CN116801872A - 调节雄激素受体凝聚物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了雄激素受体(AR)凝聚物的调节剂、调节或抑制AR凝聚物的方法、以及使用所述AR凝聚物调节剂或抑制剂治疗疾病和病症的方法。

Description

调节雄激素受体凝聚物的方法
技术领域
本公开一般涉及治疗雄激素受体(AR)凝聚物的方法、AR凝聚物调节剂及其治疗用途。
背景技术
前列腺癌是男性最常见的癌症类型之一。在其早期阶段，前列腺癌的生长通常依赖于雄激素信号传导，雄激素信号通过雄激素受体(AR)介导其作用。AR是一种转录因子，其调节数百种基因的表达，包括与肿瘤细胞生长和增殖有关的基因。已开发AR抑制剂并可用于治疗前列腺癌。然而，大多数AR抑制剂与配体结合结构域结合，并且经常产生耐药性而导致无效。
因此，对具有新作用机制的AR调节剂存在巨大需求。
发明内容
在本发明中，如本文所用，术语“一个”，“所述”表示数量为一个或一个以上(即至少为一个)的该冠词语法上的宾语。举例而言，“一种抗体”表示一种抗体或多于一种的抗体。
一方面，本公开提供了一种治疗对象(subject)体内雄激素受体(AR)相关疾病或病症的方法，包括向对象施用治疗有效量的AR凝聚物调节剂，其中所述AR凝聚物调节剂调节至少含有AR的AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述AR变体对至少一种雄激素剥夺治疗具有抗性。
在一些实施方案中，所述AR变体包括一种或多种突变，所述突变任选地在配体结合结构域(LBD)中。
在一些实施方案中，其中所述一种或多种突变位于选自下述的残基：L702、V716、V731、W742、H875、F877、T878、D880、L882、S889、D891、E894、M896、E898、和T919，其中编号相对于SEQ ID NO:1。
在一些实施方案中，所述一种或多种突变选自：L702H、V716M、V731M、W742L/C、H875Y/Q、F877L、T878A/S、D880E、L882I、S889G、D891H、E894K、M896V/T、E898G和T919S。
在一些实施方案中，所述AR变体缺少全部或部分LBD。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是转录凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR转录凝聚物(Transcriptional condensates)还包括DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述DNA/RNA序列包括AR调节基因，所述组蛋白包括K27乙酰化H3，所述辅因子包括含有LXXLL基序的蛋白，所述介体包括MED1，和/或所述RNA聚合酶包含磷酸化RNA pol II。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性或活性。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
在一些实施方案中，如通过活细胞成像所测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低所述AR凝聚物的水平。在一些实施方案中，通过DHT刺激测量所述AR凝聚物的水平。在一些实施方案中，所述AR凝聚物包括组成型AR变体，并且在没有DHT刺激下测量所述AR凝聚物的水平。在一些实施方案中，如通过活细胞成像所测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低含有组成型AR变体的AR凝聚物的水平。
在一些实施方案中，由DHT刺激的AR凝聚物水平是基于细胞核内荧光强度的变化来量化的。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂降低由DHT刺激的AR凝聚物水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
在一些实施方案中，如在表达AR的细胞系中通过定量PCR检测测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
在一些实施方案中，所述AR靶基因选自FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2和NKX3.1。
在一些实施方案中，所述AR变体靶基因选自BUB1B、CCNA2，UBE2C、KIF15和CDC20。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂在降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因(例如AR靶基因或AR变体靶基因)的表达水平方面比相当浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)有效至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。
在一些实施方案中，5μM浓度的所述AR凝聚物抑制剂降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平至少30％(例如至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％)，任选地使用如定量PCR所测。在一些实施方案中，5μM浓度的所述AR凝聚物抑制剂降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR变体靶基因的表达水平至少30％(例如至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％)，任选地使用如定量PCR所测。
在一些实施方案中，如通过细胞增殖试验所测量的，所述AR凝聚物抑制剂以不超过20μM、或15μM、或10μM、或8μM、或5μM、或4μM、或3μM的IC50抑制表达AR的癌细胞的增殖。在某些实施方案中，所述表达AR的癌细胞表达AR变体，任选表达组成型活性AR变体(例如，缺失部分或全部LBD的AR变体)。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌细胞选自LNCaP、22Rv1、VCaP和LNCaP95。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂：
a)包含化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物，或
b)与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2竞争结合AR，或
c)诱导AR构象变化，所述AR构象变化至少与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2诱导的AR构象变化相当；
d)在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：
i.降低所述AR凝聚物的水平，任选地由DHT刺激；
ii.降低含有AR变体的AR凝聚物的水平，所述AR变体任选是组成型活性AR变体(例如，缺乏部分或全部LBD的AR变体)；
iii.降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因(例如AR靶基因或AR变体靶基因)的表达水平；和/或
iv.抑制表达AR的癌细胞的增殖。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂结合AR的内在无序结构域(IDD)。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
在一些实施方案中，其中所述AR相关的疾病或病症具有异常水平的AR活性。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有上调水平的AR活性。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性、或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症为表达AR的癌症。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、套细胞淋巴瘤或唾液腺癌。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是转移性的。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是前列腺癌。
在一些实施方案中，所述前列腺癌对去势或雄激素剥夺治疗具有抗性。
另一方面，本公开提供一种调节细胞或对象中一个或多个AR调节基因的转录的方法，包括调节至少包含AR的AR转录凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述方法包括通过AR凝聚物调节剂调节所述AR转录凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性或活性。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
在一些实施方案中，所述AR靶基因包括FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2、NKX3.1或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR靶基因包括BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15、CDC20或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂：
e)包含化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物，或
f)与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2竞争结合AR，或
g)诱导AR的构象变化，所述AR的构象变化至少与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2诱导的构象变化相当；
h)在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：
i.降低所述AR凝聚物的水平，任选地由DHT刺激；
ii.降低含有AR变体的AR凝聚物的水平，任选地，所述AR变体是组成型活性AR变体(例如，缺乏部分或全部LBD的AR变体)；
iii.降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因(例如AR靶基因或AR变体靶基因)的表达水平；和/或
iv.抑制表达AR的癌细胞的增殖。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂结合AR的内在无序结构域(IDD)。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有异常水平的AR活性，或上调水平的AR活性。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
在另一方面，本公开提供一种体外筛选系统，其包含AR或其含有内在无序结构域的片段，其中所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
在一些实施方案中，所述体外筛选系统包括细胞裂解液或细胞核裂解液。
在一些实施方案中，所述体外筛选系统包括细胞或细胞核。
在一些实施方案中，所述体外筛选系统还包括DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或它们的任意组合。
在另一方面，本公开提供一种合成的AR凝聚物，其至少包含AR或其含有IDD的片段。
在另一方面，本公开提供修饰的宿主细胞，所述宿主细胞表达AR或其含有内在无序结构域的片段，其中，所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
在一些实施方式中，所述修饰的宿主细胞适用于检测所述AR凝聚物的形成。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是肿瘤细胞，任选地，所述宿主细胞是前列腺癌细胞。
在另一方面，本公开提供一种筛选试剂的方法，所述试剂调节至少含有AR的AR凝聚物，所述方法包括：
a)提供所述AR凝聚物，并评估所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应，
b)使测试试剂接触所述AR凝聚物，和
c)评估所述测试试剂是否会引起AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化。
在一些实施方案中，如果所述测试试剂引起所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚物。
在一些实施方案中，所述物理性质包括所述AR凝聚物的形成、组成、稳定性和/或活性。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物包含在本文所述的体外筛选系统、本文所述的合成的AR凝聚物、或本文所述的修饰的宿主细胞中。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是一种分离的合成的凝聚物，或是含有所述AR凝聚物的分离的细胞组合物的形式。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物位于细胞内或细胞核内。
在另一方面，本公开提供一种鉴定试剂的方法，所述试剂调节至少含有AR的AR凝聚物，所述方法包括：
a)提供能形成所述AR凝聚物的组分；
b)在适合形成所述AR凝聚物的条件下，使用测试试剂接触所述组分，和
c)评估所述测试试剂的存在是否影响所述AR凝聚物的形成或所述AR凝聚物的一种或多种生物效应。
在一些实施方案中，如果所述测试试剂影响所述AR凝聚物的形成或影响所述AR凝聚物的一种或多种生物效应，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚物的形成。
在一些实施方案中，所述能够形成AR凝聚物的组分包含在本文所述的体外筛选系统、本文所述的合成的AR凝聚物、或本文所述的修饰的宿主细胞中。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是转录凝聚物。
在一些实施方案中，基于所述AR调节基因的表达或细胞增殖来评估所述转录凝聚物的一种或多种生物效应。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因、AR变体靶基因或报告基因。
在一些实施方案中，所述测试试剂已被鉴定能够结合AR的IDD。
在一些实施方案中，本公开提供一种化合物，其选自：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或其代谢物。
在一些实施方案中，本公开提供一种含有选自下列的化合物的药物组合物：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或其代谢物。
在一些实施方案中，本公开提供一种治疗对象AR相关疾病或病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的选自下列的化合物：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或其代谢物。AR相关疾病或病症如本公开中所描述。在一些实施方案中，所述化合物与第二活性成分或治疗联合施用。
附图说明
附图作为本说明书的一部分纳入其中。附图与说明书一起还用于解释所公开的原理并能够使相关领域的技术人员实施和利用所公开的实施方式。
图1说明了转录活性AR形成的离散核内斑点。图1A：用AR-mEGFP稳定转染的LNCaP细胞在类固醇激素耗竭的培养基中生长48h(-DHT，左)，然后用1nMDHT刺激2h(+DHT，右)。白色虚线圆圈表示细胞核。图1B:用AR剪接变体AR V7-mEGFP转染的LNCaP细胞在转染8小时后进行显微成像。图1C:用AR剪接变体AR V567es-mEGFP转染的LNCaP细胞在转染8小时后进行显微成像。
图2说明了激活的性激素受体(AR)核斑点表现出类液体特性。DHT刺激后在LNCaP细胞中用AR-mEGFP进行FRAP实验的代表性图像。白色箭头突出显示正在进行靶向漂白的斑点。
图3说明了AR形成LLPS凝聚物，其是活性转录位点。H1299细胞中超级增强子标记物MED1(绿色)、活跃转录的染色质标记物H3K27ac(绿色)及其CTD(绿色)Ser5磷酸化的活性RNA聚合酶II与AR-mScarlet(红色)斑点的共定位。使用识别MED1、H3K27ac和Pol II S5P的抗体对用AR-mScarlet转染的H1299细胞进行免疫荧光实验。用Fiji分析了共定位(黄色)。
图4说明了内部无序的AR-NTD负责驱动AR相分离。图4A说明了AR蛋白的预测IDR的示意图。PONDR(自然无序区域的预测器)VSL2分数显示在Y轴上，氨基酸位置显示在X轴上。虚线框突出显示了AR蛋白的N端结构域。图4B说明了用或不用DHT刺激的LNCaP细胞中AR(ΔNTD)-mEGFP的活细胞成像。图4C说明了LNCaP细胞中不同时间点的蓝光诱导的AR(NTD)、AR(DBD)和AR(LBD)-CRY2-SV40 NLS聚类的图像。用488nm激光刺激细胞。
图5A说明了恩杂鲁胺通过抑制雄激素结合来抑制AR LLPS，并且对F877/T878A突变和V7变体没有任何抑制作用。在没有DHT刺激下组成型活性剪接变体AR V7显示出核斑点分布。抑制雄激素与AR结合的恩杂鲁胺对AR的相分离没有影响。
图5B说明了化合物60损害恩杂鲁胺抗性突变体和V7变体的LLPS。在没有DHT刺激下组成型活性剪接变体AR V7显示出核斑点分布。化合物60显著损害AR V7的LLPS。
图6A到图6C说明了化合物AA、化合物2和化合物6抑制AR或AR－V7的靶基因的mRNA表达。
图7A到图7C说明了化合物6和化合物60抑制AR相分离，但是化合物AA没有表现出抑制作用。
图8说明了化合物62和纯化的AF-1重组蛋白的STD NMR结果，表明化合物62和AF-1结合。
具体实施方式
以下描述仅为说明本文的各种实施方式。因此，在此讨论的具体变化、改换等不应被解释为对本文公开范围的限制。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文公开范围的情况下，可以得出各种等同形式、改变和修改，应当明白，这样的等同实施方式均包括在本文范围之内。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，都通过引用全文方式纳入本文。
定义
如本文所用，除非另有说明或者与上下文明显矛盾，用于本发明上下文的术语“一个”、“一种”、“所述”以及类似表达(尤其在权利要求书的内容中)应解释为涵盖单数和复数。
本文所用术语“试剂”指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“试剂”可以是任何化学品、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白质和非蛋白质实体。在一些实施方案中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适配体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适配体及其修饰和组合等。在一些实施方案中，所述试剂选自核酸、小分子、多肽和肽。在某些实施方案中，试剂是含有化学基团的小分子。在一些实施方式中，所述试剂足够小以扩散到凝聚物中。在一些实施方式中，所述试剂约小于4.4kDa。
术语“增加的”、“增长”或“增强”可以是例如统计意义上的增加或增强。在一些情况下，例如，与参考水平(例如对照)相比，统计量可以增加或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％，并且这些范围应理解为包括其中的任何整数量(例如，2％、14％、28％等)，为简洁起见，未详尽列出。在其他情况下，与参考水平相比，元素可以增加或增强至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。
