CN116790720A - 基于CRISPR/Cas12a的miRNA快速检测试剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于CRISPR/Cas12a系统实现直接检测miRNA的检测试剂和检测方法，该检测试剂及方法中，将待检测miRNA作为间隔RNA，利用重组Cas12a蛋白与间隔RNA，以及含有20nt固定序列的茎环RNA组合，当加入与miRNA序列互补的靶DNA后，可激发Cas12a的反式切割活性，进而剪切含有FAM荧光基团的单链DNA探针，产生可被检测的荧光信号，从而实现miRNA的快读、灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于CRISPR/Cas12a的miRNA快速检测试剂及其检测方法，属于基因检测及分子诊断领域。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的小分子单链非编码RNA，长度为18 -22个核苷酸，广泛存在于动物、植物和一些病毒等真核生物中，通过调节基因的表达在许多生命活动中起重要作用。
异常的miRNAs表达可以作为多种疾病的生物标志物，如神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病，甚至是免疫性疾病。miRNAs在癌症中的作用引起了研究者广泛关注，并且被证明可以作为癌症诊断、转移、化疗耐药和预后的生物标志物。考虑到miRNAs在基因调控和生物功能以及疾病中的重要作用，对miRNAs进行特异性和灵敏性的检测越来越重要。然而，由于成熟的miRNAs片段小，没有poly A尾，同一家族的miRNAs通常只有1个碱基不同，以及不同细胞中miRNA的拷贝数具有极大的差异性，造成了针对miRNA的特异性检测极具挑战性。
在传统的miRNA检测方法中，RNA印迹(Northern blotting)是分析miRNAs表达的标准方法。这种基于探针杂交技术的方法特异性和灵敏度不高、耗时长，且需要大量的RNA样本。之后，实时定量PCR(qRT-PCR)因为较好的灵敏度和特异性，并且可以获取特定组织或患者来源样本的全miRNAs表达谱，经常被用来验证全基因组筛选方法的结果，以及筛选临床相关的miRNAs亚群。然而，由于成熟的miRNAs序列短，无法像mRNA那样按常规方法设计引物进行逆转录和扩增。为解决上述问题，科研工作者对传统的qRT-PCR方法进行了改进，发明了加尾法和茎环法2种方法对miRNA进行逆转录。
目前，qRT-PCR被认为是miRNA检测的金标准，通过靶向特异性的逆转录引物，与成熟的miRNA结合，形成复合物，并在miRNA的5’末端延伸来得到RT-PCR的模板，再进行RT-PCR得到检测结果。此检测方法需要通过逆转录获得cDNA再进行检测，依赖于价格昂贵的荧光定量PCR一起。
CN 110004214B公开了一种双重DNA机器检测microRNA-21的方法，通过一种基于滚环扩增(RCA)的环状DNA机器和基于循环链置换扩增的双向DNA机器相联合的方法，实现对microRNA-21的荧光检测。该方法灵敏度高，背景信号低，目标信号强，特异性良好，可直接用于人血清样本检测，是一种通用的核酸检测平台。但是，该方法需要进行逆转录扩增，较难获得高质量待检产品。
CN112301116A公开了一种非诊断目的基于CRISPR/Cas技术超灵敏检测miRNA的方法，通过结合使用PCR技术和碱基互补配对原则，利用CRISPR/Cas技术特异性识别扩增得到的互补DNA序列，激活Cas12a的酶活性，进而切割自主加入、含有BHQ-TTTTTTTTTT-Cy5序列的ssDNA荧光探针，实现信号的级联放大效应，完成对目标miRNA的灵敏检测。但是，该方法仍需要依赖PCR核酸扩增，检测时长较长，且在扩增过程中可能引入突变，影响检测的准确性。
CN115418392A公开了一种基于点击化学末端脱氧核苷酸转移酶结合CRISPR/Cas12a对miRNA的检测方法，通过点击化学将与miRNA互补的两个ssDNA探针连接，并利用磁珠(MBs)分离其生成物；在dTTP和TdT存在的情况下，连接的DNA链和互补链miRNA暴露的游离3'-OH端可以产生连续的poly-T；crRNA的识别区域包含一个21bp的poly-A尾巴；扩展的poly-T尾巴可以作为激活剂，补充crRNA，激活CRISPR/Cas12a的反式切割活性，切割报告探针，产生荧光信号从而完成检测。所提出的包含多重扩增策略的荧光生物传感器可以实现超灵敏度检测miRNA。但是，利用互补片段捕获miRNA，以及末端转移酶加poly-T受诸多因素影响而往往效率不高，并且步骤繁琐，不适用于即时检测(POCT)场景的需求。
CN114540466 A基于CRISPR/Cas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒，通过对引物进行合理的设计，并采用合适的条件对靶标进行指数级放大，最终生成的双链DNA产物可激活对应的CRISPR基因编辑检测体系，实现对miRNA的荧光检测，一定程度上解决了现有miRNA检测技术中检测下限低、特异性差、成本较高和操作流程复杂、耗时长的问题，有望用于多个场景的miRNA快速、高效检测。但是，该方法仍需借助逆转录将miRNA转变成可被Cas12a识别的DNA信号，并且引物的设计要求较高，不适用于高GC含量的miRNA的检测，因为方法的普适性有待提高。
