CN116808176A - 一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用 - Google Patents
一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用，所述抗肿瘤药物组合物包含：盐酸帕罗西汀，以及T细胞增强剂，所述T细胞增强剂为维生素E和胸腺肽中的至少一种。本发明通过一系列体内外实验，首次发现大麻二酚和盐酸帕罗西汀能有效降低肿瘤细胞膜上PD‑L1的表达，进而阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用；在此基础上加入的T细胞增强剂能进一步提高T细胞的数量和活性，并显著增强解除免疫抑制后T细胞的杀伤能力，极大的提高药物的抗肿瘤作用。本发明药物组合物的成分大麻二酚、盐酸帕罗西汀以及维生素E+胸腺肽能发挥协同作用，提高抗肿瘤效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学的不断创新与发展，肿瘤免疫治疗（Cancer immunotherapy，CIT）已在多种类型的肿瘤治疗中取得显著的效果，给肿瘤患者带来希望。
目前，在肿瘤免疫治疗中，针对免疫检查点（Immune checkpoint）PD-1/PD-L1的相关疗法备受瞩目。程序性细胞死亡蛋白1（Programmed cell death protein 1，PD-1）是一种重要的免疫抑制分子，其广泛表达于激活的T细胞中，是激活型T细胞的一种表面受体，PD-1的受体PD-L1（programmed death ligand 1）在正常组织中几乎检测不到，而人类多种肿瘤组织中富含PD-L1。PD-1与PD-L1结合后，会对T细胞发出免疫抑制信号，抑制T细胞的活化，阻止其对肿瘤细胞的杀伤，造成肿瘤免疫逃逸。阻断PD-1/PD-L1的相互作用可恢复肿瘤特异性T细胞的功能效应。PD-1/PD-L1相关的免疫检查点抑制治疗是肿瘤免疫治疗的理想手段，目前已有多种针对PD 1/PD L1的单克隆抗体走向市场，研究发现，对anti-PD-1/PD-L1抗体响应较好的实体肿瘤，例如黑色素瘤、肾癌和非小细胞肺癌等，治疗有效率和PD-L1的阳性表达成正相关，然而由于抗体治疗有很多副作用，目前仅有少数患者受益。
发明内容
本发明针对现有anti-PD-1/PD-L1抗体免疫治疗存在副作用大、患者受益小的问题，提供一种新的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物及其应用，所述抗肿瘤药物组合物能够抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物组合物包含：盐酸帕罗西汀，以及T细胞增强剂，所述T细胞增强剂为维生素E和胸腺肽中的至少一种。
优选地，所述抗肿瘤药物组合物还包含大麻二酚。
优选地，所述抗肿瘤药物组合物由大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽组成。
优选地，所述药物组合物中，大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽的质量用量比为：（20~500）：（1~100）：（10~400）：（1~60）。
优选地，所述药物组合物还包括：药学上可接受的载体、赋形剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂中的至少一种。
优选地，所述药物组合物的剂型包含油剂、颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、微囊制剂、丸剂、粉剂、口服液、溶胶剂、喷剂、雾化剂中的至少一种。
本发明另一个目的是提供前面所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、乳腺癌、黑色素瘤中的任意一种。
优选地，所述药物组合中大麻二酚、盐酸帕罗西汀均分别能够抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
相对于现有技术，本发明的有益效果至少包括：
（1）本发明经过一系列体外细胞实验，首次发现并证实大麻二酚和盐酸帕罗西汀能有效降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达，进而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
