剂在制备治疗PSMA表达阳性的疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗PSMA表达阳性的疾病的药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的免疫细胞或上述技术方案所述制备方法制备得到的免疫细胞和雄激素受体抑制剂。
优选的是，所述PSMA表达阳性的疾病包括癌症；所述癌症包括前列腺癌、结直肠癌、胃癌、透明细胞肾癌、膀胱癌或肺癌。
优选的是，所述雄激素受体抑制剂包括阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和恩扎鲁胺、醋酸阿比特龙、比卡鲁胺、达罗他胺、卡巴他赛、氟他胺、醋酸环丙孕酮、地加瑞克、多西他赛、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、盐酸米托蒽醌、泼尼松、二氯化镭223和Sipuleucel-T中的一种或两种以上。
本发明提供了一种基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞。本发明所述基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞中嵌合抗原受体相比于其他嵌合抗原受体和其他肿瘤抗原有更好的效果。本发明所述基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞联合雄激素受体抑制剂（如阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺）组合可用于治疗表达PSMA的实体肿瘤，克服CAR-T在PSMA阳性实体肿瘤疗效的局限性，进一步扩大CAR-T的治疗领域；同时为雄激素剥夺治疗后进展的前列腺癌患者提供了一种新的有希望的治疗方法。
本发明的有益效果是：
1）本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面PSMA抗原，通过雄激素受体抑制剂（如阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺）预先治疗使肿瘤细胞上调PSMA表达，使得更多的CAR-T细胞能够到达肿瘤病灶处，从而提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。相较于单独施用CAR-T或雄激素受体抑制剂治疗相比，该联合用药方案具有更好的治疗效果，更容易缓解疾病。
2）本发明提供的CAR-T与雄激素受体抑制剂（如阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺）组合用于PSMA阳性实体肿瘤治疗。可对接受了雄激素剥夺治疗后去势抵抗性前列腺癌仍进展的表达PSMA的患者进行治疗，解决去势抵抗性前列腺癌患者雄激素受体抑制剂耐药的临床需求（具体的，使用雄激素受体抑制剂进行雄激素剥夺治疗后未死亡的细胞（雄激素受体抑制剂耐药细胞），采用CAR-T细胞进行后续治疗可有效杀死耐药的癌细胞）。本发明提供的PSMA嵌合抗原受体细胞及其与雄激素受体抑制剂（如阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺）组合具有良好的肿瘤治疗应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的抗PSMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-EF1α-J591 CAR的元件图；
图2为本发明提供的抗PSMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-EF1α-J591 CAR的载体图谱；
图3为本发明提供的流式检测CAR-T的表达情况结果图，其中，左上角图片为未转染的T细胞的CD3表达比例（99.37%）结果图，右上角图片为未转染的CD3+ T细胞的J591 CAR表达比例（0.18%）结果图，左下角图片为本发明嵌合抗原受体细胞的CD3表达比例（97.65%）结果图，右下角图片为本发明的CD3+的嵌合抗原受体的J591 CAR表达比例（71.07%）结果图；
图4为本发明提供的流式检测前列腺癌细胞系PSMA表达情况图，其中，左上角图片为PC-3细胞PSMA表达情况图，右上角图片为LNCap细胞PSMA表达情况图，左下角图片为22RV1细胞PSMA表达情况图，右下角图片为C4-2B细胞PSMA表达情况图；
图5为本发明提供的CAR-T杀伤靶细胞情况图；
图6为本发明提供的CAR-T对靶细胞的杀伤活性与PSMA表达水平的相关性结果图，其中，（a）为在效靶比为3:1时，CAR-T杀伤活性与PSMA表达水平的相关性图，（b）为在效靶比为5:1时，CAR-T杀伤活性与PSMA表达水平的相关性图；
图7为本发明提供的CAR-T与检测细胞共培养后上清中IFN-gama和IL-2的分泌结果图，其中，左图为IFN-gama分泌结果图，右图为IL-2分泌结果图；
图8为本发明提供的雄激素受体抑制剂处理后4种前列腺癌细胞PSMA表达情况图，其中，（a）为PC-3细胞表达情况图，（b）为22RV1细胞表达情况图，（c）为LNCap细胞表达情况图，（d）为C4-2B细胞表达情况图，（e）为处理至第17天，PC-3和22RV1各组细胞PSMA表达水平，（f）为处理至第17天，LNCap和C4-2B各组细胞PSMA表达水平；
图9为本发明提供的CAR-T细胞与阿帕鲁胺的组合物对靶细胞的杀伤情况图；
图10为本发明提供的CAR-T细胞与阿帕鲁胺的组合物与检测细胞共培养后上清中IFN-gama和IL-2的分泌结果图，其中，左图为IFN-gama分泌结果图，右图为IL-2分泌结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞，所述嵌合抗原受体包括能够结合前列腺特异性膜抗原的抗原结合结构域，以及与所述抗原结合结构域串联的跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、铰链区和信号肽；所述抗原结合结构域选自scFv、Fab、Fab’和F（ab’）2中的任意一种；
