CN116783302A - 用于基于生物发光的测序的方法和组合物 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本文公开了将不同标记的亲和试剂固定在位置上来对应阵列上的位置的方法和组合物。第一亲和试剂固定在第一位置中的至少一些处，并且第二亲和试剂固定在第二位置中的至少一些处第一亲和试剂与第一荧光素酶多肽缔合，第二亲和试剂与第二荧光素酶多肽缔合。第一荧光素酶多肽不与第二底物交叉反应并且第二荧光素酶多肽不与第一底物交叉反应。该方法还包括使阵列与第一底物接触，该第一底物与第一荧光素酶多肽反应，并检测固定第一亲和试剂的位置处的第一发光信号，以及使该阵列与第二底物接触，并检测固定第二亲和试剂的位置处的第二发光信号，从而将第一亲和试剂或第二亲和试剂固定在该位置处来对应该阵列上的位置。
Description
相关申请
本申请要求于2020年10月9日提交的美国临时专利申请63/089,996的优先权，其全部内容以引用方式并入。
序列表
本申请包含已以ASCII格式以电子方式提交的序列表，其全部内容以引用方式并入。该ASCII副本创建于2021年9月23日，命名为092171-1260984_(5092-WOCN)_SL.txt，大小为3,535字节。
1.技术领域
本申请涉及用于基于生物发光的核酸测序的方法和组合物。
2.背景技术
美国专利公布20180223358描述了一种大规模平行测序(MPS)化学(CoolMPSTM)，其采用特异性识别和区分具有不同核碱基的NLRT的未标记的可逆终止子(NLRT)核苷酸和抗体。与传统的MPS化学相比，CoolMPSTM测序使用未标记的可逆终止子代替染料标记的可逆终止子，这允许在新的测序循环中进一步延伸链，而不受先前循环的任何干扰。此外，NLRT制造起来更容易、成本更低，并且它们可更有效地整合。CoolMPSTM的另一个优点在于与标准标记的RT上每个碱基的单一染料相比，抗体可以允许更灵活的修饰并携带多个信号分子以改善测序信号。
荧光素酶及其底物已用于报告基因技术。荧光素酶与其底物发生反应(例如，氧化)并发出光信号，该信号可被捕获和量化。这些发光反应广泛用于体外和体内食品检测、环境监测和诊断。腔肠素是一种常见的可以被大量不同的荧光素酶氧化的底物。AubinFleiss&Karen S.Sarkisyan,A brief review of bioluminescent systems(2019),Current Genetics volume 65,pages877–882(2019)，得自：link.springer.com/article/10.1007/s00294-019-00951-5。
发明内容
一方面，本文公开了一种将不同标记的亲和试剂固定在位置上来对应阵列上的位置的方法。该方法包括提供位置阵列，其中该阵列包括第一位置和第二位置，其中第一亲和试剂固定在第一位置中的至少一些上并且第二亲和试剂固定在第二位置中的至少一些上。第一亲和试剂与第一荧光素酶多肽缔合，并且第二亲和试剂与第二荧光素酶多肽缔合。第一荧光素酶多肽可与第一底物反应以产生第一发光信号，并且第二荧光素酶多肽可与第二底物反应以产生第二发光信号。第一底物与第一荧光素酶多肽正交并且第二底物与第二荧光素酶多肽正交。第一荧光素酶多肽与第二底物不具有显著的交叉底物反应性并且第二荧光素酶多肽与第一底物不具有显著的交叉底物反应性。该方法还包括使阵列与第一底物接触并在固定第一亲和试剂的位置处检测第一发光信号；使阵列与第二底物接触并在固定第二亲和试剂的位置处检测第二发光信号。该方法还包括如果在所述位置检测到第一发光信号则确定第一亲和试剂固定在该位置处，或者如果在所述位置检测到第二发光信号则确定第二亲和试剂固定在该位置处。
在另一方面，本文公开了一种用于进行测序的试剂盒，该试剂盒包含第一蛋白质、第二蛋白质、第一底物和第二底物。第一蛋白质与第一荧光素酶多肽缔合，并且第一荧光素酶多肽可与第一底物特异性反应以产生第一发光信号。第二蛋白与第二荧光素酶多肽缔合，并且第二荧光素酶多肽可与第二底物特异性反应以产生第二发光信号。第一荧光素酶多肽与第二底物不具有显著的交叉底物反应性(这在本公开中简称为第一荧光素酶多肽不与第二底物交叉反应)，并且第二荧光素酶多肽与第二底物不具有显著的交叉反应性(这在本公开中简称为第二荧光素酶不与第一底物进行交叉反应)。
在另一方面，本文公开了一种产生荧光素酶-抗体缀合物的方法，所述方法包括：(1)提供(i)抗体，所述抗体特异性识别3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，其包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)的核碱基，及其类似物；以及(ii)荧光素酶多肽；(2)在荧光素酶多肽上产生-SH基团的条件下，使荧光素酶多肽与2-亚氨基硫烷接触，从而产生包含-SH基团的荧光素酶多肽；(3)使所述抗体与SMCC接触，其中所述SMCC的-NHS基团与所述抗体上的-NH2基团连接，从而产生具有马来酰亚胺基团的SMCC连接的抗体；以及(4)在适用于蛋白质缀合的条件下，将包含所述-SH基团的荧光素酶多肽与所述SMCC连接的抗体接触，从而形成所述荧光素酶-抗体缀合物。
附图说明
图1示出了可用于本文所公开的方法和组合物中的各种荧光素酶及其正交底物。
图2比较了来自各种商业荧光素酶的信号。
图3示出了Gluc和Nluc之间没有显著交叉底物反应性。
图4示出了f-CTZ是本文所用的Nluc荧光素酶的最佳底物。
图5示出了CTZ和f-CTZ的机载稳定性(室温24小时稳定性)与新鲜条件下(新制备)的稳定性没有显著差异。
图6A和图6B示出了Gluc/CTZ和Nluc/f-CTZ的正交对的长期(例如，长达6个月)稳定性。
图7A示出了Nluc和SMCC之间的连接化学。图7B示出了抗体与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应以产生可用于连接SMCC的巯基(-SH)的化学。
图8示出了凝胶电泳结果，其示出抗体-Nluc缀合物和抗体-Gluc缀合物的形成。泳道1：分子梯度；泳道2：αA-Nluc(克隆18B7，示出介于160-260KDa之间的多个条带)；泳道3：αT-Nluc；泳道4：αG-Gluc；泳道5：αDIG-Nluc。
图9A-9C示出了由在MGI DNBseq E系列单色测序成像仪上检测到的Nluc-抗DIG缀合物、Nluc-抗T抗体缀合物和Nluc-抗A抗体缀合物产生的信号。
图10A示出了荧光素酶多肽和SMCC接头之间共价键的形成。图10B示出了荧光素酶上的游离SH基团被碘乙酰胺保护后Gluc和Nluc产生的信号结果。
图11A示出了用Traut试剂处理Gluc和Nluc的反应。图11B示出了将抗体缀合至SMCC接头的反应。图11C和图11D示出了Gluc和Nluc的信号强度和热稳定性，这些Gluc和Nluc在与抗体缀合之前已经用Traut的试剂进行了修饰。
图12A示出了在抗体与还原剂TCEP以不同比例温育之后，在100KDa截止纯化之后的蛋白质收率。图12B示出了通过Ellman定量方法获得的-SH基团标记度。图12C示出了在用不同比例的各种还原剂处理抗体之后由测序成像仪采集的图像。
图13A-13D示出了使用特异性针对同种型NLRT抗体和链亲和素标记的Gluc的生物素化次级抗体的成像结果。图13A-13D分别检测了C-生物素、抗A抗体、抗T抗体和抗G抗体的存在。
图14示出了抗体-荧光素酶融合蛋白与3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸的结合能力。
图15示出了NLRT抗体产生的成像信号，每个抗体都已通过EZ-NHS-S-S-生物素接头与生物素缀合。
图16示出了示例性冷MPSTM生物发光单色测序方案。
图17A示出了来自图16中描述的方法的前五个测序循环的信号直方图。图17B示出了来自第一测序循环的图像1和图像2。图17C-17E示出了每个循环的信号、噪声和SNR图。
图18A示出了在DTT处理后来自Nluc的信号没有显著变化。图18B示出了来自Gluc的信号在DTT处理后减少超过95％。
图19A-19E示出来自前五个测序循环的信号。结果示出了信号与背景分离良好。在每个信号散射图中，X轴指示来自图像1的归一化信号强度，Y轴指示来自图像2的归一化信号强度。从该散射图中获得了四(4)个分离良好的信号组。X轴上的一个(中位数＝0.5,0)来自生物素标记的核苷酸A。Y轴上的一个(0,中位数＝0.5)来自地高辛标记的核苷酸C。来自(0,0)位置的信号指示来自未标记的核苷酸G的信号。来自45度(0.5,0.5)位置的信号是来自核苷酸T的信号，因为它一半用生物素标记，并且一半用地高辛标记。因此，一半的T在图像1中点亮，而另一半在图像2中点亮。在信号散射图的每个循环中，这四(4)个信号组彼此区分良好，从而使得该循环的正确碱基检出成为可能。
具体实施方式
词汇表
术语“CTZ”是指腔肠素。
术语“f-CTZ”是指氟化腔肠素。
如本文所用，术语“基本上相同”在提及两种荧光素酶的活性时是指当与相同底物反应时，由两种荧光素酶产生的信号差异比较小信号值小40％、小30％、小20％、小10％。
术语“Gluc”是指Gaussia荧光素酶多肽(SEQ ID NO：1)或其变体，前提条件是该变体与Gluc(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列基本上相同，并且还具有与Gluc(SEQ ID NO：1)基本上相同的活性。
术语“Nluc”是指NanoZac萤光素酶多肽(SEQ ID NO：2)或其变体，前提条件是该变体与Nluc(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列基本上相同，并且还具有与Nluc(SEQ ID NO：2)基本上相同的活性。
术语“NLRT”是指3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。
术语“Traut试剂”是指一种用于硫醇化(巯基加成)的环状硫代亚胺酸酯化合物，被称为2-亚氨基硫烷或2-IT。Traut试剂与伯胺(-NH2)反应引入巯基(-SH)，同时保持与原始氨基相似的电荷特性。
术语“机载稳定性”是指荧光素酶多肽在反应缓冲液中在室温下24小时的稳定性。
术语“正交底物”是指可被特定荧光素酶多肽切割的底物。例如，f-CTZ是下文所述的Nluc突变体的正交底物，而CTZ是下文所述的Gluc突变体的正交底物。荧光素酶及其正交底物一起被称为正交对，或正交酶/底物对。
术语“与……反应”是指荧光素酶接触底物并在发光化学反应中将底物转化(例如，氧化)为新分子。
术语“GDS”是指引物延伸链，例如，在测序反应期间通过掺入NLRT形成的DNA链。GDS也称为“引物延伸产物”或“延伸的引物”。
如在“用标记的亲和试剂对应阵列上的位置的方法”中使用的术语“对应”是指确定阵列上的指定物理位置与固定或位于特定阵列位置上的亲和剂的特征(例如，结构)之间的关系(或关联)。因此，在包含多个物理位置和各自固定在一个位置处的多个不同亲和试剂的阵列中，可确定固定在任何指定位置的亲和试剂的身份。
当提及两种亲和试剂时，术语“不同标记”是指这两种亲和试剂能够产生可区分的信号。例如，Gluc标记的抗体和Nluc标记的抗体是两种不同标记的亲和试剂，因为由Gluc产生的信号(与其正交底物CTZ反应)和由Nluc产生的信号(与其正交底物f-CTZ反应)是可区分的。
概述
本发明使用缀合到亲和试剂如抗体的荧光素酶，其结合具有不同核碱基的每个NLRT，以及在大规模平行的基于生物发光的单色核酸测序中使用缀合物的方法。使用生物发光信号在每个测序循环中检测碱基有利地消除了在测序硬件设计中对激发源和滤色器的需要。
