CN116814657A

CN116814657A - 一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因靶标片段Rsgsh及其应用

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Publication number: CN116814657A
Application number: CN202310841991.5A
Authority: CN
Inventors: 赵美; 朱玉涛; 王莲哲; 李冰冰; 刘东晓
Original assignee: Henan University of Urban Construction
Current assignee: Henan University of Urban Construction
Priority date: 2023-07-10
Filing date: 2023-07-10
Publication date: 2023-09-29

Abstract

本发明公开了一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因靶标片段Rsgsh及其应用。本发明克隆得到水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因以及其靶标片段Rsgsh，研究显示谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达；合成水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA，经体外处理后，沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力，显示该基因为水稻纹枯病菌的关键致病基因，能用于防治水稻纹枯病菌以及制备水稻纹枯病菌防治产品。同时，将包含片段Rsgsh的重组载体转化入植株后，能够得到抗水稻纹枯病菌的转基因植物，用于防治水稻纹枯病菌具有重要的研究意义。

Description

一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因靶标片段Rsgsh及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因靶标片段Rsgsh及其应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一，而水稻纹枯病在我国各稻区均有发生，由土传性真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani AG-1IA)侵染引起的引起的一种真菌病害。水稻纹枯病会造成叶鞘损伤，影响籽粒的灌浆和产量，发病较轻时会造成水稻产量损失10～30％，严重时可高达45％(Margani et al.,2018)，且其发病程度还在逐年递增，十分严重。如何增强水稻对水稻纹枯病的抗性是水稻生产的主要挑战之一。

抗病品种的利用是防治植物病害最经济有效的措施。对于水稻，尽管可以通过对大量水稻遗传资源的筛选来鉴定寄主植物的抗性，但在培育具有理想的纹枯病抗性的商品化水稻品种方面仍未取得成功。近年来，基于RNAi(RNA interference，RNAi)技术发展而来的寄主诱导的基因沉默技术(Host induced gene silencing，HIGS)在作物保护中发挥着重要作用，且已被证明可用于防治水稻纹枯病，提高水稻抗性。HIGS技术可以用来研究水稻纹枯病菌的基因功能，是培育高抗水稻纹枯病菌的水稻品种的新策略。

谷胱甘肽(GSH)是一种重要的抗氧化分子，GSH在酵母和丝状真菌中含量丰富，在其发生环境胁迫是发挥重要作用，谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase，gsh)调控GSH的合成。目前，有关水稻纹枯病菌的谷胱甘肽合成酶基因的研究较少。而立枯丝核菌的同一菌丝融合群的异源菌丝接触时可发生菌丝融合，一个菌丝中可能含有同源或异源的多个细胞核(Carling et al.,2002)。因此在对水稻纹枯病菌的基因功能研究中，难以通过同源重组技术对菌丝基因敲除和回补，缺乏对于该病原菌基因功能的研究。而目前克隆得到的水稻纹枯病菌的致病相关基因的还较少，亟需研究和开发出更多的能用于防治水稻纹枯病菌的关关键致病基因，用于防治水稻纹枯病菌具有重要的研究意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中对于水稻纹枯病的致病相关基因研究的缺陷和不足，提供一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh。

本发明的第二个目的是提供所述水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的应用。

本发明的第三个目的是提供水稻纹枯病菌致病基因在防治水稻纹枯病菌中的应用。

本发明的第四个目的是提供抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的制剂的应用。

本发明的第五个目的是提供一种水稻纹枯病菌防治制剂。

本发明的第六个目的是提供一种防治水稻纹枯病菌的方法。

本发明的第七个目的是提供一种构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明克隆得到一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶(glutathione synthase)基因及其靶标片段Rsgsh，水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，长度为2736bp；基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，长度为3581bp，包含9个内含子，分别位于第361～474位、486～591位、733～865位、1755～1812位、1837～1949位、2130～2292位、2434～2480位、2620～2667位、2833～2895位；基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示，编码序列的长度为2736bp，其编码911个氨基酸；基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：4所示，由911个氨基酸组成，蛋白质的分子量为101.57kDa。其靶标片段Rsgsh的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明研究显示谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达；合成水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA，经体外处理后，沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，进而显著降低水稻纹枯病菌的致病力，显示该基因为水稻纹枯病菌的关键致病基因，能用于防治水稻纹枯病菌以及制备水稻纹枯病菌防治产品。

