CN116813967A - 多孔琼脂糖微球制备方法及多孔琼脂糖微球 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多孔琼脂糖微球制备方法及多孔琼脂糖微球，该制备方法包括如下步骤：琼脂糖微球在第一溶胀剂中溶胀；第一时间后在第一溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第一交联琼脂糖微球，第一溶胀剂为饱和盐溶液和/或无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液；使用无水脱水剂预脱水第一交联琼脂糖微球，使用真空冻干工艺对预脱水的第一交联琼脂糖微球再次脱水；脱水后的第一交联琼脂糖微球在第二溶胀剂中溶胀，加入碱液和还原剂获得第二交联琼脂糖微球；第二交联琼脂糖微球在第三溶胀剂中溶胀，在第三溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得多孔琼脂糖微球。本发明制备方法获得的多孔琼脂糖微球既保持了网状孔隙，又有高的强度。
Description
技术领域
本发明涉及层析分离材料技术领域，具体地说，涉及一种多孔琼脂糖微球制备方法及多孔琼脂糖微球。
背景技术
多糖富含羟基，亲水性很强，与生物大分子具有良好的相容性，在生物大分子分离领域占据核心地位。其中，琼脂糖作为一种可生物降解聚合物，多孔、高流速、低反压的琼脂糖微球具有大孔网络结构，对于生物大分子的分离纯化具有特殊的优越性，是制备高性能层析介质的基础。
琼脂糖的骨架结构主要由氢键维系，虽然有一定的机械强度，但与无机物微球和其他有机聚合物微球相比颗粒相对较软，当将其用作为分离介质时，在压力较大的情况下，尤其在大规模层析，要求流速很高的时候，这类琼脂糖容易出现压紧和堵塞层析柱造成流动困难的现象。通常，琼脂糖微球通过化学交联增加其骨架刚性，通过琼脂糖微球中引入交联剂分子，将氢键作用转化为共价键作用，使得琼脂糖微球骨架刚性和化学稳定性大幅度提高。同时，交联剂分子在琼脂糖微球表面形成多孔结构。
然而，在多孔琼脂糖微球的制备过程中，大孔隙的保持和微球强度是一组相互矛盾的存在，随着交联强度的提升，微球收缩率增大，同时胶束之间连接更多，导致大网孔结构变小或完全消失，微球成为实心球体，其实际有效比表面积大幅下降，直接影响后续功能化。传统工序还存在对溶剂的消耗巨大，对环境不够友好，反应周期非常长，生产效率低等缺点。如何获得一种具有大孔网络结构且强度高的多孔琼脂糖微球是层析分离领域亟待解决的问题。
需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本发明的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种多孔琼脂糖微球制备方法及多孔琼脂糖微球，该制备方法获得的多孔琼脂糖微球的孔隙丰富、沟壑较深、高流速低反压，并且活化基团可控的交联球，即多孔琼脂糖微球既有孔隙，又有强度。
本发明的第一方面提供了一种多孔琼脂糖微球制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
S10：琼脂糖微球在第一溶胀剂中溶胀；第一时间后在所述第一溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第一交联琼脂糖微球，所述第一溶胀剂为饱和盐溶液和/或无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液；
S20：使用无水脱水剂预脱水第一交联琼脂糖微球，使用真空冻干工艺对预脱水的第一交联琼脂糖微球再次脱水；
S30：脱水后的第一交联琼脂糖微球在第二溶胀剂中溶胀，第二时间后在所述第二溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第二交联琼脂糖微球，所述第二溶胀剂为无水不含活性基团的有机溶剂和多环氧交联剂混合液；
S40：第二交联琼脂糖微球在第三溶胀剂中溶胀，第三时间后在所述第三溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得多孔琼脂糖微球，所述第三溶胀剂为无水有机溶剂和环氧氯丙烷混合液。