术语“减少”、“降低”、“下降”、“下调”和“抑制”可以是相对于参考系(例如对照)统计学上显著量的减少或降低。在一些情况下，与参考水平相比，元素可以例如减少或降低至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％，至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、直至例如完全不包括所述元素。这些范围应理解为包括其中的任何整数量(例如，6％、18％、26％等)，为简洁起见，未详尽列出。
术语“多核苷酸”或“核酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且是指共价连接的核苷酸链。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且彼此独立地修饰或未修饰。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。蛋白质或多肽可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域技术人员将进一步理解，蛋白质有时可包括多于一条的多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接。
本文使用的术语“片段”是指任何长度的参考多肽或多核苷酸的部分序列。片段仍可保留参考多肽的至少部分生物活性。
术语“变体”是指相对于天然存在的多肽具有一个或多个氨基酸残基改变或修饰的多肽。
本文使用的“功能等同物”是指天然存在多肽(例如AR)的片段、变体或融合多肽，尽管其化学结构存在差异，但至少仍保留天然存在多肽的部分生物学功能。在一些实施方案中，功能等同物仍保留至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然存在多肽的生物学活性。
本文中使用的术语“同源物”和“同源的”是可互换的，并且是指进行最佳比对时与另一序列有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
氨基酸序列(或核酸序列)的“百分比(％)序列同一性”定义为将序列比对并根据需要引入空位以实现相同氨基酸(或核酸)数量最大化后，候选序列中氨基酸(或核酸)残基与参考序列中氨基酸(或核酸)残基相同的百分比。氨基酸残基的保守取代可以被认为是相同的残基，也可以不被认为是相同的残基。可以通过例如使用公开可用的工具如BLASTN、BLASTp(可见于美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，也参见，Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.等人，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2(可见于欧洲生物信息研究所)网站，还参见Higgins D.G.等，Methodsin Enzymology,266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford,England),23(21):2947-8(2007))，以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件实现确认氨基酸(或核酸)序列的百分比同一性。本领域技术人员可以使用工具提供的默认参数，或者可以定制适合于比对的参数，例如通过选择合适的算法。
“分离”的物质因为经人工纯化操作已经从天然状态发生了改变。如果自然界中存在“分离的”的组分或物质，则它已被改变或从其原始环境中移除，或两者兼而有之。例如，天然存在于活体动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果相同的多核苷酸或多肽已与其天然状态的共存材料充分分离从而以基本上纯净的状态存在，则所述多核苷酸或多肽是“分离的”。
本文所用的病症的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻病症、减缓病症的发作或发展速度、降低发展病症的风险、预防或延迟与病症相关的症状的发展、减少或结束与病症相关的症状、产生病症的完全或部分消退、治愈病症或其某种组合。
术语“肿瘤”或“癌症”可互换使用，是指涉及异常细胞生长的任何疾病，并且包括影响体内任何组织、器官或细胞的疾病的所有阶段和所有形式。该术语包括所有已知的癌症和肿瘤病症，无论其特征为恶性、良性、软组织、实体或血液学，还是所有阶段和级别，包括转移前和转移后的肿瘤。一般来说，癌症可以根据肿瘤所在或起源的组织或器官以及癌组织和细胞的形态进行分类。
雄激素受体(AR)凝聚物
雄激素受体(AR)是类固醇和核受体超家族的一员，主要表达于雄激素靶组织，如前列腺、骨骼肌、肝脏和中枢神经系统(CNS)，其中表达水平最高的是前列腺、肾上腺和附睾。AR是一种可溶性蛋白质，充当细胞内转录因子。在与睾酮和二氢睾酮(DHT)等雄激素结合并激活后，AR会发生构象变化和翻译后修饰、二聚化、核易位，并最终与靶基因DNA的调节区域(称为雄激素反应元件)结合。
本公开首次发现AR能够进行相分离以形成凝聚物。本文所用的“凝聚物”是指一种或多种蛋白质和/或其他大分子(例如RNA和/或DNA)基于其内在物理性质的相分离(包括相分离的所有阶段)形成的非膜结构包裹的隔室。凝聚物表现为相分离液体，导致特定蛋白质和/或大分子浓缩在凝聚物内部，而其他特定蛋白质和/或大分子被排除在外。凝聚物是液体且可逆。当细胞生理学发生变化时，例如信号传导事件或一种大分子浓度的变化或局部环境的其他变化，细胞内的凝聚物将发生变化，改变其分子组成甚至完全溶解，从而调节与凝聚物相关的生物活性。由相分离介导的生物分子凝聚物形成连贯结构，可以分隔和集中细胞内的生化反应。在一些实施方案中，AR在体外和细胞内均进行相分离以形成AR高度浓缩的凝聚物。
野生型AR包含三个不同的结构域，包括雄激素非依赖型N端结构域(NTD)、DNA结合结构域和雄激素依赖型配体结构域(LBD)。全长野生型AR具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且全长野生型AR中的NTD跨越前559个氨基酸残基。AR的NTD具有高度内部无序性，α螺旋和β折叠很少。蛋白质中缺乏固定或有序二级和三级结构的无序区域也称为内在无序区域(IDD)。IDD的范围可以从完全非结构化到部分结构化。在一些实施方案中，IDD可以通过Ali，M.和Ivarsson，Y.(2018)，高通量发现功能无序区域，分子系统生物学，14(5)，e8377中公开的方法来识别。。
发现AR的NTD包含大量IDD。不受任何理论的束缚，认为AR的相分离或凝聚物形成是由通过IDD介导的粘附和缔合的多价相互作用驱动的。
此外，已知AR的NTD包含激活功能－1(AF1)区域，该区域对于AR反式激活至关重要，并且存在于不同形式的AR变体中。
如本文所用的术语“雄激素受体”或“AR”包含野生型AR或AR变体。如本文所用的野生型AR是指具有示例性序列SEQ ID NO:1的全长AR。如本文所用的AR变体包含保留至少部分NTD且能够相分离或能形成凝聚物的所有不同形式的AR。AR变体的例子包括但不限于突变体、片段、融合体和剪接变体。
在一些实施方案中，所述AR变体对至少一种雄激素剥夺治疗具有抗性。如本文所用术语“雄激素剥夺治疗”或“ADT”是指通过降低雄激素水平或通过抑制雄激素的生物功能(例如通过抑制AR信号传导)来抑制雄激素的治疗。ADT可以包括手术治疗(例如手术去势)和药物治疗。ADT药物的实例包括但不限于LHRH激动剂(例如Leuprolide(Lupron，Eligard)、戈舍瑞林(Zoladex)、曲普瑞林(Trelstar)和组氨瑞林(Vantas))、LHRH拮抗剂(例如地加瑞克(Firmagon)、Relugolix(Orgovyx))、降低肾上腺雄激素水平的药物(例如阿比特龙(Zytiga)、酮康唑(Nizoral))、雄激素受体拮抗剂(例如氟他胺(Eulexin)、比卡鲁胺(Casodex)、尼鲁胺(Nilandron))和其他抗雄激素(例如恩杂鲁胺(Xtandi)、阿帕鲁胺(Erleada)和达罗鲁胺(Nubeqa))。
在一些实施方案中，所述AR变体包含一种或多种突变。在雄激素不敏感综合征和前列腺癌患者中，已发现超过800种不同的突变与AR相关。在所述AR基因中，已检测到四种不同类型的突变会使AR失活，包括：a)引起氨基酸取代或过早终止密码子的单点突变；b)导致移码和过早终止(rumination)的核苷酸插入或缺失；c)完全或部分基因缺失；和d)引起可变剪接的内含子突变(详见，K.Eisermann等，Transl Androl,Urol.2013Sep；2(3):137-147)。
在一些实施方案中，所述AR变体在配体结合结构域(LBD)中包括一种或多种突变体。在一些实施方案中，在LBD中的所述一种或多种突变导致AR的异常激活。
在一些实施方案中，所述AR变体在选自下述的残基中包含一种或多种突变：L702、V716、V731、W742、H875、F877、T878、D880、L882、S889、D891、E894、M896、E898、T919，其中，所述编号相对SEQ ID NO:1。下面提供了SEQ ID NO:1的氨基酸序列(另见NCBI登录号：NP_000035.2)：
在一些实施方案中，所述一种或多种突变选自：L702H、V716M、V731M、W742L/C、H875Y/Q、F877L、T878A/S、D880E、L882I、S889G、D891H、E894K、M896V/T、E898G和T919S。
在一些实施方案中，所述AR变体缺乏全部或部分LBD。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是转录凝聚物。新的证据表明，基因表达伴随着大聚类转录复合物的募集，例如介体和RNA聚合酶II(Pol II)，它们通过相分离形成凝聚物。如本文所用的“转录凝聚物”是指在转录位点出现的相分离凝聚物，并且包含与转录相关的多个相关协作组分。如本文所用，关于凝聚物的“组分”是指在生理或病理条件下可在凝聚物之中或之上发现的分子。转录凝聚物中的组分可包括转录因子、辅因子、染色质调节子、DNA、非编码RNA、新生RNA和RNA聚合酶II等。
在一些实施方案中，所述AR转录凝聚物含有AR，且还包括DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述DNA/RNA序列包含AR调节基因。
在某些实施方式中，所述AR转录凝聚物还包括组蛋白。真核转录受染色质结构调节，其改变是由保守的翻译后组蛋白尾部修饰介导的。组蛋白尾部修饰包括但不限于乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化。组蛋白乙酰化通常由组蛋白乙酰转移酶催化，乙酰化组蛋白尾内的赖氨酸残基，减少组蛋白与DNA的相互作用，从而将浓缩的染色质转化为更松弛的结构，以促进更高水平的基因转录。在一些实施方式中，组蛋白包括H3K27ac。在一些实施方案中，组蛋白包括K27乙酰化H3。
在一些实施方案中，所述辅因子包括含有LXXLL基序的蛋白质。LXXLL基序存在于许多转录因子和辅因子中，介导可激活或抑制转录的相互作用。具有LXXLL基序的辅因子是本领域已知的。
介体的实例包括但不限于MED1、MED15、GCN4、p300、BRD4、激素(例如雌激素)或TFIID。在一些实施方案中，所述介体包括MED1。
在一些实施方案中，所述AR转录凝聚物还包括RNA聚合酶。本文所述“RNA聚合酶II”或Pol II是指12个亚基的多蛋白复合物，其将DNA转录成前mRNA和大多数小核RNA和微RNA。Pol II需要多种转录因子来与上游基因启动子结合并开始转录。由RNA聚合酶II(PolII)合成前体mRNA涉及转录起始复合物的形成和向延伸复合物的转变。Pol II的大亚基含有内在无序的C端结构域(CTD)，在起始到延伸的转变过程中，该结构域被细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)磷酸化，从而影响CTD与起始不同成分的相互作用。
在某些实施方式中，所述RNA聚合酶是磷酸化RNA pol II。
AR凝聚物调节剂
在细胞中，发明人发现AR凝聚物占据了活性基因转录的位点。相分离时，AR可以与多种组分相互作用，这些组分本身可能会或可能不会发生相分离，但可以在凝聚物中达到高局部浓度，并促进基因转录。因此，认为AR转录凝聚物的调节能够调节AR调节基因的转录或表达。
本公开还提供了AR凝聚物调节剂，其调节至少包含AR的AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性和/或活性。在一些实施方案中，调节AR凝聚物还包括改变所述AR凝聚物的形态或形状，和/或调节涉及与凝聚物相关的一种或多种组分的细胞信号传导级联。
如本文所用，关于AR凝聚物的“形成”是指生成具有明确描绘的物理边界但没有脂质膜屏障的AR凝聚物。在一些实施方案中，AR凝聚物的形成可以由相分离、特别是AR的相分离驱动。在一些实施方案中，干扰AR相分离的能力损害AR凝聚物的形成。在一些实施方案中，AR凝聚物的形成是由AR凝聚物中除AR之外的组分的相分离驱动的。在一些实施方案中，调节凝聚物的形成包括增加或减少形成速率或形成是否发生。
如本文所用，“组合物”是指在凝聚物、特别是转录凝聚物内相关的组分的集合。AR转录凝聚物通常包含多种成分，包括蛋白质和/或核酸。在一些实施方案中，AR凝聚物的组成是异质的或动态的。在一些实施方案中，可以通过例如增加或减少与凝聚物相关的组分的水平来调节AR凝聚物的组成。
本文所述的“稳定性”是指当平衡状态受到干扰时，凝聚物恢复其原始状态的性质。凝聚物的稳定性可以通过凝聚物的维持或分解(部分或完全)来反映。维持是指保持凝聚物的组成和物理性质。相反，分解是指凝聚物部分或完全解体。在一些实施方案中，调节凝聚物的稳定性包括增加或降低凝聚物维持或分解的速率，或者促进或抑制凝聚物分解。
如本文所用，“活性”是指AR凝聚物在调节AR凝聚物所靶向的基因的转录中的活性。在一些实施方案中，所述凝聚物的活性与凝聚物的组成或稳定性相关。所述凝聚物的组成的变化可能影响凝聚物的活性。在一些实施方案中，调节凝聚物活性包括改变凝聚物的转录活性。
AR凝聚物抑制剂
在一些实施方案中，通过与AR凝聚物抑制剂接触来调节AR转录凝聚物。在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
本文所用的“AR凝聚物抑制剂”是指能够抑制AR凝聚物的水平或活性的试剂。在某些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂干扰、减少或抑制AR转录凝聚物的形成、组成、稳定性或活性。
在某些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂减少了AR转录凝聚物的水平或形成。例如，所述AR凝聚物抑制剂可以破坏AR凝聚物的维持或形成所需的相互作用，或者可以诱导AR凝聚物的分解，或者可以引起AR凝聚物的组成变化，从而改变或抑制其转录活性。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂与AR的内在无序结构域(IDD)相互作用。AR的IDD被认为参与AR凝聚物的形成、维持、分解或调节，并且与IDD的相互作用可以调节AR凝聚物的水平或形成。
在一些实施方式中，IDD具有单独的离散区域。在一些实施方式中，IDD是至少约5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150或更多个无序氨基酸(例如，连续无序氨基酸)。在一些实施方案中，如果D2P2采用的算法的至少75％预测残基是无序的，则氨基酸被认为是无序氨基酸(Oates et al.,Nucleic Acids Res,.2013Jan；41(Database issue):D508-16.)。已知AR的IDD位于AR的N端结构域(NTD)内，并且可以是AR的NTD中的离散区域。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂与AR的NTD的含有IDD的片段相互作用。在一些实施方案中，含有IDD的片段是tau-1或tau-5。Tau-1覆盖AR的氨基酸位置102至371的残基，编号参考SEQ ID NO:1。Tau-5覆盖AR的氨基酸位置330至448的残基，编号参考SEQID NO:1。
在一些实施方案中，含有IDD的片段包含在氨基酸位置102至371、位置102至300、位置102至250、位置102至200、位置102至150、位置150至300、位置200至200的区域内，编号参考SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，含有IDD的片段包含氨基酸位置330至448、位置330至420、位置330至400、位置330至380、位置330至360、位置350至448、位置380至448、位置400到448或位置400到420的区域内，编号参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，含有IDD的片段具有约或至少20个残基、25个残基、30个残基、40个残基或50个残基的长度。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂与本文提供的含有IDD的片段内的残基结合。在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂与SEQ ID NO：1的半胱氨酸406结合。在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂与含有SEQ ID NO：1的半胱氨酸406的片段结合。
在一些实施方式中，所述AR凝聚物抑制剂与AR的IDD结合，或结合到IDD之外的区域，但可以变构影响IDD。与IDD的结合可以使用本领域已知的合适方法来测定。在一些实施方式中，IDD之外的区域在AR的NTD之内。
AR凝聚物调节剂与AR的结合位点可以基于本领域已知的合适方法来确定，通过饱和转移扩散核磁共振(STD NMR)亲和力测定(如实施例7中所述)、质谱分析(如实施例8中所述)或下拉实验(pull down assay)(如实施例9中所述)。
STD NMR的方法描述于例如Walpole,S.等《酶学方法(Methods in Enzymology)》，第615卷，2019，第423-451页。简而言之，对于质谱分析，可以将重组AR蛋白或含有IDD的AR片段与测试化合物一起孵育，然后进行蛋白质片段化和质谱测定。对于下拉实验(pulldown assay)，可以将含有IDD的重组片段与测试化合物接触，随后富集化合物/片段复合物，并测定所述化合物与片段的结合。
AR凝聚物的水平可以通过任何合适的方法来确定，包括但不限于通过活细胞成像。活细胞成像可以通过显微镜进行，例如，反卷积显微镜、结构照明显微镜或干涉显微镜。
在某些实施方案中，所述AR凝聚物的水平可以通过活细胞成像测定。例如，AR可以与可检测标记物(例如荧光分子)缀合，这允许AR在显微镜下可视化，并且荧光强度可以指示AR凝聚物的存在和/或水平例如，当野生型AR不形成AR凝聚物时，标记的AR的荧光强度通常均匀分布在细胞核或细胞质中。然而，在雄激素刺激时，作为与背景对比的亮点或斑点，可以观察到AR凝聚物的形成或存在，其中亮点或斑点表明AR凝聚物的存在。然而，对于某些组成型活性AR变体(例如缺乏LBD结构域的变体)，AR凝聚物可以在没有雄激素刺激的情况下自发形成，并且可以使用活细胞成像观察或确定AR凝聚物的水平。AR凝聚物的水平可以通过合适的方法进一步测定，例如，通过计数在显微镜下选择的视野下可视化的AR凝聚物的数量，或者通过计算相对于背景信号增加的荧光强度信号，或者通过计算荧光强度高于预定阈值的区域。
在一些实施方案中，如通过活细胞成像所测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低由雄激素(如DHT)刺激的AR凝聚物的水平。本领域技术人员可以选择用于试验的雄激素的合适浓度，只要其可以提供合适的窗口来确定AR凝聚物的抑制。在一个例子中，1nM的DHT可用于细胞测定中以检测AR凝聚物抑制。在一些实施方案中，如实施例2和4中所述，如通过活细胞成像所测量的，浓度不超过10μM的AR凝聚物抑制剂降低由1nM DHT刺激的AR凝聚物水平。
然而，应当理解，雄激素的刺激对于AR凝聚物形成或AR凝聚物水平的抑制测试不是必需的，因为某些AR变体能够在不存在雄激素例如DHT的情况下形成AR凝聚物。在这种情况下，AR凝聚物抑制剂可以在不存在雄激素的情况下降低AR凝聚物的水平。
在一些实施方案中，AR凝聚物抑制剂将任选地由DHT刺激的AR凝聚物水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些实施方案中，如实施例2和4中所述，如通过活细胞成像所测量的，浓度不超过10μM的AR凝聚物抑制剂将任选地由1nM DHT刺激的AR凝聚物水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂将包含AR变体、任选地组成型活性AR变体(如缺乏全部LBD的部分的AR变体)的AR凝聚物水平降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂的浓度不超过10μM。在一些实施方案中，如实施例2和4中所述，所述AR冷凝物水平的降低通过活细胞成像测量。