根据本发明提供的水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因或其片段Rsgsh的序列信息，本领域技术人员可以通过以下方法获得与片段Rsgsh等同的基因：

(1)通过数据库检索获得；(2)以片段Rsgsh为探针筛选其它丝核菌基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据片段Rsgsh序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从丝核菌或其它近缘真菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在片段Rsgsh的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

进一步地，dsRNA能够用于制备水稻纹枯病菌防治制剂，且将包含片段Rsgsh的重组载体转化入植株后，能够得到抗水稻纹枯病菌的转基因植物；因此，该水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因或其片段Rsgsh在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。

因此，以下应用均在本发明的保护范围内：

水稻纹枯病菌致病基因在防治水稻纹枯病菌中的应用。

水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh在防治水稻纹枯病菌或在制备水稻纹枯病菌防治产品中的应用。

水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的制剂在防治水稻纹枯病菌或在制备水稻纹枯病菌防治产品中的应用。

抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的制剂在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

本发明提供一种水稻纹枯病菌防治制剂，含有抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh表达制剂。

优选地，所述含有抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh表达的制剂为片段Rsgsh的dsRNA或包含片段Rsgsh的重组载体或重组菌。

更优选地，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明提供一种防治水稻纹枯病菌的方法，采用上述水稻纹枯病菌防治制剂进行防治。

本发明还提供一种构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，将含水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的载体，或含水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA的载体，转入到植物中，获得表达水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的转基因植株。

优选地，通过体外合成含有水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA，沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因；所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

或者将水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh构建到TRV2载体中，用注射法将该TRV2-Rsgsh沉默载体注射到植株中，获得表达水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的转基因植株。

或者利用转基因植株中产生的dsRNA，用于沉默接种的水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，以此降低水稻纹枯病菌在植株上的致病力。

本发明具有以下有益效果：

本发明克隆得到一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因及其靶标片段Rsgsh，该基因是水稻纹枯病菌(土传真菌病害)的致病力关键基因，研究显该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达，合成水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA，经体外处理后，沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，会显著降低水稻纹枯病菌的致病力，能用于防治水稻纹枯病菌以及制备水稻纹枯病菌防治产品。

同时，本发明提供一种水稻纹枯病菌防治制剂，还含有能够抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因表达的物质，该物质为dsRNA或包含片段Rsgsh的重组载体或重组菌。并且，通过将沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因的重组载体转化入植株，能得到抗水稻纹枯病菌转基因植物，该植物对水稻纹枯病菌具有显著的抗病性，有效地解决了生产上由纹枯病菌引起的土传真菌病害的难题，进而有效地防控土传真菌病害。

另外，本发明提供的构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，只是在植物中表达一个小片段的基因，不产生蛋白质等产物，不会产生转基因食品带来的潜在风险；因此，该水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因或其片段Rsgsh在防治水稻纹枯病菌、制备水稻纹枯病菌防治制剂、以及构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中均具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的扩增结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：PCR产物。

图2是水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果图。

图3是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24、48、72和96h的RNA提取结果图；其中，M：DNA分子量标准；1：24h提取的RNA；2：48h提取的RNA；3：72h提取的RNA；4：96h提取的RNA。

图4是dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0、24、48、72和96hpi的转录水平结果图。

图5是VIGS载体信息图。

图6是本发明构建得到的TRV2-Rsgsh沉默载体的图谱。

图7是本发明构建得到的TRV2-Rsgsh沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果图；其中，M：DNA分子量标准；1、2：菌落。

图8是接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的表型图。

图9是接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果图；其中，(A)图为接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的真菌生物量分析结果图；(B)图为接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的靶基因转录水平分析结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中采用的试剂盒以及试剂货号：TaKaRa总RNA提取试剂盒(codeNo.9769)，TARAKA PrimeScript反转录试剂盒(code No.6210A)，擎科(code No.TP001)高保真聚合酶，TaKaRa植物RNA提取试剂盒(code No.9769)。