所述scFv的氨基酸序列如（I）、（II）或（III）所示：
（I）具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（II）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有90％以上，优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上同源性且具有结合前列腺特异性膜抗原功能（即针对肿瘤表面抗原PSMA的单链抗体的活性）的氨基酸序列；
（III）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或两个以上氨基酸获得的具有结合前列腺特异性膜抗原功能的氨基酸序列。
在本发明中，编码所述抗原结合结构域的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示。在本发明中，所述抗原结合结构域的核苷酸序列优选还包含与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少85％，例如可以是85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，优选90％，更优选95％同一性的变体，其表达的蛋白具有特异性结合PSMA的功能。
本发明所述基于前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞能够特异性杀死PSMA阳性肿瘤细胞。
在本发明中，所述跨膜结构域优选选自CD8、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε的跨膜结构域中的一种或两种以上；所述CD8包括CD8α；在本发明中，所述跨膜结构域更优选为CD8α的跨膜结构域，所述CD8α氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述共刺激信号传导结构域优选选自CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的细胞内结构域中的一种或两种以上；在本发明中，所述共刺激信号传导结构域优选为串联的CD3ζ的细胞内结构域和4-1BB的细胞内结构域，所述CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述铰链区优选包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区；在本发明中，所述铰链区更优选为CD8α铰链区，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。在本发明中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域和跨膜结构域是通过铰链区连接的。
所述信号肽优选为CD8α信号肽，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。在本发明中，所述信号肽能够指导嵌合抗原受体跨膜转移。
在本发明中，所述嵌合抗原受体优选还包括启动子，所述启动子可以为EFα或任何一种高表达的启动子，本领域技术人员可以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，启动子的存在不会对本发明的嵌合抗原受体的性能产生影响。
在本发明中，所述嵌合抗原受体中各区域的连接顺序优选依次如下：CD8α信号肽序列，结合前列腺特异性膜抗原的抗原结合结构域（与PSMA抗原特异性结合的单链抗体序列，Anti-PSMA scFv），CD8α铰链区（Hinge）和跨膜结构域（CD8α的跨膜结构域序列，Transmembrane，TM），4-1BB的细胞内结构域（4-1BB共刺激域序列，ICD）和CD3ζ的细胞内结构域（CD3ζ信号传导域序列）。
在本发明中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13（MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNHIFKDKATLTVDKSSSTAYLQLSSLTSEDSAVYYCARNLYLWGQGTSVTVSLGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPERLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYCCWQGTHFPYTFGGGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR），在本发明中，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示（ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCAGCACGCCCTCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAGGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCGACCCCAGCGACAGCGAGACCCACTACAACCACATCTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAACCTGTACCTGTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGACCCTGAGCGTGACCATCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGGACAGCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCTGCAGAGGCCCGGCCAGAGCCCCGAGAGGCTGATCTACCTGGTGAGCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTGCTGCTGGCAGGGCACCCACTTCCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTGAGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG）。
本发明还提供了上述技术方案所述免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
将表达所述嵌合抗原受体的病毒感染未经修饰的细胞，得到所述免疫细胞；所述病毒包括逆转录病毒、慢病毒或仙台病毒；所述细胞包括NK细胞或T细胞。本发明所提供的制备方法可以制备出上述的PSMA嵌合抗原受体细胞（基于前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞）。在本发明中，所述病毒优选为慢病毒。在本发明中，所述细胞优选为T细胞，所述T细胞具有良好的靶向杀伤作用，同时能够释放低剂量免疫因子，具备低毒性高免疫杀伤反应性质。在本发明中，所述T细胞可以选择健康供体的T细胞或患者本身的T细胞，在本发明的实施方式中，所述T细胞选自健康供体来源的T细胞。
本发明还提供了上述技术方案所述的免疫细胞或上述技术方案所述制备方法制备得到的免疫细胞联合雄激素受体抑制剂在制备治疗PSMA表达阳性的疾病的药物中的应用。
本发明还提供了一种治疗PSMA表达阳性的疾病的药物组合物，所述药物组合物包括上述技术方案所述的免疫细胞或上述技术方案所述制备方法制备得到的免疫细胞和雄激素受体抑制剂。
在本发明中，所述PSMA表达阳性的疾病包括癌症；所述癌症包括前列腺癌、结直肠癌、胃癌、透明细胞肾癌、膀胱癌或肺癌。在本发明中，所述前列腺癌更优选为去势难治性前列腺癌。在本发明中，所述雄激素受体抑制剂包括阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和恩扎鲁胺、醋酸阿比特龙、比卡鲁胺、达罗他胺、卡巴他赛、氟他胺、醋酸环丙孕酮、地加瑞克、多西他赛、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、盐酸米托蒽醌、泼尼松、二氯化镭223和Sipuleucel-T中的一种或两种以上，优选为阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和/或恩扎鲁胺。
本发明所述药物组合物用于治疗PSMA表达阳性的疾病的治疗（即抗PSMA嵌合抗原受体与雄激素受体抑制剂联合进行治疗）时，方法优选包括以下步骤：先使用雄激素受体抑制剂进行治疗，然后使用本发明所述免疫细胞进行治疗。在本发明中，先使用雄激素受体抑制剂进行治疗，使PSMA表达水平上调，之后使用本发明所述免疫细胞进行治疗，可以实现疾病的治疗。具体的，本发明提供的CAR-T与雄激素受体抑制剂联合用于PSMA阳性实体肿瘤治疗，可对接受了雄激素剥夺治疗后去势抵抗性前列腺癌仍进展的表达PSMA的患者进行治疗，解决去势抵抗性前列腺癌患者雄激素受体抑制剂耐药的临床需求，采用CAR-T细胞进行后续治疗可有效杀死耐药的癌细胞。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种基于PSMA的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其和雄激素受体抑制剂的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
嵌合抗原受体的设计。
本实施例构建了抗PSMA的嵌合抗原受体（J591 CAR），含所述抗PSMA的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体的元件图如图1所示，本发明所述嵌合抗原受体包括一段CD8α的信号肽序列（Leader），与PSMA抗原特异性结合的单链抗体序列（Anti-PSMA scFv），CD8α的铰链区（Hinge）和跨膜区序列（Transmembrane，TM），4-1BB共刺激域序列（ICD）和CD3ζ信号传导域序列，具体各部分序列如下：
PSMA抗原结合结构域（Anti-PSMA scFv）的氨基酸序列（SEQ ID NO.1）:
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNHIFKDKATLTVDKSSSTAYLQLSSLTSEDSAVYYCARNLYLWGQGTSVTVSLGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPERLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYCCWQGTHFPYTFGGGTKVEIK；
PSMA抗原结合结构域（Anti-PSMA scFv）的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）:
CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCCGAGCTGGTGAGGCCCGGCGCCAGCGTGAAGCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCATGATCGACCCCAGCGACAGCGAGACCCACTACAACCACATCTTCAAGGACAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACCTGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAACCTGTACCTGTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGAGCCTGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGACCCTGAGCGTGACCATCGGCCAGCCCGCCAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGGACAGCGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGCTGCTGCAGAGGCCCGGCCAGAGCCCCGAGAGGCTGATCTACCTGGTGAGCAAGCTGGACAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGAAGATCAGCAGGGTGGAGGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTGCTGCTGGCAGGGCACCCACTTCCCCTACACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAG；
CD8α跨膜区（TM）的氨基酸序列（SEQ ID NO.3）：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
CD8α跨膜区（TM）的核苷酸序列（SEQ ID NO.4）：ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC；
4-1BB胞内共刺激域（ICD）的氨基酸序列（SEQ ID NO.5）：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；
4-1BB胞内共刺激域（ICD）的核苷酸序列（SEQ ID NO.6）：AAGAGAGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGCCCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGTCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAGGGAGGATGTGAGCTG；
CD3ζ信号传导域的氨基酸序列（SEQ ID NO.7）：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR；
CD3ζ信号传导域的核苷酸序列（SEQ ID NO.8）：
AGGGTGAAGTTTTCTCGGAGCGCCGATGCACCAGCATATCAGCAGGGACAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAATCTGGGCAGGCGCGAGGAGTACGACGTGCTGGATAAGCGGAGAGGCAGAGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCCAAGGAGGAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACTCTGAGATCGGCATGAAGGGAGAGCGGAGAAGGGGCAAGGGACACGATGGCCTGTATCAGGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCACTGCACATGCAGGCCCTGCCACCTAGG；
CD8α铰链区（hinge）的氨基酸序列（SEQ ID NO.9）：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；
CD8α铰链区（hinge）的核苷酸序列（SEQ ID NO.10）：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT；
CD8α信号肽（leader）的氨基酸序列（SEQ ID NO.11）：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
CD8α信号肽（leader）的核苷酸序列（SEQ ID NO.12）：ATGGCACTGCCAGTGACAGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCA CGCAGCACGCCCT。
实施例2
构建抗PSMA的嵌合抗原受体表达载体。
（1）全基因合成J591 CAR序列（SEQ ID NO.14），用EcoRI和BamHI双酶切全基因合成的J591 CAR和购自上海柯雷生物科技有限公司的pLVX-EF1α-IRES-puro质粒空载体（货号：kl-zl-0968），于37℃水浴中酶切30min后，用1.5％的琼脂糖凝胶进行DNA电泳，然后用Omega的凝胶回收试剂盒进行DNA纯化回收。
（2）将酶切后的pLVX-EF1α-IRES-Puro载体与J591 CAR基因片段用T4 DNA连接酶进行连接。连接条件为：室温连接1h。
（3）将连接产物直接转化Stbl 3大肠杆菌感受态细胞，取200μl转化产物涂布氨苄抗性的LB平板，LB平板于37℃的培养箱中倒置培养过夜。
（4）次日早晨随机挑选5个单克隆进行菌落PCR鉴定，将阳性克隆送样测序挑选测序正确的克隆进行表达质粒提取用于后续慢病毒包装。
构建的抗PSMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-EF1α-J591 CAR的元件见图1，载体图谱见图2。