根据本发明的第一方面，所述第一时间小于或等于1小时；和/或
所述单环氧交联剂为环氧氯丙烷。
根据本发明的第一方面，所述第一溶胀剂为饱和盐溶液、无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液，且有：
所述琼脂糖微球与所述饱和盐溶液的质量比为2/3~2；
所述琼脂糖微球与所述无水有机溶剂的质量比为1~4。
根据本发明的第一方面，所述无水脱水剂为二甲基亚砜、丙酮、二氧六环、乙醇或甲醇中的一种或多种。
根据本发明的第一方面，所述真空冻干工艺的真空度小于或等于0.1mpa，所述真空冻干工艺的温度在-50℃~-70℃。
根据本发明的第一方面，所述碱液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；和/或
所述还原剂为硼氢化钠和/或硼氢化钾。
根据本发明的第一方面，所述第二交联琼脂糖微球的强度大于或等于0.2mpa；和/或
所述第二交联琼脂糖微球的环氧密度大于或等于20μmol/g。
根据本发明的第一方面，所述无水不含活性基团的有机溶剂包括二甲基亚砜、丙酮或二氧六环；和/或
所述多环氧交联剂包括乙二醇二缩水甘油醚、季戊四醇缩水甘油醚或1,4丁二醇二缩水甘油醚。
本发明的第二方面提供了一种多孔琼脂糖微球，所述多孔琼脂糖微球通过所述的制备方法获得。
根据本发明的第二方面，所述多孔琼脂糖微球满足如下至少一个条件：
所述多孔琼脂糖微球的粒径为15~200μm；
所述多孔琼脂糖微球具有多孔结构；
所述多孔琼脂糖微球的多孔结构的孔径为100~200nm；
所述多孔琼脂糖微球的强度大于或等于0.5mpa。
本发明的多孔琼脂糖微球制备方法包括第一交联琼脂糖微球制备、脱水、第二交联琼脂糖微球制备和多孔琼脂糖微球制备步骤，在第一交联琼脂糖微球制备过程中，基于琼脂糖微球本身比较脆弱，并且不能耐受高浓度的有机物，为了尽量减少水份同时又不被过高的有机溶剂损伤白球，使用了饱和盐溶液和无水有机溶剂、短链有机交联剂创造双相环境，通过盐浓度来控制微球中的自由水的含量，在交联过程中，随着渗透的进行水份不断被脱出，原来的水环境被交联剂逐渐替代，短链交联剂进入胶束，从而大幅提升了交联的速率，同时又保证了球形，并且获得了良好的基础强度，为后续交联打下了基础。
在脱水过程中，不同于传统方式中溶剂替换脱水这种不彻底的脱水方式，使用无水脱水剂预脱水，再配合使用真空冻干工艺实现第一交联琼脂糖微球完全脱水，同时保证了处理效率。在真空冻干工艺过程中，第一交联琼脂糖微球可以很好地保持球形，不碎不粘连，能在高温有机溶剂中可以充分地溶胀，恢复到原尺寸。
在第二交联琼脂糖微球制备过程中，在纯有机体系建立后，使用了多环氧交联剂，即长链交联剂来固定琼脂糖微球表面的网孔和形成表面沟壑，从而建立起完整的孔隙结构。建立孔隙结构的首要特征是在无水体系中使用长链交联剂进行交联；建立起孔隙和沟壑后，再对微球进行活化，活化后再在无交联剂体系中，提高碱度进行内部交联，从而实现高强度第二交联琼脂糖微球的制备。
长链交联剂对强度的提升有限，因此本发明又使用ECH活化后在无交联剂微水有机环境中进行内交联，只让剩余的环氧基团和微球胶束上剩余的羟基进行交联，该方法可以避免ECH在交联过程中自聚延长链段将孔隙锁死的的副反应，先活化后内交联更准确地控制短链交联基团和羟基交联，只起到强度提升的作用。ECH内交联的主要特征是先将微球活化，然后清洗后在微水环境中，活化基团仅和羟基作用，只强化胶束，而不会拉近胶束。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本申请的实施例，并与说明书一起用于解释本申请的原理，通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。此外，附图仅为本公开的示意性图解，并非一定是按比例绘制。图中相同的附图标记表示相同或类似的部分，因而将省略对它们的重复描述。附图中所示的一些方框图是功能实体，不一定必须与物理或逻辑上独立的实体相对应。
图1为本发明一实施例的多孔琼脂糖微球制备方法的流程图；