注：ST.26标准序核苷酸或氨基酸序列表中dsRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)中“u”被替换成“t”。

实施例1水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的克隆

1、水稻纹枯病菌RNA的提取

水稻纹枯病菌RNA的提取使用TaKaRa总RNA提取试剂盒。具体方法为：称取0.1g水稻纹枯病菌GD-118(保存于本课题组实验室)的菌丝于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有Buffer RL裂解液的1.5mL灭菌离心管中，将裂解液12000rpm，4℃离心5min。将上清液小心吸取到新的1.5mL灭菌离心管中。加入样品裂解步骤中上清液1/2体积的无水乙醇，立即将混合液(含沉淀)全部转入到RNA Spin Column(含2mL Collection Tube)中。12000rpm，离心1min，弃滤液。依次将500μL的Buffer RWA，600μL的Buffer RWB，600μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12000rpm离心30秒钟，弃滤液。然后空管12000rpm离心1min。将RNASpin Column安置于1.5mL的RNase Free Collection Tube，在RNASpin Column膜中央处加入125μL的RNase Free ddH₂O(65℃预热)，室温静置5min。12000rpm离心2min洗脱RNA，得到水稻纹枯病菌RNA。

2、cDNA第一链的合成

以上述得到的水稻纹枯病菌菌株GD-118的RNA为模板，利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒合成cDNA。具体方法为：在微量离心管中加入2000ng Total RNA、1μL OligodT Primer、1μL dNTP Mixture(10mM each)、补充RNase Free ddH₂O至10μL。轻轻混匀，离心数秒后，65℃保温5min，冰上迅速冷却。依次加4μL5×PrimeScript II Buffer、0.5μLRNase Inhibitor(40U/μL)、1μL PrimeScript II RTase(200U/μL)、补充RNase FreeddH₂O至20μL，缓慢混匀。42℃保温50min，95℃保温5min(酶失活)，得到水稻纹枯病菌cDNA，冰上冷却后，-20℃保存备用。

根据标准菌株GD-118的谷胱甘肽合成酶基因的序列进行的引物合成与PCR克隆，进行测序，测序结果显示，水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因的全长cDNA序列如SEQ IDNO：1所示，全长DNA序列如SEQ ID NO：2所示，编码序列如SEQ ID NO：3所示，其基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3、片段Rsgsh的克隆

以上述得到的水稻纹枯病菌菌株GD-118的cDNA为模板，设计片段Rsgsh的克隆引物，9093F(SEQ ID NO:7):5'-ATTATTGGGCATTGCGTAC-3'；9093R(SEQ ID NO:8):5'-TGGCGTCGTCGTCAGTT-3'。使用擎科(code No.TP001)高保真聚合酶，进行PCR扩增反应。反应条件为：98℃，2min；98℃，10s，58℃，15s，40个循环；最后72℃，10min。使用TAE缓冲液制作1.0％的琼脂糖凝胶，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用Axygen PCR清洁试剂盒试剂盒进行PCR产物纯化。

结果显示，水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的扩增结果如图1所示，可以看出，本发明成功扩增得到水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh，大小为297bp，片段Rsgsh的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

实施例2水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程的表达分析

1、实验方法

S1.接种喷雾的制备：首先使用PDA平板(培养皿直径90mm，8mL PDA培养基)将本实验室保存的水稻纹枯病菌(R.solani AG-1IA)GD-118菌株活化，黑暗条件下，28℃培养2d。之后使用灭菌后的刀片将带有真菌的PDA平板切割成边长约为1mm大小的正方形菌丝块，转移至锥形瓶中(含200mL PDB)，黑暗条件下，28℃，180r/min，震荡培养2d后，整瓶匀浆成液体，使OD₆₀₀为1.0，即可用于接种。

S2.水稻的种植和接种：分别使用10％的次氯酸钠与30％的双氧水对水稻种子(水稻品种：日本晴)进行消毒，再将种子置于无菌培养皿内，使用无菌水浸泡3d以上直至发芽，然后将发芽的种子转移至含有10cm无菌土的方盆(长：80cm；宽：40cm；高：15cm)内。接种选择水稻三叶一心期，在盆内无水干燥条件下使用S1中匀浆后的液体进行接种，每株水稻接种5mL，30℃，湿度90％以上利于发病。