综上，现在仍需要一种不同于传统的miRNA检测方法，可实现miRNA的快速、灵敏检测。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是基于CRISPR/Cas12a系统实现直接检测miRNA，无需逆转录，无需核酸扩增，从而实现miRNA的快读、灵敏检测。
基于上述原因，本发明提供一种基于CRISPR/Cas12a的miRNA快速检测试剂，其中，该试剂包括适用于miRNA的CRISPR/Cas12a检测体系。
为了达到上述目的，本发明提供了一种用于快速检测待测miRNA的CRISPR/Cas12a检测试剂，包括：重组Cas12蛋白、茎环RNA、单链靶DNA、荧光探针和buffer，所述单链靶DNA与待测miRNA互补，即将待检测miRNA作为间隔RNA，与茎环RNA构成crRNA的两个部分。
优选地，所述茎环RNA含有20nt固定序列。
该检测试剂中，重组Cas12a蛋白与间隔RNA，以及含有20nt固定序列的茎环RNA组合，当加入与待测miRNA序列互补的ssDNA(单链靶DNA)后，可激发Cas12a的反式切割活性，进而剪切含有FAM荧光基团的单链DNA探针，产生可被检测的荧光信号。
优选地，所用荧光探针序列为5’-AATTAA-3’。
优选地，茎环RNA序列为AAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO：6)。
优选地，上述用于miRNA快速检测的CRISPR/Cas12a试剂中的重组Cas12蛋白来源于Acidaminococcus sp菌株的AsCas12a。
更优选地，上述重组Cas12蛋白获取步骤如下：
a)采用AsCas12a基因序列构建卡那霉素抗性原核表达载体pet-AsCas12a
b)将质粒pet-AsCas12a转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达
c)诱导表达获得种子菌，扩大培养种子菌；
d)将步骤c)中扩大培养的种子菌进行破菌纯化，获得AsCas12a的蛋白。
更优选地，AsCas12a序列：
acacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgaggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatcca
ggagcagggcttcatcgaggaggacaaggccagaaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgataggatctacaagacctatgc
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1)。
优选地，所述buffer为Cutsmart溶液，并添加L-脯氨酸(L-PRO)
本发明还提供了一种miRNA快速检测方法，其中，采用上述用于miRNA快速检测的CRISPR/Cas12a检测试剂。
优选地，上述miRNA快速检测方法包括以下步骤：
步骤a：获得待测miRNA和所述检测试剂组分；值得一提的是，本方法在提取待测miRNA后，无需逆转录，无需核酸扩增即可进行下一步；检测试剂中的单链靶DNA基于待测miRNA制备；
步骤b：在buffer溶液体系中，将重组Cas12a蛋白与茎环RNA、以及待测miRNA混合，经体外组装，形成Cas12a RNP复合物；
步骤c：向所述Cas12a RNP复合物中加入荧光探针和单链靶DNA，反应，读取检测结果。
优选地，步骤b中重组Cas12a蛋白与茎环RNA、以及miRNA的混合摩尔比为1:1:1～1:1.5:1.5，更加优选1:1.5:1.5。
优选地，步骤c在qPCR仪或水浴锅中反应；反应温度为37±5℃℃，反应时间为10～30min。
如实验结果所示，本方法提供的miRNA检测试剂及检测方法，过程中不需要任何扩增步骤，反应设备仅需要维持反应温度即可完成，换言之，普通荧光PCR仪器仅需要保持检测温度，并利用其荧光检测模块读取荧光数值的变化，可作为本发明实施的设备之一。如果没有荧光PCR仪器，可等反应完成后通过荧光光度计或者手持式荧光检测设备等任何可以读取、记录荧光值的仪器进行检测。本发明较现有检测方法，操作简便，耗时更短，无需逆转录，无需核酸扩增，检测结果稳定，特异性强，尤其适用于各种即时检测(POCT)场景的需求。
附图说明
图1为利用CRISPR/Cas12a检测miRNA机制示意图；
图2为本发明所用的AsCas12a的SDS-PAGE检测图；
图3为AsCas12a针对miR-21的反式剪切活性验证；
图4为针对4种不同序列的miRNA检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的基于CRISPR/Cas12的miRNA检测试剂的制备方法及其应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
本发明实施例涉及的主要生物材料如下：HeLa细胞，MCF细胞来源于ATCC细胞中心。
本发明实施例涉及的试剂及缓冲液如下：Cutsmart buffer(NEB)；L-脯氨酸(Solarbio)。
实施例