（2）本发明提供的抗肿瘤药物是基于免疫检查点抑制和T细胞增强的联合用药组合，其中，大麻二酚和盐酸帕罗西汀能有效抑制肿瘤细胞表面PD-L1的表达，大大减轻T细胞活化受到抑制的作用；另外，在此基础上加入的T细胞增强剂能进一步提高T细胞的数量和活性，并显著增强解除免疫抑制后T细胞的杀伤能力，两方面共同作用，显著提高了药物的抗肿瘤作用。更重要的是，相较于anti-PD-1/PD-L1抗体免疫治疗，本发明药物中的CBD和PAR直接作用于肿瘤细胞表面的PD-L1，更具针对性，更不容易引起T细胞对正常组织的损伤，避免副作用的发生。
（3）经实验证明，本发明提供的药物组合物成分大麻二酚、盐酸帕罗西以及维生素E+胸腺肽能发挥协同作用，提高抗肿瘤效果。
附图说明
图1为不同类型肿瘤细胞经不同浓度CBD处理后的细胞增殖对比。
图2为不同类型肿瘤细胞经不同浓度CBD处理后细胞中PD-L1的表达对比，其中：
A为RKO细胞中的PD-L1表达结果；
B为H1975细胞中的PD-L1表达结果；
C为A549细胞中的PD-L1表达结果。
图3为不同类型肿瘤细胞经不同浓度CBD处理后细胞膜上PD-L1的表达对比，其中，
A为HCT116细胞膜上的PD-L1表达结果；
B为RKO细胞膜上的PD-L1表达结果；
C为H460 细胞膜上的PD-L1表达结果；
D为A549细胞膜上的PD-L1表达结果；
E为H1975细胞膜上的PD-L1表达结果；
F为HT29 细胞膜上的PD-L1表达结果。
图4为RKO细胞经同一浓度CBD处理不同时间后细胞膜上PD-L1的表达对比。
图5为RKO细胞经CBD和NK92细胞共处理后的细胞存活率对比。
图6为结直肠癌小鼠经不同药物组合物治疗后的抗肿瘤效果对比，其中：
A为各组小鼠的肿瘤组织照片；
B为各组小鼠的肿瘤体积的生长曲线；
C 为各组小鼠的体重生长曲线；
D 为各组小鼠的肿瘤重量的生长曲线；
图7为结直肠癌免疫缺陷型小鼠经不同药物组合物治疗后的抗肿瘤效果对比，其中：
A为各组小鼠的肿瘤组织照片；
B为各组小鼠的肿瘤体积的生长曲线；
C 为各组小鼠的肿瘤重量的生长曲线；
D 为各组小鼠的体重生长曲线；
图8为不同类型肿瘤细胞经3种药物组合物和NK92细胞共处理后的细胞存活率对比，其中：
A为RKO细胞的存活率对比；
B为H1975细胞的存活率对比；
C为HepG2细胞的存活率对比；
D为MGC803细胞的存活率对比。
图9为不同类型肿瘤细胞经3种药物组合物和NK92细胞共处理后的细胞存活率对比，其中：
E为T24细胞的存活率对比；
F为TE-5细胞的存活率对比；
G为MCF-7细胞的存活率对比；
H为B16-F10细胞的存活率对比；
其中，Control组表示不给予任何药物。
图10为结直肠癌小鼠经CBD+维生素E+胸腺肽或CBD+青蒿素+维生素E+胸腺肽治疗后的抗肿瘤效果对比。
图11为结直肠癌小鼠经CBD、姜黄素+胡椒碱、CBD+姜黄素+胡椒碱、CBD+姜黄素+胡椒碱+维生素E或CBD+姜黄素+胡椒碱+维生素E+胸腺肽治疗后的抗肿瘤效果对比。
实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
正如背景技术所述，现有anti-PD-1/PD-L1抗体免疫治疗存在副作用大、患者受益小的问题。肿瘤细胞中PD-L1的表达可能影响PD-1/PD-L1相关免疫检查点治疗的临床药效，靶向调控PD-L1表达的小分子有望成为一种新的治疗方式，寻找负向调控PD-L1表达的小分子有可能成为免疫治疗过程中的新方案。
为此，本发明尝试寻找负向调控PD-L1表达的小分子，以期阻断肿瘤中PD-1/PD-L1通路，增强T细胞活性，杀死肿瘤细胞。本发明经过大量实验筛选和验证，最终提出一种新的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，包括：大麻二酚和/或盐酸帕罗西汀，以及T细胞增强剂。其中：
大麻二酚（cannabidiol，CBD）是大麻提取物之一，目前已被广泛开发用于医用护肤品、具有情绪改善功能的饮料或食品等领域。近年来，尽管越来越多的研究表明CBD在不同类型肿瘤中具有抗肿瘤活性，但抗肿瘤机制尚不完全清楚，且在不同类型肿瘤中差异较大。而本发明首次研究发现，CBD能有效降低肿瘤中PD-L1的表达，有望应用到肿瘤免疫治疗中。