图2为本发明一实施例的S10步骤使用不同交联剂在同等条件下获得的第一交联琼脂糖微球装柱后测得的压力与线性流速曲线图；
图3和图4分别为本发明的实施例一的第二交联琼脂糖微球表面和为多孔琼脂糖微球表面的扫描电镜照片；
图5和图6分别为本发明的实施例二的的第二交联琼脂糖微球表面和为多孔琼脂糖微球表面的扫描电镜照片；
图7和图8分别为本发明的实施例三的的第二交联琼脂糖微球表面和为多孔琼脂糖微球表面的扫描电镜照片；
图9为传统交联琼脂糖微球和本发明的各个步骤获得的琼脂糖微球的耐压测试结果图。
实施方式
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的范例；相反，提供这些实施方式使得本公开将更加全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式结合在一个或更多实施方式中。
在本说明书的表示中，参考术语“一个实施例”、 “一些实施例”、 “示例”、 “具体示例”、或“一些示例”等的表示意指结合该实施例或示例表示的具体特征、结构、材料或者特点包括于本说明书的至少一个实施例或示例中。而且，表示的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中表示的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
虽然在一些实例中术语第一、第二等在本文中用来表示各种溶剂、时间或反应，但是这些溶剂、时间或反应不应当被这些术语限制。这些术语仅用来将一个溶剂、时间或反应与另一个溶剂、时间或反应进行区分。例如，第一溶胀剂及第二溶胀剂等表示。再者，如同在本文中所使用的，单数形式“一”、 “一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文中有相反的指示。应当进一步理解，术语“包含”、 “包括”表明存在所述的特征、步骤、操作、种类、和/或组，但不排除一个或多个其他特征、步骤、操作、种类、和/或组的存在、出现或添加。此处使用的术语“或”和“和/或”被解释为包括性的，或意味着任一个或任何组合。因此，“A、B或C”或者“A、B和/或C”意味着“以下任一个：A；B；C；A和B；A和C；B和C；A、B和C”。仅当溶剂、步骤或操作的组合在某些方式下内在地互相排斥时，才会出现该定义的例外。
虽然未不同地定义，但包括此处使用的技术术语及科学术语，所有术语均具有与本说明书所属技术领域的技术人员一般理解的意义相同的意义。普通使用的字典中定义的术语追加解释为具有与相关技术文献和当前提示的内容相符的意义，只要未进行定义，不得过度解释为理想的或非常公式性的意义。
下面结合附图以及具体的实施例进一步阐述本发明的多孔琼脂糖微球制备方法及多孔琼脂糖微球，可以理解的是，各个具体实施例不作为本发明的保护范围的限制。
图1为本发明一实施例的多孔琼脂糖微球制备方法的流程图，具体地，该多孔琼脂糖微球制备方法包括如下步骤：
S10：琼脂糖微球在第一溶胀剂中溶胀；第一时间后在所述第一溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第一交联琼脂糖微球，所述第一溶胀剂为饱和盐溶液和/或无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液；S10步骤中可以采用糖浓度在2%~12%的琼脂糖微球，该些琼脂糖微球可以使用反渗透水（Reverses Osmosis，RO）充分清洗，抽干后获得的润湿的琼脂糖微球。所述碱液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；所述还原剂为硼氢化钠和/或硼氢化钾。