在一种方法中，测序方法使用至少两种不同标记的亲和试剂，所述试剂可特异性结合两种不同的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。所述两种亲和试剂与两种不同的荧光素酶多肽缔合(例如，缀合或结合)，并且所述两种不同的荧光素酶多肽可以与其各自的正交底物反应以产生高发光信号。为了说明而非限制，一种示例性荧光素酶多肽是NanoZac荧光素酶多肽(Nluc)(Prolume Inc.)。如下所述，Nluc的正交底物是氟化腔肠素(f-CTZ)。另一种示例性荧光素酶多肽是Gaussia荧光素酶(Gluc)(Prolume Inc.,J.Welsh,Biochemical and Biophysical Research Communications 389(2009)563-568,M43L,M110L mutant)。Gluc的正交底物是腔肠素(CTZ)。
该方法中使用的两种荧光素酶多肽不具有显著的交叉底物反应性(即具有最少的串扰)，从而使误读的机会最小化。在一些实施方案中，第一荧光素酶多肽是Gluc并且第二荧光素酶多肽是Nluc。为了进一步减少由Gluc和Nluc之间的交叉底物反应性引起的测序错误，在检测并记录来自第一个荧光素酶Gluc的信号后，将失活剂应用于测序阵列以使Gluc失活。然后检测并记录来自与其正交底物反应的第二荧光素酶Nluc的信号。失活剂的活性是选择性的，即其使Gluc失活但不能使Nluc失活，即其不影响Nluc的酶活性。
使用两种荧光素酶-底物正交对允许独特的双标记(即两个荧光素酶)单色测序，并改善单色测序的效率和准确性。本文所述的方法可用于双标记、单色测序方案，其中两种荧光素酶多肽偶联至两种亲和试剂，每种亲和试剂结合至在测序阵列上具有不同核碱基的NLRT。两种荧光素酶多肽在与其各自的正交底物反应时产生强烈的发光信号，并且它们不具有显著的交叉底物反应性。在一种方法中，将两种不同的荧光素酶偶联亲和试剂同时添加到测序阵列中。荧光素酶偶联的亲和试剂结合到特定多核苷酸掺入的核苷酸并固定在测序阵列中的位置(地址)处。可添加第一底物(与第一荧光素酶正交)并且可在阵列上的特定位置处检测第一信号(由切割第一底物的第一荧光素酶产生)并记录信息。然后可以将第二底物添加到测序阵列并且可检测/记录第二信号(由切割第二底物的第二荧光素酶产生)。可以基于在该位置存在或不存在第一发光信号或第二发光信号来确定在阵列的每个位置处掺入的核苷酸。因此，本方法允许在测序期间同时递送识别具有两个不同核碱基的NLRT的至少两种亲和试剂，并且可使用具有单色或单通道成像系统的测序仪来确定结果。其显著减少了所涉及的时间和劳动力，并简化了测序过程。可与其他标记/检测方法结合来使用两种荧光素酶缔合的亲和试剂，其包括使用四种荧光素酶缔合的亲和试剂，如下所述，使用直接连接(例如，通过接头)到荧光或生物发光信号系统，或任何其他系统的核苷酸。
在一种方法中，本文所公开的方法和组合物可涉及四种不同的亲和试剂，每种亲和试剂特异性识别和结合具有不同核碱基的NLRT。在一些方法中，第一亲和试剂缀合到第一荧光素酶多肽，第二亲和试剂缀合到第二荧光素酶多肽，第三亲和试剂缀合或结合至第一荧光素酶和第二荧光素酶多肽，并且第四亲和试剂既不与第一荧光素酶多肽也不与第二荧光素酶多肽缀合或结合。因此，通过检测阵列上某个位置处的第一发光信号和/或第二发光信号，可确定哪种亲和试剂结合到阵列的该位置上，从而确定哪个NLRT存在于该位置上。
在一些实施方案中，亲和试剂通过接头缀合至荧光素酶多肽。在一些实施方案中，荧光素酶多肽在偶联至亲和试剂之前首先用Traut试剂(2-亚氨基硫烷)处理。令人惊讶地发现，Traut试剂可增加荧光素酶多肽的酶活性，从而增加信号。
NLRT
未标记的可逆终止子(“NLRT”)是3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸是核苷酸类似物，在脱氧核糖的3'-OH位置处包含一个可移除的封端基团。尽管荧光标记的可逆终止子广泛用于当前的合成测序(SBS)系统中，但本发明中使用的NLRT可以是未标记的并且与下文所述的抗核苷酸亲和试剂结合使用。在一个实施方案中，未标记意指NLRT不包含荧光染料。在一个实施方案中，未标记意指NLRT不包含化学发光染料。在一个实施方案中，未标记意指NLRT不包含发光部分。示例性NLRT在US-2018-0223358-A1中有所描述，其全部内容以引用方式并入本文。
阵列
在一些实施方案中，将NLRT掺入位于阵列的不同位置上的生长DNA链(“GDS”)。“阵列”是指排列在表面上的固体载体(或固体载体的集合，诸如珠)，该表面可以是基本上平坦的表面，其携带构成核酸的位点集合(例如，孔阵列或表面上的衍生化区域)，使得集合的每个位点在空间上限定并且不与阵列的其他位点重叠。该位点可被描述为“空间离散的”。该阵列还可包括具有表面的非平面可询问结构，诸如珠或孔。该阵列的寡核苷酸或多核苷酸可共价结合到固体载体，或者其可以是非共价结合的。固体载体可以为例如珠、流动池、垫、微流体装置中的通道等，并且固体载体可包括硅、玻璃、金、聚合物、PDMS等。在一些实施方案中，模板核酸被固定或包含在液滴内(任选地固定在珠上或液滴内的其他底物上)。
用于本发明的阵列包含固定于其上的模板核酸。在一些实施方案中，阵列包括有序阵列(意指模板结合区域以有序的、典型地直线的图案排列，例如网格、螺旋或其他图案)，即模板在阵列上的任何特定位置(或“地址”)处的身份可能在对模板进行测序之前已知。在一些实施方案中，阵列包括无序阵列(也称为随机阵列)，其中模板结合区位于随机位置，即给定地址处模板的身份在测序前未知，在测序反应之前未知。
在一些实施方案中，模板核酸是包含靶序列的多个拷贝的固定化DNA多联体。在一些实施方案中，模板核酸表示为DNA多联体，如包含靶序列的多个拷贝和“衔接子序列”的DNA纳米球(DNB)。参见PCT专利公布WO 2007/133831，其内容据此全文以引用方式并入以用于所有目的。在一些实施方案中，模板为单个多核苷酸分子。在一些实施方案中，模板作为模板分子的克隆群体存在(例如，通过桥扩增或Wildfire扩增产生的克隆群体)。
应当理解，该方法不限于特定形式的模板，并且模板可以是任何模板，例如DNA多联体、树状物、模板的克隆群体(例如，通过桥扩增或Wildfire扩增产生的)或单个多核苷酸分子。因此，说明书应该被理解为好像每个对模板的引用都可另选地指(例如)短线性模板、单分子模板(例如，在零模式波导中)以及其他形式的模板的多联体模板、树状物、克隆群体。在一些实施方案中，模板核酸是DNB。
在一个方面，本发明提供了一种DNA阵列，其包含：多个模板DNA分子，每个DNA分子附着在阵列的一个位置处，在多个位置处与模板DNA分子的一部分碱基配对的互补DNA序列，其中互补DNA序列在其3'端包含掺入的第一可逆终止子脱氧核糖核苷酸；特异性结合到第一可逆终止子脱氧核糖核苷酸的至少一些的第一亲和试剂，以及特异性结合到第二可逆终止子脱氧核糖核苷酸的至少一些的第二亲和试剂。第一亲和试剂与第一荧光素酶多肽缀合或结合，并且第二亲和试剂与第二荧光素酶多肽缀合或结合。第一荧光素酶多肽可与第一底物特异性反应以产生第一发光信号，并且第二荧光素酶多肽可与第二底物特异性反应以产生不同于第一发光信号的第二发光信号。第一荧光素酶多肽不与第二底物交叉反应并且第二荧光素酶多肽不与第一底物交叉反应。
荧光素酶多肽和底物
本文公开的荧光素酶多肽能够与其正交底物反应以产生高信号强度并且足够稳定。优选地，荧光素酶相对较小(例如，小于 30 KDa)，以便它们可容易地被工程化，例如，与本文公开的亲和试剂偶联或融合。合适的荧光素酶多肽的非限制性示例包括Gaussia荧光素酶(GLuc，SEQ ID NO:1)和NanoZac荧光素酶(Nluc，SEQ ID NO:2)。可使用的荧光素酶的其他非限制性示例包括 Nanoluc (Promega) 和 NanoKaz (NanoLight Technology)，它们也包含 SEQ ID NO: 2 的序列。如表 1 所示，与萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶相比，Gaussia 荧光素酶 (GLuc)、Nanoluc 荧光素酶和 NanoKaz 荧光素酶在细胞中具有高得多的信号强度和稳定性。因此，这些荧光素酶适用于本文公开的测序方法。
表1：荧光素酶多肽的示例
来自桡足类 Gaussia princeps的 Gaussia荧光素酶(GLuc)为约20kDa。GLuc 催化腔肠素的氧化以产生 470 nm 的强蓝光。在一些实施方案中 ， 本公 开 中 使 用 的Gluc 具 有 以 下 序 列 ：MKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKELEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGEAIVDIPEIP
GFKDLEPLEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGDHHHHHH(SEQ ID NO:1)。其含有相对于野生型Gluc的两个突变，M43L和M110L(下划线)。J.Welsh,Biochemical and Biophysical Research Communications 389(2009)563–568，其全部内容以引用方式并入本文。与野生型Gluc相比，Gluc(SEQ ID NO:1)具有更长的保质期并保持与野生型Gluc基本上相同的信号强度。
Nluc是另一种小(约19.1kDa)且高度稳定的荧光素酶。Nluc还能够在与其正交底物反应时产生强发光。Nluc源自深海虾Oplophorus gracilirostris，其通过执行诱变优化该物种中野生型酶的发光输出。参见England et al.,Bioconjug.Chem.2016may 18 27(5):1175-1187，整个公开内容以引用方式并入本文。工程化Nluc能够产生比海肾荧光素酶(Rluc)高150倍的信号。在一些实施方案中，该方法中使用的Nluc具有以下序列：MVFTLEDFVGDWRQTAGYNLDQVLEQGGVSSLFQNLGVSVTPIQRIVLSGENGLKIDIHVIIPYEGLSGDQMGQIEKIFKVVYPVDDHHFKVILHYGTLVIDGVTPNMIDYFGRPYEGIAVFDGKKITVTGTLWNGNKIIDERLINPDGSLLFRVTINGVTGWRLCERILA(SEQ ID NO:2)，如美国专利9,315,783和US9,404,145中所述。
无显著交叉底物反应性
如下所述，至少两种荧光素酶用于本文所公开的单色测序方案的各种方法中。这些荧光素酶不具有显著交叉底物反应性，因此可使测序读数的噪音最小化。术语“不具有显著交叉底物反应性”、“或具有最小串扰”是指荧光素酶多肽(例如，第一荧光素酶多肽)与其正交底物(例如，第一底物)反应产生的信号强度比第一荧光素酶多肽与相同条件下同一反应中使用的不同底物(例如，第二底物)反应产生的信号强度高至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或至少500倍。因此，可用于本发明的正交对的非限制性示例包括Gaussia荧光素酶多肽(Gluc)/腔肠素(CTZ)和NanoZac荧光素酶多肽(Nluc)/氟化腔肠素(f-CTZ)。如下图3所示，Gluc在与Nluc底物f-CTZ(目录号345，Nanolight Technology)反应时仅示出约2％的背景信号。然而Nluc在与Gluc底物CTZ反应时仅示出约10％的背景信号。这证明这两种酶不具有显著交叉底物反应性。
由荧光素酶与其底物反应产生的信号可使用任何能够检测发光的方法或装置(例如发光计)来检测。在一些实施方案中，萤光素酶与底物一起温育足够量的时间以允许在检测之前产生信号。信号产生的步骤可持续5分钟至30分钟，例如约10分钟。