盐酸帕罗西汀（Paroxetine Hydrochloride，PAR）是一种抗抑郁药。本发明经过实验发现，盐酸帕罗西汀也同样展现出降低肿瘤细胞中PD-L1表达的作用，因此盐酸帕罗西汀也可以作为负向调控肿瘤细胞中PD-L1表达的候选药物。
基于上述研究发现，本发明进一步设计将CBD或PAR与T细胞增强剂联合使用。所述T细胞增强剂包括以下作用中的任意一种或多种：（1）促进T细胞的增殖和分化，提高T细胞的百分比或绝对数量；（2）增强T细胞的活性，提高T细胞免疫功能。这样设计的构思为：CBD和PAR能够降低肿瘤细胞中PD-L1表达，大大减轻了T细胞活化受到抑制的程度，在此基础上，加入T细胞增强剂，T细胞的数量和活性能得到提高，并显著增强解除免疫抑制后T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。可以理解，若在PD-L1的表达没有受到抑制的情况下加入T细胞增强剂，即使T细胞增强剂能够促进T细胞增殖、分化，但T细胞的活化仍会被PD-1/PD-L1通路抑制，T细胞增强剂的作用因而被大大降低。因此，本发明将CBD或PAR与T细胞增强剂联用，以期药物组合物发挥协同效应，提高药物的抗肿瘤活性。
一些实施例中，所述T细胞增强剂包括：维生素E和胸腺肽中的至少一种。维生素E是一种重要的抗氧化剂，但它同时也是有效的免疫调节剂，能够促进机体免疫器官的发育和免疫细胞的分化，提高机体细胞免疫和体液免疫的功能；胸腺肽是来源于小牛、猪或羊的胸腺组织提取物，是一种可溶性多肽，其可增强T细胞免疫功能，用于治疗先天或获得性T细胞免疫缺陷病、自身免疫性疾病和肿瘤。
一些实施例中，所述抗肿瘤药物组合物由大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽组成。其中，所述大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽的用量比为：（20~500）：（1~100）：（10~400）：（1~60）。
一些实施例中，所述药物组合物还包括：药学上可接受的载体、赋形剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂。
合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。 在使用时，是将安全有效量的本发明所述抗肿瘤药物施用于哺乳动物（如人）。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。 对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。
一些实施例中，所述药物组合物的剂型包含油剂、颗粒剂、片剂、散剂、胶囊、丸剂、粉剂、口服液、溶胶剂、喷剂、雾化剂等。
本发明另一方面还提供了前面所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
一些实施例中，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、乳腺癌、黑色素瘤中的任意一种。
下面结合附图以及实施例对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明，从而详细阐述本发明抗肿瘤药物组合物能够抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，大麻二酚购买自玉溪鸿宝生物科技有限公司；盐酸帕罗西汀购买自MCE公司，货号BRL29060A；胸腺肽肠溶片购买自黑龙江迪龙制药制药有限公司（国药准字H20058365）；维生素E购买自RD公司（货号A04GS156945）；Anti-PD-1购买自Bioxcell公司（Ultra-LEAF™ Purifiedanti-mouse CD279（PD-1，BE0146）；玉米油购自金太阳粮油公司；姜黄素购买于MCE公司，货号HY-N0005 ；辣椒碱购自MCE公司，货号HY-10448 ；青蒿素购自MCE公司，货号HY-B0094 。本发明实施例中所用实验细胞均购自ATCC（American Type Culture Collection）。
实施例1 CBD对体外培养的肿瘤细胞的影响
（一） 实验过程。
1、 CBD对体外培养的肿瘤细胞的增殖作用