图1为本发明提供的检测试剂的检测原理示意图，通过将待检测miRNA作为间隔RNA，利用重组Cas12a蛋白与间隔RNA，以及含有20nt固定序列的茎环RNA组合，当加入与miRNA序列互补的ssDNA后，可激发Cas12a的反式切割活性，进而剪切含有FAM荧光基团的单链DNA探针，产生可被检测的荧光信号。以下就该试剂的制备方法及检测方法提供详细说明。如图1所示，本发明的检测机理为：待检测的miRNA被巧妙地设计为配对RNA，而原来充当靶标的ssDNA在这里起到与miRNA配对的作用，从而激活了Cas12a的反式剪切活性。根据荧光探针切割后的信号变化，即可实现对目标miRNA的特异性检测。整个检测过程无需逆转录，无需核酸扩增，在10分钟左右即可完成。
以下就本发明提供的检测试剂的制备和检测应用进行说明。
一、原核表达菌株的表达和纯化
1、AsCas12a蛋白的表达
1)AsCas12a原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，挑取菌落至含有卡那霉素10mL液体LB培养基的试管中，37℃转速180rpm的摇床上培养至菌液的OD600值到0.4-0.6。
2)将表达菌液10mL接种到含有1L液体LB培养基的试管中，37℃转速180rpm的摇床上培养3-6小时。
3)培养至菌液的OD值到0.4-0.8时，加入1mL的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，18℃转速180rpm的摇床上诱导表达20h。
4)菌液进行8000rpm离心30min，收集菌体，用80mL的裂解buffer(pH 8.0的20mMTris-HCL，0.5M NaCl)溶液重悬菌体形成菌体悬液，加入800μL PMSF。
5)用高压匀浆机进行菌体的破碎，破碎条件为压力1000bar，流速22L/h，破碎时间10min。
6)破碎后的溶液经过14000rpm离心收集上清液，并进行目的蛋白的后续纯化。
2、AsCas12a蛋白的纯化
采用Sepharose DEAE作为纯化填料，平衡缓冲液为pH 7.5，30mM/L的Tris缓冲液，洗脱液为pH 8.0，50mM/L的Tris，0.5M/L的NaCl，咪唑浓度逐渐增加的溶液。图2所示为纯化后的AsCas12a蛋白的SDS-PAGE检测图。
AsCas12a序列：
acacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgaggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatcca
ggagcagggcttcatcgaggaggacaaggccagaaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgataggatctacaagacctatgc
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二、miRNA提取
选用TIANGEN的miRcute miRNA提取分离试剂盒，提取肿瘤细胞中的miRNA。
1、样品处理：在细胞培养板中加入裂解液MZ裂解细胞，每10cm2面积加1mL裂解液MZ，抽打混匀。将匀浆样品在室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
2、4℃12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的无RNase的离心管中。加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。
3、4℃12000rpm离心15min，取分层的水相层，转移到新管中，缓慢加入转移液体积0.43倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入向吸附柱miRspin中，室温12000rpm离心30s，弃掉吸附柱，保留流出液。
4、缓慢加入流出液体积0.75倍的无水乙醇，混匀。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute中，室温12000rpm离心30s，弃掉流出液，保留吸附柱。再加入500μL去蛋白液MRD，室温静置2min后12000rpm离心30s，弃废液。
5、向吸附柱中加入500μL漂洗液RW，室温静置2min后12000rpm离心30s，弃废液。重复一次。
6、将吸附柱放入2mL收集管中，室温12000rpm离心1min，去除残余液体。再转入一个新的RNase-Free 1.5mL离心管中，加15-30μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min后12000rpm离心2min。获得的miRNA保存在-80℃。
三、以miRNA-21为检测对象，体外验证反式剪切活性
1、在10μL体系中加入1μL的10×Cutsmart和0.5M的L-脯氨酸；
2、加入500nM AsCas12a，1000nM茎环RNA和待检测miRNA，混匀孵育3分钟；
3、加入10nM与miRNA相配对的单链DNA和1000nM荧光探针，加水补足至10μL；
4、37℃恒温反应30分钟，核酸PAGE分析。