琼脂糖微球在微观上是由很多细小胶束纽结在一起，形成粗胶束后，搭建起网孔结构，在悬浮作用下形成的。为了固定胶束和保持网孔，常用的交联剂，有短链交联剂和长链交联剂，短链交联剂因为分子尺寸更小，更容易进入琼脂糖微球的胶束内部，在胶束表面发生交联起到胶束固定的作用；长链交联剂较难进入胶束内部，但是可以在网格结构中起到支撑网孔的作用。因此，S10步骤的第一溶胀剂为饱和盐溶液、无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液。在一实施例中，饱和盐溶液为饱和氯化钠溶液，无水有机溶剂为二甲基亚砜（DMSO），单环氧交联剂为最容易扩散进入微球内部的环氧氯丙烷（ECH）。考虑琼脂糖微球在二甲基亚砜无水有机溶剂中的耐受性，所述第一时间，即预溶胀的时间小于或等于1小时，第一时间可以根据使用的具体的无水有机溶剂，即琼脂糖微球在实际使用的无水有机溶剂确定，第一时间内需确保不出现琼脂糖微球的溶解、碎裂、褶皱等现象。
在S10步骤中，对不同种类交联剂做了评测，将使用不同的交联剂获得的第一交联琼脂糖微球装入直径为1.4cm，高为5cm的色谱柱，由上而下的注入液相（纯水），在色谱柱两端分别安装压力传感器，记录压力差随着液相流速的变化而变化的数值。图2为S10步骤使用不同交联剂在同等条件下获得的第一交联琼脂糖微球装柱后测得的压力与线性流速曲线图，其中，第一时间（预溶胀时间）小于1小时，可以看出，分子量较小的交联剂更容易溶胀进入微球内部，在1小时的预溶胀条件下，使用ECH的流量压力曲线的斜率最低，说明其交联强度提升最高，同时保持了较好的孔道结构。
S10步骤可以看成琼脂糖微球预交联的过程，由于琼脂糖微球本身比较脆弱，并且不能耐受高浓度的有机物，为了尽量减少水份同时又不被过高的有机溶剂损伤微球，本发明独创性地使用了饱和盐溶液、无水有机溶剂以及单环氧交联剂这类短链有机交联剂，制造双相环境，通过盐浓度来控制微球的自由水的含量，优选地，琼脂糖微球与饱和盐溶液的质量比为2/3~2；琼脂糖微球与无水有机溶剂的质量比为1~4。在预交联过程中，随着渗透的进行水份不断被脱出，原来的水环境被交联剂逐渐替代，短链有机交联剂进入胶束，从而大幅提升了交联的速率，第一交联琼脂糖微球同时又保持了琼脂糖微球的球形形状，并且获得了良好的基础强度，为后续交联打下了基础。
S10步骤具体使用时，环氧氯丙烷在以二甲基亚砜为溶剂的体系中充分溶解，使得环氧氯丙烷有充分的时间通过在溶剂中的扩散渗透到胶束内部，然后在抽滤干净多余的交联剂与溶剂，防止过度交联发生在胶束之间，即将第一交联反应控制在胶束的内部。通过使用交联剂加强琼脂糖微球的骨架（胶束）密度和骨架之间的交联键的数量，从而提升琼脂糖微球的强度。相较于采用比较温和的溶剂体系，比如水、乙醇、丙酮等，本发明的S10步骤更易于控制交联过程，避免一定程度的过度交联，从而影响琼脂糖微球最终偶联之后的应用，如制备成蛋白A亲和填料之后由于过度交联导致孔径较小，会影响最终的吸附载量。第一交联琼脂糖微球具备一定的初始强度，以便可以耐受住下一步的脱水以及后续的在纯DMSO溶剂体系内的反应强度。未经过S10步骤的微球会在后续的脱水工艺以及DMSO反应体系中损毁、溶解或形变。
琼脂糖微球交联过程的发生，是有机交联剂与琼脂糖微球上的羟基发生交联，从而提升强度。但琼脂糖微球本身比较脆弱，只能在水中或低浓度有机系中才能保持完整性。而水的存在一方面会消耗交联剂造成严重副反应，另一方面水与有机交联剂之间不互溶，交联剂难以与琼脂糖微球上的羟基接触，阻碍交联的顺利进行。为了实现琼脂糖交联强度提升的同时，又保持较好的孔隙，需要尽可能减少水的存在，乃至排除水份，让交联反应仅在有机体系中进行。此时需要尽可能将微球内的水脱除或脱干，创造微水或无水环境，以保证交联剂只与琼脂糖上的羟基交联。
为了实现脱水并且达到脱水后能够在强有机交联剂中保持球形完整，需要对微球进行预处理。本发明中，在获得第一交联琼脂糖微球后，执行S20步骤：使用无水脱水剂预脱水第一交联琼脂糖微球，使用真空冻干工艺对预脱水的第一交联琼脂糖微球再次脱水；所述无水脱水剂可以为二甲基亚砜、丙酮、二氧六环、乙醇或甲醇中的一种或多种。使用了丙酮等无水脱水剂替换常温条件的脱水不会损伤微球，无水脱水剂可以脱除第一交联琼脂糖微球80%的水份，进一步脱水使用了真空冻干工艺，所述真空冻干工艺的真空度小于或等于0.1mpa，所述真空冻干工艺的温度在-50℃~-70℃，真空冻干的时间可以根据琼脂糖微球状态设置在24至48小时。无水脱水剂与真空冻干工艺结合最终实现了高效的微球完全脱水，此时，琼脂糖微球呈绝干无水干粉状。