将处于对数生长期的不同类型肿瘤细胞（结直肠癌细胞RKO、肺癌细胞H1975、肺癌细胞A549）分别接种于96孔板中，接种密度为每孔5×103个细胞，随后置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育24 h；将CBD母液（10 mM）用培养基分别稀释至5、10、20 μM，吸走96孔板中的旧培养基，每孔加入100 μL含不同浓度CBD的培养基，并设置对照孔（0 μM CBD），继续孵育24 h。培养结束后，用EDU试剂盒（碧云天，C0085S）检测肿瘤细胞的增殖数量。最后利用高内涵成像分析系统拍照并统计数据。
2、 CBD对肿瘤细胞中PD-L1表达的影响
将生长状态良好、密度在80%以上的不同类型肿瘤细胞（结直肠癌细胞RKO、肺癌细胞H1975、肺癌细胞A549）分别铺到6孔板中，密度为5×104个细胞/孔，每孔混悬液体积为2mL，随后置于37℃培养箱中培养。培养12 h且细胞完全贴壁后，分别给予不同浓度（0、10、20、30、40 μM）的CBD；继续培养24 h后，终止培养并进行后续检测；
终止培养后，收集细胞并用冷PBS洗涤2次，待PBS残留除尽后，加入适量的细胞裂解液进行裂解，并在冰上孵育15 min，之后在4℃离心机上12000 rpm离心15 min，小心吸取上清，并用BCA方法进行蛋白浓度测定，然后加入相应量的Loading buffer，摇匀后在100℃水浴锅孵育10 min，最后将样品进行蛋白质免疫印迹实验。
3、 CBD对肿瘤细胞膜上PD-L1表达的影响
（1）将处于生长对数期的不同类型肿瘤细胞（结肠癌细胞RKO、HCT116和HT29以及肺癌细胞A549、H1975和H460）分别接种于6孔板中，接种密度为每孔2.5×105个/mL细胞，每孔2 mL，随后置于细胞培养箱孵育过夜；吸去培养液，加入不同浓度（0、5、10、20 μM）的CBD处理24 h，去上清，PBS洗2遍，用胰酶消化细胞后，300 g、4℃条件下离心5 min，收集细胞；用预冷的PBS洗涤细胞2次，300 g、4℃条件下离心5 min，收集细胞；用预冷的PBS洗涤细胞2次，加入100 μL PBS重悬细胞，加入Anti-PD-L1-Alexa Fluor 647抗体室温孵育30 min，300 g、4℃条件下离心5 min，加入300 μL PBS重悬细胞于流式管中，采用流式细胞仪检测样品的Alexa Fluor 647信号（激发/发射波长为647 nm/666 nm)；
（2）将处于生长对数期的结直肠癌细胞（RKO）接种于6孔板中，密度为2.5×105个细胞/孔，每孔混悬液体积为2 mL，放入细胞培养箱孵育过夜，吸去培养液，加入20 μM CBD处理12 h，去上清，PBS洗涤2遍后，加入多聚甲醛固定15 min，然后加入5% BSA固定1h，PBST洗涤2遍后，加入PD-L1抗体进行过夜孵育，加入红色荧光抗体进行室温孵育1 h后，加入DAPI染色10 min，最后用激光共聚焦显微镜进行拍照分析。
4、 CBD增强T细胞体外杀伤肿瘤细胞的研究
将处于对数生长期的RKO细胞接种于12孔板中，密度为5×104个细胞/mL，置于5%CO2培养箱中贴壁生长过夜，去上清，加入不同浓度（0、5、10、20 μM）的CBD，共同孵育12 h；按1：500加入NK-92细胞（T细胞），培养24 h，同时设置不加NK-92细胞的对照组；去上清，PBS洗涤2遍后，加入4%多聚甲醛固定细胞；再用PBS洗涤2遍，加入结晶紫染色30 min，最后用PBS洗去多余的结晶紫，拍照收集数据；
（二） 实验结果
1、CBD体外对肿瘤细胞无明显毒性
如图1所示，同一类型肿瘤细胞经不同浓度CBD处理后，细胞的荧光强度没有明显的差异。这一结果说明，当体外培养的肿瘤细胞中仅加入CBD时，CBD对肿瘤细胞没有明显的毒性。需要进一步对CBD的抗肿瘤机制进行研究。
2、CBD降低肿瘤细胞中PD-L1的表达
如图2中A-C图所示，蛋白质免疫印迹实验结果显示，CBD能显著抑制结直肠癌细胞（RKO）和肺癌细胞（H1975和A549）中PD-L1的表达，并在5 μM、10 μM和20 μM时呈浓度依赖性。
3、 CBD降低癌细胞膜上PD-L1的表达且呈浓度、时间依赖性
如图3和图4所示，流式检测结果显示，CBD呈浓度依赖性（5 μM、10 μM和20 μM）地降低结肠癌细胞（RKO、HCT116和HT29）以及肺癌细胞（A549、H1975和H460）细胞膜上PD-L1的表达。免疫荧光结果显示，CBD在20μM时，呈时间依赖性地降低结肠癌细胞（RKO）膜上PD-L1的表达。
4、CBD增强T细胞体外杀伤癌细胞
