CN116778483A - 一种基于反射共聚焦显微镜技术的细胞死亡类型识别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于反射共聚焦显微镜技术的细胞死亡类型识别方法，通过制备了一定厚度和弹性的聚丙烯酰胺水凝胶基底增强了细胞的反射干涉图像对比信号，故而克服了传统使用反射干涉对比显微镜反射图像信号噪点高的缺点，同时由于选择了RT 15/85作为滤光片，使得激发光强度与之前的相比降低了10倍，大大减少了激光对细胞的损伤，并且根据所得的细胞干涉条纹图像随时间的变化特征能够区分出不同的细胞死亡类型。所以本发明提供了一种实时、非侵入性的细胞死亡的类型识别方法，无需使用染色剂或荧光探针。
Description
技术领域
本发明属于细胞成像技术领域，具体涉及一种基于反射共聚焦显微镜技术的细胞死亡类型识别方法。
背景技术
细胞死亡是生命现象的重要组成部分，对于维持生物体的稳态、发育、免疫和疾病等过程具有重要的作用。目前已知的细胞死亡类型包括细胞凋亡、坏死性凋亡、细胞焦亡、铁死亡、铜死亡等，它们各自具有不同的形态学、生化和免疫学特征。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，其特征是细胞核和胞质的碎片化、DNA的梯度断裂、膜磷脂酰丝氨酸的外翻等，通常不引起炎症反应。铁死亡是一种铁依赖性的脂质过氧化物所致的细胞死亡，其形态特征是线粒体变小、线粒体膜破裂。铜死亡是一种由铜与TCA循环中的脂质酶结合，导致蛋白质聚集、蛋白质毒性应激的细胞死亡，其形态特征是线粒体皱缩、线粒体膜破裂。
细胞死亡类型的识别是细胞死亡机制研究的重要前提和基础，也对于药物筛选、毒理学评价等领域具有重要意义。目前常用的细胞死亡检测方法包括流式细胞仪、荧光显微镜、电子显微镜等，它们主要依据细胞形态学或生化标记来区分不同类型的细胞死亡。然而，这些方法存在一些局限性和不足，如创伤性（需要固定或破裂细胞）、低效率（需要大量样本或时间）、高成本（需要昂贵仪器或试剂）等。因此，开发一种快速、无损的细胞死亡类型识别的方法具有重要的理论和实际价值。
发明内容
针对现有细胞死亡检测技术的不足，本发明的目的是提供一种基于反射共聚焦显微镜的细胞死亡类型识别方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
在共聚焦小皿底部制备具有特定厚度及弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶基底，并对基底进行黏附处理；
所述共聚焦小皿具体为硼硅酸盐玻璃培养皿，购于上海晶安生物科技有限公司；所述聚丙烯酰胺水凝胶基底的厚度为50~150μm，弹性模量为7~10kPa。
进一步的，所述聚丙烯酰胺水凝胶基底的制备方法如下：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺在催化剂和引发剂的作用下进行聚合得到。所述催化剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的一种；所述引发剂为TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)。
所述表面黏附处理具体为：（1）将附有基底的共聚焦小皿浸泡于PBS溶液使其达到溶胀平衡，取出备用；（2）取适量交联剂Sulfo-SANPAH，用无菌水稀释成500μg/mL的浓度，滴加至基底表面，并使用紫外灯照射10min，用PBS溶液冲洗3次，将表面多余的Sulfo-SANPAH洗掉；（3）将配制好的100μg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液缓慢滴加至经表面固化处理的水凝胶基底上，均匀表面覆盖，37℃孵育2h。胶原蛋白为后续的细胞贴壁培养提供了足够的黏附位点，所述胶原蛋白优选为鼠尾I型胶原蛋白。
（2）将细胞消化后以一定密度接种于水凝胶基底上，加入培养基放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养；
（3）在成像之前先打开共聚焦显微镜的反射模块，同时将培养基更换为含有细胞死亡诱导剂的培养基用于诱导不同类型的细胞死亡。
（4）采用延时采集图像功能对共聚焦小皿中的细胞进行观察，根据采集到的干涉条纹图像和时间信息，利用基于深度神经网络的目标检测模型对采集的干涉条纹图像进行识别和定位，以提取单细胞图像；然后使用基于深度神经网络的分割模型对图像的干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度进行分割，并得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化的数据信息；最后使用基于深度神经网络的分析模型对所述数据信息进行分类，判断细胞死亡类型。