应当理解，其他Gluc变体也可用于本发明，前提条件是它们具有与Gluc(SEQ IDNO:1)基本上相同的活性。同样，其他Nluc变体也可用于本发明，前提条件是它们具有与Nluc(SEQ ID NO:2)基本上相同的活性。如本文所用，术语“基本上相同”在涉及两种荧光素酶的活性时意指当与相同底物反应时，由两种荧光素酶产生的信号差异比较小的信号值小40％、小30％、小20％、小10％。例如，与Gluc活性基本上相同的荧光素酶将与CTZ反应生成氧化的CTZ，而与Nluc活性基本上相同的荧光素酶将与f-CTZ反应生成氧化的f-CTZ。在一方面，Gluc变体包含与SEQ ID NO:1的子序列或全长序列相同或基本上相同的序列。一方面，Nluc变体包含与SEQ ID NO:2的子序列或全长序列相同或基本上相同的序列。氨基酸序列在其与相应序列的对应部分具有至少70％、至少80％或至少90％的序列同一性时，与参考序列(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)基本上相同。在一些实施方案中，Gluc变体具有与SEQ ID NO:1相差不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过8个、不超过10个氨基酸残基并与Gluc(SEQ ID NO:1)具有基本上相同的活性的序列。在一些实施方案中，Nluc变体具有与SEQ ID NO:2相差不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过8个、不超过10个氨基酸残基并与Nluc(SEQ ID NO:2)具有基本上相同活性的序列。
底物
荧光素酶多肽及其特定底物在本文中称为正交酶/底物对或本公开中的正交对。在一个实施方案中，Gluc的正交底物是CTZ。在一个实施方案中，Nluc的正交底物是f-CTZ，其具有以下化学结构(结构I)：
基底储备缓冲液
荧光素酶底物通常在溶剂或储备缓冲液中制备。对于不溶于水的底物，如CTZ和f-CTZ，可使用各种有机溶剂。可用于制备本文公开的底物的有机溶剂的非限制性示例包括乙醇、丙二醇、甲醇、DMSO及其不同比率的混合物。在一种实施方案中，有机溶剂包含50体积/体积％乙醇和50体积/体积％丙二醇。具有这种配方的储备缓冲液中的底物已证明具有最佳的溶解度、稳定性和信号强度。
荧光素酶底物反应缓冲液
在一些实施方案中，本文所使用的底物(例如，CTZ和f-CTZ)可能对氧化敏感。可使用各种方法来防止底物氧化并确保最佳信号产生。这些方法包括但不限于向荧光素酶底物反应缓冲液中添加一种或多种抗氧化剂(例如抗坏血酸钠)；添加可增加底物缓冲液粘度的试剂(例如，PEG3350)；和/或维持底物缓冲液的pH值在既适用于荧光素酶底物反应又维持底物稳定性的范围内。在一些实施方案中，pH在pH 7.5至8.5的范围内，例如pH 8。在一个特定实施方案中，反应缓冲液具有以下组分：
50mM Tris-HCl,pH＝8.0
0.5M NaCl
0.1％20(或山梨醇酯20)
0.1M抗坏血酸钠
1％(w/v)PEG 3350
亲和试剂
亲和试剂可用于检测是否存在掺入核酸3'端(GDS的3'端)的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸(“NLRT”)。3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸可包含选自由腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)的核碱基及其类似物。基于掺入NLRT的结构特征，亲和试剂可特异性结合NLRT，例如，亲和剂可特异性结合到具有特定碱基和/或特定可逆保护基团的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。
在一种方法中，亲和试剂特异性结合到核碱基，并且部分基于是否存在3'-OH基团来区分不同的碱基(A、T、G、C)。在这种方法中，亲和试剂将GDS的3'端带有3'-OH的核苷酸与掺入GDS内部(不在3'端)的核苷酸区分开来。在一些情况下，亲和试剂可识别特定的核碱基，并且还区分是否存在3'-OH基团，这可将掺入的NLRT鉴定为具有特定核碱基的3'端核苷酸。
在一种方法中，亲和试剂识别包含保护基团的表位但不区分碱基。例如，考虑四个RT保护基团[A.叠氮甲基、B.2-(氰基乙氧基)甲基、C.3'-O-(2-硝基苄基)和D.3'-O-烯丙基]，可产生区分四个保护基团的亲和试剂。出于说明的目的，考虑下文标记为A到D的脱氧鸟嘌呤类似物，可选择一种亲和试剂，该亲和试剂仅识别一个NLRT，而不识别其他三个NLRT。
A.3'-O-叠氮甲基-2'-脱氧鸟嘌呤
B.3’-O-2-(氰基乙氧基)甲基-2’-脱氧鸟嘌呤
C.3'-O-(2-硝基苄基)-2'-脱氧鸟嘌呤
D.3'-O-烯丙基-2'-脱氧鸟嘌呤
本文亲和试剂的示例包括抗体(包括抗体的结合片段、单链抗体、双特异性抗体)、适配体、结蛋白、亲和体、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G-蛋白)，或以适当的特异性和亲和力结合掺入的NLRT的任何其他已知的试剂。WO2020097607中描述了亲和试剂(包括抗体)的非限制性示例，其全部公开内容以引用方式并入本文。
作为亲和试剂的抗体
在一些实施方案中，亲和试剂是可特异性结合NLRT并区分包含不同核碱基的NLRT的抗体。如本文所用，“抗体”意指免疫球蛋白分子或组合物(单克隆抗体和多克隆抗体)，以及基因工程化形式，诸如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体、异源缀合抗体(诸如双特异性抗体)和抗体片段。抗体可来自重组来源和/或在动物(包括但不限于转基因动物)中产生。
术语“抗体”包括“抗体片段”，其包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体、纳米抗体、双抗体及其多聚体和双特异性抗体片段。可使用常规技术将抗体片段化。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体来生成F(ab')2片段。可处理生成的F(ab')2片段以减少二硫键桥接以产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可导致Fab片段的形成。Fab、Fab’和F(ab’)2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微抗体、双抗体、双特异性抗体片段和其他片段也可通过重组技术合成。抗体可以是任何有用的同种型，包括IgM和IgG，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，亲和试剂是微抗体。微抗体是工程化抗体构建体，其由融合到铰链区和免疫球蛋白分子的CH3结构域的天然抗体的可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)组成。因此，微抗体是在单个蛋白质链中编码的完整抗体的小型式，该单个蛋白质链保留抗原结合区、允许组装成二价分子的CH3结构域和抗体铰链以适应二硫键的二聚化。也可使用单域抗体(sdAb)。单域抗体或纳米抗体(Ablynx)是具有单个单体可变抗体结构域的近似抗体片段。单个结构域抗体选择性地结合到特异性抗原，并且比常规抗体更小(MW 12-15kDa)。
作为亲和试剂的适配体
在一些实施方案中，亲和试剂可以为特异性结合到NLRT并区分具有不同核碱基的NLRT的适配体。适配体是与特定靶分子结合的寡核苷酸或肽分子。适配体可分为：(a)DNA或RNA或XNA适配体，其由(通常是短的)寡核苷酸链组成；(b)肽适配体，其由两端附接到蛋白质支架上的一个(或多个)短的可变肽结构域组成。
核酸适配体是通过反复轮次的体外选择或等效地SELEX(指数富集配体进化技术)工程化以结合各种分子靶如NLRT的核酸种类。例如，可以通过SELEX从大型寡核苷酸库中选择对靶NLRT具有亲和力的适配体，SELEX是一个迭代过程，其中丢弃非结合适配体并扩展与提出的靶结合的适配体。有时最初的阳性选择轮次之后进行阴性选择。这提高了所得适配体候选物的选择性。在该过程中，靶NLRT固定到亲和柱上。应用适配体库并允许结合。弱结合剂被洗掉，并且结合的适配体被洗脱并使用PCR扩增。然后将扩增的适配体库重新应用于靶。在越来越严格的条件下重复该过程多次，直到获得具有期望选择性和亲和力的适配体。参见Jayasena,et al.,Clinical Chemistry 45:1628-1650,1999。可使用不同的系统进行肽适配体选择，其包括酵母双杂交系统。肽适配体也可选自通过噬菌体展示和其他表面展示技术(诸如mRNA展示、核糖体展示、细菌展示和酵母展示)构建的组合肽文库。这些实验程序也称为生物淘选。参见，Reverdatto et al.,2015,Curr.Top.Med.Chem.15:1082-1101。
作为亲和试剂的亲和体
在一些实施方案中，亲和试剂是可特异性结合到NLRT并区分具有不同核碱基的NLRT的亲和体。亲和体是小(12–14kDa)、高度稳定的蛋白质，其以与抗体相似的特异性和亲和力结合其靶分子。这些蛋白质共享位于反平行β片层顶部的α螺旋的共同三级结构。亲合体蛋白展示两个肽环和N端序列，它们可全部随机化，以与单克隆抗体类似的方式以高亲和力和特异性结合到期望的靶蛋白。蛋白质支架对两种肽的稳定性限制了肽可能采用的构象，其与游离肽库相比增加了结合亲和力和特异性。
可通过使用噬菌体展示库来选择特异于NLRT的亲和体，这些文库被筛选以鉴定高特异性结合到靶NLRT和高结合亲和力(例如在nM范围内)的亲和体蛋白。许多不同的标签、标记和融合蛋白(如荧光团)已与亲和蛋白缀合以用于各种应用。参见美国专利8,481,491、美国专利8,063,019和WO 2009/136182，其以引用方式并入本文。还参见Crawford et al.,Brief Funct.Genomic Proteomic,2:72-79,2003。
作为亲和试剂的结蛋白
在一些实施方案中，亲和试剂是可特异性结合到NLRT并区分具有不同核碱基的NLRT的结蛋白。“结蛋白”或“抑制剂胱氨酸结”(ICK)是包含三个二硫键桥接的蛋白质结构基序。连同它们之间的多肽部分，两个二硫键形成一个环，第三个二硫键(连接序列中的第三个和第六个半胱氨酸)通过该环，从而形成结。可使用蛋白质工程将新的结合表位引入天然结蛋白中，并且结蛋白已被工程化以靶向广泛的靶。一种生产特异于NLRT的结蛋白的方法是使用酵母表面展示和荧光激活细胞分选来创建和筛选结蛋白文库。关于生产对靶NLRT具有选择性和高亲和力的结蛋白以及标记此类结蛋白的信息参见Kintzing and Cochran,Curr.Opin.Chem.Biol.34:143–150,2016；Moore et al.,Drug Discovery Today:Technologies 9(1):e3–e11,2012；以及Moore and Cochran,Meth.Enzymol.503:223-51,2012。
荧光素酶偶联亲和试剂
如本文所公开的荧光素酶可与如下所述的亲和试剂偶联。在其正交底物存在的情况下，荧光素酶偶联亲和试剂结合到引物延伸产物并产生可检测的发光信号。在一些实施方案中，本文公开的荧光素酶偶联亲和试剂是直接或间接(例如通过接头)、共价或非共价地偶联到荧光素酶的亲和试剂。在一些实施方案中，荧光素酶偶联的亲和试剂是包含荧光素酶多肽和亲和试剂的融合蛋白。在一种方法中，荧光素酶多肽直接融合到作为多肽的亲和试剂(“蛋白质亲和试剂”)。在另一种方法中，荧光素酶多肽共价连接到亲和试剂。在另一种方法中，荧光素酶多肽非共价结合至亲和试剂。例如，亲和试剂可包含生物素基团，其结合到荧光素酶多肽上的链霉亲和素基团。
与荧光素酶多肽共价连接的亲和试剂