实施例3
慢病毒包装。
分别对实施例中的慢病毒表达载体进行慢病毒包装，具体步骤如下：
（1）将生长状态良好的293T细胞用含10%FBS的DMEM培养基培养17~18h备用；
（2）在无菌离心管中加入表达慢病毒载体包装所需的gag/pol、Rev、VSV-G及实施例2构建的抗PSMA的嵌合抗原受体慢病毒表达载体pLVX-EF1α-J591 CAR，混匀；
（3）将上述质粒混合物加入至一定体积的无血清的DMEM中，混匀后放置15min，将上述混合液加入至铺有293T细胞的T75培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱培养6h；
（4）6h后弃去培养基，更换新鲜的完全培养基，继续进行培养，并且加入10mM的丁酸钠溶液，72h后收集慢病毒的培养上清用于感染，并分装后置于－80℃储存待用。
实施例4
CAR-T细胞的扩增。
（1）采集志愿者的全血，将外周血与生理盐水1:1进行稀释，在离心管内加入Ficoll，缓缓加入稀释后的外周血，1500rpm离心30min，轻轻吸取PBMC层移入另一离心管内；
（2）用生理盐水洗涤PBMC多次，转入X-VIVO培养基（含50ng/mL的OKT3，300IU/mL的IL2）中进行培养，PBMC分离后，需要用含50ng/mL的OKT3，300IU/ml的IL-2的X-VIVO进行激活，2日后将培养基更换成含300IU/mL的X-VIVO进行扩大培养，而后每两天进行一次计数并更换含300IU/mL的X-VIVO，并且将细胞浓度维持在0.5×106~1×106/mL，连续观察10天，得到足够数量的CD3活化的T细胞，流式检测激活后T细胞中CD3表达比例为99.37%，见图3左上角结果图。
实施例5
慢病毒感染T细胞。
（1）将30μg的RetroNectin包被于6孔板内，37℃细胞培养箱2h；
（2）吸走RetroNectin，用含2.5％BSA的Hank’s溶液封闭包被的6孔板，37℃细胞培养箱0.5h；
（3）吸走封闭液，利用含2％Hepes的Hank’s溶液洗涤6孔板，加入X-VIVO培养基和适量的实施例3获得的慢病毒溶液，2000g，离心2h；
（4）弃上清，加入1×106的T细胞（CD3阳性>90％），1000g，离心10min，于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养。第二日弃去培养板中上清，重新加入新鲜培养基继续培养细胞；
（5）感染5天后通过流式细胞仪测定重组人PSMA蛋白（货号PSA-H5264，Acrobiosystems）与J591 scFv的结合，检测J591 CAR的表达，以未转染的T细胞作为阴性对照（Mock T）结果如图3；从图3的结果显示，未转染的T细胞CD3表达比例为99.37%（见左上角图），且不表达J591 CAR（见右上角图）；转染后的CAR-T细胞CD3+比例为97.65%（见左下角图），CD3+ CAR-T细胞中J591 CAR的表达阳性率为71.07％（见右下角图）。（P1表示只检测CD3表达，P2表示同时检测CD3和J591 CAR表达）。
实施例6
流式细胞法测定不同前列腺细胞系中PSMA的表达水平。
（1）收集对数生长期的前列腺癌细胞（LNCap、C4-2、22RV1和PC-3）。用胰酶消化后收集细胞并计数，每种细胞收集5×105个细胞，取细胞悬液离心弃上清，用pH为7.4的PBS再次重悬细胞后离心弃上清。
（2）将商品化的FITC标记的PSMA特异性单克隆抗体AFF488稀释至5 μg/mL，分别与收集的四种细胞在4℃下共同孵育1 h，然后用PBS洗涤2次后用100 μL PBS重悬细胞并吹散细胞，用流式细胞仪检测各细胞系的荧光强度，每个细胞系重复3次检测，结果如图4所示。结果显示，C4-2B细胞和LNCap细胞高表达PSMA，22RV1低表达PSMA，PC-3细胞几乎不表达PSMA。四种细胞系中PSMA表达水平C4-2B>LNCap>22RV1>PC-3。
实施例7
CAR-T细胞对前列腺癌细胞的细胞毒性检测。
本实施例采用xCELLigence®实时无标记动态分析技术（Real Time CellAnalysis，RTCA）对细胞杀伤效应进行全程自动化检测。实时无标记细胞分析仪（RTCA）基于微电子阻抗技术，在E-plate板底整合有大量微金电极，当贴壁细胞粘附到微金电极上，细胞数量、直径以及贴壁能力均会影响微金电极间的电流传导，从而引起阻抗值的改变，这一改变极为精细且灵敏，在毒负效应下，细胞直接或间接影响阻抗值。因此，xCELLigence可以监测由分子靶标引起的细胞毒性效应。
（1）用一定体积的1×Tether Buffer稀释anti-CD40，向E-Plate View 96孔板的每孔中加入50μL稀释好的包被液，室温避光孵育3h，每组设置三个复孔；
（2）弃包被液，用200μL PBS轻轻洗孔2次，向每个孔中加入50μL含2％FBS的1640培养基，将E-Plate View 96孔板放入xCELLigence仪中（仪器预先1h放入培养箱中），37℃平衡1h，测量背景值；
（3）将表达PSMA的C4-2B、LNCap、22RV1作为靶细胞，并以PC-3细胞作为对照细胞制备靶细胞悬液并测定细胞密度，向每个孔中加入50000个细胞/50μL，每个孔的终体积为100μL，室温静置孵育30min，将E-Plate View 96孔板重新放回仪器中，操作软件进行数据收集，每5min检测一次电阻抗，检测时间为2h；
（4）分别制备不同效靶比的效应细胞悬液（即实施例5制备的CAR-T细胞）和阴性对照细胞悬液（即未转染的T细胞），向每孔中加入50μL稀释好的效应细胞悬液或阴性对照细胞悬液，空白对照组加入50μL培养基，阳性对照组加入50μL 1×Cytolysis Solution，室温静置孵育30min，使效应细胞均匀分布在固定的靶细胞上；