结果如图3所示，只有miRNA-21存在时，能够切割靶标DNA，并激活反式切割活性，将无关的ssDNA探针切碎；而其他的miRNA则无法使激活AsCas12a的反式剪切活性，ssDNA探针没有被剪切。该实验结果证明本发明中miRNA检测方法特异性强。
四、运用CRISPR/Cas12a系统对不同miRNA检测限的测定
1、合成四种不同的待测miRNA
采用利用化学合成(由金斯瑞公司合成)的方法，合成四种待测miRNA，各miRNA序列如下：
miR-21:UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A(SEQ ID NO:2)
miR-31:AGG CAA GAU GCU GGC AUA GCU(SEQ ID NO:3)
miR let-7a：UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U(SEQ ID NO:4)
miR-17:CAA AGU GCU UAC AGU GCA GGU AG(SEQ ID NO:5)
2、合成通用茎环RNA序列AAUUUCUACUAAGUGUAGAU(SEQ ID NO:6)，以及与四种miRNA相对应的靶DNA
miRNA-21对应靶DNA:TCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQ ID NO:7)
miRNA-17对应靶DNA:CTACCTGCACTGTAAGCACTTTG(SEQ ID NO:8)
miRNA-31对应靶DNA：AGCTATGCCAGCATCTTGCCT(SEQ ID NO:9)
miRNA-let 7a对应靶DNA：AACTATACAACCTACTACCTCA(SEQ ID NO:10)
3、在10μL体系中加入1μL的Cutsmart和0.5M的L-脯氨酸后，再加入500nMAsCas12a，1000nM茎环RNA和浓度梯度的miRNA，混匀孵育3分钟，加入10nM的靶DNA和1000nM荧光探针，加水补足至10μL。在qPCR仪中37℃反应10分钟，监测并读取荧光数值。探针序列：5’-AATTAA-3’(SEQ ID NO:11)。
采用该方法检测miRNA，所得荧光数值结果如图4所示，采用本发明提供的miRNA检测试剂的检测结果与qRT-PCR检测结果一致。本发明的检测试剂针对四种不同的miRNA的检测限为100fM-1pM。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于CRISPR/Cas12a的miRNA快速检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括：重组Cas12蛋白、茎环RNA、单链靶DNA、荧光探针、buffer；所述单链靶DNA与待测miRNA互补。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述荧光探针序列如SEQ ID NO:11所示。
3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述茎环RNA含有20nt固定序列，所述茎环RNA序列如SEQ ID NO:6所示。
4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述重组Cas12蛋白来源于Acidaminococcus sp菌株的AsCas12a。
5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述重组Cas12蛋白获取步骤如下：
a)采用AsCas12a基因序列构建卡那霉素抗性原核表达载体pet-AsCas12a；
b)将质粒pet-AsCas12a转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达；
c)诱导表达获得种子菌，扩大培养种子菌；
d)将步骤c)中扩大培养的种子菌进行破菌纯化，获得AsCas12a的蛋白。
6.根据权利要求5所述的检测试剂，其特征在于：所述AsCas12a序列如SEQ ID NO:1所示。
7.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述buffer为Cutsmart溶液，并添加L-脯氨酸(L-PRO)。
8.一种miRNA快速检测方法，其特征在于：采用权利要求1～7任一所述的检测试剂对待测miRNA进行检测。
9.根据权利要求8所述的miRNA快速检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
在所述检测试剂的buffer体系中，将重组Cas12a蛋白与茎环RNA、以及待测miRNA混合，经体外组装，形成Cas12a RNP复合物；
向所述Cas12a RNP复合物中加入荧光探针和单链靶DNA，反应，读取检测结果。
10.根据权利要求8所述的miRNA快速检测方法，其特征在于：用于体外组装的混合溶液中重组Cas12a蛋白与茎环RNA、以及miRNA的混合摩尔比为1:1:1～1:1.5:1.5。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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