在一些实施方案中，由DHT刺激的AR凝聚物的水平是基于细胞核内荧光强度的变化来量化的。荧光强度的变化可以在显微镜下测定。
在一些实施方案中，基于细胞核内显示出相对于背景荧光增加的荧光强度的斑点的数量来量化AR凝聚物的水平。在一些实施方案中，基于细胞核内显示出相对于背景荧光增加的荧光强度的区域来量化AR凝聚物的水平。
或者，AR凝聚物的活性可以通过任何合适的方法来测定，包括但不限于通过测定AR调节基因的表达。可以使用用于确定基因表达的任何合适的方法，例如但不限于定量PCR、报告测定、蛋白质印迹等。
在一些实施方案中，如在表达AR的细胞系中通过定量PCR检测测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
如本文所用，“AR靶基因”是指其转录由野生型AR调节的基因。AR靶基因的实例包括但不限于FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2和NKX3.1。
如本文所用，“AR变体靶基因”是指其转录由AR变体而非野生型AR特异性调节的基因。AR变体靶基因的实例包括但不限于BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15和CDC20。详情参见Hu，R等，Cancer Res 2012；72：3457-3462，其全部内容并入本文。
不希望受任何理论限制，据信野生型AR和AR变体所调节的基因是不同的，或者程度不同。特别是，某些受AR变体调节的基因不能被现有的AR抑制剂(例如恩杂鲁胺)有效抑制。然而，本文提供的AR凝聚物抑制剂可以抑制野生型AR调节的基因以及受AR变体优先调节的基因的表达，并且在一些实施方案中，本文提供的AR凝聚物抑制剂的抑制显著高于现有的AR抑制剂例如恩杂鲁胺的抑制。
在一些实施方案中，本文提供的AR凝聚物抑制剂在降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平方面比相当浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)有效至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。恩杂鲁胺是是一种雄激素受体抑制剂，已知与雄激素竞争与AR配体结合域(LBD)的结合。就基因表达水平降低而言，X倍效力是指一种或多种基因的表达水平降低是参考化合物在相似浓度下实现的表达水平降低的X倍。例如，如果AR凝聚物抑制剂在浓度为5μM时将基因的表达水平降低60％，而参考化合物在浓度为5μM时将同一基因的表达水平降低30％，则AR凝聚物抑制剂的效力是参考化合物的2倍。
在一些实施方案中，在降低选自FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2和NKX3.1中的两种、三种、四种或五种AR靶基因表达水平方面，本文提供的AR凝聚物抑制剂比相当浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)有效至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。在一些实施方案中，AR凝聚物抑制剂和恩杂鲁胺在0.1uM、0.5uM、1uM、2uM、5μM、10μM、15μM或20μM下测试。
在一些实施方案中，在降低选自BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15和CDC20中的两种、三种、四种或五种AR变体靶基因表达水平方面，本文提供的AR凝聚物抑制剂比相当浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)有效至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。在一些实施方案中，AR凝聚物抑制剂和恩杂鲁胺在0.1uM、0.5uM、1uM、2uM、5μM、10μM、15μM或20μM下测试。
在一些实施方案中，任选地使用如定量PCR所测量的，5μM浓度的AR凝聚物抑制剂将所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平降低至少30％(例如至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％)。
在一些实施方案中，任选地如通过细胞增殖测定所测量的，本文提供的AR凝聚物抑制剂以不超过20μM、或15μM、或10μM、或10μM、或8μM、或5μM、或4μM、或3μM的IC50抑制表达AR的癌细胞的增殖。在一些实施方案中，所述表达AR的癌症细胞表达AR变体。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌细胞选自LNCaP、22Rv1、VCaP和LNCaP95。
LNCaP是表达野生型人类雄激素受体(AR)的人类前列腺癌细胞系。LNCaP可从商业来源获得，例如DSMZ，登录号为ACC 256。
22Rv1是一种人前列腺癌上皮细胞系，其表达野生型AR和缺乏配体结合域的AR剪接变体7(AR-V7)。22Rv1可从商业来源获得，例如ATCC，保藏号为CRL-2505。
VCaP是一种表达野生型AR和缺乏配体结合域的AR-V7的人类前列腺癌细胞系。VCaP可从商业来源获得，例如ATCC，保藏号为CRL-2876。
LNCaP95源自LNCaP细胞系，但长期在去雄激素血清条件下培养，使其对雄激素剥夺治疗(ADT)具有抵抗力，并且表达野生型AR和AR-V7。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
术语“肽”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键共价连接的氨基酸残基链。肽可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域技术人员将进一步理解，肽有时可包括多于一条的肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式连接。
术语“多核苷酸”或“核酸”或“寡核苷酸”可互换使用，并且是指共价连接的核苷酸链。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并且彼此独立地修饰或未修饰。
本文使用的术语“小分子”是指化学分子，不是肽或核酸的化合物。在某些实施方式中，小分子的质量可小于约2kDa。在某些实施方式中，小分子小于约1.5kDa，或小于约1kDa。在一些实施方案中，小分子小于约800道尔顿(Da)、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常，小分子的质量至少为50Da。在一些实施方式中，小分子是非聚合的。
在一些实施方案中，AR凝聚物调节剂包含化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物。
本文所用的“化合物6”是指3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈。
本文所用的“化合物60”是指N-(5-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯基)乙炔基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺。
本文所用的“化合物61”是指3-氯-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-5-基)乙炔基)苯基)丙-2-基)-2-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲腈。
本文所用的“化合物2”是指3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈。
本文所用的化合物“62是指”3-氯-2-(2-羟基乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈。
化合物6、化合物60、化合物2、化合物61和化合物62的化学结构如下所示：
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在一些实施方案中，AR凝聚物调节剂与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2竞争与AR的结合。
在一些实施方案中，AR凝聚物调节剂诱导的AR构象变化至少与由化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2诱导的构象变化相当。
在一些实施方案中，所示AR凝聚物调节剂在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：a)降低AR凝聚物的水平，所述AR凝聚物任选地由DHT刺激；b)降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平；和/或c)抑制表达AR的癌细胞的增殖。
在一些实施方案中，所示AR凝聚物调节剂在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：a)降低含有AR变体的AR凝聚物的水平；b)降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因(如AR靶基因或AR变体靶基因)的表达水平；和/或c)抑制表达AR的癌细胞的增殖。
化合物和药物组合物
另一方面，本公开提供了一种化合物，选自：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物。
另一方面，本公开提供了含有化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述化合物选自：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”表示物质或组合物必须在化学和/或毒理学上与包含在制剂中的其他成分和/或与用其治疗的对象相容。
如本文所用，除非另有说明，术语“药学上可接受的盐”包括保留特定化合物的游离酸和碱的生物有效性并且不是生物学不期望或其他方面不期望的盐。预期的药学上可接受的盐形式包括但不限于单盐、双盐、三盐、四盐等。药学上可接受的盐在其施用的量和浓度下是无毒的。此类盐的制备可以通过改变化合物的物理性质而不阻止其发挥其生理作用来促进药理学用途。物理性质的有用改变包括降低熔点以促进经粘膜给药和增加溶解度以促进给予更高浓度的药物。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、氯化物、盐酸盐、富马酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎宁酸盐的那些盐。药学上可接受的盐可以从酸获得，例如盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、富马酸和奎尼酸。
当存在酸性官能团，例如羧酸或苯酚时，药学上可接受的盐还包括碱加成盐，例如含有苄星乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、叔丁胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的那些盐。例如参见《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)，19版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(MackPublishing Co.,Easton,PA)，第2卷，第1457页，1995；《药用盐手册：性质、选择及用途》(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)，Stahl和Wermuth编著，Wiley-VCH公司，德国魏因海姆，2002。此类盐可以使用适当的相应碱来制备。
药学上可接受的盐可以通过标准技术制备。例如，可以将化合物的游离碱形式溶解在合适的溶剂中，例如含有合适的酸的水性溶液或水性醇溶液，然后通过蒸发溶液来分离。因此，如果特定化合物是碱，可通过本领域可用的任何合适方法制备所需的药学上可接受的盐，例如，用无机酸或有机酸处理游离碱，无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，有机酸例如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、乙醇酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸)、α-羟基酸(如柠檬酸或酒石酸)、氨基酸(如天冬氨酸或谷氨酸)、芳香酸(如苯甲酸或肉桂酸)、磺酸(例如对甲苯磺酸或乙磺酸)等。
类似地，如果特定化合物是酸，则可通过任何合适的方法制备所需的药学上可接受的盐，例如用无机或有机碱处理游离酸，例如胺(伯、仲或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等。合适盐的说明性示例包括：衍生自氨基酸(例如甘氨酸和精氨酸)、氨、伯胺、仲胺和叔胺以及环状胺(例如羟乙基吡咯烷、哌啶、吗啉或哌嗪)的有机盐，以及衍生自钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂的无机盐。
还应当理解，本公开的化合物可以以非溶剂化形式、溶剂化形式(例如，水合形式)和固体形式(例如，晶体或多晶型形式)存在，并且本公开旨在涵盖所有此类形式。
如本文所用，术语“溶剂化物”或“溶剂化形式”是指含有化学计量或非化学计量量的溶剂的溶剂加成形式。一些化合物倾向于在结晶固态中捕获固定摩尔比的溶剂分子，从而形成溶剂化物。如果溶剂是水，则形成的溶剂化物是水合物；而如果溶剂是醇，则形成的溶剂化物是醇化物。水合物是由一个或多个水分子与一个物质分子结合形成的，其中水保持其分子状态为H2O。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
如本文所用，术语“晶体形式”、“结晶形式”、“多晶型形式”和“多晶型物”可以互换使用，“晶体结构”是指化合物(或其盐或溶剂化物)可以以不同的晶体堆积排列方式结晶的晶体结构，所有晶体堆积排列都具有相同的元素组成。不同的晶型通常具有不同的X射线衍射图、红外光谱、熔点、密度硬度、晶体形状、光学和电学性质、稳定性和溶解度。重结晶溶剂、结晶速率、储存温度和其他因素可能导致一种晶型占主导地位。化合物的晶体多晶型物可以通过在不同条件下结晶来制备。
本公开还旨在包括化合物中原子的所有同位素。原子的同位素包括具有相同原子序数但不同质量数的原子。例如，除非另有说明，本公开的化合物中的氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴或碘意在还包括它们的同位素，例如但不限于1H、2H、3H、11C、12C、13C、14C、14N、15N、16O、17O、18O、31P、32P、32S、33S、34S、36S、17F、18F、19F、35Cl、37Cl、79Br、81Br、124I、127I和131I。在一些实施方案中，氢包括氕、氘和氚。在一些实施方案中，碳包括12C和13C。
本领域技术人员将理解，本公开的化合物可以不同的互变异构形式存在，并且所有此类形式都涵盖在本公开的范围内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”指，通过低能垒可相互转化的不同能量的结构异构体。异构体形式的存在和浓度将取决于化合物所处的环境，并且可以根据例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而不同。举例来说，质子互变异构体(也称为质子互变异构体)包括通过质子迁移的互变，例如酮-烯醇、酰胺-亚氨酸、内酰胺-内酰亚胺、亚胺-烯胺异构化和质子可以占据杂环系统的两个或多个位置的环状形式。价互变异构体包括通过一些键合电子重组而发生的互变。互变异构体可以通过适当的取代处于平衡状态或空间锁定为一种形式。本公开通过名称或结构确定为一种特定互变异构形式的化合物旨在包括其他互变异构形式，除非另有说明。
如本文所用，术语“前药”是指当在生理条件下代谢或当通过溶剂分解转化时产生所需活性化合物的化合物或其药学上可接受的盐。前药包括但不限于活性化合物的酯、酰胺、氨基甲酸酯、碳酸酯、酰脲、溶剂化物或水合物。通常，前药是无活性的，或者活性低于活性化合物，但可以提供一种或多种有利的处理、施用和/或代谢特性。例如，一些前药是活性化合物的酯；在代谢过程中，酯基被裂解产生活性药物。此外，一些前药被酶促活化以产生活性化合物，或产生在进一步化学反应后产生活性化合物的化合物。前药可以在单个步骤中从前药形式转变为活性形式，或者可以具有一种或多种本身可以具有活性或可以是无活性的中间形式。前药的制备和使用参见T.Higuchi和V.Stella，“作为新型递送系统的前药(Pro-drugs as Novel Delivery Systems)”，A.C.S.研讨会系列，第14卷，参见《药物设计中的生物可逆载体(Bioreversible Carriers in Drug Design)》，Edward B.Roche编辑，美国制药协会和佩加蒙出版社(American Pharmaceutical Association and PergamonPress)，1987；参见《前药：挑战与回报(Prodrugs:Challenges and Rewards)》，V.Stella,R.Borchardt,M.Hageman,R.Oliyai,H.Maag,J.Tilley编辑，纽约施普林格出版社(Springer-Verlag New York)，2007，所有这些均通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“代谢物”，例如，活性代谢物与如上所述的前药重叠。因此，此类代谢物是药理学活性化合物或进一步代谢为药理学活性化合物的化合物，所述药理学活性化合物是由对象体内的代谢过程产生的衍生物。例如，此类代谢物可以由所给予的化合物或盐或前药的氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺、酯化、脱酯化、酶裂解等产生。其中，活性代谢物是此类具有药理活性的衍生化合物。对于前药，前药化合物通常没有活性或活性低于代谢产物。对于活性代谢物，母体化合物可以是活性化合物或可以是无活性的前药。
前药和活性代谢物可以使用本领域已知的常规技术来鉴定。例如参见Bertolini等，1997，J Med Chem 40:2011-2016；Shan等，J Pharm Sci 86:756-757；Bagshawe，1995，DrugDev Res 34:220-230；Wermuth，同上。
本文提供的化合物可以使用任何已知的有机合成技术来制备，并且可以根据多种可能的合成路线中的任一种来合成，包括但不限于本公开的实施例中描述的那些。
用于制备本公开的化合物的反应可以在合适的溶剂中进行，有机合成领域的技术人员可以容易地选择合适的溶剂。合适的溶剂可以在反应进行的温度下基本上不与起始材料(反应物)、中间体或产物发生反应，例如温度范围可以从溶剂的冷冻温度到溶剂的沸腾温度。给定的反应可在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。根据具体的反应步骤，本领域技术人员可以选择用于具体反应步骤的合适的溶剂。
本公开的化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和脱保护。本领域技术人员可以容易地确定保护和脱保护的需要以及适当保护基团的选择。保护基团化学性质可以参见例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts,《有机合成中的保护基团(Protective Groups inOrganic Synthesis)》，第三版，威利父子公司(Wiley&Sons,Inc.)，纽约(1999)；参见P.Kocienski，保护组(Protecting Groups)，Georg Thieme Verlag，2003，和参见PeterG.M.Wuts，《格林氏有机合成中的保护基团(Greene's Protective Groups in OrganicSynthesis)》，第5版，威利公司(Wiley)，2014，所有这些均通过引用整体并入本文。