（5）将E-Plate View 96孔板重新放入仪器中，操作软件进行数据收集，每5min检测一次电阻抗，检测时间为16h，实验结束后保存数据并分析。以各组细胞检测的电阻抗值计算CAR-T细胞对四个前列腺癌细胞系的细胞毒性。细胞毒性(％)＝[(空白对照组－CAR-T细胞组)－(空白对照组－未转染T细胞组)]/（空白对照组-阴性对照组）*100%。以不同效靶比（效应细胞：靶细胞数量的比值）为横坐标，不同效靶比下的细胞毒性值为纵坐标，绘制细胞毒性（Cytotoxicity）-效靶比（Effector : Target Ratio，E : T）关系图，不同效靶比下，CAR-T对各细胞的细胞毒性见表1。
表1 不同效靶比下CAR-T对4种细胞系的细胞毒性
结果如图5所示，CAR-T在不同的效靶比（1:1、3:1、5:1）下与PSMA表达阳性的LNCap细胞、C4-2B细胞和22RV1细胞共孵育48h后，均能有效杀伤靶细胞，效靶比越大杀伤能力越强。而对不表达PSMA的PC-3细胞的杀伤活性极低。以实施例6中检测的4个细胞系的PSMA表达的MFI值为横坐标，实施例7中效靶比5:1和3:1下，CAR-T对4种细胞的的细胞毒性值为纵坐标作CAR-T细胞毒性与PSMA表达水平的相关性图，分析CAR-T细胞毒性与PSMA表达水平的相关性。结果表明，在效靶比3:1和5:1下CAR-T对肿瘤细胞的杀伤活性与PSMA表达水平呈正相关，相关系数R2分别为0.892和0.776，如图6中的（a）、图6中的（b）。
实施例8
ELISA检测各细胞系与CAR-T细胞共培养上清中IFN-γ和IL-2的水平。
(1)分别将C4-2B、LNCap、22RV1和PC-3细胞按照5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔5×105细胞分别加入CAR-T细胞，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12h后；
(2)采用人IL-2、IFN-γ ELISA检测试剂盒（欣博盛生物），对共培养上清进行检测（具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书），结果见表2和图7。从图7可以看出，CAR-T细胞与PSMA阳性的细胞（C4-2B、LNCap和22RV1）共培养后释放大量IFN-γ和IL-2，而与PSMA阴性细胞（PC-3）共培养后未见大量IFN-γ和IL-2释放，说明靶向PSMA的CAR-T细胞的杀伤具有特异性。
表2 CAR-T细胞与各细胞系共培养后上清中IFN-γ和IL-2的水平
实施例9
雄激素受体抑制剂上调肿瘤细胞中PSMA表达水平。
利用阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和恩扎鲁胺分别刺激各细胞系，使肿瘤细胞中PSMA表达水平上调，具体步骤如下：
(1)将实施例6中四种细胞系每个细胞系分五组，分别用普通培养基培养作为空白对照组、用含1‰ DMSO（v/v）的培养基培养（阴性对照组）、用含10μM阿帕鲁胺（YZ4100）的培养基培养（实验组1）、用含10μM瑞维鲁胺（YZ5100）的培养基培养（实验组2）和用含10μM恩扎鲁胺（YZ3100）的培养基培养（实验组3）。
(2)各组细胞分别用上述特定的培养基传代培养3周，每3~4天用流式细胞术检测各组细胞PSMA表达水平。流式检测方法步骤如下：
（a）分别收集四种细胞，用胰酶消化后收集细胞并计数，每种细胞收集5×105个细胞，取细胞悬液离心弃上清，用pH为7.4的PBS再次重悬细胞后离心弃上清。
（b）将本发明中J591 scFv序列与人IgG1κ恒定区序列连接，构建人源化J591全长抗体表达质粒，再用该质粒转染CHO细胞，收集细胞上清中的人源化J591抗体，经Protein A层析纯化获得抗PSMA特异性单抗J591。将J591抗体稀释至5 μg/mL，分别与收集的四种细胞在4℃下共同孵育1 h，然后用PBS洗涤2次后用100 μL PBS重悬细胞。再次离心弃上清，将商品化的PE标记的羊抗人IgG二抗1:200稀释后与四种细胞在4℃下共同孵育40 min，离心弃上清，用100 μL PBS重悬细胞并吹散细胞，用流式细胞仪检测各细胞系的荧光强度，采用FlowJo分析各组细胞荧光强度，结果见下表3和图8。如图8中的a-图8中的d）结果所示，分别加入阿帕鲁胺、瑞维鲁胺和恩扎鲁胺培养后，LNCap细胞和C4-2B细胞PSMA表达水平显著上调，且上调比例随刺激时间延长而提高。其中，22RV1细胞表达水平有上调，上调趋势弱于LNCap细胞和C4-2B细胞；PC-3细胞培养前后均不表达PSMA。
表3 不同雄激素受体抑制剂处理不同时间对肿瘤细胞PSMA表达水平的影响
（3）分别收集培养17天的四种细胞，用胰酶消化后收集细胞并计数，每种细胞收集5×105个细胞，取细胞悬液离心弃上清，用pH为7.4的PBS再次重悬细胞后离心弃上清。
（4）将J591单抗稀释至5 μg/mL，分别与收集的四种细胞在4℃下共同孵育1 h，然后用2% FBS/PBS洗涤2次后加入1:200倍稀释的PE标记的羊抗人IgG（购自Thermo Fisher）4℃孵育40 min，PBS洗涤2次后用500 μL PBS重悬细胞并吹散细胞，采用FlowJo分析各组细胞荧光强度，结果如图8中的e、f所示，其中YZ4100（4100）为阿帕鲁胺培养组，YZ5100（5100）为瑞维鲁胺培养组，YZ3100（3100）为恩扎鲁胺培养组，Blank为不添加人源化单抗J591组。根据图8中的e和f可以看出，培养17天后，与对照组细胞相比，LNCap细胞、C4-2B细胞和22RV1细胞雄激素受体抑制剂处理组PSMA表达水平均显著上调，且各细胞系上调效果有差异，具体地：对于22RV1细胞：4100>5100>3100；对于LNCap细胞：3100>4100>5100；对于C4-2B细胞：5100>3100>4100。而PC-3细胞不同雄激素药物处理组与对照组相比，PSMA表达水平无明显差异。表明，雄激素受体抑制剂处理可上调PSMA阳性肿瘤细胞中PSMA表达水平。