在一些实施方案中，本文使用的亲和试剂通过接头共价连接至荧光素酶多肽。蛋白质亲和试剂(例如抗体)可以通过多种方式进行共价修饰，以适应特定测定的目的。用于缀合的蛋白质(例如抗体)上的官能团包括三个靶中的一个：(1)伯胺(–NH2)；(2)巯基(–SH)；以及碳水化合物(糖)。伯胺出现在赖氨酸残基和每条多肽链的N端，并且它们数量众多且分布在整个抗体中。巯基出现在半胱氨酸残基上，并作为稳定整个分子结构的二硫键形式存在。可选择性地还原铰链区二硫化物以使游离巯基可用于靶标记。碳水化合物(糖)可主要出现在抗体(IgG)的Fc区。在一些情况下，这些含有顺式二醇的多糖部分中的成分糖也可被氧化以产生用于偶联的活性醛(-CHO)。US-2018-0223358-A1中概述了用于抗体标记的各种化学方法，其全部内容以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，亲和试剂通过SMCC接头与荧光素酶(例如，Nluc)偶联。SMCC具有以下结构(结构II)：
在本公开的不同位置，当连接两个分子时，SMCC也称为SMCC接头(例如，连接荧光素和抗体的SMCC接头)。在一些实施方案中，亲和试剂是NLRT抗体，其用还原剂(例如，三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP))处理以打开抗体中的铰链区二硫化物并产生巯基(-SH)。在一些实施方案中，抗体在与荧光素酶多肽缀合之前用还原剂处理，并且抗体与还原剂的摩尔比范围为1:1至1:5。抗体与荧光素酶的偶联示于图7A和图7B中。SMCC经由在如上形成的抗体上的–SH基团和SMCC接头上的马来酰亚胺基团之间形成的共价键连接至抗体。同一个SMCC分子也经由共价键连接到荧光素酶上，并且共价键在SMCC接头上的-NHS基团和荧光素酶上的伯胺基团之间形成。在一些实施方案中，亲和试剂经由SMCC接头偶联至Nluc。在一些实施方案中，亲和试剂经由SMCC与Gluc偶联。
在一些实施方案中，亲和试剂与荧光素酶多肽(诸如Gluc或Nluc，其已用Traut试剂处理)偶联。在一些实施方案中，亲和试剂通过下列偶联到荧光素酶多肽：i)荧光素酶上的-SH基团与SMCC上的马来酰亚胺基团之间的共价键，和ii)SMCC的-NHS基团与亲和试剂上的-NH2基团之间的共价键。如图11C和11D所示，用Traut试剂处理荧光素酶(Gluc或Nluc)显著增加荧光素酶的信号强度和稳定性，Gluc增加60％，Nluc增加100％。
在一些实施方案中，萤光素酶多肽与抗体之间的摩尔比范围为1:3至1:20，例如，约1:10。
与荧光素酶多肽融合的亲和试剂
在一些实施方案中，荧光素酶多肽与蛋白质亲和试剂融合以形成重组荧光素酶-亲和试剂融合蛋白。在一些实施方案中，蛋白质亲和试剂是抗体或抗体片段，例如单链Fv片段(ScFv)。用于将荧光素酶多肽序列连接至靶蛋白的多种方法在本领域中是已知的。参见，例如，Wouters et al.,2020,“Bioluminescent Antibodies through Photoconjugationof Protein G–Luciferase Fusion Proteins”Bioconjugate Chem.31,3,656–662。
通过非共价方式与荧光素酶多肽偶联的亲和试剂
在一些实施方案中，亲和试剂通过非共价方式，例如通过两个结合配偶体的相互作用，偶联至荧光素酶。结合配偶体的非限制性示例包括链霉亲和素和生物素、抗原和抗体、次氮基乙酸镍复合物和组氨酸标签。例如，荧光素酶可与生物素或链霉抗生物素缀合，亲和试剂可与链霉抗生物素或生物素缀合，然后荧光素酶多肽通过生物素和链霉抗生物素在两者上的结合而与亲和试剂偶联。
结合配偶体与亲和试剂之间的比例可有所不同。在一些方法中，亲和试剂与两种蛋白质结合配偶体中的一者的比例可以在1:5至1:20，例如1:6至1:15、1:8至1:12的范围内，或约1:10。在一个示例中，使用抗体：生物素的比例为1:10的生物素标记抗体产生的信号对于单色测序方案来说足够高。参见图15。
荧光素酶偶联的亲和试剂组
术语“荧光素酶偶联的亲和试剂组”是指一组两种或更多种亲和试剂，其各自特异性识别NLRT之一。在一些方法中，本文公开的方法和组合物使用一组荧光素酶偶联的亲和试剂，其中至少两种亲和试剂与两种不同的荧光素酶多肽偶联。该组中使用的两种不同的荧光素酶多肽不具有显著的交叉底物反应性。
在一些方法中，荧光素酶偶联亲和试剂组包含四种荧光素酶偶联亲和试剂：偶联到第一荧光素酶多肽的第一亲和试剂、偶联到第二荧光素酶多肽的第二亲和试剂、偶联到第一萤光素酶多肽和第二萤光素酶多肽两者的第三亲和试剂，以及既不偶联到第一萤光素酶多肽也不偶联到第二萤光素酶多肽的第四亲和试剂。第一荧光素酶多肽不同于第二荧光素酶多肽。在一些实施方案中，第三亲和试剂共价连接至第一荧光素酶多肽但非共价偶联至第二荧光素酶多肽。例如，如图16所示，第三亲和试剂可通过SMCC接头共价连接至Nluc并且还共价连接至生物素。与第三亲和试剂缀合的生物素基团可结合与Gluc缀合的链霉亲和素，使得第三亲和试剂可与两种荧光素酶多肽偶联。
在一些方法中，第一荧光素酶多肽是Gluc并且第二荧光素酶多肽是Nluc。在一个特定实施方案中，Gluc具有SEQ ID NO:1的序列并且Nluc具有SEQ ID NO:2的序列。
荧光素酶偶联结合对
在一些实施方案中，萤光素酶通过结合对被募集到掺入到GDS末端的NLRT。结合对由两个结合配偶体组成，一个与荧光素酶缀合，另一个与NLRT缀合。结合对的非限制性示例包括链霉亲和素和生物素、抗原和抗体、次氮基乙酸镍复合物和组氨酸标签等。例如，荧光素酶可与链霉亲和素缀合，NLRT可与生物素缀合，并且荧光素酶多肽通过生物素和链霉亲和素的结合被募集到NLRT。
在一些实施方案中，测序反应包括NLRT组。NLRT组包括第一、第二、第三和第四NLRT。在反应中使用至少两种荧光素酶，包括第一荧光素酶和第二荧光素酶。第一NLRT通过第一结合对与第一荧光素酶结合，一个结合配偶体与第一荧光素酶缀合，另一结合配偶体与第一NLRT缀合。第二NLRT通过第二结合对与第二荧光素酶结合，一个结合配偶体与第二荧光素酶缀合，另一结合配偶体与第二NLRT缀合。第三NLRT中的一些与第一结合对的结合配偶体缀合，其通过第一结合对与第一荧光素酶结合。第三NLRT中的一些与第二结合对的结合配偶体缀合，其通过第二结合对与第二荧光素酶结合。
在一些实施方案中，第一荧光素酶是Gluc，而第二荧光素酶是Nluc。在一些实施方案中，第一结合对是链霉亲和素和生物素，而第二结合对是抗原和特异性识别该抗原的抗体。在一些实施方案中，抗原是地高辛并且抗体是抗地高辛抗体。
一个说明性示例在实施例5中，其中3'-叠氮甲基-dATP与生物素缀合，3'-叠氮甲基-dCTP与地高辛缀合，3'-叠氮甲基-dUTP中的一些与生物素缀合，并且3'-叠氮甲基-dUTP中的一些与地高辛缀合。3'-叠氮甲基-dUTP既不与生物素缀合也不与地高辛缀合。在测序反应中，链霉亲和素缀合的Gluc与生物素标记的3'-叠氮甲基-dATP和生物素标记的3'-叠氮甲基-dUTP结合，并且抗地高辛抗体缀合的Nluc与地高辛标记的3'-叠氮甲基-dCTP和地高辛标记的3'-叠氮甲基-dUTP结合。Gluc和Nluc与NLRT的结合可通过它们各自的正交底物来检测。
固定亲和试剂
可将亲和试剂(例如荧光素酶偶联的亲和试剂)固定在固体载体(例如阵列)上，待测序的DNA模板固定在该固体载体上。可使用各种方式来实现该目的。在一种方法中，亲和试剂在GDS端处与NLRT直接结合。在一种方法中，亲和试剂结合到已被修饰以包括结合配偶体的NRLT，并且所述结合配偶体结合到亲和试剂。在另一种方法中，亲和试剂结合到结合配偶体并且所述结合配偶体结合到NRLT。固定装置的其他变体可由本领域技术人员容易地理解，并且也涵盖在本公开内容中。
试剂盒
试剂盒中的荧光素酶偶联亲和试剂可以以试剂盒形式、作为混合物或在单独的容器中提供。本文公开的试剂盒可包括荧光素酶偶联的亲和试剂或如上所述的亲和试剂组。该试剂盒可另外包含NLRT和NLRT组。例如，试剂盒可包括但不限于：(a)NLRT或NLRT组，该NLRT组包括一个、两个、三个、四个或更多不同的单独NLRT；以及(b)相应的亲和试剂或亲和试剂组，该亲和试剂组包括一种、两种、三种、四种或更多种亲和试剂，每种亲和试剂对一种NLRT具有特异性，并且亲和试剂中的至少两种与两种荧光素酶多肽偶联。该试剂盒还可包括包装材料和/或使用说明。这两种荧光素酶多肽不具有显著的交叉底物反应性。在一些实施方案中，该试剂盒还包含用于每种荧光素酶多肽的正交底物，例如，用于Gluc偶联亲和试剂的CTZ和用于Nluc偶联亲和试剂的f-CTZ。在一些实施方案中，试剂盒还包含抗氧化剂以防止第一底物、第二底物或两种底物的氧化。在一些实施方案中，该试剂盒还包含Traut试剂。
在一些实施方案中，试剂盒包含与第一亲和试剂或第二亲和试剂结合的次级亲和试剂。在一些实施方案中，第一亲和试剂或第二亲和试剂通过结合至共价连接至荧光素酶多肽的次级亲和试剂而偶联至荧光素酶。在一些实施方案中，第一亲和试剂和/或第二亲和试剂是抗体。
共价连接到荧光素酶多肽的亲和试剂的生产
在一个实施方案中，亲和试剂是识别NLRT之一的抗体。抗体可通过多种方式共价缀合至荧光素酶多肽。在一些方法中，抗体可以通过SMCC接头与荧光素酶多肽共价缀合。在这种方法中，产生荧光素酶-亲和试剂缀合物的方法可包括用还原剂处理亲和试剂(例如，NLRT抗体)以在抗体上产生游离-SH基团。在一些实施方案中，还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)。期望将还原剂和接头(SMCC，Traut's)的比例保持在最佳比例，以便从荧光素酶亲和试剂缀合物获得高信号强度。在一些实施方案中，还原剂与接头的比例在1:150至1:3000，例如，1:200至1:2000，或1:1000或1:1800的范围内。在一个特定的实施方案中，将还原剂与接头的比例保持在1:1500能够实现最高的SH标记程度和来自测序成像仪的最高信号。参见图12A-12C。然后，用还原剂处理的抗体以通过抗体上的–SH基团和SMCC上的马来酰亚胺基团之间形成的共价键连接到SMCC；SMCC还经由SMCC上的-NHS基团与荧光素酶上的伯胺(-NH2)基团之间形成的共价键与荧光素酶多肽连接，从而形成抗体-荧光素酶多肽缀合物。在一些实施方案中，抗体通过SMCC与Nluc偶联。
在一些方法中，荧光素酶多肽在与合适的接头(例如SMCC)缀合之前首先用硫醇化试剂处理。用硫醇化试剂处理在荧光素酶多肽上产生游离巯基，并且引入这些巯基可提高荧光素酶的酶活性。在一些实施方案中，硫醇化试剂是环状硫代亚胺酸酯化合物。在一些实施方案中，硫醇化试剂是2-亚氨基硫烷，通常也称为Traut剂。
在一个说明性示例中，如图11A所示，用Traut试剂处理荧光素酶多肽(例如Gluc)以在荧光素酶上产生游离的–SH基团。NLRT抗体用SMCC接头处理，使得在抗体上的伯胺和SMCC上的-NHS基团之间形成共价键，如图11B所示。Traut试剂与荧光素酶的反应(1)和抗体与SMCC的反应(2)可以任意顺序进行，也可以同时进行。将经Traut试剂处理的荧光素酶与经SMCC处理的抗体混合，以使荧光素酶多肽上的-SH基团与SMCC上的马来酰亚胺基团形成共价键，从而形成荧光素酶抗体缀合物。当在没有Traut试剂处理的情况下用SMCC接头将Gluc与NLRT结合时，这种方法对于生产Gluc缀合的NLRT抗体特别有用。参见实施例3。
一般测序过程
本文公开的方法和组合物可与多种测序方法组合使用，其包括使用未标记的可逆终止子核苷酸的合成测序(SBS)。SBS方法是众所周知的，其包括但不限于本文引用的参考文献中所描述的方法，将每篇文献以引用方式并入以用于所有目的。通常，SBS确定固定在表面的位置处的单链核酸模板的序列。如本领域普通技术人员所知，通常在表面的位置处存在多个模板的拷贝。就说明而非限制而言，模板拷贝最通常使用DNA纳米球(DNB)方法或桥接PCR方法来产生。DNB方法产生具有模板的许多拷贝的单链多联体(例如，基因组DNA序列和相邻的引物结合位点)。桥接PCR方法导致模板分子的克隆簇(例如，基因组DNA序列侧接可用作引物结合位点的衔接子)。在桥接PCR中，模板核酸的两条链都可以作为单独单链存在。应当理解，本文对“模板”核酸(即，单数语法形式)或等同术语的提及也指在底物上给定位置处的模板的多个拷贝。还应认识到，尽管本文可能提及确定模板核酸的序列或模板核酸序列(即，单数语法形式)，但预期本发明的方法使用包含多(通常数亿)个位置，该位置包含一个或多个模板核酸分子。