可以根据本领域已知的任何合适的方法监测反应。例如，可通过分光光度法，如核磁共振谱(例如1H或13C)，红外广谱，分光光度法(例如紫外-可见光)，质谱法，或通过色谱法，例如高效液相色谱(HPLC)，液相色谱-质谱(LCMS)，或薄层色谱(TLC)监控产物形成。本领域技术人员可以通过多种方法纯化化合物，包括高效液相色谱(HPLC)(“制备型LC-MS纯化：改进的化合物特定方法优化(Preparative LC-MS Purification:Improved CompoundSpecific Method Optimization)”，Karl F.Blom,Brian Glass,Richard Sparks,AndrewP.Combs J.Combi，Chem，2004，6(6)，874-883，其全部内容通过引用并入本文)，以及正相二氧化硅色谱法。
另一方面，本文提供了药物组合物，其包含一种或多种本公开的化合物或其药学上可接受的盐，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有适合施用于对象的形式的本公开内容的分子或化合物的制剂。
如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”应指可用于制备基本安全无毒的药物组合物的赋形剂，所述药物组合物通常是安全无毒并且在生物学上或其他方面也无其他不利情况，并包括可用于兽医用途以及人类药物用途可接受的赋形剂。本文所用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。术语“药学上可接受的赋形剂”还涵盖“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的稀释剂”。
所用的特定赋形剂将取决于本公开的化合物所应用的手段和目的。通常基于本领域技术人员认为可安全施用于包括人类在内的哺乳动物的溶剂来选择溶剂。一般来说，安全溶剂是无毒的水性溶剂，例如水和其他可溶于或混溶于水的无毒溶剂。合适的水性溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如PEG 400、PEG 300)等及其混合物。
在一些实施方案中，合适的赋形剂可以包括缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸)；抗氧化剂(包括抗坏血酸和蛋氨酸)；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质(如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；氨基酸(如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸)；包括葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖，二糖和其它碳水化合物；螯合剂如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，合适的赋形剂可以包括一种或多种稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂和其他已知的添加剂，以提供药物(即，本公开的化合物或其药物组合物)的精良呈递或有助于药物产品(即，药剂)的制造。所述活性药物成分还可以被包封在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于《雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences)》第16版，Osol,A.编著(1980)。“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物(例如本文公开的化合物和任选的化疗剂)递送至哺乳动物(包括人类)。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。
本文提供的药物组合物可以是允许将组合物施用于对象(包括但不限于人)的任何形式，并且配制为与预期的施用途径相容。
对于本文提供的药物组合物考虑了多种途径，并且因此本文提供的药物组合物可以根据预期的施用途径以散装或单位剂量形式提供。例如，对于口服、含服和舌下给药，粉末剂、混悬剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、软胶囊和囊片可以是可接受的固体剂型，并且作为液体剂型的乳液、糖浆、酏剂、混悬剂和溶液也是可以接受的。对于注射给药，乳液和混悬液作为液体剂型是可接受的，而适合用适当的溶液重构的粉末作为固体剂型是可接受的。对于吸入给药，溶液剂、喷雾剂、干粉剂和气雾剂可以是可接受的剂型。对于局部(包括含服和舌下)或透皮给药，粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液和贴剂可以是可接受的剂型。对于阴道给药，子宫托、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫和喷雾剂可以是可接受的剂型。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以是用于口服施用的制剂的形式。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是片剂制剂的形式。用于片剂制剂的合适的药学上可接受的赋形剂包括例如惰性稀释剂(如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙)，造粒剂和崩解剂(如玉米淀粉或海藻酸)；粘合剂(例如淀粉)；润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉)；防腐剂(如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯)以及抗氧化剂(如抗坏血酸)。片剂制剂可以是未包衣的或包衣的，以改变其崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收，或改善其稳定性和/或外观，在任一情况下均使用本领域熟知的常规包衣剂和程序。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是硬明胶胶囊形式，其中活性成分和惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或者是可以是软明胶胶囊形式，其中活性成分与水或油(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是水性悬浮液的形式，其通常含有细粉形式的活性成分以及一种或多种悬浮剂(例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯树胶)；分散剂或润湿剂，例如卵磷脂或环氧烷与脂肪酸的缩合产物(如聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七乙烯氧基鲸蜡醇)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯)，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合产物(例如聚脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂(例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯、抗氧化剂(例如抗坏血酸)、着色剂、调味剂和/或甜味剂(例如蔗糖、糖精或阿斯巴甜))。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是油性悬浮液的形式，其通常含有悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(例如液体石蜡)中的活性成分。所述油性混悬剂也可含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂(例如，如上述的那些)和调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过添加抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是水包油乳剂的形式。油相可以是植物油(如橄榄油或花生油)，或者是矿物油(如液体石蜡)，或者是它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的树胶(如阿拉伯胶或黄蓍胶)；天然存在的磷脂(如大豆、卵磷脂、衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯(例如脱水山梨糖醇单油酸酯))；以及所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物(如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)。乳液还可以包含甜味剂、调味剂、防腐剂和抗氧化剂。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以是糖浆剂和酏剂的形式，其可以含有甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、阿斯巴甜或蔗糖、缓和剂、防腐剂、调味剂和/或着色剂。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以是用于注射施用的制剂的形式。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上文已经提到的那些合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是配制在无毒的肠胃外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可用的可接受载剂和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种低刺激非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂的制备中也同样可使用脂肪酸如油酸。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以是用于吸入施用的制剂的形式。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以是水性和非水性(例如，在碳氟化合物推进剂中)气雾剂的形式，其含有任何核实的试剂和任选的其他化合物，例如但不限于稳定剂、抗微生物剂、抗氧化剂、pH调节剂、表面活性剂、生物利用度调节剂以及这些的组合。所述载剂和稳定剂根据特定化合物的要求而变化，但通常包括非离子表面活性剂(吐温(Tweens)、Pluronics或聚乙二醇)、无毒蛋白质(如血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇)。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以是用于局部或经皮施用的制剂的形式。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以是霜剂、软膏剂、凝胶剂和水性或油性溶液或悬浮液的形式，其通常可通过将活性成分与常规的、局部可接受的赋形剂(例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、有机硅、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合物)配制来获得。
在某些实施方案中，本文提供的药物组合物可以配制为本领域普通技术人员熟知的经皮皮肤贴剂的形式。
除了上述那些代表性剂型之外，药学上可接受的赋形剂和运载体通常是本领域技术人员已知的并且因此包括在本公开内容中。此类赋形剂和运载体描述于《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，麦克出版公司(Mack Pub.Co.)，新泽西州，1991，描述于《雷明顿：药物科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》，费城科学大学编，第21版，LWW出版公司(2005)，其通过引用纳入本文。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以配制为单一剂型。单一剂型中本文提供的化合物的量将根据治疗的对象和特定的施用模式而变化。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以配制为0.001-1000mg/kg体重/天的剂量。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物可以配制为短效、快速释放、长效和持续释放。因此，本公开的药物制剂还可配制用于控释或缓释。
另一方面，本文还提供了兽用组合物，其包含一种或多种本公开的化合物的分子或化合物或其药学上可接受的盐和兽用运载体。兽用运载体是可用于施用组合物的材料，并且可以是固体、液体或气体材料，其在兽医领域中是惰性的或可接受的并且与活性成分相容。这些兽医组合物可以肠胃外、口服或通过任何其他所需途径施用。
药物组合物或兽医组合物可以根据用于施用药物的方法以多种方式包装。例如，用于分配的制品可包括其中存放有适当形式的组合物的容器。合适的容器是本领域技术人员众所周知的，并且包括诸如瓶子(塑料和玻璃)、小袋、安瓿、塑料袋、金属圆筒等的材料。容器还可以包括防篡改组件以防止不谨慎地接触包装的内容物。另外，容器上放置有描述容器内容物的标签。标签还可能包含适当的警告。所述组合物还可包装在单位剂量或多剂量容器中(例如密封的安剖和小瓶)，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用前添加无菌液体运载体(例如水)即可用于立即注射。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含一种或多种本发明的化合物或其药学上可接受的盐作为第一活性成分，和第二活性成分。第二活性成分可以是用于治疗方法的任何合适的活性成分，包括但不限于抗癌疗法，或特别是抗前列腺癌药物。
治疗疾病或病症的方法
一方面，本公开提供了一种治疗对象中雄激素受体(AR)相关疾病或病症的方法，包括向对象施用治疗有效量的AR凝聚物调节剂，其中所述AR凝聚物调节剂调节至少含有AR的AR凝聚物。
在某些实施例中，AR凝聚物调节剂包含选自下组的化合物：化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或其代谢物。
在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病的症状或延长接受治疗的对象的存活时间。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。治疗有效量根据对象所涉及的具体治疗而变化，并取决于本领域已知的各种因素，例如对象的体重、体型和健康状况；病情的性质和程度；给药率；选择用于施用的治疗剂或治疗剂的组合；以及处方医生的判断。给定情况下的治疗有效量可以通过临床医生的技能和判断范围内的常规试验来确定。例如，初始施用剂量可以高于后续施用剂量。又例如，施用剂量可以在治疗过程中根据对象的反应而变化。
在一些实施方案中，其中所述AR相关的疾病或病症具有异常水平的AR活性。
如本文所用，术语“AR活性的异常水平”是指其水平显著低于或高于AR活性的正常或基线水平的AR活性。AR活性的正常水平可以是健康细胞或组织样品中的AR活性水平。AR活性的基线水平可以是一般癌症患者群体或AR依赖性癌症(例如AR依赖性前列腺癌)的一般患者群体中AR活性的平均水平。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有上调水平的AR活性。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、套细胞淋巴瘤、唾液腺癌、脱发、痤疮、多毛症、卵巢囊肿、多囊卵巢病、性早熟、脊髓和延髓肌萎缩或年龄相关性黄斑变性。
在一些实施方案中，所述AR相关的疾病或病症为表达AR的癌症。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、套细胞淋巴瘤或唾液腺癌。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是转移性的。
在一些实施方案中，所述表达AR的癌症是前列腺癌。在一些实施方案中，前列腺癌是原发性或局限性前列腺癌、局部晚期前列腺癌、复发性前列腺癌、晚期前列腺癌、转移性前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌和激素敏感性前列腺癌。
在一些实施方案中，所述前列腺癌对去势或雄激素剥夺治疗(ADT)具有抗性。“抗性”是指所述疾病对ADT的反应性或敏感性缺失或降低。反应性降低可以通过例如需要增加剂量以实现给定功效来指示。在某些实施方案中，前列腺癌可以对ADT无反应。例如，尽管使用ADT治疗，癌细胞或肿瘤大小仍增加，或者疾病显示出消退或复发回到其之前的状态，例如，在部分康复后先前的症状复发。对ADT的耐药性可以是从头产生的，也可以是获得性的。
在一些实施方式中，前列腺癌具有去势抵抗性。去势抵抗性前列腺癌(CRPC)是一种晚期前列腺癌，尽管雄激素剥夺治疗，但仍显示疾病进展。在一些实施方案中，CRPC涉及AR的表达水平或活性升高。在一些实施方案中，CRPC涉及具有雄激素依赖性AR激活的突变的AR。在一些实施方案中，CRPC涉及瘤内和替代性雄激素产生。
在一些实施方案中，AR凝聚物调节剂与第二活性成分或疗法联合施用。第二活性成分或疗法可以是用于治疗方法的任何合适的活性成分或疗法，包括但不限于抗癌疗法，或特别是抗前列腺癌药物。
抗癌治疗的实例包括但不限于化疗剂、放射治疗、免疫治疗剂、抗血管生成剂、细胞治疗剂、基因治疗剂、激素治疗剂、细胞因子、姑息性护理、治疗癌症的手术、一种或多种止吐药以及化疗引起的并发症的治疗。
第二活性成分可以是抗前列腺癌药物。抗前列腺癌药物的示例包括雄激素轴抑制剂、雄激素合成抑制剂、聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制剂或其组合。
在某些实施方案中，所述雄激素轴抑制剂选自黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂、LHRH拮抗剂和雄激素受体拮抗剂。
在某些实施方式中，所述雄激素轴抑制剂为地加瑞克(degarelix)、比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁胺(nilutamide)、阿帕鲁胺(apalutamide)、达洛鲁胺(darolutamide)、恩杂鲁胺(enzalutamide)或阿比特龙(abiraterone)。在某些实施方案中，雄激素合成抑制剂是醋酸阿比特龙或酮康唑(ketoconazole)。在某些实施方案中，PARP抑制剂是奥拉帕尼(olaparib)或卢卡帕尼(rucaparib)。
在某些实施方案中，所述抗前列腺癌药物选自：醋酸阿比特龙、阿帕鲁胺、比卡鲁胺、卡巴他赛、Casodex(比卡鲁胺)、达洛鲁胺、地加瑞克、多西他赛、Eligard(醋酸亮丙瑞林)、恩杂鲁胺、Erleada(阿帕鲁胺)、Firmagon(地加瑞克)、氟他胺、醋酸戈舍瑞林、Jevtana(卡巴他赛)、醋酸亮丙瑞林、Lupron(醋酸亮丙瑞林)、Lupron Depot(醋酸亮丙瑞林)、Lynparza(Olaparib)、盐酸米托蒽醌、Nilandron(尼鲁米特)、尼鲁米特、Nubeqa(达洛鲁胺)、Olaparib、Provenge(西普鲁塞-T)、二氯化镭223、Rubraca(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐(Rucaparib Camsylate)、西普鲁塞-T、Taxotere(多西他赛)、Xofigo(二氯化镭223)、Xtandi(恩杂鲁胺)、Zoladex(醋酸戈舍瑞林)和Zytiga(醋酸阿比特龙)
转录调节方法
另一方面，本公开提供了调节细胞或对象中一种或多种AR调节基因的转录的方法，包括调节至少包含AR的AR转录凝聚物。
例如，基因转录的调节可以包括以下事件中的一个或多个：增加或减少基因转录的速率或频率，增加或减少基因转录的抑制，以及增加或减少mRNA转录起始、mRNA延伸或mRNA剪接活性。