为了满足有机体系交联过程中琼脂糖微球球形的完整，使用单环氧交联剂，尤其是ECH对基球进行预处理，该预处理是与真空冻干脱水工艺有机结合在一起的。一方面是可以保证脱水时球形不塌缩，另一方面是保证了后续有机交联体系对脱水微球的充分溶胀，并且可以保护微球不被破坏。S20步骤中获得的完全脱水的第一交联琼脂糖微球在后续交联中可以使交联剂和溶剂与胶束发生充分溶胀，进而实现了更高的交联度，更完善的孔隙，更高的交联效率，完全避免水份存在造成的负面影响。
S30：脱水后的第一交联琼脂糖微球在第二溶胀剂中溶胀，第二时间后在所述第二溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第二交联琼脂糖微球，所述第二溶胀剂为无水不含活性基团的有机溶剂和多环氧交联剂混合液；所述无水不含活性基团的有机溶剂包括二甲基亚砜、丙酮或二氧六环；所述多环氧交联剂包括乙二醇二缩水甘油醚（EGDE）、季戊四醇缩水甘油醚（PEGE）或1,4丁二醇二缩水甘油醚（BEDE）。S30步骤中，活化是在完全脱水的第一交联琼脂糖微球上进行DMSO溶胀，使用EGDE、PEGE或BEDE等进行环氧活化，活化完成后，清洗掉交联剂，此种先经过活化，然后去掉多余交联剂后再次交联称为内交联。将该活化微球在微水有机系中实现活化的环氧基团和胶束上的羟基交联，而不存副反应和链段延长反应的发生，提升了微球的强度，又保持了完好的孔隙。S30步骤可以看成第一交联琼脂糖微球的再次内交联，同样地，该步骤中验证了不同环氧数量的交联剂对交联的影响，发现多环氧交联剂对微球表面沟壑的形成效果明显，但是强度有所欠缺，因此仅作为内交联前段工艺使用，而强度的提升还是S10步骤中的ECH等短链交联剂提供。S30步骤后，所述第二交联琼脂糖微球的强度大于或等于0.2mpa；所述第二交联琼脂糖微球的环氧密度大于或等于20μmol/g。
第二交联琼脂糖微球为长链修饰的微球，长链交联剂对微球的强度的提升有限，因此，本发明的制备方法还包括S40：第二交联琼脂糖微球在第三溶胀剂中溶胀，第三时间后在所述第三溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得多孔琼脂糖微球，所述第三溶胀剂为无水有机溶剂和环氧氯丙烷混合液。S30步骤和S40步骤的碱液和还原剂可以与S10步骤相同，可以分别为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液，以及硼氢化钠和/或硼氢化钾。
在上述步骤中，溶胀或交联的温度在20℃-50℃之间。S20和S30步骤的溶胀时间为0.5-6小时，碱液的质量分数为8-50%，还原剂的质量分数为0.1-0.5%，交联时间为4-18小时，其中，各个步骤反应过程中可以搅拌，搅拌转速80-180rpm。
S40步骤使用ECH活化后在无交联剂微水有机环境中进行内交联，只让剩余的环氧基团和微球胶束上剩余的羟基进行交联，可以避免ECH在交联过程中自聚延长链段将孔隙锁死的的副反应，先活化后内交联更准确地控制短链交联基团和羟基交联，只起到强度提升的作用。ECH内胶联的主要特征是先将微球活化，然后清洗后在微水环境中，仅活化基团和羟基作用，只强化胶束，而不会拉近胶束。
本发明中不需要进行双官能团活化，避免了溴和溴类衍生物的使用，节省反应步骤的同时，实现了相同的反应效果，反映了绿色工艺的优越性。为了进一步提升强度，使用短链或双环氧交联剂进行先活化，然后去除反应液，在纯惰性溶剂DMSO中进行内部交联的绿色工艺。
实施例一的具体步骤，使用的为4-6%浓度的琼脂糖微球，在S10步骤前，使用RO水充分清洗，抽干获得润湿的琼脂糖微球，S10步骤包括：
S11：在反应装置内加入1.2份的饱和氯化钠溶液；
S12：加入0.5份的DMSO；
S13：加入0.5份的ECH，加入1份润湿的琼脂糖微球，35℃搅拌1小时，搅拌转速为80-180rpm；
S14：加入 0.6份的50% 氢氧化钠溶液；
S15：加入 0.0025份的硼氢化钠，在42℃反应8小时后放料充分清洗后获得第一交联琼脂糖微球。所述份均为质量份。
S20步骤包括：
S21：在1份第一交联琼脂糖微球中加入1份的丙酮，浸泡30分钟后抽干，重复S21步骤至少3次；