实施例10
CAR-T细胞与阿帕鲁胺的药物组合物对肿瘤细胞的杀伤活性检测:
(1)将实施例9中用含阿帕鲁胺（YZ4100）的培养基培养10天的LNCap细胞和用含DMSO的培养基培养的对照组LNCap细胞用无血清无酚红的RPMI1640培养基多次洗涤后计数，每种取1×106个细胞50μL/孔，铺板于96孔板内，作为靶细胞；按靶细胞：效应细胞＝1:5、1:3、1:1、3:1、5:1加入CAR-T细胞，37℃、5％CO2细胞培养箱内培养48h。
(2)用同前所述的xCELLigence®实时无标记动态分析技术 （Real Time CellAnalysis，RTCA）对细胞杀伤效应进行全程自动化检测，分析CAR-T与阿帕鲁胺联合对肿瘤细胞的杀伤活性影响。步骤同本发明实施例7。
结果如表4和图9，CAR-T对DMSO对照组和加阿帕鲁胺（Apalutamide）培养组的LNCap细胞均具有较高的杀伤活性，随着效靶比越高，杀伤率越高。且CAR-T对阿帕鲁胺处理的LNCap细胞的杀伤作用强于DMSO对照组。
表4 不同效靶比下，CAR-T细胞与阿帕鲁胺的药物组合物对肿瘤细胞的杀伤活性结果
实施例11
ELISA检测阿帕鲁胺处理的细胞系与CAR-T细胞（J591-CAR-T细胞）共培养上清中IFN-γ、IL-2的水平：
（1）分别将阿帕鲁胺处理组和DMSO对照组的LNCap细胞按照5×105细胞/孔接种24孔板。按每孔5×105细胞分别加入J591-CAR-T，补充培养液至1.5mL，于孵箱中共培养12h后；
（2）采用人IL-2、IFN-γELISA检测试剂盒（欣博盛生物），对共培养上清进行检测（具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书），结果见表5和图10。从图10可以看出，CAR-T细胞与阿帕鲁胺处理后的LNCap共培养上清中IFN-γ水平高于DMSO组，且IL-2细胞因子水平显著高于DMSO组，表明加入阿帕鲁胺刺激可以促进CAR-T细胞分泌更高水平的细胞因子，从而提高CAR-T细胞对靶细胞的杀伤活性。
表5 CAR-T细胞与各组细胞共培养后上清中IFN-γ和IL-2的水平
综上所述，本发明的靶向PSMA CAR-T细胞在不同的效靶比下对PSMA阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，与肿瘤细胞共培养后分泌大量的细胞因子IFN-γ和IL-2，在PSMA阳性肿瘤治疗领域具有应用前景。本发明还提供了一种新的抗PSMA嵌合抗原受体与雄激素受体抑制剂联合的治疗方法，该方法较嵌合抗原受体单独治疗或雄激素受体抑制剂单独治疗能够更有效的达到更好的治疗效果，为PSMA阳性肿瘤患者提供了一个更有效的治疗选择。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种基于前列腺特异性膜抗原的嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括能够结合前列腺特异性膜抗原的抗原结合结构域，以及与所述抗原结合结构域串联的跨膜结构域、共刺激信号传导结构域、铰链区和信号肽；所述抗原结合结构域选自scFv、Fab、Fab’和F（ab’）2中的任意一种；
所述scFv的氨基酸序列如（I）、（II）或（III）所示：
（I）具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（II）与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有90％以上同源性且具有结合前列腺特异性膜抗原功能的氨基酸序列；
（III）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或两个以上氨基酸获得的具有结合前列腺特异性膜抗原功能的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选自CD8、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4和CD3ε的跨膜结构域中的一种或两种以上；所述CD8包括CD8α；
所述共刺激信号传导结构域选自CD27、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD30、CD40、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB、OX40、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3的细胞内结构域中的一种或两种以上；
所述铰链区包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区；
所述信号肽包括CD8α信号肽。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞，其特征在于，所述跨膜结构域为CD8α的跨膜结构域，所述CD8α的跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述共刺激信号传导结构域为串联的CD3ζ的细胞内结构域和4-1BB的细胞内结构域，所述CD3ζ的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述4-1BB的细胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述铰链区为CD8α铰链区，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述信号肽为CD8α信号肽，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.根据权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