S3.样品的荧光定量PCR分析：为了验证不同基因在水稻纹枯病菌侵染水稻过程中的表达量，选取了接种后的6个时间点，24、48、72、96和120h后，收集整株水稻为样品。使用TaKaRa植物RNA提取试剂盒进行不同时间的水稻样品总RNA的提取，具体方法同实施例1。

利用TARAKA PrimeScript反转录试剂盒进行RNA反转录，具体方法同实施例1，将反转录所得的cDNA产物稀释10倍后用于实时荧光定量PCR。利用Primer Premier 5.0软件设计片段Rsgsh的荧光定量PCR引物，9093qPCR F(SEQ ID NO:9):5'-AAAACAATTTACTTTTCGGGGTATGC-3'；9093qPCR R(SEQ ID NO:10):5'-GGGACTTTCAGAAGGGCTGG-3'。引物的特异性通过凝胶电泳、测序和溶解曲线检验。试验使用Bio-Rad CFX real-time PCR system，反应体系为20μL，其中包含10μL MIX、0.2μM上/下游引物、2μL cDNA模板和适量的纯水。每个样品进行三次技术重复。水稻纹枯病菌的内参基因使用GAPDH进行样品间的基因表达的均一化处理，引物GAPDH F(SEQ ID NO:11):5'-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3'；引物GAPDH R(SEQ ID NO:12):5'-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3'。结果采用2^-ΔΔCt法进行分析。

2、实验结果

水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染过程的基因表达分析结果如图2所示，可以看出，谷胱甘肽合成酶基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被诱导，且随着时间延长表达量持续升高，表明该基因在水稻纹枯病菌与水稻的互作过程中可能起到关键作用。

实施例3片段Rsgsh dsRNA的合成和体外沉默实验

1、片段Rsgsh dsRNA的体外合成

使用T7 RNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific，Catalog number:EP011)合成片段Rsgsh的dsRNA。通过在任一扩增引物的5'末端添加T7启动子序列，可以使用PCR将T7 RNA聚合酶启动子添加到任何DNA序列中。最小的T7RNA聚合酶启动子序列是：5'-TAATACGACTCACTATAGG-3'。在上下游引物5'末端分别添加T7启动子序列，即上游引物T7-9093 F(SEQ ID NO:13):5'-TAATACGACTCACTATAGG ATTATTGGGCATTGCGTAC-3'；下游引物T7-9093R(SEQ ID NO:14):5'-TAATACGACTCACTATAGG TGGCGTCGTCGTC AGTT-3'。以水稻纹枯病菌的cDNA为模板进行PCR扩增得到dsRNA的模板，经过转录纯化后得到谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA，dsRNA的核酸序列如SEQ ID NO：6所示：uaauacgacucacuauaggauuauugggcauugcguacaagacau ccagaucgccccaguccccauauuucgaccuacaugcccgaugaauugauccaagaccgagacgaacacuuuacgccuacagauucguacagaauaccugagucuuacgauuuuacugaccuggaucuuccaucuacaacuauccuccacgagaguucggaauacgaagccuauuauugugaaucgcccauaucauugcucacuuaucggagcucgcguggcagaucucaggguaauucgcacgacucgagacgaacugacgacgacgccaccuauagugagucguauua。

2、dsRNA对水稻纹枯病菌的体外沉默实验

从培养2d的水稻纹枯病菌PDA平板边缘取边长2mm正方形菌饼放入直径60mm的培养皿中(含有7mLPDB)，静置培养48h后，以500ng/mL加入dsRNA，并在处理0、24、48、72和96h时收集菌丝样品，并使用TaKaRa植物RNA提取试剂盒进行不同时间的水稻样品总RNA的提取，具体方法同实施例，每次处理重复三次，实验重复三次。

结果显示，dsRNA体外处理水稻纹枯病菌24、48、72和96h提取结果如图3所示，可以看出，各时间段样品提取出的RNA质量良好。

dsRNA体外处理水稻纹枯病菌0、24、48、72和96hpi的转录水平结果如图4所示，可以看出，谷胱甘肽合成酶基因的转录水平在24hpi就有显著降低，并随着处理时间的增加持续降低，72hpi的沉默效率高达85.35％，证明体外施用dsRNA处理病原菌沉默相关基因的表达是切实可行的。