S22：将抽干的第一交联琼脂糖微球置于托盘，放置在40℃烘箱烘干至无丙酮气味，第一交联琼脂糖微球呈干粉状；
S23：1份干粉状的第一交联琼脂糖微球置于托盘，放入-80℃预冻6小时以上；
S24：将预冻好的微球放入冷阱温度为-60℃的真空冻干机的冷冻室，抽真空至0.1mpa以下，冷冻24小时或36小时至物料冻成干粉状。
S30步骤包括：
S31a：在0.1份琼脂糖微球内加入1份的DMSO，溶胀温度为52℃；
S32a：加入0.5份的乙二醇二缩水甘油醚；
S33a：加入0.1份的50% 氢氧化钠溶液；
S34a：加入0.0025份的硼氢化钠，在52℃反应8小时后放料充分清洗获得第二交联琼脂糖微球。S30步骤使用乙二醇二缩水甘油醚交联剂，可以获得孔隙较大，并且表面沟壑较深的成孔微球，见图3的扫描电镜照片，第二交联琼脂糖微球强度为~0.25mpa，低环氧密度为~40μmol/g。
S40步骤包括：
S41a：在1份第二交联琼脂糖微球中加入1.2份DMSO，溶胀温度为52℃；
S42a：加入0.25份的ECH；
S43a：加入0.1份的50% 氢氧化钠溶液；
S44a：加入0.0025份的硼氢化钠，在52℃反应4小时；
S45a：加入0.4份的50% 氢氧化钠溶液，在62℃反应2小时；放料充分清洗获得多孔琼脂糖微球。多孔琼脂糖微球孔隙较大，见图4所示，并且其为高强度（~0.6mpa）的高流速低反压的成孔微球。
实施例二的具体步骤，实施例二与实施例一的S10步骤和S20步骤相同，其S30步骤包括：
S31b：在0.1份琼脂糖微球内加入1.5份的DMSO，溶胀温度为52℃；
S32b：加入0.5份的季戊四醇缩水甘油醚；
S33b：加入0.1份的50% 氢氧化钠溶液；
S34b：加入0.0025份的硼氢化钠，在52℃反应8小时后放料充分清洗获得第二交联琼脂糖微球。S30步骤使用季戊四醇缩水甘油醚交联剂，可以获得孔隙较大，并且表面沟壑较深的成孔微球，见图5的扫描电镜照片，第二交联琼脂糖微球强度为~0.2mpa，高环氧密度为~150μmol/g。
其S40步骤也与实施例一的S40步骤相同，获得的多孔琼脂糖微球孔隙较大、沟壑深，见图6所示，并且其为高强度（~1mpa）的高流速低反压的成孔微球。
实施例三的具体步骤，实施例三与实施例一的S10步骤和S20步骤相同，其S30步骤包括：
S31c：在0.1份琼脂糖微球内加入1.5份的DMSO，溶胀温度为52℃；
S32c：加入0.5份的1,4丁二醇二缩水甘油醚；
S33c：加入0.1份的50% 氢氧化钠溶液；
S34c：加入0.0025份的硼氢化钠，在52℃反应8小时后放料充分清洗获得第二交联琼脂糖微球。S30步骤使用1,4丁二醇二缩水甘油醚交联剂，可以获得孔隙较大，并且表面沟壑较深的成孔微球，见图7的扫描电镜照片，第二交联琼脂糖微球强度为~0.15mpa，低环氧密度为~20μmol/g。
其S40步骤也与实施例一的S40步骤相同，获得的多孔琼脂糖微球孔隙较大、沟壑深，见图8所示，并且其为高强度~1mpa的高流速低反压的成孔微球。
本发明还提供了一种多孔琼脂糖微球，所述多孔琼脂糖微球通过所述的制备方法获得。所述多孔琼脂糖微球的粒径为15~200μm；所述多孔琼脂糖微球具有多孔结构，且多孔结构的孔径为100~200nm；所述多孔琼脂糖微球的强度大于或等于0.5mpa，见图9，图9展示了传统交联球（传统工艺制备的短链交联的琼脂糖微球以及传统工艺制备的长链交联的琼脂糖微球）与本发明各个步骤后获得的琼脂糖微球的耐压测试结果图，其中，经过脱干工艺（步骤S20）和二次交联（S30步骤）后的琼脂糖微球的强度均大于或等于0.2mpa。经过第三次交联（S40步骤）后的多孔琼脂糖微球的强度进一步的优于二次交联后的琼脂糖微球，见图9中的实施例三获得的多孔琼脂糖微球，其强度大于0.5mpa。上述耐压测试结果显示本发明制备的多孔琼脂糖微球的耐压能力优于传统交联球。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域技术人员而言，显然本申请不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本申请的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本申请。