CN116804198A - 长牡蛎富锌相关锌转运蛋白zip1-ii的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白(ZIP1‑II)的分子标记及其应用。分子标记为SEQ ID NO:1所示长牡蛎锌转运蛋白ZIP1‑II核苷酸序列5’端起第260个碱基为A或G。本发明首次从长牡蛎锌转运蛋白ZIP1‑II基因外显子区筛选到与富锌性状相关的分子标记，建立了富锌标记基因型的快速检测方法和富锌性状的分子标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作便捷等特点，适用于牡蛎锌含量的快速评估和富锌良种的选育。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术领域，具体的说是一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白(ZIP1-II)的分子标记及其应用。
背景技术
锌是生物体必需的微量元素，锌缺乏可引发生长迟缓、免疫受损、神经系统异常、生殖功能障碍等多种疾病，威胁着全球近三分之一人口的生命健康。长牡蛎作为锌含量最高的水产养殖动物之一，在改善人类锌营养等方面具有巨大的应用潜力。然而，长牡蛎体内锌含量个体差异大、易受环境因素影响，且其测量流程复杂。挖掘与锌含量紧密连锁的分子标记，对于准确评估长牡蛎富锌能力、培育富锌牡蛎新品种具有重要的应用价值。
锌转运蛋白是介导锌离子跨膜运输的主要蛋白，广泛参与锌元素的吸收、转运和区隔等过程，在调控细胞锌含量、维持机体锌稳态等方面发挥重要作用。ZIP1是最先被鉴定的锌转运蛋白家族成员之一，其广泛表达于多种组织和细胞类型中，是机体重要的锌吸收蛋白。课题组前期研究发现，ZIP1在长牡蛎基因组中出现了显著扩张，其中长牡蛎CgZIP1-II的mRNA在鳃、肝胰腺等锌含量高的组织中表达量相对较高，推测其与长牡蛎的锌吸收能力密切相关。以CgZIP1-II为靶标基因，筛选与长牡蛎锌含量相关的分子标记并配套开发快速分型技术，有助于推动富锌牡蛎新品种的培育进程，对于改善人类锌营养具有积极意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记及其辅助育种方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记，分子标记为SEQ ID NO:1所示长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II核苷酸序列5’端起第260个碱基为A或G。
所述分子标记为SEQ ID NO:1所示序列5’端起第260个碱基存在A>G突变，其富锌基因型为260AG。
所述长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的获得，按如下步骤：
1.长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区部分序列的克隆：以长牡蛎闭壳肌的总DNA为模板，以引物CgZIP1-IIF和CgZIP1-IIR扩增得到DNA序列，待用；引物序列CgZIP1-IIF(5′-ACCGTTTGCCTTGTTGAGGA-3′)，CgZIP1-IIR(5′-GACTCTGCAAGACACCGGAA-3′)。
2.锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的筛选：采集来自同一养殖海区的长牡蛎成体41个，利用所述引物扩增ZIP1-II基因外显子区序列并进行测序，对多态性位点基因型和表型数据进行相关性分析，发现260A/G位点与长牡蛎锌含量显著相关。再提取来自同一养殖海区的50个高锌个体和50个低锌个体的基因组DNA，针对260A/G位点，首先PCR扩增锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列，然后利用Nde I内切酶对PCR产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳后，得到AA和AG两种基因型，经卡方检验分析，AG个体在高锌群体中出现的频率显著高于低锌群体，因此260A/G可作为长牡蛎锌含量相关的分子标记，260AG为富锌基因型。
一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的应用，所述分子标记在鉴定或辅助鉴定长牡蛎锌含量和长牡蛎辅助育种中的应用。
一种用于扩增长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的引物，所述引物的序列为：CgZIP1-IIF(5′-ACCGTTTGCCTTGTTGAGGA-3′)，CgZIP1-IIR(5′-GACTCTGCAAGACACCGGAA-3′)。
一种用于扩增长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的试剂盒，含所述的引物。
一种所述的应用，所述引物或试剂盒在鉴定或辅助鉴定长牡蛎锌含量和长牡蛎辅助育种中的应用。
一种富锌长牡蛎的选育方法，以待测牡蛎的基因组DNA为模板，利用引物CgZIP1-IIF和CgZIP1-IIR进行PCR扩增，用Nde I内切酶对PCR产物进行酶切；若酶切产物为465bp和260bp两条条带，该位点为纯合AA型；若酶切产物为725bp、465bp和260bp三条条带，该位点为杂合AG型；收集AG杂合基因型个体，进行多代繁育后即可建立富锌新品种。
长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记辅助育种方法：将上述获得携带富锌相关分子标记的长牡蛎进行繁殖，培育子代，克隆获得子代中的锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列，研究其多态性；同时检测其锌含量，研究富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的遗传规律及其与富锌能力的关系，从中筛选基因型为260AG、锌含量又显著提高的牡蛎进行多代繁育即可建立富锌新品种。
本发明与已有技术相比其特点为：本发明借助分子生物学技术，以长牡蛎为实验材料发掘富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记，初步建立了长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记辅助育种技术，该技术具有操作便捷、选育效率高、周期短等特点，为牡蛎富锌品种的培育开辟了新的分子辅助育种途径，对养殖贝类富锌品种的选育具有重要的理论价值和实践意义。
附图说明
图1为本发明实施例提供的长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II外显子区序列和260A/G位点图。
图2为本发明实施例提供的长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II外显子区260A/G位点不同基因型的测序图谱。
图3为本发明实施例提供的长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II外显子区260A/G位点的NdeI酶切分型示意图(M为DL2000 Marker，1为260AA基因型，2为260AG基因型)。