在某些实施方式中，通过调节AR转录凝聚物来调节一种或多种基因的转录。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述方法包括通过AR凝聚物调节剂调节所述AR转录凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性或活性。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
在一些实施方案中，所述AR靶基因包括FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2、NKX3.1或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR靶基因包括BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15、CDC20或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物抑制剂结合AR的内在无序结构域(IDD)。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有异常水平的AR活性，或上调水平的AR活性。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性或它们的任意组合。
在一些实施方案中，所述细胞或对象具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
体外筛选系统
在另一方面，本公开提供一种体外筛选系统，其包含AR或其含有内在无序结构域的片段，其中所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR是本文提供的野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，体外筛选系统基于细胞中天然存在的AR凝聚物。细胞可以是转基因细胞或以其他方式操作的细胞。在一些实施方案中，体外筛选系统基于体外AR凝聚物。在一些实施方案中，体外AR凝聚物包含模拟细胞中发现的凝聚物的组分。
在一些实施方案中，所述体外筛选系统包括细胞或细胞核。
在一些实施方案中，所述体外筛选系统包括细胞裂解液或细胞核裂解液。在某些实施方式中，从细胞中分离出体外AR凝聚物。任何合适的从细胞或组合物中分离凝聚物的方法均涵盖在本发明中(例如化学或免疫沉淀)。在一些实施方案中，通过离心(例如，在约5,000xg、10,000xg、15,000xg下约5-15分钟；在约10,000xg下约10分钟)分离凝聚物。可以通过在合适的缓冲条件下用匀浆器(即，杜恩斯匀浆器)裂解细胞核，然后通过离心和/或过滤来分离凝聚物，从而从细胞中分离凝聚物。
在一些实施方案中，体外AR凝聚物是在溶液中具有一种或多种凝聚物组分的合成凝聚物。
在一些实施方案中，所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。如本文所用，术语“荧光团”包括任何荧光分子或部分，包括荧光蛋白、肽、化学化合物等。本文使用的术语“可检测标记物”包括但不限于：荧光团、放射性同位素、比色底物或酶；异源表位(其特定抗体可商购)，例如FLAG标签；异源氨基酸序列(作为市售结合蛋白的配体)，例如Strep标记、生物素；荧光猝灭剂(通常与其他多肽上的荧光标签结合使用)；以及互补的生物发光或荧光多肽片段。
可以直接测量作为可检测标记物或互补生物发光或荧光多肽片段的标记物(例如，通过测量适当底物或酶的荧光或放射性，或与未结合的多肽相比，与适当底物或酶一起孵育以产生相关多肽的分光光度计可检测的颜色变化)。作为异源表位或配体的标记物通常用与其结合的另外的试剂例如抗体或结合蛋白来检测，其中该试剂与可检测的标记物结合。在一些实施方案中，AR或凝聚物组分(例如，如本文所述的第一或第二组分)包含可检测标记物。
在一些实施方案中，体外凝聚物包含多个如本发明所述的可检测标记物。在一些实施方案中，不同的可检测标记物连接至AR和AR凝聚物的不同组分(例如，用一种荧光标记物标记的AR或其片段和用不同荧光标记物标记的RNA聚合酶Pol II)。在一些实施方式中，凝聚物的一种或多种组分具有猝灭剂。
在一些实施方案中，体外筛选系统进一步包含DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或其任何组合。
合成凝聚物
在另一方面，本公开提供一种合成的AR凝聚物，其至少包含AR或其含有IDD的片段。
如本文所述“合成”凝聚物是指包含凝聚物组分的非天然存在的凝聚物。在一些实施方案中，所述AR凝聚物是合成转录凝聚物。.在一些实施方式中，合成AR凝聚物模拟细胞中发现的AR转录凝聚物。
合成AR凝聚物可包含本文所述的任何组分。在一些实施方案中，所述AR是本文提供的野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，凝聚物还包含DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或其任何组合。
在一些实施方案中，AR的片段可以在相关生理条件(例如，与细胞中的条件相同或近似的条件)或相关实验条件(例如，体外用于形成凝聚物的合适条件)下形成凝聚物或掺入凝聚物中。
在一些实施方案中，AR或其片段进一步包含如本文所述的可检测标记物。在一些方面，可检测标记物是荧光标记物。
本公开的一些方面提供了制备合成AR转录凝聚物的方法。在一些实施方案中，该方法包括在适合形成AR转录凝聚物的条件下在体外将包含AR或其含有IDD的片段任选地与两种或更多种凝聚物组分组合。所述条件可包括适当的组分浓度、盐浓度、pH值等。在一些实施方案中，所述条件包括约25mM、40mM、50mM、125mM、200mM、350mM或425mM，或者大约在10-250mM、25-150mM、或40-100mM的盐浓度(例如，NaCl)范围内。在一些实施方式中，所述条件包括pH约为7-8、7.2-7.8、7.3-7.7、7.4-7.6或约7.5。
修饰的宿主细胞
在另一方面，本公开提供表达AR或其含有内在无序结构域的片段的修饰的宿主细胞，其中，所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
本文所述的“宿主细胞”是指引入了编码外源蛋白质或肽的表达载体的真核细胞，以及此类细胞的任何后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，所以这些后代实际上可能不与亲本细胞相同，但仍包括在本发明所用的术语的范围内。
在一些实施方案中，所述AR是野生型AR或AR变体。
在一些实施方案中，所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
在一些实施方式中，所述修饰的宿主细胞适用于检测所述AR凝聚物的形成。
在一些实施方案中，所述宿主细胞是肿瘤细胞、任选的前列腺癌细胞。
本发明公开的修饰的宿主细胞可用于产生本文所提供的体外筛选系统。在一个实施方案中，在合适的培养基中培养宿主细胞(其中已引入编码与可检测标签融合的AR或片段的重组表达载体)直至产生AR或其片段，然后从细胞中分离包含AR凝聚物的组合物。
本发明的修饰的宿主细胞还可用于产生非人转基因动物。所述非人转基因动物可用于筛选试验，该试验旨在鉴定能够调节AR凝聚物并改善癌症症状的试剂。
筛选方法
在另一方面，本公开提供一种筛选调节至少含有AR的AR凝聚物的试剂的方法，包括：
a)提供所述AR凝聚物，并评估所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应，
b)使测试试剂接触所述AR凝聚物，和
c)评估所述测试试剂是否会引起AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化。
在一些实施方案中，如果所述测试试剂引起所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化，则所述测试试剂调节所述凝聚物。在一些实施方案中，所述物理性质包括所述AR凝聚物的形成、组成、稳定性和/或活性。
在一些实施方案中，测量AR凝聚物的物理性质。物理性质可包括但不限于组成、稳定性、尺寸、浓度、渗透性、形态和粘度。可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量一种或多种物理性质。
在一些实施方案中，凝聚物具有可检测标记物并且该可检测标记物用于确定与测试试剂的接触是否引起AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的任何变化。
在一些实施方案中，评估测试试剂以确定AR凝聚物的以下一种或多种物理性质在接触时是否改变：(i)AR凝聚物的数量；(ii)AR凝聚物的尺寸；(iii)AR凝聚物的位置；(iv)AR凝聚物的分布；(v)AR凝聚物的表面积；(vi)AR凝聚物的组成；(vii)AR凝聚物的流动性；(viii)AR凝聚物的凝固；和(ix)AR凝聚物的分解。
所述物理性质可以与凝聚物激活报告基因的能力相关。
在一些实施方案中，本文所述的体外筛选系统、本文所述的合成的AR凝聚物、或本文所述的修饰的宿主细胞中含有所述AR凝聚物。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是一种分离的合成的凝聚物，或是含有所述AR凝聚物的分离的细胞组合物的形式。
在一些实施方案中，筛选方法在无细胞系统中进行，包括提供具有AR凝聚物的分离的细胞组合物，使组合物与测试试剂接触，并确定与测试试剂的接触是否引起AR凝聚物的一种或多种物理性质的变化或一种或多种生物效应的变化。在一些实施方案中，所述分离的细胞组合物包括含有AR凝聚物的细胞核。
含有凝聚物的细胞或从中分离出含有AR凝聚物的组合物的类型不受限制并且可以是本发明公开的任何细胞类型。在一些实施方案中，所述细胞受到疾病(例如癌细胞)的影响。在一些实施方案中，含有凝聚物的细胞是原代细胞、细胞系成员、分离自患有疾病的对象的细胞、或衍生自分离自患有疾病的对象的细胞的细胞(例如，分离自患有疾病的对象的诱导多能细胞的祖细胞)。
在一些实施方式中，AR凝聚物是一种合成凝聚物(另见下面的描述)。合成凝聚物在体外可以表现为由AR和一种或多种组分(例如，本文所述的第一组分和第二组分)组成的液滴。所述液滴还可包含RNA、DNA和/或组蛋白。所述液滴是体外凝聚物并且可以对应于体内存在的凝聚物和/或用作体内存在的凝聚物的模型。
在一些实施方案中，测量AR凝聚物的物理性质。物理性质可包括但不限于组成、稳定性、尺寸、浓度、渗透性、形态和粘度。可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量一种或多种物理性质。所述物理性质可以与凝聚物激活细胞中报告基因的能力相关。
所述凝聚物可能是天然存在的凝聚物。在一些实施方案中，所述AR凝聚物位于细胞内或细胞核内。在其他实施方案中，凝聚物可以存在于转基因细胞或以其他方式操作的细胞中。在一些实施方案中，筛选方法在基于细胞的系统中进行，包括提供含有AR凝聚物的细胞，使细胞与测试试剂接触，并确定与测试试剂的接触是否引起AR凝聚物的一种或多种物理性质的变化或一种或多种生物效应的变化。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是AR转录凝聚物。在某些实施方式中，所述转录凝聚物还包括RNA聚合酶。
在另一方面，本公开提供一种鉴定调节至少含有AR的AR凝聚物形成的试剂的方法，包括：
a)提供能形成所述AR凝聚物的组分；
b)在适合形成所述AR凝聚物的条件下，使用测试试剂接触所述组分，和
c)评估所述测试试剂的存在是否影响所述AR凝聚物的形成或所述AR凝聚物的一种或多种生物效应。
在一些实施方案中，如果所述测试试剂影响所述AR凝聚物的形成或影响所述AR凝聚物的一种或多种生物效应，则所述测试鉴定为调节所述凝聚物的形成。
在一些实施方案中，本文所述的体外筛选系统、本文所述的合成的AR凝聚物、或本文所述的修饰的宿主细胞中含有所述能够形成AR凝聚物的组分。
在一些实施方式中，细胞经基因工程改造以表达可检测标记物。
在一些实施方案中，所述AR凝聚物是转录凝聚物。
在一些实施方案中，基于所述AR调节基因的表达或细胞增殖来评估所述转录凝聚物的一种或多种生物效应。
在一些实施方案中，所述AR调节基因是AR靶基因、AR变体靶基因或报告基因。
在一些实施方案中，所述测试试剂已被鉴定能够结合AR的IDD。
可以使用任何合适的方法检测在接触测试试剂时凝聚物的变化，包括本领域已知的和本发明教导的方法。在一些实施方式中，使用显微镜确定与测试试剂的接触是否导致凝聚物的性质改变。在一些实施方式中，显微镜是反卷积显微镜、结构化照明显微镜或干涉显微镜。在一些实施方式中，使用DNA-FISH、RNA-FISH或其组合确定与测试试剂的接触是否导致凝聚物的性质改变。
在一些实施中，通过以凝聚物依赖的方式基于靶基因的表达来评估AR转录凝聚物的一个或多个生物效应。在一些实施方式中，所述靶基因是报告基因。所述报告基因可以可操作地连接至AR的结合位点。在一些实施方案中，报告基因编码可检测的荧光或发光蛋白。
在一些实施方案中，如果所述测试试剂影响所述凝聚物的形成或影响所述AR凝聚物的一种或多种生物效应，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚物的形成。
例如，可以提供AR和任选的其他组分，将它们组合在容器中，并观察凝聚物形成方面发生的情况和/或测量所得凝聚物的性质(例如，稳定性、组成、活性、形态的增加或减少)。在一些实施方式中，所提供的组合物将形成凝聚物，并就调节凝聚物形成(例如，增加或减少凝聚物的形成或凝聚物形成的速率)来筛选测试试剂。
在一些实施方案中，筛选调节AR凝聚物形成的试剂的方法包括：提供细胞、分离的细胞组合物和/或在AR凝聚物控制下表达报告基因的体外转录实验，将细胞或实验与测试试剂接触，并评估所述报告基因的表达。
在一些实施方案中，可以执行所述方法来鉴定与AR相互作用并驱动AR进入转录凝聚物的试剂。在一些实施方案中，可以执行所述方法来鉴定与AR相互作用并防止AR整合入凝聚物的试剂。在一些实施方案中，可以执行该方法来鉴定迫使组分整合到AR凝聚物中或防止组分进入AR凝聚物的试剂。在一些实施方案中，进一步测试通过本文公开的调节AR凝聚物或AR凝聚物形成的方法鉴定的试剂调节疾病的一种或多种特征的能力。所述疾病不受限制并且可以是本文所述的任何疾病。例如，如果该试剂抑制报告基因的表达或AR凝聚物的形成，则可以测试该试剂抑制癌细胞增殖的能力，所述癌细胞具有比对照升高的AR表达。
在一些实施方案中，通过本发明公开的方法所鉴定的试剂，能调节凝聚物的一种或多种物理性质或形成(例如形成、稳定性或形态)或凝聚物的功能性质(例如转录的调节)，将该试剂施用于对象，例如充当疾病模型的非人类动物，或需要疾病治疗的对象。
在一些实施方式中，进行高通量筛选(HTS)。高通量筛选可以利用无细胞或基于细胞的测定(例如，含有细胞的凝聚物、合成凝聚物、分离的细胞组合物)。高通量筛选通常涉及高效地测试大量测试剂，例如并行测试。例如，可以在短时间内(例如几小时到几天)常规筛选数十或数百或数千种化合物。通常，所述筛选在含有至少96个孔的多孔板或其他容器中进行，其中基底中存在多个物理分离的空腔或凹陷。高通量筛选通常涉及自动化的使用，例如用于液体处理、成像、数据采集和处理等。可以应用于本发明的HTS的实施例中的某些一般原理和技术记载于Macarron R和Hertzberg RP.“高通量筛选试验的设计和实施(Design and implementation of high-throughput screening assays)”.Methods MolBiol.,565:1-32,2009和/或An WF和Tolliday NJ.,“简介：基于细胞的高通量筛选分析(Introduction:cell-based assays for high-throughput screening)”.Methods MolBiol.486:1-12,2009,和/或其中任何一个的参考文献中。
在一些实施方案中，可以产生通过本文公开的方法鉴定的试剂的类似物，所述类似物调节凝凝聚物的一种或多种物理性质或形成(例如形成、稳定性、功能或形态)或凝聚物的功能性质(例如转录的调节)。第一试剂的“类似物”是指结构上和/或功能上与第一试剂相似的第二试剂。试剂类似物可以具有与该试剂基本相似的物理、化学、生物和/或药理学(多种)性质，或者可以在至少一种物理、化学、生物或药理学性质上不同。在一些实施方案中，至少一种所述的性质不同，这样的不同使得类似物更适于感兴趣的目的(例如，用于调节凝聚物)。产生类似物的方法是本领域已知的并且包括本文所述的方法。在一些实施方案中，可以测试所产生的类似物的感兴趣的性质，例如增加稳定性(例如，在水性介质中、在人血液中、在胃肠道中等)，增加生物利用度，对象施用后半衰期延长，细胞摄取增加，调节凝聚物性质的活性增加，包括凝聚物的物理性质或形成(例如形成、稳定性、功能或形态)或凝聚物的功能性质(例如转录的调节)，凝聚物的特异性增加。
实施例
尽管已经参考具体实施方式(其中一些是优选实施方式)具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应当理解，可在不背离所附权利要求所限定的本发明的构思和范围的情况下在形式和细节上进行各种改变。
实施例1
化合物2、化合物6、化合物60、化合物61、化合物62、化合物AA的合成
中间体A1：3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-羟基苯基)丙-2-基)苯甲腈的合成
步骤1：0℃下向A1-1(80g,429mmol)的二氯甲烷(1000mL)溶液中加入NIS(116g,515mmol)。然后将溶液在室温下搅拌16小时。将溶液倒入水中并用二氯甲烷(1000ml*2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，Na2SO4干燥，并蒸发至干燥。残留物用CH3CN重结晶，得到白色固体产物。A1-2(117g，收率87.3％)LC-MS[M-1]-＝310.7
步骤2：向A1-2(100g，320mmol)、A1-3(91g，640mmol)和DMF(1200mL)的溶液中添加Cs2CO3(208g，640mmol)。将混合物在70℃搅拌16小时。将混合物倒入水中并用乙酸乙酯(1000ml*3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，Na2SO4干燥，过滤并蒸发至干燥。残留物经硅胶柱(PE/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得A1-4(103.4g,86.1％)，为无色油状物。LC-MS[M+1]+＝374.7
步骤3：向A1-4(53g，141.3mmol)的NMP(600mL)溶液中添加CuCN(19g，200mmol)。将混合物在N2气氛下在160℃搅拌3小时。用氨水(2000mL，23％)淬灭混合物，然后用乙酸乙酯(1000mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱(PE/乙酸乙酯＝10/1)纯化，得到白色固体A1-5(21g,54.3％)。
LC-MS[M+1]+＝274.0
步骤4：向A1-5(21g，76.6mmol)的THF(100mL)溶液中加入MeMgBr溶液(613mL，1M溶液)。将混合物在N2气氛下室温搅拌2小时。将混合物倒入饱和氯化铵溶液中，然后用乙酸乙酯萃取(300mL*3)。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱(PE/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到白色固体A1-6(17g,80.9％)，为黄色油状物。LC-MS[M+17]+＝290.9
步骤5：在-78℃N2气氛下向A1-6(19.2g，310mmol)和A1-7(19.2g，310mmol)的DCM(200mL)溶液中加入BF3.Et2O溶液(34mL，47％)。该混合物在室温下搅拌2小时。将混合物倒入水(200mL)中，然后用乙基二氯甲烷(100mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱(PE/乙酸乙酯＝5/1)纯化，得到白色固体A1-6(18g,83％)，为黄色油状物。
1H NMR:(400MHz,氯仿-d)δ7.44(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(dd,J＝4.9,2.4Hz,1H),7.06-7.02(m,2H),6.80-6.76(m,2H),4.41(t,J＝6.2Hz,2H),3.87(t,J＝6.2Hz,2H),1.63(s,6H)。
LC-MS[M-1]-＝347.9