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本申请的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化涵括在本申请内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.一种多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
S10：琼脂糖微球在第一溶胀剂中溶胀；第一时间后在所述第一溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第一交联琼脂糖微球，所述第一溶胀剂为饱和盐溶液和/或无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液；
S20：使用无水脱水剂预脱水第一交联琼脂糖微球，使用真空冻干工艺对预脱水的第一交联琼脂糖微球再次脱水；
S30：脱水后的第一交联琼脂糖微球在第二溶胀剂中溶胀，第二时间后在所述第二溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得第二交联琼脂糖微球，所述第二溶胀剂为无水不含活性基团的有机溶剂和多环氧交联剂混合液；
S40：第二交联琼脂糖微球在第三溶胀剂中溶胀，第三时间后在所述第三溶胀剂中加入碱液和还原剂，获得多孔琼脂糖微球，所述第三溶胀剂为无水有机溶剂和环氧氯丙烷混合液。
2.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述第一时间小于或等于1小时；和/或
所述单环氧交联剂为环氧氯丙烷。
3.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述第一溶胀剂为饱和盐溶液、无水有机溶剂与单环氧交联剂混合液，且有：
所述琼脂糖微球与所述饱和盐溶液的质量比为2/3~2；
所述琼脂糖微球与所述无水有机溶剂的质量比为1~4。
4.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述无水脱水剂为二甲基亚砜、丙酮、二氧六环、乙醇或甲醇中的一种或多种。
5. 根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述真空冻干工艺的真空度小于或等于0.1mpa，所述真空冻干工艺的温度在-50℃~-70℃。
6.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述碱液为氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液；和/或
所述还原剂为硼氢化钠和/或硼氢化钾。
7.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述第二交联琼脂糖微球的强度大于或等于0.2mpa；和/或
所述第二交联琼脂糖微球的环氧密度大于或等于20μmol/g。
8.根据权利要求1所述的多孔琼脂糖微球制备方法，其特征在于，所述无水不含活性基团的有机溶剂包括二甲基亚砜、丙酮或二氧六环；和/或
所述多环氧交联剂包括乙二醇二缩水甘油醚、季戊四醇缩水甘油醚或1,4丁二醇二缩水甘油醚。
9.一种多孔琼脂糖微球，其特征在于，所述多孔琼脂糖微球通过权利要求1至8任一项所述的制备方法获得。
10.根据权利要求9所述的多孔琼脂糖微球，其特征在于，所述多孔琼脂糖微球满足如下至少一个条件：
所述多孔琼脂糖微球的粒径为15~200μm；
所述多孔琼脂糖微球具有多孔结构；
所述多孔琼脂糖微球的多孔结构的孔径为100~200nm；
所述多孔琼脂糖微球的强度大于或等于0.5mpa。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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