两种标签，单色测序
使用两种不同标记的亲和试剂的本发明方法允许同时递送不同的NLRT亲和试剂，每种亲和试剂识别具有不同核碱基的NLRT。在一些实施方案中，两种不同标记的亲和试剂是指两种萤光素酶多肽；不仅两种荧光素酶多肽在与其对应的正交底物反应时各自可产生高强度发光信号，而且它们也不具有显著的交叉底物反应性串扰。因此，当与两种亲和试剂偶联时，每种亲和试剂识别具有不同核碱基的NLRT，至少两种不同的核碱基可被区分。
在一个实施方案中，双标记、单色测序方法包括：提供多个核酸模板，每个模板包含引物结合位点以及与引物结合位点相邻的靶核酸序列；通过使用一组NLRTs和相应的一组亲和试剂，将引物与所述引物结合位点杂交并在一个或多个合成测序循环中每个循环将单个引物延伸一个核苷酸，对多个不同的核酸模板进行测序反应，所述亲和试剂例如：(i)第一NLRT和特异性结合到第一NLRT并偶联第一萤光素酶多肽的第一亲和试剂；(ii)第二NLRT和特异性结合到第二NLRT并与第二荧光素酶多肽偶联的第二亲和试剂；(iii)第三NLRT和特异性结合到第三NLRT并与第一荧光素酶多肽和第二荧光素酶多肽偶联的第三亲和试剂；(iv)第四NLRT和特异性结合到第四NLRT且未标记的(即，既不与第一荧光素酶多肽偶联也不与第二荧光素酶多肽偶联)第四亲和试剂。在合成测序的每个循环中，该方法包括1)使阵列与NLRT组和NLRT亲和试剂组接触，2)使阵列与第一底物接触，3)检测由第一亲和试剂裂解第一底物产生的第一发光信号；4)移除第一底物；5)将阵列与第二底物接触；6)检测由第二亲和试剂裂解第二底物产生的第二发光信号；7)通过检测标记的存在和强度(或不存在)来确定靶核酸序列，从而确定检测位置处的NLRT的身份。
在一些实施方案中，将第一荧光素酶和第二荧光素酶以一种混合物的形式添加到测序流动池中，并添加第一底物。第一荧光素酶与第一底物反应并产生第一信号。在检测到第一信号后，将第一底物从流动池中洗掉，然后加入第二底物。第二荧光素酶与第二底物反应并产生第二信号。第二信号也被检测到。然后基于第一信号和第二信号是否存在来确定流动池的每个位置处的NLRT类型。
在一些实施方案中，顺序添加第一荧光素酶和第二荧光素酶。在一些情况下，将第一荧光素酶和第一底物添加至流动池以产生第一信号。在检测到第一信号后，将第二荧光素酶和第二底物添加到流动池中。产生并检测第二信号。
任选地，在使阵列与第二底物和/或第二荧光素酶接触之前，将选择性失活剂(如下文进一步讨论的)添加至阵列或测序流动池，并且该试剂以可选择性地使第一荧光素酶而不是第二荧光素酶失活的量添加。
在一个实施方案中，第一荧光素酶是Gluc，第一底物是CTZ，第二荧光素酶是Nluc，第二底物是f-CTZ。
在一些实施方案中，为了进一步减少与两种荧光素酶多肽之间的交叉底物反应性相关的测序错误，在检测并记录来自第一荧光素酶多肽(例如，Gluc)的信号后，将失活剂应用于测序阵列以使第一萤光素酶多肽失活。然后将第二底物(第二荧光素酶的正交底物)添加到阵列中，然后检测由第二荧光素酶(例如，Nluc)产生的第二发光信号。
在优选实施例中，试剂的失活活性是选择性的。也就是说，它使第一荧光素酶多肽失活但基本上不损害第二荧光素酶多肽的酶活性。如本文所用，术语“失活”，当涉及对荧光素酶的处理时，是指如通过荧光素酶多肽裂解其正交底物所产生的发光信号所测量的，与处理前的荧光素酶的活性相比，处理后荧光素酶的活性降低至少60％、至少70％、至少80％。当提及处理对荧光素酶的酶活性的影响时，术语“基本上不损害”是指在处理后，荧光素酶多肽保留处理前其活性的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。
适用于本发明的选择性失活剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙胺、三羧乙基膦(TCEP)。适用于选择性地使第一萤光素酶失活的试剂(例如，DTT)的合适浓度可以在0.001M至2M的范围内，例如，0.01M至0.5M、0.05M至1M、0.07M至0.5M、或约0.1M。在一个示例性测定中，Gluc萤光素酶在用DTT处理后几乎完全失去酶活性(图18B，其示出在DTT处理后信号减少超过95％)。相比之下，Nluc对DTT处理具有抗性(图18A，其示出DTT处理不损害Nluc的活性，DTT处理后的信号不降低而略有增加)。
因此，在一些实施方案中，在测量来自第一荧光素酶的信号(第一发光信号”)之后，以使第一荧光素酶(例如，Gluc)选择性失活方面有效的浓度将选择性失活试剂(例如，二硫苏糖醇(DTT))添加到洗涤缓冲液。然后添加第二底物并被第二荧光素酶切割。这产生可检测到的第二发光信号。
反应混合物
各种亲和试剂、NLRT、DNA聚合酶和/或合适的缓冲液可以作为用于核酸测序的反应混合物的组分存在。示例性反应混合物包括但不限于含有下列的那些：(a)模板核酸；(b)聚合酶；(c)寡核苷酸引物；(d)NLRT，或具有结构不同核碱基的NLRT的混合物；(e)荧光素酶偶联亲和试剂的混合物，每一种都特异性识别如上所述的NLRT。本发明的示例性测序反应混合物包括但不限于包含固定在阵列上不同位置处的多个不同模板核酸的阵列；(b)一种或多种DNA聚合酶；(c)一种或多种寡核苷酸引物；(d)和一种或多种NLRT；以及(e)两种亲和试剂，其各自偶联至两种荧光素酶多肽中的至少一种，如上所述。本发明的示例性测序反应混合物包括但不限于，包含固定在阵列上不同位置处的多个不同模板核酸的阵列；(b)生长DNA链(GDS)；以及(c)一种或多种荧光素酶偶联的亲和试剂(例如，如上所述的亲和试剂组)。在一些实施方案中，GDS包含3'NLRT。在一些实施方案中，试剂盒还包含选择性地使第一荧光素酶多肽失活的失活剂，例如DTT。
参考以下非限制性实验实施例将进一步理解本发明。
示例性实施方案
实施方案1.一种将不同标记的亲和试剂固定在阵列上的位置处来对应阵列上的位置的方法，所述方法包括
i)提供位置阵列，其中所述阵列包括第一位置和第二位置，
其中第一亲和试剂固定在所述第一位置的至少一些处，并且所述第二亲和试剂固定在所述第二位置的至少一些处；
其中所述第一亲和试剂与第一荧光素酶多肽缔合，所述第二亲和试剂与第二荧光素酶多肽缔合，
其中所述第一荧光素酶多肽可以与第一底物反应以产生第一发光信号，
其中所述第二荧光素酶多肽可以与第二底物反应以产生第二发光信号，
其中所述第一底物与所述第一荧光素酶多肽正交并且所述第二底物与第二荧光素酶多肽所述正交，并且
其中所述第一荧光素酶多肽不与所述第二底物交叉反应并且所述第二荧光素酶多肽不与所述第一底物交叉反应，
ii)使所述阵列与所述第一底物接触并在固定所述第一亲和试剂的位置处检测所述第一发光信号，
iii)使所述阵列与所述第二底物接触并在所述第二亲和试剂固定的位置处检测所述第二发光信号，和
iii)如果在位置检测到所述第一发光信号，则确定该位置是用第一亲和试剂固定，或
如果在位置检测到所述第二发光信号，则确定该位置是用所述第二亲和试剂固定，从而用不同标记的亲和试剂对应了阵列上的位置。
实施方案2.根据实施方案1所述的方法，其中所述第一底物是f-CTZ并且所述第一荧光素酶多肽是Nluc。
实施方案3.根据实施方案1-2中任一项所述的方法，其中所述第二底物是f-CTZ并且所述第二荧光素酶多肽是Nluc。
实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述第一底物为腔肠素(coeleterazine，CTZ)并且所述第二底物为f-CTZ。
实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽是Gaussia荧光素酶多肽(Gluc)并且所述第二荧光素酶多肽是NanoZac荧光素酶多肽(Nluc)。
实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述阵列包括第三位置和第四位置，第三亲和试剂固定在所述第三位置中的至少一些处，并且第四亲和试剂固定在所述第四位置中的至少一些处，
其中所述第三亲和试剂与所述第一萤光素酶多肽和所述第二萤光素酶多肽两者缔合，并且
其中所述第四亲和试剂与所述荧光素酶多肽都不缔合，
其中如果从位置检测到所述第一发光信号，则确定所述第一亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测到所述第二发光信号，则确定所述第二亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测到所述第一发光信号和所述第二发光信号两者，则确定所述第三亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测不到所述第一发光信号和所述第二发光信号，则确定所述第四亲和试剂固定在该位置处。
实施方案7.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中在检测所述第二发光信号之前检测所述第一发光信号，并且
其中在检测到所述第一发光信号之后但在检测到所述第二发光信号之前添加失活剂，并且
其中所述失活剂选择性地使所述第一荧光素酶多肽失活。
实施方案8.根据实施方案7所述的方法，其中所述失活剂是二硫苏糖醇(DTT)。
实施方案9.根据实施方案1-8中任一项的方法，其中所述第一亲和试剂或所述第二亲和试剂特异性结合到3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，所述3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)的核碱基及其类似物。
实施方案10.根据实施方案9所述的方法，所述方法还包括如果确定一种类型的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸的亲和试剂被固定在所述位置处，则鉴定出与所述亲和试剂缔合的所述类型的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。
实施方案11.根据实施方案1所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽经由接头与所述第一蛋白质缀合，和/或
其中所述第二荧光素酶多肽经由接头与所述第二蛋白质缀合。
实施方案12.根据实施方案11所述的方法，其中所述接头是SMCC接头。
实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽包含与SMCC接头上的马来酰亚胺基团连接的-SH基团，并且SMCC接头的-NHS基团与所述第一蛋白质上的-NH2基团连接；和/或
其中所述第二荧光素酶多肽包含连接到所述SMCC接头上的马来酰亚胺基团的-SH基团，并且所述SMCC接头的-NHS基团连接到所述第二蛋白质上的-NH2基团。
实施方案14.根据实施方案13所述的方法，其中所述第一荧光素酶上的所述SH基团通过用环状硫代亚胺酸酯化合物处理所述第一荧光素酶多肽产生。
实施方案15.根据实施方案13所述的方法，其中所述第二荧光素酶上的所述SH基团通过用环状硫代亚胺酸酯化合物处理所述第二荧光素酶多肽产生。
实施方案16.根据实施方案14-15中任一项所述的方法，其中所述环状硫代亚胺酸酯化合物是2-亚氨基硫杂环戊烷。
实施方案17.一种用于进行测序的试剂盒，所述试剂盒包括：
与第一萤光素酶多肽缔合的第一蛋白质，
其中所述第一荧光素酶多肽可特异性切割第一底物以产生第一发光信号，
与第二荧光素酶多肽缔合的第二蛋白质，
其中所述第二荧光素酶多肽可特异性切割所述第二底物以产生第二发光信号，
第一底物，和
第二底物；
其中所述第一荧光素酶多肽不与所述第二底物交叉反应并且所述第二荧光素酶多肽不与所述第一底物交叉反应。