中间体A2：3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-乙炔基苯基)丙-2-基)苯甲腈的合成
步骤1：向A1(5.8g，16mmol)、Et3N(4.87g,48mmol)的DCM(100mL)溶液中添加Tf2O(6.78g，24mmol)。将混合物在N2气氛下在25℃搅拌2小时。用水(100mL)猝灭混合物，然后用DCM(200mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱(PE/乙酸乙酯＝30/1)纯化，得到白色固体A2-1(6g,78％)，为橙色油状物。
步骤2：A2-1(6g，12.5mmol)、乙炔基三甲基硅烷(12g，122.2mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(1.6g，2.3mmol)、Et3N(23.31g，230.4mmol)的CH3CN溶液(100mL)中添加CuI(1.3g，6.8mmol)。将混合物在N2气氛下在80℃搅拌16小时。用水(100mL)猝灭混合物，然后用DCM(300mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱纯化，得到A2-2(4.2g，69％)，为橙色油状物。
步骤3：向A2-2(4.2g，9.79mmol)的MeOH(65mL)溶液中添加KF(4.2g，72.3mmol)。混合物在N2气氛下在室温搅拌12小时。用水(50mL)猝灭混合物，然后用DCM(300mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱纯化，得到A2(2.8g，80％)，为橙色油状物。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.48-7.42(m,2H),7.41(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(d,J＝2.4Hz,1H),7.16-7.11(m,2H),4.42(t,J＝6.2Hz,2H),3.88(t,J＝6.2Hz,2H),3.07(s,1H),1.65(s,6H)。
化合物A3：3-氯-5-(2-(4-乙炔基苯基)丙-2-基)-2-甲氧基苯甲腈的合成
按照与化合物A1相同的方法，用碘甲烷代替A1-3，经过4步制备得到化合物A3-4。
LC-MS[M+18]+＝319.1
按照与化合物A2相同的步骤，用A3-4代替A1，分3步制备3-氯-5-(2-(4-乙炔基苯基)丙-2-基)-2-甲氧基苯甲腈(化合物A3)。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.43(d,J＝7.0Hz,2H),7.37(d,J＝2.2Hz,1H),7.31(d,J＝2.2Hz,1H),7.15-7.11(m,2H),4.04(s,3H),3.06(s,1H),1.64(s,6H)。
LC-MS[M+1]+＝310.1
中间体B1：1-亚氨基四氢-1H-1l6-噻吩1-氧化物的合成
步骤1：向四氢噻吩(0.2mL，2.27mmol)、NH2COONH4(177.1mg，2.27mmol)在MeOH(5mL)中的溶液中添加PhI(OAc)2(1826.6mg，5.67mmol)。该混合物在室温下搅拌1小时。用水(10mL)猝灭混合物，然后用DCM(50mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱纯化，得到B1(0.2g，74％)，为黄色油状物。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.22-3.12(m,4H),2.36-2.22(m 4H)
中间体B2的合成：
1-亚氨基-1l6-硫代吗啉-4-羧酸叔丁酯1-氧化物
步骤1：向硫代吗啉(0.18mL,1.94mmol)、Et3N(0.81mL,5.82mmol)的DCM(10mL)溶液中加入Boc2O(634.5mg,2.91mmol)该混合物在室温下搅拌12小时。用水(10mL)猝灭混合物，然后用DCM(50mL*3)萃取。合并有机层，用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并蒸干。将残留物用硅胶柱纯化，得到B1(0.37g，94％)，为黄色油状物。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ3.80-3.60(m,4H),2.72-2.49(m 4H),1.49(s,9H)。
步骤2：按照中间体B1的方法，从B2-1开始，得到B2。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ5.18(s,1H),4.09-3.92(m,2H),3.91-3.78(m,2H),3.15-2.98(m,4H),1.49(s,9H)。
根据专利(WO2020081999,A109)合成化合物AA
N-(4-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯氧基)甲基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺
步骤1：向化合物A1(1.5g，4.28mmol)和化合物1-1(698mg，4.28mmol，1.0eq)在MeCN(40mL)中的混合物中添加Cs2CO3(2.79g，8.57mmol，2.0eq)。然后在40℃搅拌该混合物2小时(h)。过滤混合物并将滤液减压浓缩。残留物经硅胶纯化(己烷/EtOAc＝4/1)，得到产物AA-1(0.8g，产率：39％)。
步骤2：向密封管中的化合物AA-1(800mg，1.68mmol)、甲磺酰胺(1.6g，16.8mmol)和Cs2CO3(1.64g，5.04mmol)在二恶烷(15mL)中的混合物中添加t-Buxphos Pd G3(14.5mg,0.025mmol)。然后将所得混合物在N2气氛下在微波中于100℃搅拌55分钟。冷却至室温后，过滤混合物并浓缩滤液。将残留物用EtOAc(100mL)和水(100mL)稀释。有机层经Na2SO4干燥，然后减压浓缩。将残留物通过二氧化硅纯化(己烷/EtOAc＝1/1)，得到粗产物(600mg)。通过预HPLC纯化粗产物，得到所需产物N-(4-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯氧基)甲基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺(化合物AA，253mg，产率：28.2％)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.62(d,J＝5.1Hz,1H),7.44(d,J＝2.3Hz,1H),7.31(d,J＝2.4Hz,1H),7.28(d,J＝4.9Hz,1H),7.12(d,J＝8.6Hz,2H),6.90(d,J＝8.6Hz,2H),5.10(s,2H),4.42(t,J＝6.2Hz,2H),3.87(t,J＝6.2Hz,2H),3.47(s,3H),1.64(s,6H)。
LCMS[M+1]+＝535.1
化合物2：
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈
向化合物1-2(60mg，0.088mmol)、化合物B1(21.0mg，0.176mmol)、Pd(OAc)2(1.98mg，0.009mmol)和Ruphos(8.22mg，0.018mmol)在甲苯(1mL)中的混合物中添加Cs2CO3(43.05mg，0.132mmol)。然后在100℃搅拌该混合物12小时(h)。冷却至室温后，过滤混合物并浓缩滤液。然后将残余物用EtOAc(50mL)和水(30mL)稀释。然后用盐水(20mL)洗涤EtOAc层并经Na2SO4干燥。通过预HPLC纯化残留物，得到产物3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈(化合物2，5mg，产率：10.14％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.51-8.40(m,1H),7.70-7.54(m,2H),7.23-7.13(m,2H),7.00-6.97(m,3H),5.03(s,2H),4.49-4.36(m,2H),3.99-3.91(m,2H),2.29-1.98(m,4H),1.71-1.57(m,4H),1.24(s,6H).
LCMS[M+H]+＝559.1
化合物6：
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈
步骤1：向化合物1-2(50mg，0.105mmol)、化合物B2(24.60mg，0.105mmol)Ruphos(9.79mg，0.021mmol)和Cs2CO3(51.25mg，0.157mmol)在甲苯(1mL)中的混合物中添加Pd(OAc)2(2.36mg，0.01mmol)。然后在100℃N2气氛下搅拌该混合物12小时(h)。冷却至室温后，将混合物用水(20mL)稀释，然后用EtOAc(30mL*2)萃取。用盐水(30mL)洗涤EtOAc层并经Na2SO4干燥。残留物经硅胶纯化(DCM/MeOH＝25/1)，得到产物3-1(40mg，产率：56.47％)。
LCMS[M+H-Boc]+＝574.1
步骤2：将化合物3-1(40mg，0.06mmol)在DCM(1mL)和HCl/二恶烷(1mL，4M)中的混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物浓缩并通过预HPLC纯化残留物，得到产物3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈(化合物3，30mg，产率：82.81％)。
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.45(d,J＝5.2Hz,1H),7.50(dd,J＝18.0,2.4Hz,2H),7.19(d,J＝8.8Hz,2H),7.10(s,1H),6.95(d,J＝8.8Hz,2H),5.08(s,2H),4.46-4.36(m,2H),3.90(t,J＝5.6Hz,2H),3.87-3.76(m,2H),3.54-3.37(m,4H),3.36-3.32(m,2H),1.67(s,6H).
LCMS[M+H]+＝574.1
化合物60：
N-(5-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯基)乙炔基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺
向化合物A2(2.3g，5.3mmol)、化合物4-1(1.3g，5.3mmol)和DIEA(13.7g，106mmol)在THF(13mL)中的混合物中添加Pd(PPh3)4(613mg，6.4mmol)和CuI(101mg，0.53mmol)。然后在80℃N2气氛下搅拌该混合物16小时。冷却至室温后，将混合物用水(50mL)稀释，然后用EtOAc(50mL*3)萃取。用盐水(50mL)洗涤EtOAc并经Na2SO4干燥。将有机层减压浓缩。将残留物通过二氧化硅纯化(己烷/EtOAc＝1/1)，得到粗产物。通过预HPLC再次纯化粗产物，得到产物N-(5-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯基)乙炔基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺(化合物4，253mg，产率：7.4％)，为白色固体。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.74(s,2H),7.50(d,J＝7.7Hz,2H),7.43(s,1H),7.34(d,J＝2.3Hz,1H),7.20(d,J＝8.2Hz,2H),4.44(t,J＝6.3Hz,2H),3.88(t,J＝6.2Hz,2H),3.49(s,3H),1.68(s,6H)。
LC-MS[M+1]+＝529.1
化合物61：化合物61的合成
3-氯-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-5-基)乙炔基)苯基)丙-2-基)-2-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲腈
步骤1：向化合物A3(1.5g，4.84mmol)和化合物61-1(1.03g，5.33mmol)在THF(10mL)中的混合物中添加CuI(276mg，1.45mmol)、DIEA(3.12g，24.2mmol)和Pd(PPh3)4(839mg，0.726mmol)。然后将混合物在N2气氛下在微波炉中于80℃搅拌2小时。冷却至室温后，将混合物浓缩，残留物用水(50mL)稀释，然后用EtOAc(50mL*3)萃取。用盐水(50mL)洗涤EtOAc并经Na2SO4干燥。将有机层减压浓缩。残留物经硅胶纯化(己烷/EtOAc＝3/1)，得到产物61-2(1.1g，产率：53.8％)，为黄色固体。
步骤2：向化合物61-2(0.5g，1.18mmol)、化合物B1(141mg，1.18mmol)和t-BuxphosPd G3(93.8mg，0.12mmol)在二恶烷(7mL)中的混合物中添加Cs2CO3(964mg，2.96mmol)。然后在100℃N2气氛下在微波炉中搅拌该混合物1小时。冷却至室温后，过滤混合物并浓缩滤液。然后将残余物用EtOAc(50mL)和水(30mL)稀释。然后用盐水(20mL)洗涤EtOAc层并经Na2SO4干燥。浓缩EtOAc，残余物经硅胶纯化(己烷/EtOAc＝1/5)，得到产物61-3(470mg，收率：82.5％)，为黄色固体。
LC-MS[M+1]+＝505.1
步骤3：向61-3(230mg，0.39mmol)在DCM(4mL)中的混合物中滴加BBr3(198mg，0.79mmol)。然后将混合物在室温下搅拌16小时。然后将混合物通过饱和NH4Cl(10mL)淬灭并用DCM(10mL*2)萃取。将DCM层用盐水(30mL)洗涤并用Na2SO4干燥。然后浓缩DCM，得到黄色油状的粗产物5-4(200mg，收率：89％)。
LC-MS[M+1]+＝491.1
Step 4:向化合物61-4(180mg，0.38mmol)和Cs2CO3(315mg，0.97mmol)在DMF(4mL)中的混合物中添加化合物5-5(132mg，0.97mmol)。混合物在70℃搅拌16小时。冷却至室温后，然后用EtOAc(50mL)和水(30mL)稀释残余物。然后用盐水(30mL*2)洗涤EtOAc层并经Na2SO4干燥。浓缩EtOAc，并通过二氧化硅(己烷/EtOAc＝1/5)纯化残留物，得到产物3-氯-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-5-基)乙炔基)苯基)丙-2-基)-2-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲腈(化合物61，70mg，产率：33％)，其为白色固体。
1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.59(s,2H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H),7.40(d,J＝2.4Hz,1H),7.33(d,J＝2.4Hz,1H),7.16(d,J＝8.6Hz,2H),4.40-4.36(m,3.5Hz,1H),4.19-4.14(m,1H),3.71-3.64(m,2H),3.46-3.37(m,3H),2.92-2.86(m,1H),2.76-2.71(m,1H),2.42-2.21(m,4H),1.65(s,6H)。
LC-MS[M+1]+＝547.2
化合物62：化合物62的合成
3-氯-2-(2-羟基乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈
步骤1：将化合物6-1(100mg，0.148mmol)、甲酸钠(25.20mg，0.371mmol)和四丁基碘化铵(5.47mg，0.015mmol)的DMSO(1mL)溶液在110℃搅拌2小时。将反应冷却至25℃并添加NaOH(11.86mg，0.296mmol)。然后将混合物在25℃搅拌12小时。将混合物用水(10mL)和DCM(5mL*3)萃取。将有机层用盐水(10mL)洗涤，干燥并过滤。减压浓缩滤液。通过二氧化硅(0-5％MeOH/DCM)纯化残余物，得到呈白色固体的化合物62-1(50mg，0.076mmol，51.41％)。
LCMS[M+H]+＝656.2
步骤2：步骤2：将化合物62-1(50mg，0.08mmol)在DCM(1mL)和HCl/二恶烷(1mL，4M)中的混合物在室温下搅拌12小时。然后将混合物浓缩并通过预HPLC纯化残留物，得到化合物62(15mg，产率：35.4％)。
1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ8.43(d,J＝5.2Hz,1H),7.48(dd,J＝17.6,2.4Hz,2H),7.19-7.15(m,2H),7.07(d,J＝5.2Hz,1H),7.01-6.91(m,2H),5.07(s,2H),4.24(t,J＝4.8Hz,2H),3.91(t,J＝4.8Hz,2H),3.84-3.71(m,2H),3.52-3.32(m,4H),3.21(ddd,J＝14.0,8.8,2.8Hz,2H),1.65(s,6H).LCMS[M+H]+＝556.1
实施例2：雄激素受体(AR)核分布的活细胞成像
雄激素受体(AR)属于类固醇激素受体家族，可以被相应的配体(如二氢睾酮，DHT)特异性激活。为了研究活性AR的亚核分布，我们在前列腺癌细胞LNCaP中稳定表达增强型绿色荧光蛋白(mEGFP)标记的AR。活细胞成像(参见图1A-1C)显示，未配体的AR(图1A，-DHT，左图)主要存在于细胞质中，而在DHT结合后(图1A，+DHT，右图)，AR易位到细胞核中并表现出不均匀的分布。为了进一步探究与去势抵抗性前列腺癌(CRPC)相关的组成型活性AR剪接变体的分布，我们对转染AR-V7(图1B)和带有mEGFP标记的AR-V567es(图1C)的LNCaP细胞进行了活细胞成像。这两种活性剪接变体均表现出离散的核分布。这些共同表明转录活跃的AR可以形成离散的核斑点。
具体方法及结果如下：
活细胞成像方法
细胞在24孔玻璃底板(Cellvis，P24-1.5H-N)上生长，并使用Leica TCS SP8共聚焦显微镜系统用100倍油物镜(NA＝1.4)拍摄图像。细胞在加热台(37℃)上成像，并补充温热的(37℃)湿空气。显微镜被封闭在加热至37℃的培养室中。
使用不含类固醇激素和不含酚红的RPMI培养基，用AR-mEGFP表达载体转染LNCaP细胞48小时，然后添加1nM DHT。对于用配体独立剪接变体AR V7和AR V567es转染的LNCaP细胞，用正常RPMI培养基培养细胞，不需要DHT刺激。
对于化合物处理测定，在化合物处理之前，使用不含类固醇激素和不含酚红的RPMI培养基，用AR(AR或AR F877L/T878A)-mEGFP的表达载体转染LNCaP细胞24小时。10μM化合物处理3小时后，向LNCaP细胞中添加1nM DHT。对于表达LNCaP细胞的配体独立的AR V7-mEGFP，跳过饥饿步骤并在转染后12小时添加化合物。DMSO的最终浓度为0.1％。添加DHT/化合物后每30分钟对细胞进行一次显微镜观察。
对从每组100多个代表性视野收集的图像进行数据分析。根据通过绿色(AR-mEGFP)通道的斑点面积和强度进行斑点定量。使用LAS X(徕卡)和Fiji处理荧光图像并将其组装成图形。使用GraphPad Prism绘制和分析化合物处理结果。
实施例3：核AR斑点光漂白(FRAP)后的荧光恢复
液-液相分离(liquid-liquid phase separation)已成为生物过程的基本机制，并且越来越多的证据证实基因调控发生在转录凝聚物中。后续我们评估了活性AR核斑点是否表现出类液体特性。光漂白后荧光恢复(FRAP)实验表明，漂白后，DHT刺激的AR-mEGFP的荧光在几秒钟内恢复。该结果表明，激活的AR(雄激素受体)形成了具有类液体特性的核斑点(即凝聚物)。
使用LeicaSP8共焦显微镜系统的FRAP模块进行FRAP测定。AR-mEGFP分别使用488nm激光束漂白。使用100％激光功率将漂白聚焦于圆形感兴趣区域(ROI)，并收集延时图像。活细胞成像方法与实施例2中所述相同。
实施例4：AR凝聚物的免疫荧光