实施例4TRV2-Rsgsh沉默载体构建和转化烟草研究

1、TRV2-Rsgsh沉默载体构建及农杆菌转化

根据水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的编码序列，设计引物两端包含EcoRI和BamHI酶切位点的特异性引物，上游引物VIGS-9093F(SEQ ID NO:15)：5'-CCGgaattcATTATTGGGCATTGCGTAC-3'；下游引物VIGS-09093R(SEQ ID NO:16)：5'-CGCggatccTGGCGTCGTCGTCAGTT-3'，VIGS载体信息如图5所示。以水稻纹枯病菌cDNA为模板，使用擎科公司高保真酶进行PCR扩增，将扩增产物回收后和载体pYL156同时在37℃下双酶切5h。将酶切后的目的片段和载体利用T₄-DNA连接酶，16℃过夜连接，将连接好的产物转化入E.coil DH5α感受态，测序确定无误后，扩繁提取质粒，保存备用。

结果显示，本发明构建得到的TRV2-Rsgsh沉默载体的图谱如图6所示，可以看出，载体全长9942bp，经对比与实际测序结果相同。

2、根癌农杆菌感受态的制备及电击转化

将根癌农杆菌单菌落接于4mL含Rif(25μg/mL)的LB液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养2d。取培养液3mL的接种量转接至200mL LB培养液中，200r/min、28℃振荡培养至对数生长期(细胞浓度OD₆₀₀＝0.6)。离心弃去废液，收集菌体。用预冷的无菌双蒸水将菌液重悬洗涤3次，后用2mL无菌预冷的10％w/v甘油重悬菌体。取100μL菌悬液于1.5mL离心管，-70℃保存备用。加3μL质粒于菌液中，轻轻混匀并转移至无菌预冷的电击杯中，电击后迅速加入1mL LB液体培养基，混匀并转移细胞至1.5mL的离心管中，在28℃摇床中200r/min培养2h；取100μL菌液涂布于含Rif(25μg/mL)和Kan(50μg/mL)的LB平板中，倒置放于28℃培养箱中培养2天，观察转化子生长情况，取未质粒DNA的农杆菌在同样电击条件下的结果作为对照。挑取单菌落使用pYL156载体引物进行PCR验证。上游引物PYL156 F(SEQ ID NO:17):5'-AATTCACTGGGAGATGATACGCTG-3'；下游引物PYL156 R(SEQ ID NO:18):5'-CCTATGGTAAGACAATGAGTCGGC-3'。

结果显示，本发明构建得到的TRV2-Rsgsh沉默载体转化至根癌农杆菌GV3101的菌落验证结果如图7所示，条带大小为729bp，条带单一明亮且大小正确，说明TRV2-Rsgsh沉默载体已成功转进根癌农杆菌GV3101菌株。

3、农杆菌培养和烟草瞬时转化

农杆菌单克隆加入5mL的液体LB培养基(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min过夜培养，将1mL菌液加入50mL LB(25μg/mL Rif和50μg/mL Kan)中，放于28℃摇床中进行200r/min振荡培养。当培养物OD₆₀₀＝0.6时，6000rpm，5min低温离心收集菌体，弃去废液。将菌体重悬于注射基质(10mM MES、10mM MgCl₂、100μM乙酰丁香酮)中，使OD₆₀₀＝0.4。把两种农杆菌菌株(TRV1与TRV2+靶标基因片段)以1:1混合，室温静置4h，不要摇动。最后利用注射器将含有注射基质的农杆菌注射于最嫩的叶片中。