实施方案18.根据实施方案17所述的试剂盒，其还包含第三蛋白质和第四蛋白质，其中所述第三蛋白质与所述第一荧光素酶多肽和所述第二种荧光素酶多肽两者缔合，并且其中所述第四蛋白质既不与所述第一荧光素酶多肽也不与所述第二荧光素酶多肽缔合。
实施方案19.根据实施方案17-18中任一项所述的试剂盒，其中所述第一荧光素酶多肽是Gluc并且所述第二荧光素酶多肽是Nluc。
实施方案20.根据实施方案17-19中任一项所述的试剂盒，其中所述第一底物是腔肠素(CTZ)。
实施方案21.根据实施方案17-20中任一项所述的试剂盒，其中所述第二底物为f-CTZ，其具有下面结构：
实施方案22.根据实施方案17-21中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含多个3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，其中每个3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含不同的核苷酸碱基。
实施方案23.根据实施方案17-22中任一项所述的试剂盒，其中所述第一底物或所述第二底物存在于储备缓冲液中，其中所述储备缓冲液选自乙醇、丙二醇、甲醇、DMSO以及它们的任何组合。
实施方案24.根据实施方案23所述的试剂盒，其中所述储备缓冲液是50体积/体积％乙醇与50体积/体积％丙二醇的混合物。
实施方案25.根据实施方案17-24中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含抗氧化剂，其中所述抗氧化剂可防止第一底物、第二底物或第一底物和第二底物两者的氧化。
实施方案26.一种生产荧光素酶-抗体缀合物的方法，所述方法包括：
(1)提供(i)抗体，所述抗体特异性识别3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，其包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)的核碱基，及其类似物；以及(ii)荧光素酶多肽，
(2)在荧光素酶多肽上在产生-SH基团的条件下，使荧光素酶多肽与2-亚氨基硫烷接触，从而产生包含-SH基团的荧光素酶多肽，
(3)使所述抗体与SMCC接触，其中所述SMCC的-NHS基团与所述抗体上的-NH2基团连接，从而产生具有马来酰亚胺基团的SMCC连接的抗体，以及
(4)在适于蛋白质缀合的条件下，将包含所述-SH基团的荧光素酶多肽与所述SMCC连接的抗体接触，从而形成所述荧光素酶-抗体缀合物。
实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中所述荧光素酶多肽是Gluc或Nluc。
实施方案28.根据实施方案26-27中任一项所述的方法，其中所述荧光素酶多肽在伯胺、巯基或碳水化合物上缀合至所述抗体。
实施方案29.根据实施方案26-28中任一项所述的方法，其中所述缀合发生在反应缓冲液中，其中所述反应缓冲液包含Tris-HCL、NaCl、Tween 20、抗坏血酸钠和PEG 3350。
实施方案30.根据实施方案26-29中任一项所述的方法，其中所述荧光素酶多肽与所述抗体的摩尔比在1:3至1:20的范围内。
实施方案31.其中所述抗体在与所述荧光素酶多肽缀合之前用还原剂处理，其中所述抗体与所述还原剂的摩尔比在1:1至1:5的范围内。
实施方案32.根据实施方案31所述的方法，其中所述还原剂是TCEP或巯基乙胺-HCl。
实施例
实施例1.荧光素酶选择
筛选了市场上不同的荧光素酶以选择信号强度高、还原剂稳定性好的最稳健荧光素酶作为基于生物发光的测序化学的信号标签。根据最佳底物的信号强度、蛋白质大小、信号寿命、稳定性等评估了一系列荧光素酶，如表1和图1所示。
为了标记4种不同的NLRT抗体以构建单色测序化学，需要两种荧光素酶/底物对。选择这两种荧光素酶/底物对的要求是：1)高信号强度；2)两个荧光素酶/底物对之间的最小串扰。
作为信号强度的并排比较，在系统中选择了Gaussia荧光素酶(Gluc)突变体(Prolume Inc.,J.Welsh,Biochemical and Biophysical Research Communications 389(2009)563–568,M43L,M110L mutant)，其与来自竞争性供应商的最佳候选荧光素酶相比，具有至少5倍的信号增强，如图2所示。在系统中选择的其他NanoZac荧光素酶(Nluc)突变体(Prolume Inc.)与Gluc突变体相比示出了一半的信号。然而，其强度仍然比其他对应物高出数倍。在这种并排比较中，来自不同供应商的每种荧光素酶都与供应商出售的最佳底物发生反应。从每个荧光素酶/底物对获得前10秒的积分信号强度以进行比较。
在系统中选择Gluc和Nluc不仅是因为它们与其他荧光素酶相比具有更高的强度，而且还证明了这两种荧光素酶与其自己的底物之间的最小串扰。如下图3所示，Gluc在与Nluc底物反应时显示出约2％的背景信号。然而Nluc在与Gluc底物反应时示出约10％的背景信号。因此，选择这两种荧光素酶作为我们用于测序的NLRT抗体的生物发光信号标记。
实施例2.荧光素酶底物结构筛选和制剂开发
还为所选的两种荧光素酶开发了最佳底物结构和缓冲液制剂，以示出高信号强度、良好的稳定性(长保质期和机载稳定性)和最小的串扰。
2.1底物结构筛选
根据文献(J.Welsh,Biochemical and Biophysical Research Communications389(2009)563–568)，所选Gluc突变体的最佳底物是腔肠素(CTZ)。用Nluc突变体筛选了不同的CTZ类似物，并发现f-CTZ在不同的CTZ类似物结构中给出了最高的信号强度，如图4所示。因此，我们鉴定出Nluc突变体的最佳底物结构是f-CTZ，如下所示：
2.2底物缓冲液制剂开发
2.2.1底物储备缓冲液开发
由于CTZ和f-CTZ不溶于水。需要最佳的有机溶剂作为底物储备缓冲液以获得良好的溶解性和稳定性。测试了不同的有机溶剂和混合物，诸如乙醇、丙二醇、甲醛、DMSO以及这些溶剂的不同比例的混合物。结果示出，50体积/体积％乙醇和50体积/体积％v丙二醇产生最好的溶解度、稳定性和信号强度。
2.2.2底物反应缓冲液开发
还开发了基于水的底物反应缓冲液配方，以实现底物与荧光素酶的最佳反应条件。由于CTZ和f-CTZ对氧化高度敏感，因此在与荧光素酶反应之前保护CTZ和f-CTZ免受氧气影响至关重要。选择抗坏血酸钠作为有效抗氧化剂，以帮助防止CTZ和f-CTZ氧化。还将PEG3350添加到配方中以增加缓冲液的粘度并减缓氧气的氧化。除了抗氧化剂之外，pH值也是另一个关键因素。较高的pH导致更容易氧化。已发现pH＝8是荧光素酶/底物反应的最佳pH，同时在与所有抗氧化剂反应之前保持底物在缓冲液中稳定。
CTZ和f-CTZ两者的最佳底物反应缓冲液配方确定如下：
50mM Tris-HCl，pH＝8.0
0.5M NaCl
0.1％ Tween 20
0.1M抗坏血酸钠
1(重量/体积)％PEG 3350
为了将底物反应缓冲液开发成用于基于生物发光的测序平台的稳健试剂盒，已经对机载稳定性和长期保质期进行了评估。由于PE100在MGI DNBseq E系列单色测序仪上的典型运行时间为14小时左右，此时包括反应缓冲液中的底物在内的整个试剂盒都需要保持在室温下。评估了上述反应缓冲液配方中CTZ和f-CTZ两者的24小时室温稳定性(称为机载稳定性)。如图5所示的数据指示，CTZ和f-CTZ两者在该反应缓冲液形成中的机载稳定性示出与新鲜条件没有显著差异。
还评估了底物反应缓冲液配方的长期保质期(长期稳定性)。300uM底物在反应缓冲液稀释，并在-20℃下保存。将一份等分试样解冻并针对新鲜荧光素酶进行测试。每个时间点的数据是与新鲜荧光素酶/底物对相比的相对信号强度比。
对于Gluc/CTZ而言，在-20℃下6个月的长期稳定性示出，在6个月的保质期内没有明显信号下降，从而指示反应配方是保护CTZ免受氧化的最佳反应配方。参见图6A。
对于Nluc/f-CTZ，在-20℃下4个月的长期稳定性是指，在4个月的保质期内没有明显信号下降，从而指示该反应配方是保护f-CTZ免受氧化的最佳反应配方。更多数据点仍处于保质期研究下。参见图6A。
实施例3.NLRT抗体
本发明采用在美国专利5,888,884中讨论的CoolMPSTM chemistry NLRT抗体(美国专利公布20180223358)，其例如，在合成测序(SBS)期间通过聚合酶掺入生长DNA链的末端之后，特异性识别并结合到生长DNA链3'端的NLRT。
3.1NLRT抗体修饰位点
在在测序期间采用未标记的保留终止子进行掺入的测序技术中，信号分子附接到NLRT抗体以区分不同的碱基。在本发明中，选择荧光素酶作为NLRT抗体上的信号标记。为了将荧光素酶蛋白缀合到NLRT抗体上，可使用NLRT抗体上的多个标记位点：(1)伯胺(-NH2)：这些出现在赖氨酸残基和每条多肽链的N末端。它们数量众多且分布在整个抗体中。(2)巯基(-SH)：这些出现在半胱氨酸残基上，并以稳定整个分子结构的二硫键形式存在。可选择性地还原铰链区二硫化物，以使游离巯基可用于靶向标记。(3)碳水化合物(糖)：糖基化主要发生在抗体(IgG)的Fc区。这些含有顺式二醇的多糖部分中的组分糖可被氧化以产生用于偶联的活性醛(-CHO)。Wild,the Immunoassay Handbook,4th ed.；Elsevier:Amsterdam,the Netherlands,2013；Kobayashi and Oyama,Analyst 136:642-651,2011)。
3.2NLRT抗体-荧光素酶缀合方法
NLRT抗体-荧光素酶标记的一些化学缀合方法总结如下：
3.2.1SMCC化学
SMCC接头用作连接NLRT抗体与荧光素酶的交联剂。如图7A和7B中的方案所示，SMCC接头上的–NHS基团首先与Nluc上的伯胺基团反应。NLRT抗体用还原剂三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)处理以打开铰链区二硫键以产生巯基(-SH)。该巯基与SMCC接头另一端上的马来酰亚胺基团反应，该SMCC接头将NLRT抗体与Nluc连接起来。
Nluc：SMCC＝1:8的Nluc和SMCC之间的最佳反应条件给出了最好的Nluc活性和信号强度。Nluc与NLRT抗体之间的最佳比例为Nluc:抗体＝1:10。在这些缀合条件下，成功获得了Nluc与NLRT-A、NLRT-T和抗地高辛(用作对照抗体)之间的缀合物。如图8所示，在NLRT-A、NLRT-T和抗-地高辛的泳道中示出了160-260KDa之间的多个条带，从而指示存在Nluc-抗体缀合产物。
Nluc_抗-DIG缀合物也在MGI DNBseq E系列单色测序成像仪上得到证实。Nluc通道示出与对照Gluc通道相似的信号强度，其中信号分布与背景有明显的峰分离，从而指示Nluc成功缀合到抗地高辛抗体上。参见见图9A。
Nluc_NLRT-A和Nluc_NLRT-T缀合物也在MGI DNBseq E系列单色测序成像仪上得到证实，如下文信号原始成像和直方图所示，从而指示使用SMCC接头将Nluc成功缀合到NLRT-A和NLRT-T抗体上。NLRT-C和NLRT-G两者都给出了显著较低的信号，其中Nluc缀合到抗体上。参见图9B和图9C。然而，使用SMCC接头在Gluc和NLRT抗体之间没有获得成功的缀合。
3.2.2Traut化学