基于前述实验结果2和3，在肿瘤细胞中加入CBD和T细胞（NK-92细胞）进行体外共培养，研究CBD对T细胞体外杀伤肿瘤细胞的影响；
结果如图5所示，与对照组相比，CBD+T细胞共培养处理能显著降低RKO细胞的存活率，并诱导RKO细胞的凋亡。这一结果表明，CBD通过下调RKO细胞中PD-L1的表达，增强了T细胞对RKO细胞的细胞毒性，并且在5 μM、10 μM和20 μM时成浓度依赖性。
实施例2 CBD和盐酸帕罗西汀的不同药物组合物的体内抗肿瘤作用
（一） 实验过程
1、将结直肠癌细胞MC38接种于6周龄雌性C57BL小鼠（1×106个细胞/只）体内建立皮下瘤模型。肿瘤体积达到50 mm3后，将小鼠按以下药物组合进行分组和给药：（1）对照组（不给药），（2）anti-PD-1（100 μg/每次）组，（3）anti-CTLA4（100 μg/每次）组，（4）CBD（100mg/kg）组，（5）CBD （100 mg/kg）+ anti-CTLA4（100 μg/每次）组，（6）PAR（10 mg/kg）组，（7）PAR（10 mg/kg）+ anti-CTLA4（100 μg/每次）组，（8）CBD（100 mg/kg）+ PAR（10 mg/kg）组，（9）维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组，（10）CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg），（11）PAR（10 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg），（12）PAR（10 mg/kg）+CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组，（13）CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）+anti-CTLA4（100 μg/每次）组，（14）PAR（10mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）+anti-CTLA4（100 μg/每次）组，（15）CBD（100 mg/kg）+ PAR（10 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）+anti-CTLA4（100 μg/每次）组。每2天监测一次小鼠肿瘤重量、体积以及小鼠体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm3）=0.5×（长）×（宽）2。给药14天后处死小鼠，解剖肿瘤；
其中，药物组合物的溶解方式为：10%DMSO+玉米油，灌胃100 μl/只，对照组小鼠注射等体积相同溶剂。
2、将结肠癌细胞MC38接种于6周龄雌性裸鼠小鼠（1×106 个细胞/只）体内建立皮下瘤模型。肿瘤体积达到50 mm3后，将小鼠按以下药物组合进行分组和给药：（1）对照组，（2）CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组，（3）PAR（10 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组，（4）PAR（10 mg/kg）+CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组。每2天监测一次小鼠肿瘤重量、体积以及小鼠体重。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm3）=0.5×（长）×（宽）2。给药14天后处死小鼠，解剖肿瘤；
（二） 实验结果
1、CBD和盐酸帕罗西汀的不同药物组合物在正常小鼠体内发挥抗肿瘤作用。
如图6中A-D图所示，对比组（1）（2）（4）（6）的实验结果可见，CBD和PAR的治疗作用相当，且两者与现有常用的anti-PD-1抗体的治疗作用也相当。进一步对比组（1）（4）（6）（8）的实验结果可见，相较于单独使用CBD和PAR，联合使用CBD+PAR时，抑制肿瘤效果更好，具有协同效应。
当加入T细胞增强剂（维生素E+胸腺肽）处理后，对比组（1）（4）（9）（10）的实验结果可见，单独使用维生素E+胸腺肽无明显治疗效果，而当CBD与维生素E+胸腺肽联合使用时，治疗效果相较于单独使用CBD、维生素E+胸腺肽治疗时会更好，具有协同效应。
同样地，对比组（1）（6）（9）（11）的实验结果可见，当PAR与维生素E+胸腺肽联合使用时，治疗效果相较于单独使用PAR、维生素E+胸腺肽治疗时也会更好，同样具有协同效应。
对比组（1）（8）（9）（12）的实验结果可见，相较于单独使用CBD+PAR、维生素E+胸腺肽，CBD+PAR+维生素E+胸腺肽联合使用时，抑制肿瘤生长作用更强，具有协同效应。
以上结果表明，本发明提供的药物组合物中，CBD和PAR中的任意一种或两种与T细胞增强剂（维生素E+胸腺肽）联合使用时，会发挥协同效应，产生更强的抗肿瘤作用。
2、CBD和盐酸帕罗西汀的3种组合物在T细胞缺失小鼠体内无抗肿瘤作用。
基于上述研究结果，将抗肿瘤作用较好的3种组合物注射入裸鼠体内，探究其对免疫缺陷型小鼠体内肿瘤的影响。
结果如图7中A-D图所示，4组小鼠的肿瘤体积大小均没有显著性差异，也就是说，3种组合药物（CBD+维生素E+胸腺肽；PAR+维生素E+胸腺肽；PAR+CBD+维生素E+胸腺肽）都对裸鼠的肿瘤没有治疗作用。
以上结果表明，当体内不存在没有T细胞时，3种组合物无法发挥明显的抗肿瘤作用。
3、CBD和盐酸帕罗西汀的3种组合物联用其他免疫检查点抑制剂发挥更优异的抗肿瘤作用
本发明还尝试在抗肿瘤作用较好的3种组合物中加入其他免疫检查点抑制剂，以期得到抗肿瘤作用更优异的药物组合物。本实施例采用anti-CTLA4抗。
如图6中A-D图所示，对比组（10）至（15）的实验结果可见，在3种组合物中加入anti-CTLA4抗体后，药物组合物发挥协同效应，具有更显著的抗肿瘤作用，其中CBD+PAR+维生素E+胸腺肽+anti-CTLA4组合物相较于其他组合物，展现出了最优的抗肿瘤作用。
实施例3 3种组合物增强T细胞体外杀伤不同类型的肿瘤细胞
（一）实验过程
基于实施例2的研究结果，将抗肿瘤作用较好的3种组合物与T细胞共同加入到不同类型的肿瘤细胞中进行研究。具体实验过程如下：
将处于对数生长期的结直肠癌细胞（RKO）、肺癌（H1975）、肝癌（HepG2）、胃癌细胞（MGC-803）、膀胱癌细胞（T24）、食管癌细胞（TE-5）、乳腺癌（MCF-7）及黑色素瘤（B16-F10）以5×104个/mL的密度接种于12孔板中，置于37℃，5%CO2培养箱贴壁生长过夜，去上清，分别加入PAR+维生素E+胸腺肽组合物、CBD+维生素E+胸腺肽组合物或PAR+CBD+维生素E+胸腺肽组合物培养基，同时设置空白培养基作为对照组，共同孵育12 h。按1：500加入NK-92细胞，培养24 h；去上清，PBS洗涤2遍后，加入4%多聚甲醛固定细胞；再用PBS洗涤2遍后，加入结晶紫染色30 min，最后用PBS洗去多余的结晶紫，拍照收集数据；
（二）实验结果
如图8中A-D图和图9中E-H图所示，与对照组相比，3种药物组合物和T细胞共培养处理能显著降低结直肠癌细胞（RKO）、肺癌（H1975）、肝癌（HepG2）、胃癌细胞（MGC-803）、膀胱癌细胞（T24）、食管癌细胞（TE-5）、乳腺癌（MCF-7）及黑色素瘤（B16-F10）的存活率，并诱导肿瘤细胞的凋亡。这些结果表明，本发明提供的3种药物组合物均能通过下调肿瘤细胞中PD-L1的表达来增强T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。
实施例4 CBD和青蒿素组合物、CBD和姜黄素组合物的体内抗肿瘤作用
（一）实验过程
本发明还尝试加入其它可能对T细胞的数量或活性具有调节作用的物质或具有抗肿瘤效果的物质，以得到发挥协同效应的不同药物组合物。本实施例采用了青蒿素和姜黄素+胡椒碱。其中，青蒿素有报道称可以抗肿瘤，姜黄素和胡椒碱也有报道公开其具有免疫调节作用。
具体实验过程如下：
将结肠癌细胞MC38接种于6周龄雌性SCID小鼠（1×106 个细胞/只）体内建立皮下瘤模型。肿瘤体积达到50 mm3后，青蒿素给药组的小鼠按以下药物组合进行分组和给药：（1）对照组，（2）CBD（100 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）组，（3）CBD（100mg/kg）+青蒿素（20 mg/kg）+维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）。姜黄素给药组的小鼠按以下药物组合进行分组和给药：（1）对照组，（2）CBD（100 mg/kg）组，（3）姜黄素（50 mg/kg）+胡椒碱（1 mg/kg）组，（4）CBD（100 mg/kg）+姜黄素（50 mg/kg）+胡椒碱组（1 mg/kg），（5）CBD（100 mg/kg）+姜黄素（50 mg/kg）+胡椒碱（1 mg/kg） +维生素E（50 mg/kg）+胸腺肽（2 mg/kg）。