进一步的，为提高深度神经网络判断的准确度，对结果输出阈值进行设定；即利用深度神经网络的分析模型分别对单个细胞的干涉条纹波长随时间变化关系、细胞铺展面积随时间变化关系、细胞圆度随时间变化关系进行分类判断，分别得出细胞死亡类型的结论；对结果输出阈值进行设定，例如对被识别得到的细胞数量符合规律的百分比、三组对应关系符合规律的百分比进行设定，达到阈值则输出结果，否则从第（3）步重新开始。
进一步的，通过图像处理软件对所采集的干涉条纹图像进行降噪和增强。
所述深度神经网络的目标检测模型对检测图像进行识别和定位之前，所述方法还包括：获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，并对所述图像中的单个细胞进行标注；以及使用带标注的所述图像训练神经网络模型，以便得到所述目标检测模型。
所述深度神经网络的分割模型对检测图像进行分割之前，所述方法还包括：获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，对细胞干涉条纹图像中某一时间的干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度进行标注，并使用带标注的干涉条纹图像对神经网络模型进行训练，得到分割模型。所述分割模型可得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息。
所述深度神经网络的分析模型对数据信息进行分类之前，所述方法还包括：获取大样本的细胞死亡类型信息，所述细胞死亡类型信息包括细胞类型、细胞死亡类型、所述分割模型得到的数据信息；使用上述数据对神经网络模型进行训练，得到分析模型。所述分析模型可根据所述分割模型得到的数据信息对细胞死亡类型进行分类判断。
所述反射共聚焦显微镜（RCM）的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，激发光强度为1%，滤光片选择RT 15/85。
本发明的有益效果如下：
本发明在通过反射共聚焦显微镜（RCM）区分细胞死亡类型的过程中通过制备了一定厚度和弹性的聚丙烯酰胺水凝胶基底增强了细胞的反射干涉图像对比信号，故而克服了传统使用反射干涉对比显微镜反射图像信号噪点高的缺点，同时由于选择了RT 15/85作为滤光片，使得激发光强度与之前的相比降低了10倍，大大减少了激光对细胞的损伤，并且根据所得的细胞干涉条纹图像随时间的变化特征能够区分出不同的细胞死亡类型。所以本发明提供了一种实时、非侵入性的细胞死亡的类型识别方法，无需使用染色剂或荧光探针。
附图说明
图1为基于反射共聚焦显微镜技术区分细胞死亡类型的流程图。
图2为正常NIH-3T3细胞在不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶基底或共聚焦小皿基底的细胞干涉条纹图像。
图3为NIH-3T3细胞在不同弹性模量的聚丙烯酰胺水凝胶基底或共聚焦小皿基底中凋亡时的干涉条纹波长、细胞圆度、细胞铺展面积随时间的变化关系。
图4为NIH-3T3细胞铁死亡时的干涉条纹波长、细胞圆度、细胞铺展面积随时间的变化关系。
图5为NIH-3T3细胞铜死亡时的干涉条纹波长、细胞圆度、细胞铺展面积随时间的变化关系。
图6为NIH-3T3细胞在不同死亡类型下的细胞干涉条纹图像和肌动蛋白染色图。图中标尺为10μm。
图7为人骨肉瘤细胞铁死亡时不同时间观察得到的干涉条纹图像。
图8为人骨肉瘤细胞铁死亡时的干涉条纹波长、细胞圆度、细胞铺展面积随时间的变化关系。
图9为乳腺癌细胞铁死亡时不同时间观察得到的干涉条纹图像。
图10为乳腺癌细胞铁死亡时的干涉条纹波长、细胞圆度、细胞铺展面积随时间的变化关系。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如图1所示，为本发明的基于反射共聚焦区分细胞死亡类型的流程图，一种基于反射共聚焦显微镜（RCM）的细胞死亡类型识别方法主要包括：S1在共聚焦小皿上制备聚丙烯酰胺水凝胶基底，并进行黏附处理；S2接种细胞于基底中，使用死亡诱导剂（或药物）诱导细胞发生死亡；S3使用反射共聚焦显微镜进行延时连续成像，采集细胞的干涉条纹图像，获得细胞干涉条纹图像随时间的变化信息；S4使用深度神经网络的目标检测模型对干涉条纹图像进行分割，提取单个细胞图像；S5使用深度神经网络的分割模型对干涉条纹图像进行分割，分别得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息；S6利用深度神经网络的分析模型对步骤S5得到的数据信息进行分类判断，得出细胞死亡类型结论。
所述步骤S4使用神经网络对图像分割前，前置采用图像处理软件对干涉条纹图像进行降噪和增强。
所述基于深度神经网络的目标检测模型通过以下方式获得：获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，对细胞干涉条纹图像中的单个细胞进行标注；以及使用带标注的所述图像训练神经网络模型。
所述死亡干涉条纹图像信息采用RCM获得。对待检测图像进行识别和定位可以是包括识别和定位待检测图像中的每一个目标活体细胞，以提取活体单细胞图像，并排除杂质等因素的影响。