4、致病力检测和生物量测定

从注射后的第10天起，本氏烟草的白化现象就非常明显，这表明了在本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，我们选择了从注射VIGS系列载体后的第10天，进行活体接种。对接菌后第120hpi(post-inoculation hour，hpi)进行本氏烟草的病情指数统计，通过统计叶片病斑和凋萎叶片的数量进行致病力的检测。提取接种水稻纹枯病菌120hpi后本氏烟草(转基因植株和阴性对照)中部叶片的总DNA，以立枯丝核菌(R.solani)内部转录间隔区ITS序列为靶标片段。上游引物Rs F(SEQ ID NO:19):5'-GCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAG-3'；下游引物Rs R(SEQ ID NO:20):5'-GTGTGTAAATTAAGTAGACAGCAAATG-3'。同时，以烟草actin基因为内参基因，上游引物EF1a(SEQ ID NO:21):5'-TGGTGTCCTCAAGCCTGGTAT-3'；下游引物EF1b(SEQ ID NO:22):5'-ACGCTTGAGATCCTTAACCGC-3'。具体方法同实施例，结果采用2^-ΔΔCt法进行分析(苏晓峰，2014)。

结果显示，接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的表型如图8所示，可以看出，转基因烟草对病原菌的抗性均有明显增强，阴性对照GFP植株显示为整株即将枯死，而RNAi-Rsgsh只有少数叶片有病斑。为了进一步更直观的观测抗性水平，选择了接种后的本氏烟草的第3、4和5片叶片，进行了病斑的量化，结果显示，GFP的烟草叶片相对侵染面积为46.60％，RNAi-Rsgsh的相对侵染面积仅为6.02％。

接种水稻纹枯病菌120hpi后的本氏烟草的真菌生物量和靶基因转录水平分析结果如图9所示，可以看出，转基因阳性烟草(pTRV2:Rsgsh)的真菌生物量明显降低，仅为野生型的18％(图9A)，转基因植物体内谷胱甘肽合成酶基因的表达量显著下降，为为阴性对照的51.14％(图9B)。表明靶标基因Rsgsh与水稻纹枯病菌的致病力相关，注射进本氏烟草的病毒载体成功转录生成了相应的dsRNA，并在水稻纹枯病菌侵染过程中降低了靶标基因的表达，使得水稻纹枯病菌的菌丝在本氏烟草种的生长及繁殖的速度减慢，从而导致致病力显著降低。

综上，本发明克隆得到的水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，属于水稻纹枯病菌致病力关键基因，该基因在水稻纹枯病菌侵染水稻的前期过程中被显著诱导表达；通过体外合成谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA并进行处理，沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因，能够显著降低水稻纹枯病菌的致病力；因此，本发明提供含有能够抑制水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因表达的物质，在防治水稻纹枯病中的应用，抑制水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因表达的物质为dsRNA或包含片段Rsgsh的重组载体或重组菌；同时，将高效沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因的重组载体转化入植株，能够得到抗水稻纹枯病菌转基因植物，该植物对水稻纹枯病菌具有显著的抗病性，有效地解决了生产上由纹枯病菌引起的土传真菌病害的难题，进而有效地防控土传真菌病害。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh，其特征在于，所述谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.权利要求1所述水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh在防治水稻纹枯病菌或在制备水稻纹枯病菌防治产品中的应用。

3.权利要求1所述水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

4.水稻纹枯病菌致病基因在防治水稻纹枯病菌中的应用，其特征在于，所述水稻纹枯病菌致病基因的全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示；全长DNA序列如SEQ ID NO:2所示；编码序列如SEQ ID NO:3所示；基因的编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

5.抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的制剂在防治水稻纹枯病菌、在制备水稻纹枯病菌防治产品、或在构建抗水稻纹枯病菌转基因植物中的应用。

6.一种水稻纹枯病菌防治制剂，其特征在于，含有抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh表达制剂。

7.根据权利要求6所述防治制剂，其特征在于，所述含有抑制或沉默水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh表达的制剂为片段Rsgsh的dsRNA或包含片段Rsgsh的重组载体或重组菌。

8.根据权利要求7所述防治制剂，其特征在于，所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

9.一种防治水稻纹枯病菌的方法，其特征在于，采用权利要求6～8任一所述水稻纹枯病菌防治制剂进行防治。

10.一种构建抗水稻纹枯病菌转基因植物的方法，其特征在于，将含水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的载体，或含水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的dsRNA的载体，转入到植物中，获得表达水稻纹枯病菌谷胱甘肽合成酶基因片段Rsgsh的转基因植株。