每2天监测一次小鼠肿瘤生长体积。肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积（mm3）=0.5×（长）×（宽）2。给药14天后处死小鼠，解剖肿瘤。其中，药物组合物的溶解方式为：10%DMSO+玉米油，灌胃100 μl/只，对照组小鼠注射等体积相同溶剂；
（二）实验结果
如图10所示，与对照组相比，CBD+维生素E+胸腺肽组和CBD+维生素E +胸腺肽+青蒿素组小鼠的肿瘤生长得到抑制，但两者的抗肿瘤作用没有明显差异，说明青蒿素的加入并不能进一步提高CBD+维生素E+胸腺肽组合物的抗肿瘤作用。
如图11所示，与对照组相比，CBD组小鼠的肿瘤生长得到一定的抑制，而姜黄素+胡椒碱组小鼠的肿瘤生长没有受到明显抑制。另外，CBD+姜黄素+胡椒碱、CBD+姜黄素+胡椒碱+维生素E及CBD+姜黄素+胡椒碱+维生素E+胸腺肽这几种药物组合物的抗肿瘤效果相当，且相较于单用CBD的效果，这几种药物组合物没有展现出明显优势，说明并不是所有的组合都能达到协同增强抗肿瘤的效果。
综上所述，本发明提供了一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，所述抗肿瘤药物组合物包含：大麻二酚和/或盐酸帕罗西汀，以及T细胞增强剂。并通过一系列体内外实验研究了药物组合物对肿瘤细胞膜上PD-L1表达以及对肿瘤细胞杀伤作用的影响，结果发现CBD与盐酸帕罗西汀能显著下调癌细胞表面PD-L1的表达，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用；此外，经实验证明，本发明提供的药物成分大麻二酚、盐酸帕罗西以及维生素E+胸腺肽在进行不同组合时能发挥协同作用，提高抗肿瘤效果。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一种基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物包含：盐酸帕罗西汀，以及T细胞增强剂，所述T细胞增强剂为维生素E和胸腺肽中的至少一种。
2.如权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物还包含大麻二酚。
3.如权利要求2所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物由大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽组成。
4.如权利要求3所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，大麻二酚、盐酸帕罗西汀、维生素E和胸腺肽的质量用量比为：（20~500）：（1~100）：（10~400）：（1~60）。
5.如权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括：药学上可接受的载体、赋形剂、润湿剂、乳化剂、pH缓冲剂中的至少一种。
6.如权利要求1所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包含油剂、颗粒剂、片剂、散剂、胶囊剂、微囊制剂、丸剂、粉剂、口服液、溶胶剂、喷剂、雾化剂中的至少一种。
7.权利要求1-6中任一项所述的基于免疫检查点阻断的抗肿瘤药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、乳腺癌、黑色素瘤中的任意一种。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物组合中大麻二酚、盐酸帕罗西汀均分别能够抑制肿瘤细胞表面PD-L1蛋白的表达，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，增强T细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
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