6.权利要求1~5任一项所述免疫细胞的制备方法，包括以下步骤：
将表达所述嵌合抗原受体的病毒感染未经修饰的细胞，得到所述免疫细胞。
7.权利要求1~5任一项所述的免疫细胞或权利要求6所述制备方法制备得到的免疫细胞联合雄激素受体抑制剂在制备治疗PSMA表达阳性的疾病的药物中的应用。
8.一种治疗PSMA表达阳性的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1~5任一项所述的免疫细胞或权利要求6所述制备方法制备得到的免疫细胞和雄激素受体抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述PSMA表达阳性的疾病包括癌症；所述癌症包括前列腺癌、结直肠癌、胃癌、透明细胞肾癌、膀胱癌或肺癌。
10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其特征在于，所述雄激素受体抑制剂包括阿帕鲁胺、瑞维鲁胺、恩扎鲁胺、醋酸阿比特龙、比卡鲁胺、达罗他胺、卡巴他赛、氟他胺、醋酸环丙孕酮、地加瑞克、多西他赛、醋酸戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、盐酸米托蒽醌、泼尼松、二氯化镭223和Sipuleucel-T中的一种或两种以上。
CN202310350458.9A 2023-04-04 2023-04-04 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用 Pending CN116536271A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310350458.9A CN116536271A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310350458.9A CN116536271A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116536271A true CN116536271A (zh) 2023-08-04

Family

ID=87442494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310350458.9A Pending CN116536271A (zh) 2023-04-04 2023-04-04 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116536271A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7399157B2 (ja) 改良された治療用ｔ細胞
CN107982538B (zh) 一种药物组合物及其应用
CN109803983B (zh) 靶向nkg2dl的特异性嵌合抗原受体t细胞，其制备方法和应用
CN108064252A (zh) 嵌合抗原受体及其使用方法
WO2018053885A1 (zh) 一种加强型Slit2 CAR-T和CAR-NK细胞制备方法和应用
JP7288503B2 (ja) 改変された抗ｃｄ１９ ｃａｒ－ｔ細胞
CN112142854A (zh) 免疫调节特异性嵌合抗原受体细胞及制备方法和应用
WO2022199125A1 (zh) 一种自分泌IL-15与anti-PD1融合蛋白的免疫细胞
CN113896801B (zh) 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
CN113416260B (zh) 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
CN112500497B (zh) Cltx-nkg2d双特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
JP2018500337A (ja) 炭酸脱水酵素ｉｘ特異的キメラ抗原受容体およびその使用方法
CN113621073A (zh) 一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用
CN115212299A (zh) Car-t和car-m联用在制备抗肿瘤药物中的应用
CN109824783B (zh) 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用
CN116814664B (zh) 一种扩展肿瘤识别表位的cea嵌合抗原受体t细胞的制备与应用
CN116120465B (zh) 一种靶向bcma和/或fcrh5的嵌合抗原受体及其应用
CN116143943B (zh) 一种靶向baffr嵌合抗原受体、car-t细胞及应用
WO2022171195A1 (zh) 抗cd87抗体与抗pd1抗体联合治疗胃癌
CN111542547A (zh) 对bdca2抗原具有特异性的嵌合抗原受体
CN116536271A (zh) 一种基于psma的car基因修饰的免疫细胞及其联合雄激素受体抑制剂的应用
CN113493525B (zh) 一种增效且抵抗耗竭的嵌合抗原受体t细胞及其在制备治疗肿瘤药物中的用途
CN111499723B (zh) 一种嵌合抗原受体及其应用
CN117247462B (zh) 一种靶向ror1的嵌合抗原受体、car-t细胞及其用途
CN113549599B (zh) 靶向cxcr5阳性细胞的car-t细胞、核酸、载体、慢病毒及car-t细胞的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination