CN116804193A

CN116804193A - 一种高水解活性的青霉素g酰化酶突变体

Info

Publication number: CN116804193A
Application number: CN202210270135.4A
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 梁岩; 任亮
Original assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-09-26

Abstract

本发明通过基因工程筛选出了一种青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3，与野生型大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1相比，该突变体的水解活力显著提升，能够高效地催化青霉素G钾盐水解生成6‑氨基青霉烷酸(6‑APA)。

Description

一种高水解活性的青霉素G酰化酶突变体

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种通过随机突变及高通量筛选的方法获得青霉素G酰化酶突变体，及其在生产β-内酰胺类抗生素关键母核6-氨基青霉烷酸中的用途。

背景技术

青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是抗生素行业中，用于制备半合成β-内酰胺类抗生素的重要用酶。该酶是一个可逆反应酶，参与β-内酰胺类抗生素的水解及合成。该酶的水解功能，工业上主要用于β-内酰胺类抗生素重要母核6-氨基青霉烷酸(6-AminoPenicillinic acid，6-APA)和7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸(7-Amino-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA)的生产(Abian et al.,BiotechnolProg,2003，19(6)，1639-42，2003)；其合成功能主要是催化母核6-APA、7-ADCA或其他母核与各种D-氨基酸侧链反应生成新的半合成β-内酰胺抗生素(半合成青霉素和头孢霉素)(Bruggink et al.1998；Yang and Wei 2003；Youshko et al.2004；Gabor et al.2005)。除此之外，手性化合物合成过程中，青霉素G酰化酶可以保护羟基和氨基，拆分手性化合物等(Shewale et al，1990)

一直以来，青霉素G酰化酶的研究大部分都集中在其合成反应酶活性能的提升，水解功能的研究相对较少，其中大肠杆菌和巨大芽孢杆菌来源的PGA水解性能应用报道相对较多。随着抗生素原料行业竞争的加剧，改进酶的性能、升级产品制备工艺、降低生产成本成为行业竞争最有效的手段。

发明内容

为了得到高水解活性的青霉素G酰化酶，本发明利用基因工程技术来对目前已工业应用的大肠杆菌来源的PGA(ecPGA)进行改造，以期构建筛选出水解性能进一步提高的突变酶，并将其应用于β-内酰胺类抗生素的生产。经过长期的实验，以氨基酸序列为SEQ IDNO:1(GenBank登录号X04114)的野生型青霉素G酰化酶为改造对象，最终筛选出具有工业化应用能力的突变体。具体地，本发明提供了如下技术方案。

一种青霉素G酰化酶，其为野生型青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1第227位的F替换为L、第363位的D替换为N、第582位的D替换为Y、第719位的T替换为P的突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MKNRNRMIVNCVTASLMYYWSLPALAEQSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTWHLFYGYGYVVAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLGKDFVKFDKDIRRNYWPDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWIDKVNTNPETLLPKQFNTFGFTPKRWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAVQESNYPLKLNQQNSQTAALLPRYDLPAPMLDRPAKGADGALLALTAGKNRETIVAQFAQGGANGLAGYPTTSNMWVIGKSKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWGSTAGFGDNVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWVKMLSREETITVKNGQAETFTVWRTVHGNILQTDQTTQTAYAKSRAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPVPGTGKWDWKGLLPFEMNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQYLNLRLFLPTLQAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPGSAILNVWLTSMLKRTVVAAVPMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEVVLAALEDPWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSDRPVLAWDVVAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSLWLTKQDVEAHKESQEVLHVQR(SEQ ID NO:3)。

本发明的第二个方面提供了一种多核苷酸，其为编码上述青霉素G酰化酶SEQ IDNO:3的基因。

优选地，上述多核苷酸的核苷酸序列可以为序列表中的SEQ ID NO:4。但本发明的多核苷酸不限于此，还可以包含密码子优化的其他多核苷酸，优选它们的核苷酸序列与SEQID NO:4具有80％以上、优选85％以上、优选90％以上、优选95％以上的同源性。

本发明的第三个方面提供了一种质粒，其上克隆了上述的多核苷酸之一，用于表达青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3。

作为上述质粒的骨架，质粒载体可以是PET系列，比如载体可以是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。更优选载体是pET24a，以便在细菌比如大肠杆菌中表达青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3。

本发明的第三个方面提供了一种微生物，其为转化了上述质粒的转化子。

例如上述的微生物可以是大肠杆菌，优选宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。

应理解，用于表达上述青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3的微生物不限于细菌，还可以是其他增殖速度快、发酵工艺容易控制的真菌比如酵母菌。

本发明的第三个方面提供了上述青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3或者其表达微生物在水解青霉素G钾盐生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)中的用途。

本发明的青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3不仅可以呈酶的形式用于催化青霉素G钾盐或者青霉素G溶液的水解反应，还可以直接呈其表达微生物菌体的形式用于催化水解反应。

本发明的青霉素G酰化酶SEQ ID NO:3水解青霉素G钾盐的比活力明显高于野生酶，可达野生酶的2.1倍。因此相对于现有技术而言，能够以更高的催化效率来催化生成β-内酰胺酶类抗生素重要母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)，应用潜力巨大。

附图说明

图1本发明构建的用于表达野生酶(ecPGA)的pET24a-ecPGA质粒图谱。

图2是野生型酶ecPGA纯酶和突变酶ecPGA-M2139纯酶的SDS-PAGE电泳跑胶照片。其中泳道Lane1：ecPGA-M2139亲和层析洗脱；Lane 2-3：ecPGA-M2139亲和层析洗杂；Lane4：ecPGA-M2139亲和层析样品流穿；Lane 5：ecPGA亲和层析样品洗脱；M：蛋白marker(分子量由上而下分别为116kDa、66.2kDa、45kDa、35kDa、25kDa)。

具体实施方式

本发明的研究目的在于改造工业应用的水解青霉素G生产6-APA的青霉素G酰化酶。经过对不同微生物来源的野生酶进行比较，将大肠杆菌来源的PGA(ecPGA)作为重点野生酶(或称起始酶、原始酶)进行突变和筛选，构建出水解活性进一步提高的突变体，从而降低6-APA的生产成本。

以氨基酸序列为SEQ ID NO:1(GenBank登录号X04114)的野生型青霉素G酰化酶为改造对象，为了得到高水解活性的青霉素G酰化酶。

在本文中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型的青霉素G酰化酶ecPGA。

类似地，术语“青霉素G酰化酶突变体”、“突变体青霉素G酰化酶”、“突变青霉素G酰化酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指青霉素G酰化酶的突变体SEQ ID NO:3。

有时为了表述方便起见，本文中可以将野生酶SEQ ID NO:1与其突变体SEQ IDNO:3统称为“青霉素G酰化酶”。

为了得到高水解活力的青霉素G酰化酶突变体，对野生型青霉素G酰化酶进行酶工程改造。本发明对SEQ ID NO:1的编码基因序列SEQ ID NO:2进行易错PCR，通过高通量筛选，最终获得了相对SEQ ID NO:1第227位苯丙氨酸、第363位天冬氨酸、第582位天冬氨酸、第719位苏氨酸四个位点突变的突变氨基酸序列SEQ ID NO:3。

本发明的青霉素G酰化酶突变体SEQ ID NO:3的氨基酸数量为846个，其中第1-26位为信号肽，第27-235位为α亚基，第236-289位为间隔肽(spacer peptide)，第290-846位为β亚基，微生物表达后的青霉素G酰化酶是α亚基和β亚基组成的复合体，蛋白序列结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体(转化子)。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

上述转化体宿主可以是任何适合表达青霉素G酰化酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是大肠杆菌和酵母菌，尤其优选大肠杆菌或者毕赤酵母。

当作为生物催化剂用于生产时，本发明的青霉素G酰化酶可以呈现酶的形式或者微生物发酵菌体的形式。其中酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

为操作方便、易于控制、以及后处理容易起见，优选使用酶形式作为催化剂来催化青霉素G水解反应生产6-APA。

本发明的酶分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

青霉素G钾盐由国药威奇达药业有限公司赠送。

NIPAB(6-硝基-3-氨基苯甲酸)购自维编科贸有限公司。

实施例1：初始青霉素G酰化酶基因重组大肠杆菌的构建

Escherichia coli来源的青霉素G酰化酶ecPGA的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，根据Genebank上已经公布的基因序列X04114，全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:2。在基因两端设计限制性内切酶位点Nde I和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-ecPGA，其结构图谱如图1所示。

通过电转化将重组质粒pET24a-ecPGA转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到表达野生型青霉素G酰化酶SEQ ID NO:1的重组大肠杆菌pET24a-ecPGA/BL21(DE3)。

实施例2：易错突变库建立及筛选

2.1易错突变库建立

以pET24a-ecPGA/BL21(DE3)菌种提取的质粒为模板，建立青霉素G酰化酶的易错突变库。

正向引物ecPGA-F为5’-GCCGCATATTTATGCCAATGATACATG-3’，

反向引物ecPGA-R为5’-ACTTCCTGCGACTCCTTATGCGCCTC-3’。

易错PCR反应体系：100ng质粒模板，20μM一对引物ecPGA-F和ecPGA-R，1×Taqbuffer，0.2mM dGTP，1mM dATP，1mM dCTP，0.2mM dTTP，7mM MgCl₂，5个单位的Taq酶(Thermo公司)。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min/kbp；25-30个循环；72℃10min。

胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)2.5k bp随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃20s，60℃40s，68℃2min/kbp，30个循环；68℃10min。Dpn I限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(Invitrogen公司)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

2.2突变体库的高通量筛选

选取突变体库中的转化子接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中，培养过夜，然后取80μL过夜培养物，转接至800μL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养3h后，加入终浓度0.5mM IPTG，降温至25℃，培养过夜，取600μL培养菌液4500rpm离心15min，弃上清，加入100μL 50mM磷酸钾盐缓冲液(pH7.5)重悬菌体用于活力测定。

2.3高通量酶活力测定

NIPAB母液：将90mg NIPAB溶于100ml 50mM磷酸钾盐缓冲液(pH7.5)，加热煮沸得到。

取20μL菌悬液加入200μL NIPAB母液，37℃反应60min，加入0.2ml无水乙醇终止反应，5000rpm离心20min，取200μL测定405nm吸光度的变化。

通过对约6000个突变体克隆筛选，结果显示其中一株克隆菌株水解底物NIPAB的能力明显增强，约是野生酶菌体pET24a-ecPGA/BL21(DE3)的3.9倍，该克隆菌体的编号为pET24a-ecPGA-M2139/BL21(DE3)。

对筛选到的突变菌株pET24a-ecPGA-M2139/BL21(DE3)提取质粒，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，通过基因组测序比对，确定青霉素G酰化酶编码基因突变为SEQ ID NO:4，已经导致氨基酸序列改变，发生了四个氨基酸突变，分别为F227L、D363N、D582Y、T719P。

实施例3：菌株摇瓶发酵培养

从菌株pET24a-ecPGA/BL21(DE3)和突变菌pET24a-ecPGA-M2139/BL21(DE3)的LB培养平板上分别挑取单菌落，分别接种至5mL含50mg/L硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜，然后分别按照0.5v/v％接种量将过夜培养物接种至1L TB培养基中，于37℃，250rpm培养2-3h，至OD600 0.8-1.2时，加入0.2mM IPTG，于28℃，200rpm培养过夜。然后于4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体，冻存备用。

实施例4：纯酶液提取

取实施例3中摇瓶发酵收集的两种菌体，分别用100mM磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)重悬菌体至菌浓达到20％(W/V)，用超声破碎仪破壁(300W能量，工作2秒，间歇5秒，工作20-40min)，将细胞破碎液于4℃，12000rpm离心30min，收集上清液。上清液以1ml/min的速率加入含10ml Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有10mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质，最后用含有500mM咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值。

洗脱液经截留分子量为30kDa的超滤管进行脱盐处理，分别得到ecPGA和ecPGA-M2139两个纯酶蛋白。图2显示了它们的SDS-PAGE电泳照片。

实施例5：两种纯酶的比活测定

采用Thermo的Pierce^TM蛋白定量试剂盒对实施例4中获得的两种纯酶蛋白进行蛋白浓度测定，然后精密量取1mL纯酶液，加入预热至28℃的40mL 5％青霉素G钾盐溶液(青霉素G钾盐5g，溶解于100ml 50mM的磷酸钾盐缓冲液(pH7.8))中，保持温度28℃，快速搅拌，用0.1M NaOH滴定液调pH至8.0，计时，保持pH恒定，反应3-5min，记录加入的NaOH量及反应时间(分钟)。

酶水解活力单位(U)定义为：28℃，pH8.0条件下，每分钟水解1μmol的青霉素G钾盐所需的青霉素G酰化酶量为1个单位。

两个纯酶的活力测定显示，突变蛋白纯酶ecPGA-M2139比活力明显高于野生酶ecPGA，活力大约高出约2.1倍，具体数据见下表。

实验结果表明，本发明的青霉素G酰化酶突变体ecPGA-M2139水解青霉素G钾盐的比活力明显高于野生酶ecPGA，达野生酶的2.1倍。因此相对于现有技术而言，能够以更高的催化效率来催化生成β-内酰胺酶类抗生素重要母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)，显示出极大的工业化应用潜力。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 一种高水解活性的青霉素G酰化酶突变体

<130> SHPI2210074

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 846

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu

1 5 10 15

Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu

20 25 30

Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn

35 40 45

Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp

50 55 60

Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val

65 70 75 80

Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg

85 90 95

Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser

100 105 110

Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala

115 120 125

Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln

130 135 140

Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val

145 150 155 160

Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr

165 170 175

Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val

195 200 205

Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro

210 215 220

Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp

245 250 255

Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Val

260 265 270

Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr

275 280 285

Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys

290 295 300

Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr

305 310 315 320

Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn

325 330 335

Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile

340 345 350

Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala

355 360 365

Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys

370 375 380

Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly

385 390 395 400

Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu

405 410 415

Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp

420 425 430

Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys

435 440 445

Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu

450 455 460

Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val

465 470 475 480

His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu

485 490 495

Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe

500 505 510

Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn

515 520 525

Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala

530 535 540

Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu

545 550 555 560

Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg

565 570 575

Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu

580 585 590

Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu

595 600 605

Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp

610 615 620

Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu

625 630 635 640

Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe

645 650 655

Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro

660 665 670

Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala

675 680 685

Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala

690 695 700

Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp

705 710 715 720

Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr

725 730 735

Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro

740 745 750

Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg

755 760 765

Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg

770 775 780

Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile

785 790 795 800

Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met

805 810 815

Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val

820 825 830

Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg

835 840 845

<210> 2

<211> 2538

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgaaaaata gaaatcgtat gatcgtgaac tgtgttactg cttccctgat gtattattgg 60

agcttacctg cactggctga gcagtcgtca agtgagataa agattgttcg cgatgaatac 120

ggcatgccgc atatttatgc caatgataca tggcacctat tttatggcta tggctatgta 180

gtagcacaag atcgcctttt tcagatggaa atggcacgtc gcagtactca agggactgtc 240

gcggaagtgc ttggcaaaga ttttgtgaaa tttgataaag atatccgtcg taactactgg 300

ccggatgcta tccgggcgca aattgctgcc ctttccccag aggatatgtc cattctgcaa 360

ggctacgctg atggaatgaa tgcctggatt gataaggtaa ataccaatcc agagacgctc 420

ttaccaaaac agtttaatac atttggcttt actcctaagc gctgggaacc gtttgatgtc 480

gcgatgatat ttgtgggcac catggcaaac cgcttctctg atagcactag cgaaattgat 540

aatctggcac tgctaacggc tttaaaagat aaatatggtg tatcacaagg catggcggta 600

tttaatcagt tgaaatggct ggtaaaccca tcagcgccaa ccactattgc cgtacaagag 660

agtaactacc cacttaaatt taatcagcaa aactcgcaaa cagcagctct gttgccacgc 720

tacgatttac ctgcaccaat gcttgaccga ccagcaaaag gggcggatgg cgcactgctg 780

gcgttaacag cagggaagaa ccgggaaact attgttgcac aatttgcaca gggtggtgcc 840

aatggtctgg cggggtatcc aacgaccagc aatatgtggg ttatcggcaa aagcaaagcc 900

caggatgcga aagcaatcat ggtaaatggt ccgcagtttg gctggtatgc gcctgcgtat 960

acttatggta ttggtctgca cggtgctggt tatgatgtca ctggcaatac accatttgcc 1020

tatcctgggc tggtttttgg tcataatggt gtgatttcct ggggatcaac ggcaggtttc 1080

ggcgatgatg tcgatatttt tgctgaacgg ctgtcggcag agaaaccagg ctactacttg 1140

cataatggta agtgggtgaa aatgttaagc cgtgaggaaa ccattacggt gaaaaatggt 1200

caggcagaga cctttactgt ctggcgtacg gtgcatggca acattctcca aactgaccag 1260

acgacacaaa cggcttacgc taaatcccgc gcatgggatg gtaaagaggt ggcgtctttg 1320

ctggcctgga ctcatcagat gaaggccaaa aattggcagg agtggacaca gcaggcagcg 1380

aaacaagcac tgaccatcaa ctggtactat gctgatgtaa acggcaatat tggttatgtt 1440

catactggtg cttatccaga tcgtcaatca ggccatgatc cgcgattacc cgttcctggt 1500

acgggaaaat gggactggaa agggctattg ccttttgaaa tgaaccctaa ggtgtataac 1560

ccccagtcgg gatatattgc taactggaac aattctcccc aaaaagatta tcccgcttca 1620

gatctgtttg cctttttgtg gggtggtgca gatcgcgtta cggagatcga ccgactgctt 1680

gagcaaaagc cacgcttaac tgctgatcag gcatgggatg ttattcgcca aaccagtcgt 1740

caggatctta acctgaggct ttttttacct actctgcaag cagcgacatc tggtttgaca 1800

cagagcgatc cgcgtcgtca gttggtagaa acattaacac gttgggatgg catcaatttg 1860

cttaatgatg atggtaaaac ctggcagcag ccaggctctg ccatcctgaa cgtttggctg 1920

accagtatgt tgaagcgtac cgtagtggct gccgtaccta tgccatttga taagtggtac 1980

agcgccagtg gctacgaaac aacccaggac ggcccaactg gttcgctgaa tataagtgtt 2040

ggagcaaaaa ttttgtatga ggcggtgcag ggagacaaat caccaatccc acaggcggtt 2100

gatctgtttg ctgggaaacc acagcaggag gttgtgttgg ctgcgctgga agatacctgg 2160

gagactcttt ccaaacgcta tggcaataat gtgagtaact ggaaaacacc tgcaatggcc 2220

ttaacgttcc gggcaaataa tttctttggt gtaccgcagg ccgcagcgga agaaacgcgt 2280

catcaggcgg agtatcaaaa ccgtggaaca gaaaacgata tgattgtttt ctcaccaacg 2340

acaagcgatc gtcctgtgct tgcctgggat gtggtcgcac ccggtcagag tgggtttatt 2400

gctcccgatg gaacagttga taagcactat gaagatcagc tgaaaatgta cgaaaatttt 2460

ggccgtaagt cgctctggtt aacgaagcag gatgtggagg cgcataagga gtcgcaggaa 2520

gtgttgcacg ttcagaga 2538

<210> 3

<211> 846

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu

1 5 10 15

Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu

20 25 30

Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn

35 40 45

Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp

50 55 60

Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val

65 70 75 80

Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg

85 90 95

Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser

100 105 110

Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala

115 120 125

Trp Ile Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln

130 135 140

Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val

145 150 155 160

Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr

165 170 175

Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val

195 200 205

Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro

210 215 220

Leu Lys Leu Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp

245 250 255

Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Val

260 265 270

Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr

275 280 285

Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys

290 295 300

Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr

305 310 315 320

Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn

325 330 335

Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile

340 345 350

Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asn Val Asp Ile Phe Ala

355 360 365

Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys

370 375 380

Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly

385 390 395 400

Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu

405 410 415

Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp

420 425 430

Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys

435 440 445

Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu

450 455 460

Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val

465 470 475 480

His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu

485 490 495

Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe

500 505 510

Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn

515 520 525

Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala

530 535 540

Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu

545 550 555 560

Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg

565 570 575

Gln Thr Ser Arg Gln Tyr Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu

580 585 590

Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu

595 600 605

Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp

610 615 620

Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Gly Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu

625 630 635 640

Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe

645 650 655

Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro

660 665 670

Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala

675 680 685

Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala

690 695 700

Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Pro Trp

705 710 715 720

Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr

725 730 735

Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro

740 745 750

Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg

755 760 765

Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg

770 775 780

Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile

785 790 795 800

Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met

805 810 815

Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val

820 825 830

Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg

835 840 845

<210> 4

<211> 2538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaaaaata gaaatcgtat gatcgtgaac tgtgttactg cttccctgat gtattattgg 60

agcttacctg cactggctga gcagtcgtca agtgagataa agattgttcg cgatgaatac 120

ggcatgccgc atatttatgc caatgataca tggcacctat tttatggcta tggctatgta 180

gtagcacaag atcgcctttt tcagatggaa atggcacgtc gcagtactca agggactgtc 240

gcggaagtgc ttggcaaaga ttttgtgaaa tttgataaag atatccgtcg taactactgg 300

ccggatgcta tccgggcgca aattgctgcc ctttccccag aggatatgtc cattctgcaa 360

ggctacgctg atggaatgaa tgcctggatt gataaggtaa ataccaatcc agagacgctc 420

ttaccaaaac agtttaatac atttggcttt actcctaagc gctgggaacc gtttgatgtc 480

gcgatgatat ttgtgggcac catggcaaac cgcttctctg atagcactag cgaaattgat 540

aatctggcac tgctaacggc tttaaaagat aaatatggtg tatcacaagg catggcggta 600

tttaatcagt tgaaatggct ggtaaaccca tcagcgccaa ccactattgc cgtacaagag 660

agtaactacc cacttaaatt aaatcagcaa aactcgcaaa cagcagctct gttgccacgc 720

tacgatttac ctgcaccaat gcttgaccga ccagcaaaag gggcggatgg cgcactgctg 780

gcgttaacag cagggaagaa ccgggaaact attgttgcac aatttgcaca gggtggtgcc 840

aatggtctgg cggggtatcc aacgaccagc aatatgtggg ttatcggcaa aagcaaagcc 900

caggatgcga aagcaatcat ggtaaatggt ccgcagtttg gctggtatgc gcctgcgtat 960

acttatggta ttggtctgca cggtgctggt tatgatgtca ctggcaatac accatttgcc 1020

tatcctgggc tggtttttgg tcataatggt gtgatttcct ggggatcaac ggcaggtttc 1080

ggcgataatg tcgatatttt tgctgaacgg ctgtcggcag agaaaccagg ctactacttg 1140

cataatggta agtgggtgaa aatgttaagc cgtgaggaaa ccattacggt gaaaaatggt 1200

caggcagaga cctttactgt ctggcgtacg gtgcatggca acattctcca aactgaccag 1260

acgacacaaa cggcttacgc taaatcccgc gcatgggatg gtaaagaggt ggcgtctttg 1320

ctggcctgga ctcatcagat gaaggccaaa aattggcagg agtggacaca gcaggcagcg 1380

aaacaagcac tgaccatcaa ctggtactat gctgatgtaa acggcaatat tggttatgtt 1440

catactggtg cttatccaga tcgtcaatca ggccatgatc cgcgattacc cgttcctggt 1500

acgggaaaat gggactggaa agggctattg ccttttgaaa tgaaccctaa ggtgtataac 1560

ccccagtcgg gatatattgc taactggaac aattctcccc aaaaagatta tcccgcttca 1620

gatctgtttg cctttttgtg gggtggtgca gatcgcgtta cggagatcga ccgactgctt 1680

gagcaaaagc cacgcttaac tgctgatcag gcatgggatg ttattcgcca aaccagtcgt 1740

cagtatctta acctgaggct ttttttacct actctgcaag cagcgacatc tggtttgaca 1800

cagagcgatc cgcgtcgtca gttggtagaa acattaacac gttgggatgg catcaatttg 1860

cttaatgatg atggtaaaac ctggcagcag ccaggctctg ccatcctgaa cgtttggctg 1920

accagtatgt tgaagcgtac cgtagtggct gccgtaccta tgccatttga taagtggtac 1980

agcgccagtg gctacgaaac aacccaggac ggcccaactg gttcgctgaa tataagtgtt 2040

ggagcaaaaa ttttgtatga ggcggtgcag ggagacaaat caccaatccc acaggcggtt 2100

gatctgtttg ctgggaaacc acagcaggag gttgtgttgg ctgcgctgga agatccctgg 2160

gagactcttt ccaaacgcta tggcaataat gtgagtaact ggaaaacacc tgcaatggcc 2220

ttaacgttcc gggcaaataa tttctttggt gtaccgcagg ccgcagcgga agaaacgcgt 2280

catcaggcgg agtatcaaaa ccgtggaaca gaaaacgata tgattgtttt ctcaccaacg 2340

acaagcgatc gtcctgtgct tgcctgggat gtggtcgcac ccggtcagag tgggtttatt 2400

gctcccgatg gaacagttga taagcactat gaagatcagc tgaaaatgta cgaaaatttt 2460

ggccgtaagt cgctctggtt aacgaagcag gatgtggagg cgcataagga gtcgcaggaa 2520

gtgttgcacg ttcagaga 2538

Claims

1.一种青霉素G酰化酶，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

2.一种多核苷酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的青霉素G酰化酶。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

4.一种质粒，其特征在于，其上克隆了如权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，载体是PET系列。

6.如权利要求4所述的质粒，其特征在于，载体是pET24a。

7.一种微生物，其特征在于，是转化了如权利要求5所述质粒的转化子。

8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，宿主是大肠杆菌BL21(DE3)。

10.如权利要求1所述青霉素G酰化酶或者如权利要求7所述微生物在水解青霉素G钾盐生产6-氨基青霉烷酸(6-APA)中的用途。