应注意在与SMCC接头温育后，Nluc和Gluc的信号下降了15％-30％。研究了详细的荧光素酶结构以找出信号下降的原因。根据Nluc和Gluc的氨基酸序列，Nluc有1个半胱氨酸，没有二硫键，并有7个赖氨酸；而Gluc有10个半胱氨酸、4个二硫键、2个游离半胱氨酸和19个赖氨酸。怀疑Gluc中的二硫键被SMCC上的马来酰亚胺基团阻断，这对于保持Gluc的酶活性至关重要。为了证实这一假设，将碘乙酰胺用于与Gluc和Nluc两者一起温育。碘乙酰胺可共价结合到半胱氨酸的硫醇基，所以蛋白质不能形成二硫键，如图10A所示。结果示出，在Gluc:碘乙酰胺比例为1:10并在室温下与碘乙酰胺反应30分钟后，Gluc信号丢失2/3；而在Nluc:碘乙酰胺比例为1:10并在室温下与碘乙酰胺反应30分钟后，Nluc丢失了所有信号。结果(如图10B所示)指示在Gluc和Nluc上均存在游离-SH基团，并且(通过碘乙酰胺)阻断这些-SH基团导致酶活性丧失。SMCC接头具有马来酰亚胺基团，其可与Gluc/Nluc上的游离-SH基团反应。这是在SMCC与Nluc/Gluc一起温育之后信号丢失的原因，这会导致最终抗体缀合物的信号强度低。
还尝试了其他缀合方法来避免SMCC的副反应。Traut试剂(Thermo Fisher Inc.)似乎是Gluc/Nluc的较好接头，并且对荧光素酶上的–SH基团的影响最小。缀合化学方案如图11A所示。Traut试剂与Gluc/Nluc上的伯胺基反应以生成荧光素酶上的-SH基团；而NLRT抗体用SMCC接头处理以通过抗体上的伯胺和SMCC上的-NHS基团反应(图11B)。在纯化各反应后，将Traut处理后的荧光素酶和SMCC处理后的抗体混合在一起，以通过荧光素酶上的-SH基团和抗体上SMCC基团上的马来酰亚胺反应。
在Traut修饰后，Gluc和Nluc都示出改善的信号。如图11C和图11D所示，1:1Gluc/Nluc与Traut的摩尔比给出最高信号。在Traut修饰之后，Gluc信号提高了60％，而Nluc信号提高了一倍。除了信号评估外，还研究了稳定性研究。Gluc/Nluc_Traut缀合物在50℃或70℃下温育1小时以进行热稳定性测试。对于Gluc，Trau修饰导致在50℃或70℃下的稳定性较差。对于Nluc，Trau修饰(1:1比例)有助于提高在50℃下的稳定性并将信号提高约30％。在70℃，修饰或未修饰的Nluc都不能在70℃下存活。
Nluc-抗地高辛和Nluc-NLRT抗体缀合物已通过Traut方法成功获得。已在1:15、1:2和1:1下测试了不同的Nluc与Traut的比例。Traut试剂的比例越高，缀合物就给出越高的信号。然而，缀合物信号类似于SMCC方法，没有进一步的信号增强，如假设中讨论的和上面的初始数据所示的。还获得了Gluc-NLRT抗体缀合物，但信号强度显著低于Nluc-NLRT抗体缀合物。
3.2.3还原化学
为了对每个抗体获得更多的荧光素酶拷贝以使得每个缀合物获得更高的荧光素酶信号，研究了与NLRT抗体不同比例的不同还原剂(TCEP、巯基乙胺-HCl)和其他接头(SMCC、Traut’s)。
如下文数据所示，高浓度TCEP(1:1500)、较低比例的TCEP(1:150)、巯基乙胺-HCl，以及其他交联剂(如SMCC、Traut's)已经过测试。在所有还原方法中，1500:1比例的TCEP给出了最高的–SH标记度和来自测序成像仪的最高信号。参见图12A-12C。
3.3次级抗体标记方法
除了用荧光素酶直接标记NLRT抗体外，还尝试了次级抗体标记方法。对同种型NLRT抗体具有特异性的生物素标记的次级抗体(即抗初级山羊IgG抗体)用于特异性靶向和标记NLRT抗体。链霉亲和素标记的Gluc用于信号标记。由于次级标记方案，更多的Gluc可结合到每个NLRT抗体，从而导致更高的信号强度。如图15所示，图像1是对照图像，其中生物素标记的dCTP掺入到DNA链上，然后用链霉抗生物素标记的Gluc进行标记。图2-4是未标记的dNTP掺入到DNA链上，之后进行NLRT抗体结合、生物素标记的次级抗体结合，然后进行链霉亲和素标记的Gluc结合。与使用次级抗体标记方案的对照方案相比，获得了大约两倍的信号强度。然而，该方案的缺点是每个测序循环中的反应步骤较多，从而导致测序时间较长。
3.4.NLRT抗体-萤光素酶融合蛋白
此外，可使用直接连接重组抗体片段(例如单链Fv片段(scFvs)与报告蛋白的融合(Skerra and Plückthun,Science 240:1038-1041,1988；Bird et al.,Science 242:423-426,1988；Huston et al.,Methods Enzymol 203:46-88,1991；Ahmad et al.,Clin.Dev.Immunol.2012:1,2012)。例如，具有生物发光特性的发光蛋白(例如荧光素酶和水母发光蛋白)可用作例如具有抗体片段、表位肽和链霉亲和素的融合蛋白中的报告蛋白(Oyama et al.,Anal Chem 87:12387-12395,2015；Wang et al.,Anal Chim Acta 435:255-263,2001；Desai et al.,Anal Biochem 294:132-140,2001；Inouye et al.,BiosciBiotechnol Biochem 75:568-571,2011)。
一些使用NLRT抗体-荧光素酶融合蛋白的初步尝试已经完成。如图14所示，NLRT-T-Gluc和NLRT-T-Nluc融合蛋白示出对未标记的RT的良好结合能力。将进行更多的工作来改善融合蛋白的性能。
3.5NLRT-抗体-生物素标记
使用EZ-NHS-S-S-生物素接头(Thermo Fisher)开发了生物素与NLRT抗体(A、T、C、G和第二抗体)的缀合物。EZ-NHS-S-S-生物素接头通过伯胺基团与NLRT抗体反应。然后使用链霉亲和素标记的Gluc来标记NLRT抗体。在抗体：生物素接头＝1：10的比例下获得最佳信号强度。参见图15。
实施例4.基于生物发光的测序方案
NLRT-抗体-萤光素酶缀合物可用于核酸测序方法，特别适用于单色(也称为单通道)测序。
根据一种这样的方法，提供了一种阵列，其包含布置在表面上的位置处的单链核酸模板。进行延伸测序或SBS以便通过以下方法确定多个测序循环中核酸模板中检测位置处的核苷酸的身份：(i)将未标记的互补核苷酸(NLRT)结合(或掺入)到检测位置，(ii)通过直接或间接标记的亲和试剂与其结合来标记NLRT，所述亲和试剂与此类NLRT特异性结合；(iii)在检测位置处检测与互补NLRT相关的信号是否存在，该信号由标记产生(例如荧光素酶信号)；其中(1)在检测位置处检测到第一信号而不是第二信号，将互补的NLRT鉴定为选自NLRT-A、NLRT-T、NLRT-G和NLRT-C；
(2)在检测位置处检测第二信号而非第一信号将互补的NLRT鉴定为选自NLRT-A、NLRT-T、NLRT-G或NLRT-C的NLRT，其与(1)中选择的NLRT不同；
(3)在不同时间在检测位置处检测到第一信号和第二信号，将互补的NLRT鉴定为选自NLRT-A、NLRT-T、NLRT-G和NLRT-C的NLRT，其与(1)和(2)中选择的核苷酸不同；以及
(4)在该位置处既未检测到第一信号也未检测到第二信号将互补NLRT鉴定为选自NLRT-A、NLRT-T、NLRT-G和NLRT-C的NLRT，其不同于在(1)、(2)和(3)中选择的核苷酸；并且(iii)基于互补NLRT的身份推断核酸模板中检测位置处的核苷酸的身份。
使用NLRT-抗体-萤光素酶缀合物的基于生物发光的测序方案的实施例示于图16中。
获得了五个循环的测序数据。获得了与背景的良好信号分离，如信号直方图所示(图17A，底部面板)。良好的碱基分离也示于散射图中(图17A，上图)，从而指示来自每个NLRT-抗体-萤光素酶缀合物的良好信号特异性。每个周期的信号、噪声和SNR图也示于图17C-17E中。循环1的图像1(由Nluc产生的信号)、图像2(由Gluc产生的信号)示于图17B中。
实施例5.具有选择性失活的基于生物发光的测序方案
在每个循环中，将NLRT的混合物与待在DNA聚合酶存在下测序的DNA模板一起温育。这些NLRT包括7-去氮-7-生物素-接头-3'-叠氮甲基-dATP、5-生物素-接头-3'-叠氮甲基-dTTP、5-地高辛-接头-3'-叠氮甲基-dTTP、5-地高辛-接头-3'-叠氮甲基-dCTP和3'-叠氮甲基-dGTP。将链霉亲和素缀合的Gluc(识别生物素标记的核苷酸A和T)添加到测序流动池中，然后添加底物CTZ。收集来自Gluc裂解CTZ的生物发光信号。然后使100mM DTT流入测序流动池，这使Gluc失活。随后，将Nluc缀合的抗地高辛抗体添加到流动池中以结合地高辛标记的核苷酸(T和C)。没有如预期的那样检测到G的信号。
在第一个循环结束时，将叠氮甲基从GDS末端的核苷酸上切下。生物素或地高辛标记被释放并从流通池中洗掉。下一个循环开始于添加新的NLRT混合物。
图19A-19E示出来自前五个测序循环的信号。结果示出信号与背景分离良好。在每个信号散射图中，X轴表示图像1的归一化信号强度，Y轴表示图像2的归一化信号强度。从该散射图中获得了四(4)个分离良好的信号组。X轴上的一个(中位数＝0.5，0)来自生物素标记的核苷酸A。Y轴上的一个(0，中位数＝0.5)来自地高辛标记的核苷酸C。来自(0，0)位置的信号指示来自未标记的核苷酸G的信号。来自45度(0.5,0.5)位置的信号是来自核苷酸T的信号，因为它一半用生物素标记，一半用地高辛标记。因此，一半的T在图像1中点亮，而另一半在图像2中点亮。在信号散射图的每个循环中，这四(4)个信号组彼此区分良好，使得该循环的正确碱基检出成为可能。
以引用方式并入
本公开中提及的每份出版物和专利文献都以引用整体并入本文用于所有目的至如同每份此类每份出版物和专利文献都被具体且单独地指示为以引用方式并入本文那样的程度。
虽然本发明已参考具体示例和说明进行了描述，但作为常规开发和优化的一部分并且在本领域普通技术人员的范围内，可进行更改并且可替换等同物以适应特定上下文或预期用途，从而在不脱离权利要求及其等同物的范围的情况下实现本发明的有益效果。
序列表
<110> 深圳华大基因科技有限公司
<120> 用于基于生物发光的测序的方法和组合物
<130> 092171-1260984 (5092-WOCN)
<140>
<141>
<150> 63/089,996
<151> 2020-10-09
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成多肽
<400> 1
Met Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala
1 5 10 15
Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro
20 25 30
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Leu Glu Ala Asn Ala
35 40 45
Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile
50 55 60
Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr
65 70 75 80
Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile
85 90 95
Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Leu Glu
100 105 110
Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys
115 120 125
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp
130 135 140
Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val
145 150 155 160
Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp His His His His His His
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<210> 2