图4为本发明实施例提供的长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II外显子区260A/G位点不同基因型个体的锌含量图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明首次从长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区筛选到与富锌性状相关的分子标记，建立了富锌标记基因型的快速检测方法和富锌性状的分子标记辅助育种方法。本发明具有针对性强、选育效率高、操作便捷等特点，适用于牡蛎锌含量的快速评估和富锌良种的选育。
实施例1
长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记，包括：1.长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区部分序列克隆；2.富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记筛选；3.携带富锌相关分子标记个体的快速筛查；具体为：
1.长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区部分序列的克隆
参照分子克隆所述方法，从长牡蛎闭壳肌中提取基因组DNA作为扩增模板；根据已知的锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列设计引物CgZIP1-IIF(5′-ACCGTTTGCCTTGTTGAGGA-3′)和CgZIP1-IIR(5′-GACTCTGCAAGACACCGGAA-3′)，按照以下程序进行PCR扩增：94℃变性5min，然后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸1min)，最后在72℃保温10min。对PCR产物进行测序，获得其核苷酸序列(参见图1)。克隆得到的ZIP-II外显子区序列长度为725bp，SMART预测分析显示，该片段位于ZIP结构域内。
2.长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的筛选
对来自同一养殖海区的41个个体的扩增产物进行测序，对多态性位点基因型和表型数据进行相关性分析，发现260A/G位点(参见图2)与长牡蛎锌含量显著相关。再提取来自同一养殖海区的50个高锌个体和50个低锌个体的基因组DNA，针对260A/G位点，首先PCR扩增锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列，程序如下：94℃变性5min，然后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30s，57℃退火10s，72℃延伸1min)，最后在72℃保温10min。然后利用Nde I内切酶对PCR产物进行酶切。利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，对于AA等位基因，酶切后会产生465 bp和260 bp两个片段，而对于AG等位基因则产生725 bp、465 bp和260 bp三个片段(参见图3)。
统计来自同一海区41个个体中260A/G位点基因型与锌含量的相关性，比较不同基因型个体的锌含量差异(参见表1和图4)，再利用SPSS v26软件对不同基因型的分布频率进行卡方检验，发现AG基因型个体在高锌群体中出现的频率显著高于低锌群体(参见表2)。因此，260A/G可作为长牡蛎锌含量相关的分子标记，260AG为富锌基因型。
表1.长牡蛎260A/G位点不同基因型个体锌含量差异的T检验
表2.长牡蛎260A/G位点不同基因型在高锌群体和低锌群体中分布频率的卡方检验
3.携带富锌相关分子标记个体的快速筛查
取长牡蛎闭壳肌25 mg，提取DNA作为模板，利用引物CgZIP1-IIF(5′-ACCGTTTGCCTTGTTGAGGA-3′)和CgZIP1-IIR(5′-GACTCTGCAAGACACCGGAA-3′)对锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列进行PCR扩增，程序如下：94℃变性5 min，然后进行35个循环的恒定扩增(94℃变性30 s，57℃退火10 s，72℃延伸1 min)；最后在72℃保温10 min。随后利用Nde I内切酶对PCR产物进行酶切，琼脂糖凝胶电泳分型后，选择基因型为260AG的牡蛎作为富锌个体。
实施例2
长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记辅助育种方法：
将携带上述富锌相关分子标记的长牡蛎按照常规方式进行繁殖，培育子代；
利用上述引物进行克隆获得子代中的锌转运蛋白ZIP1-II基因外显子区序列，按照常规方式研究其多态性；同时检测其锌含量，分析富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的遗传规律及其与富锌能力的关系，从中筛选出基因型为260AG、锌含量又显著提高的牡蛎进行多代繁育即可建立富锌新品种。
Claims (7)
1.一种长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记，其特征在于：分子标记为SEQID NO:1所示长牡蛎锌转运蛋白ZIP1-II核苷酸序列5’端起第260个碱基为A或G。
2.长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记，其特征在于：所述分子标记为SEQID NO:1所示序列5’端起第260个碱基存在A>G突变，其富锌基因型为260AG。
3.按权利要求1所述的长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的应用，其特征在于：所述分子标记在鉴定或辅助鉴定长牡蛎锌含量和长牡蛎辅助育种中的应用。
4.一种用于扩增长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的引物，其特征在于，所述引物的序列为：CgZIP1-IIF(5′-ACCGTTTGCCTTGTTGAGGA-3′)，CgZIP1-IIR(5′-GACTCTGCAAGACACCGGAA-3′)。
5.一种用于扩增长牡蛎富锌相关锌转运蛋白ZIP1-II的分子标记的试剂盒，其特征在于：含权利要求4所述的引物。
6.一种权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述引物或试剂盒在鉴定或辅助鉴定长牡蛎锌含量和长牡蛎辅助育种中的应用。
7.一种富锌长牡蛎的选育方法，其特征在于：以待测牡蛎的基因组DNA为模板，利用引物CgZIP1-IIF和CgZIP1-IIR进行PCR扩增，用Nde I内切酶对PCR产物进行酶切；若酶切产物为465bp和260bp两条条带，该位点为纯合AA型；若酶切产物为725bp、465bp和260bp三条条带，该位点为杂合AG型；收集AG杂合基因型个体，进行多代繁育后即可建立富锌新品种。
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