为了研究AR核凝聚物是否是活性转录区域，我们通过免疫荧光分析了AR斑点和几个活性转录标记物的共置情况。AR斑点富含超级增强子标记物MED1、活性转录的染色质标记物H3K27ac以及在C端结构域Ser5处磷酸化的活性RNA聚合酶II。这些数据支持AR形成LLPS凝聚物，这是活性转录位点(图3)。
DHT刺激后，用4％ PFA在室温下固定表达AR-mScarlet的H1299细胞15分钟。随后用PBS(3×3分钟)洗涤细胞，并在室温下用PBS/BSA(3％)/Triton X-100(0.3％)封闭60分钟。将细胞在PBS中漂洗，并与抗MED1(ab64965，abcam)抗H3K27ac(ab4729，Abcam)、抗RNAPol II-S5P抗体(#04-1572，Millipore)在PBS/BSA(1％)中4℃孵育过夜。用PBS(1xPBS+Tween20 0.2％，3×5分钟)洗涤细胞，并与二抗在室温下孵育1小时。用PBST(3×5min)洗涤后，用DAPI对细胞进行染色。图像是使用Leica TCS SP8共焦显微镜系统使用100倍油物镜(NA＝1.4)拍摄的，并使用FIJI进行进一步后处理。
如图3所示，在H1299细胞中观察到超级增强子标记物MED1(绿色)、活性转录的染色质标记物H3K27ac(绿色)和活性RNA聚合酶II，该RNA聚合酶II在其CTD(绿色)的Ser5处被AR-mScarlet(红色)斑点磷酸化。
实施例5：雄激素受体N端结构域(AR-NTD)负责AR液-液相分离(LLPS)
全长AR由内在无序的NTD、折叠的DNA结合结构域(DBD)、无序的铰链区和折叠的配体结合结构域(LBD)组成。生物信息学分析预测AR-NTD是非结构化的，并且包含大的内在无序区域(IDR)(图4A)。我们研究了AR-NTD对于AR相分离是否是必要的。活细胞成像显示，NTD的缺失消除了AR的LLPS能力(图4B)。为了进一步探讨AR-NTD是否参与驱动LLPS，我们使用先前报道的optoIDR测定来测试IDR依赖性、光活化斑点形成。AR的N端结构域与用mCherry标记的可光激活、自缔合的Cry2蛋白融合。
OptoIDR测定如下进行。
AR NTD、DBD和LBD被克隆到含有mCherry-Cry2融合蛋白和SV40 NLS的慢病毒骨架中。在转导前一天将LNCaP细胞铺板，并根据制造商的说明使用jetOPTIMUS(Polyplus，117-15)转导质粒。图像是使用Leica TCS SP8共焦显微镜系统使用100倍油物镜(NA＝1.4)拍摄的，并使用FIJI进行进一步后处理。细胞在加热台(37℃)上成像，并补充温热的(37℃)湿空气。用488nm光脉冲诱导斑点形成，用561nm光刺激mCherry荧光。活细胞成像方法与实施例2中所述相同。
图4C显示LNCaP细胞中不同时间点的蓝光诱导的AR(NTD)、AR(DBD)和AR(LBD)-CRY2-SV40 NLS聚类的代表性图像。用488nm激光刺激细胞。
延时成像显示，AR-NTD与Cry2-mCherry的融合促进了蓝光刺激下球形液滴的快速形成，同时DBD和LBD则呈现弥散分布。这些均表明内在无序的AR-NTD是驱动AR相分离的原因。
实施例6：调节AR凝聚物的化合物的表征
已知恩杂鲁胺是一种AR拮抗剂，可抑制雄激素与AR的结合。
鉴于AR点是活性转录位点，而AR是前列腺癌的驱动癌基因，我们探讨了损害AR凝聚物的化合物可能抑制AR转录活性和前列腺癌生长的可能性。
将表达AR(AR或AR F877L/T878A或V7)-mEGFP的LNCaP细胞在不含类固醇激素和不含酚红的RPMI培养基中培养24小时，然后用或不用10μM测试化合物(例如恩杂鲁胺)处理。10μM化合物处理3小时后，向LNCaP细胞中添加1nM DHT。对于表达LNCaP细胞的配体独立的AR V7-mEGFP，跳过饥饿步骤并在转染后12小时添加化合物。活细胞成像方法与实施例2中所述相同。
图5A显示活细胞成像，其显示用或不用10μM恩杂鲁胺处理的表达AR(AR或ARF877L/T878A或V7)-mEGFP的LNCaP细胞。显微图像显示，恩杂鲁胺确实消除了AR的斑点形成，而对其耐药突变体F877L/T877A没有影响。AR V7是一种缺乏LBD的组成型活性变体，据报道是恩杂鲁胺的主要耐药机制。如图5A所示，恩杂鲁胺几乎不会损害AR V7的斑点形成。这一结果表明AR活性与AR相分离能力密切相关。
我们测试了本公开中合成的几种化合物。在这些化合物中，我们发现化合物60可以抑制AR和恩杂鲁胺耐药突变体(例如F877L/T877A突变体和AR V7突变体)的相分离(图5B)。
图5B显示了活细胞成像，其显示用或不用10μM化合物60处理的表达AR(AR或ARF877L/T878A或V7)-mEGFP的LNCaP细胞。活细胞成像方法与实施例2中所述相同。如图5B所示，化合物60不仅消除了AR的斑点形成，还消除了其抗性突变体如F877L/T877A突变体和ARV7突变体的斑点形成。该结果表明抑制LLPS形成可以克服AR突变的抗性。
实施例7：AF-1NMR结合测定中一种或多种化合物的表征
使用STD饱和转移扩散核磁共振(STD NMR)分析技术以及纯化的AF-1重组蛋白进行示例性化合物与人AR-NTD的结合。
方法：
使用STD饱和转移扩散核磁共振(STD NMR)分析技术以及纯化的Tau-5AF-1重组蛋白进行示例性化合物与人AR-NTD的结合。所有NMR波谱实验均在Bruker Avance III600MHz波谱仪上进行。NMR样品含有25μM AF-1和250μM化合物，并用PBS(pH 7.4，60％ D2O)缓冲液稀释至500μL。对于STD实验，使用标准Bruker stdd iffgp19.3脉冲序列，饱和时间为2秒，谱宽为16ppm，扫描128次。共振频率设置为-0.4ppm，而失共振频率设置为33ppm。在不存在蛋白质或化合物的情况下进行适当的空白实验以测试化合物质子的直接饱和的缺乏。
在STD NMR中，结合会产生具有与化合物相对应的峰的差异光谱，而如果没有发生结合，则差异光谱不会显示任何峰。如图8所示，在10摩尔当量化合物62存在下，在AF-1蛋白的STD差异谱中观察到的清晰信号证实了AF-1与该化合物之间的结合。
实施例8：化合物61和蛋白质加合物的质谱分析
将50μg重组AR截短蛋白(AF-1)与20μM化合物61在Tris-NaCl缓冲液中在室温下持续孵育2个小时。将样品与过滤器中的消化缓冲液混合，并与3μL胰蛋白酶混合，在70℃下消化1.5小时。100μL蛋白加入2μL 1M DTT，37℃还原30分钟，并用5.5μL 1M碘乙酰胺在黑暗中室温烷基化30分钟。然后用0.5％甲酸终止消化。通过22μm过滤器进行注射器过滤后，将澄清溶液进行LC-MS/MS分离。每个样品均通过Thermo C18 PepMap100预柱(300μm x 5mm)上样进行脱盐，并在Thermo Acclaim PepMap RSLC分析柱(75μm x 15cm)上洗脱。使用流动相A(0.1％甲酸的水溶液)和流动相B(0.1％甲酸的乙腈溶液)建立梯度洗脱过程。流速为0.3μL/min。原始质谱由Waters UNIFI处理。发现化合物的结合位点位于AR蛋白的NTD内。
通过Intact Mass检测AF-1蛋白和化合物61加合物，并通过肽图谱鉴定出3个结合位点(表1)。
表1化合物61在AF-1蛋白上的鉴定结合位点
实施例9通过下拉实验表征一种或多种生物素化化合物对Tau-5结合的影响
为了确认示例性化合物是否与AR蛋白的Tau-5区域结合，用以EGFP标记的纯化的AR Tau-5重组蛋白进行无细胞结合测定。
方法
将重组AR Tau-5与含炔的测试化合物在4℃下混合过夜。然后，在含有0.1％SDS、5％叔丁醇、100μM三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺、1mM三-(2-羧乙基)膦(TCEP)、100μM生物素叠氮化物试剂和1mM硫酸铜的缓冲溶液中，通过点击化学反应在25℃下用生物素标记化合物3小时。将样品在50mM HEPES(pH 8.0)、150mM NaCl、0.1％ SDS和1％ Triton-X100中透析过夜，以去除过量的生物素叠氮化物试剂。使用链霉亲和素-琼脂糖树脂富集与Tau-5-GFP蛋白结合的生物素化化合物。在SDS-PAGE上解析生物素-化合物-蛋白质复合物，并使用抗GFP抗体进行蛋白质印迹分析。
实施例10在ARE-荧光素酶报告基因测定中表征一组化合物
进行ARE-荧光素酶报告基因测定以评价示例性化合物是否可以调节前列腺癌细胞中AR或AR变体的转录活性。
方法
ARE-荧光素酶报告质粒含有功能性ARE(雄激素反应元件)，AR与雄激素反应结合以诱导荧光素酶活性。LNCaP(Cobioer)细胞在处理24小时之前，在经过木炭剥离的FBS/不含酚红的RPMI培养基中用ARE-荧光素酶报告基因瞬时转染。然后在添加DHT(1nM)之前一小时添加DMSO或具有系列稀释浓度的测试化合物。与DHT孵育24小时后，裂解细胞，使用ONE-GloTM荧光素酶测定系统(Promega)测定荧光素酶活性，并根据制造商的说明使用EnVision多模式读板仪进行测量。将值标准化为由CellTiter-发光细胞活力测定试剂盒(Promega)测定的细胞活力。为了确定IC50，将处理标准化为DHT诱导的载剂对照活性，将未经DHT处理的载剂对照的平均值设定为100％抑制。使用GraphPad Prism绘图软件计算IC50值。
为了评估AR-V7的转录活性，在激素饥饿条件下将HEK293T(Cobioer)细胞与AR-V7表达载体和ARE荧光素酶报告基因瞬时共转染。对于表达内源性AR-V7的22Rv1(Cobioer)前列腺癌细胞系，在激素饥饿条件下瞬时转染ARE-荧光素酶报告基因。转染24小时后，加入DMSO或系列稀释浓度的测试化合物，再孵育24小时。如上所述，检测报告分子活性并通过细胞活力进行标准化。将处理标准化为DMSO对照活性，并通过GraphPad Prism绘图软件进一步确定IC50值。
结果如下所示，表明代表性化合物可以主动抑制野生型-AR或AR-V7变体的转录活性。特别是在两种表达AR-V7的细胞中，代表性化合物在抑制AR-V7转录活性方面表现出令人惊讶的好得多的活性。
表2.ARE-荧光素酶报告基因测定中测试化合物的抑制IC50总结
实施例11AR/AR-V7靶基因qPCR测定中一组化合物的表征
为了评估示例性化合物对AR或AR-V7下游靶基因的mRNA表达的影响，在表达AR和AR-V7两者的前列腺癌细胞系22Rv1中进行实时定量PCR测量。
方法
将22Rv1细胞在经木炭剥离的FBS/不含酚红的RPMI培养基中培养24小时，然后在RT-qPCR之前用DMSO或测试化合物再处理48小时。简而言之，使用Rneasy迷你试剂盒(RNeasy Mini Kit(Qiagen))按照制造商的方案从细胞中分离RNA。逆转录RNA并使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(应用生物系统公司(Applied Biosystems))进行qPCR。通过比较目标基因的Ct和管家基因GAPDH的平均Ct，使用ΔΔCt方法计算目标基因的相对数量。
结果表明测试化合物可以抑制AR或AR-V7靶基因的mRNA表达(图6A、6B、6C)。
实施例12在前列腺癌细胞系增殖测定中一组化合物的表征
为了评价示例性化合物对AR/AR-V7依赖性前列腺癌细胞增殖的作用，分别在LNCaP(AR阳性)、22Rv1(AR阳性；AR-V7阳性)、VCaP(AR阳性；AR-V7阳性)和DU145(AR阴性)细胞中进行细胞活力测定。
方法
将LNCaP细胞接种在96孔板中经木炭剥离的FBS/不含酚红的RPMI培养基中24小时，然后用测试化合物预处理1小时，然后添加0.2nM DHT培养4天。将22Rv1或VCaP细胞在木炭剥离的FBS/不含酚红的RPMI培养基中培养24小时，然后添加测试化合物4天。将DU145细胞接种在完全培养基中24小时，然后添加测试化合物培养4天。使用CellTiter-发光细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega))测量细胞增殖。在LNCaP细胞中，通过测量用或不用0.2nM DHT处理的载体对照(DMSO)细胞之间的差异来计算DHT依赖性细胞生长。IC50值通过GraphPad Prism绘图软件使用四参数拟合来确定。
结果表明，测试化合物可以抑制AR/AR-V7依赖性前列腺癌细胞增殖。
表3.细胞增殖测定中测试化合物的IC50
实施例13：AR相分离抑制IC50测试。
核斑点成像用于化合物IC50测定
LNCaP细胞在10cm培养皿中培养。用AR(AR或AR F877L/T878A)-mEGFP表达质粒(pMSCV载体，每10cm培养皿12μg质粒)转染细胞。转染12小时后，将培养基更换为不含类固醇激素和不含酚红的RPMI1640(饥饿培养基)，并继续饥饿24小时。将细胞(80μl，每孔20,000个)接种到96孔玻璃底板(Cellvis，P96-1.5H-N)中并再培养24小时。然后将细胞与10倍连续稀释的化合物(10μl)一起孵育3小时，然后进行20nM DHT刺激(10μl)。添加DHT 3小时后，用等体积预热的8％PFA固定细胞30分钟，随后更换为100μl PBS。使用配备60倍水浸透镜(每孔40个视野)的Operetta CLS(Perkin Elmer)采集核斑点图像。使用Operetta内置分析模块对图像进行分析。使用查找核模块(M型)从照明校正图像中找到核，并滤除低强度核。随后，首先使用查找点模块(A型)识别出点，并使用PhenoLOGIC机器学习插件将其分为高置信度点和低置信度点。为了更好地表示，仅保留高置信度的点。导出分析的图像斑点数据并使用R/Bioconductor进行统计处理。通过R/drc包(四参数对数逻辑函数)计算具体IC50值。
化合物编号 AR相分离抑制IC50 化合物编号 AR相分离抑制IC50
化合物AA >20uM 化合物60 2.5uM
化合物6 3.6uM
实施例14：CRPC体内模型中一种或多种化合物的表征
在携带LNCaP、22Rv1或VCaP肿瘤的雄性小鼠中测量肿瘤生长。当肿瘤达到～200mm3时进行去势，当肿瘤重新生长到200mm3时开始给药。每周两次监测肿瘤体积和体重。
序列表
<110> 上海奕拓医药科技有限责任公司
<120> 调节雄激素受体凝聚物的方法
<130> 076084-8004CN01
<150> PCT/CN2021/076556
<151> 2021-02-10
<160> 1
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 920
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser
1 5 10 15
Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu
20 25 30
Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
65 70 75 80
Glu Thr Ser Pro Arg Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly Glu Asp Gly Ser
85 90 95
Pro Gln Ala His Arg Arg Gly Pro Thr Gly Tyr Leu Val Leu Asp Glu
100 105 110
Glu Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu
115 120 125
Arg Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly
130 135 140
Leu Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala
145 150 155 160
Pro Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser
165 170 175
Cys Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln
180 185 190
Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser
195 200 205
Gly Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn
210 215 220
Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys
225 230 235 240
Lys Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His
245 250 255
Leu Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu
260 265 270
Leu Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala
275 280 285
Glu Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu
290 295 300
Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu
305 310 315 320
Glu Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser
325 330 335
Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala
340 345 350
Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro
355 360 365
Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His
370 375 380
Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly
405 410 415
Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser
420 425 430
Ser Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly
435 440 445
Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp
485 490 495
Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val
500 505 510
Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met
515 520 525
Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg
530 535 540
Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys
545 550 555 560
Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr
565 570 575
Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln
580 585 590
Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg
595 600 605
Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly
610 615 620
Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu
625 630 635 640
Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr
645 650 655
Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro
660 665 670
Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala
675 680 685
Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser
690 695 700
Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala
705 710 715 720
Lys Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala
725 730 735
Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp
740 745 750
Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp
755 760 765
Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln
770 775 780
Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile
785 790 795 800
Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile
805 810 815
Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg
820 825 830
Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys
835 840 845
Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu
850 855 860
Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp
865 870 875 880
Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met
885 890 895
Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val
900 905 910
Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln
915 920

Claims (82)

1.一种治疗对象雄激素受体(AR)相关疾病或病症的方法，包括向所述对象施用治疗有效量的AR凝聚物调节剂，其中，所述AR凝聚物调节剂调节至少包含AR的AR凝聚物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述AR是野生型AR或AR变体。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述AR变体对至少一种雄激素剥夺治疗具有抗性。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述AR变体包括一种或多种突变，任选地，所述突变在配体结合结构域(LBD)中。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种突变位于选自下述的残基：L702、V716、V731、W742、H875、F877、T878、D880、L882、S889、D891、E894、M896、E898和T919，其中，所述编号相对于SEQ ID NO:1。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述一种或多种突变选自：L702H、V716M、V731M、W742L/C、H875Y/Q、F877L、T878A/S、D880E、L882I、S889G、D891H、E894K、M896V/T、E898G、T919S。
7.如权利要求2或3所述的方法，其中所述AR变体缺乏全部或部分LBD。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物是转录凝聚物。
9.如权利要求8所述的方法，所述AR转录凝聚物还包括DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或它们的任意组合。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述DNA/RNA序列包括AR调节基因，所述组蛋白包括K27乙酰化H3，所述辅因子包括含有LXXLL基序的蛋白，所述介体包括MED1，和/或所述RNA聚合酶包含磷酸化RNA pol II。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性或活性。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中，如通过活细胞成像所测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低所述AR凝聚物的水平，任选地，所述AR凝聚物由DHT刺激产生。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述AR凝聚物的水平是基于细胞核内荧光强度的变化来量化的，任选地，所述AR凝聚物由DHT刺激产生。
15.如权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物抑制剂降低所述AR凝聚物的水平至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％，任选地，所述AR凝聚物由DHT刺激产生。
16.如权利要求12-15中任一项所述的方法，其中，如在表达AR的细胞系中通过定量PCR检测测量的，所述AR凝聚物抑制剂降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述AR靶基因选自FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2和NKX3.1。
19.如权利要求17所述的方法，其中，所述AR变体靶基因选自BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15和CDC20。
20.如权利要求16-19中任一项所述的方法，其中，所述AR凝聚物抑制剂在降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平方面比相当浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)有效至少2倍(例如3倍、4倍、5倍、6倍等)。
21.如权利要求16-20中任一项所述的方法，其中，5μM浓度的所述AR凝聚物抑制剂将所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平降低至少50％。
22.如权利要求16-21中任一项所述的方法，其中，5μM浓度的恩杂鲁胺降低所述至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平不超过20％。
23.如权利要求12-22中任一项所述的方法，其中，如通过细胞增殖测定所测量的，所述AR凝聚物抑制剂以不超过20μM、或15μM、或10μM、或8μM、或5μM、或4μM、或3μM的IC50抑制表达AR的癌细胞的增殖。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述表达AR的癌细胞选自LNCaP、22Rv1、VCaP和LNCaP95。
25.如权利要求12-24中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂：
a)包含化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、化合物2或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物，或
b)与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2竞争结合AR，或
c)诱导AR的构象变化，所述AR的构象变化至少与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2诱导的构象变化相当；
d)在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：
i)降低所述AR凝聚物的水平，任选地，所述AR凝聚物由DHT刺激产生；
ii)降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平；和/或
iii)抑制表达AR的癌细胞的增殖。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂结合AR的内在无序结构域(IDD)。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述AR相关的疾病或病症具有异常水平的AR活性。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述AR相关的疾病或病症的AR活性水平升高。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述AR相关的疾病或病症具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性或它们的任意组合。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述AR相关的疾病或病症具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述AR相关的疾病或病症为表达AR的癌症。
34.如权利要求33所述的方法，其中，所述表达AR的癌症是前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肾细胞癌、胰腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、子宫内膜癌、套细胞淋巴瘤或唾液腺癌。
35.如权利要求33-34中任一项所述的方法，其中所述表达AR的癌症是转移性的。
36.如权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述表达AR的癌症是前列腺癌。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述前列腺癌对去势或雄激素剥夺治疗有抗性。
38.一种调节细胞或对象中一个或多个AR调节基因的转录的方法，包括调节至少包含AR的AR转录凝聚物。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述AR是野生型AR或AR变体。
40.如权利要求38或39所述的方法，包括通过AR凝聚物调节剂调节所述AR转录凝聚物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂调节AR凝聚物的形成、稳定性或活性。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂是AR凝聚物抑制剂。
43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述AR调节基因是AR靶基因或AR变体靶基因。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述AR靶基因选自FKBP5、KLK2、PSA、TMPRSS2和NKX3.1。
45.如权利要求43所述的方法，其中，所述AR变体靶基因选自BUB1B、CCNA2、UBE2C、KIF15和CDC20。
46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂：
a)包含化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2、或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物，或
b)与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6、或化合物2竞争结合AR，或
c)诱导AR的构象变化，所述构象变化至少与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2诱导的构象变化相当；
d)在以下任意一个方面或其任意组合具有与化合物60、化合物61、化合物62、化合物6或化合物2相当或更高的活性：
i)降低所述AR凝聚物的水平，任选地，所述AR凝聚物由DHT刺激产生；
ii)降低至少一种(或至少两种、三种或四种)AR调节基因的表达水平；和/或
iii)抑制表达AR的癌细胞的增殖。
47.如权利要求38-46中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物抑制剂结合AR的内在无序结构域(IDD)。
48.如权利要求38-47中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物调节剂包括肽、核酸或小分子。
49.如权利要求38-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞或对象具有异常水平的AR活性，或上调水平的AR活性。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述细胞或对象具有一种或多种遗传畸变，所述遗传畸变导致AR活性升高、组成型AR激活、或对去势或雄激素剥夺治疗的抗性。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述一种或多种遗传畸变包括AR基因的扩增、AR基因的突变、AR基因的异常剪接、AR基因的重排、AR基因的多态性或它们的任意组合。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述细胞或对象具有AR变体，任选地，所述AR变体缺乏全部或部分配体结合结构域(LBD)。
53.一种体外筛选系统，其包含AR或其含有内在无序结构域的片段，其中所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
54.如权利要求53所述的体外筛选系统，其中所述AR是野生型AR或AR变体。
55.如权利要求53或54所述的体外筛选系统，其中，所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
56.如权利要求53-55任一项所述的体外筛选系统，其中所述体外筛选系统包括细胞裂解物或核裂解物。
57.如权利要求53-55任一项所述的体外筛选系统，其中所述体外筛选系统包括细胞或细胞核。
58.如权利要求53-57中任一项所述的体外筛选系统，其中所述体外筛选系统还包括DNA/RNA序列、组蛋白、辅因子、介体、RNA聚合酶或它们的任意组合。
59.一种合成的AR凝聚物，其至少包含AR或其含有IDD的片段。
60.一种修饰的宿主细胞，其表达AR或其含有内在无序结构域的片段的，其中，所述AR或所述片段附接至可检测标记物并且能够形成AR凝聚物。
61.如权利要求60所述的修饰的宿主细胞，其中所述AR是野生型AR或AR变体。
62.如权利要求60或61所述的修饰的宿主细胞，其中所述可检测标记物包括荧光染料、放射性同位素、比色底物或抗原表位。
63.如权利要求60-62中任一项所述的修饰的宿主细胞，其适用于检测AR凝聚物的形成。
64.如权利要求60-63任一项所述的修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞是肿瘤细胞，任选地是前列腺癌细胞。
65.一种筛选试剂的方法，所述试剂调节至少含有AR的AR凝聚物，所述方法包括：
a.提供AR凝聚物，并评估所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应，
b.使测试试剂接触所述AR凝聚物，和
c.评估所述测试试剂是否会引起AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化。
66.如权利要求65所述的方法，其中如果所述测试试剂引起所述AR凝聚物的一种或多种物理性质或一种或多种生物效应的变化，则所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚物。
67.如权利要求65或66所述的方法，其中所述物理性质包括所述AR凝聚物的形成、组成、稳定性和/或活性。
68.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中，所述AR凝聚物包含在权利要求53-58中任一项所述的体外筛选系统、权利要求59所述的合成的AR凝聚物、或权利要求60-64中任一项所述的修饰的宿主细胞中。
69.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物是一种分离的合成的凝聚物，或是含有所述AR凝聚物的分离的细胞组合物的形式。
70.如权利要求65-67中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物位于细胞内或细胞核内。
71.一种鉴定试剂的方法，所述试剂调节至少含有AR的AR凝聚物形成，所述方法包括：
a.提供能形成所述AR凝聚物的组分；
b.在适合形成所述AR凝聚物的条件下，使用测试试剂接触所述组分，和
c.评估所述测试试剂的存在是否影响所述AR凝聚物的形成或所述AR凝聚物的一种或多种生物效应。
72.如权利要求71所述的方法，其中，如果所述测试试剂影响所述AR凝聚物的形成或影响所述AR凝聚物的一种或多种生物效应，则将所述测试试剂鉴定为调节所述凝聚物的形成。
73.如权利要求71所述的方法，其中，所述能形成所述AR凝聚物的组分包含在权利要求53-58中任一项所述的体外筛选系统、权利要求59所述的合成的AR凝聚物、或权利要求60-64中任一项所述的修饰的宿主细胞中。
74.如权利要求71-73中任一项所述的方法，其中所述AR凝聚物是转录凝聚物。
75.如权利要求71-74任一项所述的方法，其中，基于所述AR调节基因的表达或细胞增殖来评估所述转录凝聚物的一种或多种生物效应。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述AR调节基因是AR靶基因、AR变体靶基因或报告基因。
77.如权利要求71-76中任一项所述的方法，其中所述测试试剂已被鉴定能够结合AR的IDD。
78.一种化合物，其化学结构选自下组：
或者
或其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、同位素取代物、多晶型物或代谢物。
79.一种药物组合物，其包含选自下组的化合物：
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，
N-(5-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯基)乙炔基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺，
3-氯-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-5-基)乙炔基)苯基)丙-2-基)-2-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲腈，和
3-氯-2-(2-羟基乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，或其药学上可接受的盐，溶剂化物，前药，对映异构体，非对映异构体，互变异构体，同位素取代物，多晶型物或代谢物。
80.一种治疗对象AR相关疾病或病症的方法，其包括向对象施用治疗有效量的选自下组的化合物：
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，
3-氯-2-(2-氯乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，
N-(5-((4-(2-(3-氯-4-(2-氯乙氧基)-5-氰基苯基)丙-2-基)苯基)乙炔基)嘧啶-2-基)甲磺酰胺，
3-氯-5-(2-(4-((2-((1-氧化四氢-1λ6-噻吩-1-亚基)氨基)嘧啶-5-基)乙炔基)苯基)丙-2-基)-2-(环氧乙烷-2-基甲氧基)苯甲腈，或
3-氯-2-(2-羟基乙氧基)-5-(2-(4-((2-((1-氧化-1λ6-硫代吗啉-1-亚基)氨基)嘧啶-4-基)甲氧基)苯基)丙-2-基)苯甲腈，或其药学上可接受的盐，溶剂化物，前药，对映异构体，非对映异构体，互变异构体，同位素取代物，多晶型物或代谢物。
81.如权利要求80所述的方法，其中，所述化合物与第二活性成分或治疗联合施用。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述第二活性成分或治疗是抗癌治疗，或任选地为抗前列腺癌药物。
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