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述:合成多肽
<400> 2
Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu
20 25 30
Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu
35 40 45
Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr
50 55 60
Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys
65 70 75 80
Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr
85 90 95
Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe
100 105 110
Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr
115 120 125
Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu
130 135 140
Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val
145 150 155 160
Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
165 170
Claims (32)
1.一种将不同标记的亲和试剂固定在阵列上的位置处来对应阵列上的位置的方法，所述方法包括：
i)提供位置阵列，其中所述阵列包括第一位置和第二位置，
其中第一亲和试剂固定在所述第一位置的至少一些处，并且所述第二亲和试剂固定在所述第二位置的至少一些处；
其中所述第一亲和试剂与第一荧光素酶多肽缔合，所述第二亲和试剂与第二荧光素酶多肽缔合，
其中所述第一荧光素酶多肽可以与第一底物反应以产生第一发光信号，
其中所述第二荧光素酶多肽可以与第二底物反应以产生第二发光信号，
其中所述第一底物与所述第一荧光素酶多肽正交并且所述第二底物与第二荧光素酶多肽所述正交，并且
其中所述第一荧光素酶多肽不与所述第二底物交叉反应并且所述第二荧光素酶多肽不与所述第一底物交叉反应，
ii)使所述阵列与所述第一底物接触并在固定所述第一亲和试剂的位置处检测所述第一发光信号，
iii)使所述阵列与所述第二底物接触并在所述第二亲和试剂固定的位置处检测所述第二发光信号，和
iii)如果在位置检测到所述第一发光信号，则确定该位置是用第一亲和试剂固定，或
如果在位置检测到所述第二发光信号，则确定该位置是用所述第二亲和试剂固定，从而用不同标记的亲和试剂对应了阵列上的位置。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一底物是f-CTZ并且所述第一荧光素酶多肽是Nluc。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二底物是f-CTZ并且所述第二荧光素酶多肽是Nluc。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一底物为腔肠素(CTZ)并且所述第二底物为f-CTZ。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽是Gaussia荧光素酶多肽(Gluc)并且所述第二荧光素酶多肽是NanoZac荧光素酶多肽(Nluc)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述阵列包括第三位置和第四位置，第三亲和试剂固定在所述第三位置中的至少一些处，并且第四亲和试剂固定在所述第四位置中的至少一些处，
其中所述第三亲和试剂与所述第一萤光素酶多肽和所述第二萤光素酶多肽两者缔合，并且
其中所述第四亲和试剂与所述荧光素酶多肽都不缔合，
其中如果从位置检测到所述第一发光信号，则确定所述第一亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测到所述第二发光信号，则确定所述第二亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测到所述第一发光信号和所述第二发光信号两者，则确定所述第三亲和试剂固定在该位置处，
如果从位置检测不到所述第一发光信号和所述第二发光信号，则确定所述第四亲和试剂固定在该位置处。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在检测所述第二发光信号之前检测所述第一发光信号，并且
其中在检测到所述第一发光信号之后但在检测到所述第二发光信号之前添加失活剂，并且
其中所述失活剂选择性地使所述第一荧光素酶多肽失活。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述失活剂是二硫苏糖醇(DTT)。
9.根据权利要求1的方法，其中所述第一亲和试剂或所述第二亲和试剂特异性结合到3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，所述3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)的核碱基及其类似物。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括如果确定一种类型的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸的亲和试剂被固定在所述位置处，则鉴定出与所述亲和试剂缔合的所述类型的3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽经由接头与所述第一蛋白质缀合，和/或
其中所述第二荧光素酶多肽经由接头与所述第二蛋白质缀合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述接头是SMCC接头。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一荧光素酶多肽包含与SMCC接头上的马来酰亚胺基团连接的-SH基团，并且SMCC接头的-NHS基团与所述第一蛋白质上的-NH2基团连接；和/或
其中所述第二荧光素酶多肽包含连接到所述SMCC接头上的马来酰亚胺基团的-SH基团，并且所述SMCC接头的-NHS基团连接到所述第二蛋白质上的-NH2基团。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一荧光素酶上的所述SH基团通过用环状硫代亚胺酸酯化合物处理所述第一荧光素酶多肽产生。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二荧光素酶上的所述SH基团通过用环状硫代亚胺酸酯化合物处理所述第二荧光素酶多肽产生。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述环状硫代亚胺酸酯化合物是2-亚氨基硫杂环戊烷。
17.一种用于进行测序的试剂盒，所述试剂盒包括：
与第一萤光素酶多肽缔合的第一蛋白质，
其中所述第一荧光素酶多肽可特异性切割第一底物以产生第一发光信号，
与第二荧光素酶多肽缔合的第二蛋白质，
其中所述第二荧光素酶多肽可特异性切割所述第二底物以产生第二发光信号，
第一底物，和
第二底物；
其中所述第一荧光素酶多肽不与所述第二底物交叉反应并且所述第二荧光素酶多肽不与所述第一底物交叉反应。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其还包含第三蛋白质和第四蛋白质，其中所述第三蛋白质与所述第一荧光素酶多肽和所述第二种荧光素酶多肽两者缔合，并且其中所述第四蛋白质既不与所述第一荧光素酶多肽也不与所述第二荧光素酶多肽缔合。
19.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一荧光素酶多肽是Gluc并且所述第二荧光素酶多肽是Nluc。
20.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一底物是腔肠素(CTZ)。
21.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第二底物为f-CTZ，其具有下面结构：
22.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含多个3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，其中每个3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸包含不同的核苷酸碱基。
23.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述第一底物或所述第二底物存在于储备缓冲液中，其中所述储备缓冲液选自乙醇、丙二醇、甲醇、DMSO以及它们的任何组合。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述储备缓冲液是50体积/体积％乙醇与50体积/体积％丙二醇的混合物。
25.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含抗氧化剂，其中所述抗氧化剂可防止第一底物、第二底物或第一底物和第二底物两者的氧化。
26.一种生产荧光素酶-抗体缀合物的方法，所述方法包括：
(1)提供(i)抗体，所述抗体特异性识别3'-O-可逆终止子脱氧核糖核苷酸，其包含选自腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)的核碱基，及其类似物；以及(ii)荧光素酶多肽，
(2)在荧光素酶多肽上产生-SH基团的条件下，使荧光素酶多肽与2-亚氨基硫烷接触，从而产生包含-SH基团的荧光素酶多肽，
(3)使所述抗体与SMCC接触，其中所述SMCC的-NHS基团与所述抗体上的-NH2基团连接，从而产生具有马来酰亚胺基团的SMCC连接的抗体，以及
(4)在适于蛋白质缀合的条件下，将包含所述-SH基团的荧光素酶多肽与所述SMCC连接的抗体接触，从而形成所述荧光素酶-抗体缀合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述荧光素酶多肽是Gluc或Nluc。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述荧光素酶多肽在伯胺、巯基或碳水化合物上缀合至所述抗体。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述缀合发生在反应缓冲液中，其中所述反应缓冲液包含Tris-HCL、NaCl、Tween 20、抗坏血酸钠和PEG 3350。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述荧光素酶多肽与所述抗体的摩尔比在1:3至1:20的范围内。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗体在与所述荧光素酶多肽缀合之前用还原剂处理，
其中所述抗体与所述还原剂的摩尔比在1:1至1:5的范围内。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述还原剂是TCEP或巯基乙胺-HCl。
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