所述基于深度神经网络的分割模型通过以下方式获得：获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，对细胞干涉条纹图像中某一时间的干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度进行标注，并使用带标注的干涉条纹图像对神经网络模型进行训练，得到分割模型。所述细胞死亡干涉条纹图像信息同样采用RCM获得。
所述基于深度神经网络的分析模型通过以下方式获得：获取大样本的细胞死亡类型信息，所述细胞死亡类型信息包括细胞类型、细胞死亡类型、所述分割模型得到的数据信息；使用上述数据对神经网络模型进行训练，得到分析模型。所述细胞类型包括癌细胞和正常细胞，例如人骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞、成纤细胞等。所述细胞死亡类型包括不限于凋亡、坏死、自噬性死亡、焦亡、铁死亡、铜死亡等。
所述步骤S6还包括子步骤S61，具体为：利用深度神经网络的分析模型分别对单个细胞的干涉条纹波长随时间变化关系、细胞铺展面积随时间变化关系、细胞圆度随时间变化关系进行分类判断，分别得出细胞死亡类型的结论；对结果输出阈值进行设定，例如对被识别得到的细胞数量符合规律的百分比、三组对应关系符合规律的百分比进行设定，达到阈值则输出结果，否则返回S2。
所使用的细胞死亡诱导剂列于表1。
本发明采用的试验材料来源列于表2。
本发明采用的反射式共聚焦激光扫描显微镜为Vivas-cope1500，购于美国Lucid技术。
实施例1
配置终浓度为0.32wt%丙烯酰胺、终浓度为1.25wt%甲叉双丙烯酰胺，终浓度为0.11wt%过硫酸铵、终浓度为0.01wt%TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)的预聚液，取1.5μL的预聚液置于共聚焦小皿上，然后用石英片盖在液滴上使得液滴在重力下变平，室温下静置60min使其发生聚合交联，将石英片缓慢剥离后，得到厚度为100±2μm的水凝胶基底，记为基底1。
配置终浓度为0.31wt%丙烯酰胺、终浓度为0.97wt%甲叉双丙烯酰胺，终浓度为0.12wt%过硫酸铵、终浓度为0.01wt%TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)的预聚液，取1.5μL的预聚液置于共聚焦小皿上，然后用石英片盖在液滴上使得液滴在重力下变平，室温下静置60min使其发生聚合交联，将石英片缓慢剥离后，得到厚度为100±2μm的水凝胶基底，记为基底2。
配置终浓度为0.31wt%丙烯酰胺、终浓度为1.5wt%甲叉双丙烯酰胺，终浓度为0.12wt%过硫酸铵、终浓度为0.01wt%TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)的预聚液，取1.5μL的预聚液置于共聚焦小皿上，然后用石英片盖在液滴上使得液滴在重力下变平，室温下静置60min使其发生聚合交联，将石英片缓慢剥离后，得到厚度为100±2μm的水凝胶基底，记为基底3。
采用原子力压痕实验测量聚丙烯酰胺水凝胶基底弹性模量，方法如下：
把附有水凝胶基底的聚焦小皿浸泡于pH=7.4的PBS中，待其达到溶胀平衡后，置于原子力显微镜载物台上；（2）将球形-尖端探针安装到原子力显微镜上，采用水接触模式在原子力显微镜力曲线模式下测量；（3）移动探针到基底表面聚焦，低速下压加载，选取5个不同区域测量，获得多条力-位移曲线；（4）通过赫兹模型拟合计算出聚丙烯酰胺水凝胶的弹性模量。
试验结果：基底1、2、3的弹性模量分别为：4.85 kPa、8.73 kPa、1.12 GPa。
对上述基底1、2、3进行黏附处理，步骤如下：将附有基底的共聚焦小皿浸泡于PBS溶液（pH=7.4）使其达到溶胀平衡（大概12h），取出备用；取适量交联剂Sulfo-SANPAH，用无菌水稀释成500μg/mL的浓度，取2μL滴加至基底表面，并使用紫外灯照射10min进行交联，用PBS溶液冲洗3次，将表面多余的Sulfo-SANPAH洗掉；将2μL 100μg/mL的鼠尾Ⅰ型胶原蛋白溶液缓慢滴加至经表面固化处理的水凝胶基底上，均匀表面覆盖，37℃孵育2h。胶原蛋白为后续的细胞贴壁培养提供了足够的黏附位点。
对比细胞在不同弹性模量的的水凝胶基底和共聚焦小皿基底的细胞干涉条纹图像，方法如下：
将小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）用0.25wt%的含EDTA的胰蛋白酶消化3分钟，将细胞从培养瓶中取出，然后将细胞离心后重新悬浮于PBS中备用，将细胞接种在附有水凝胶基底的共聚焦小皿上，加入培养基（DMEM＋10% CS＋1% P/S）放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养，待细胞完全贴壁，置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%。
附图2分别为共聚焦小皿基底（a）、附有弹性模量为4 kPa的水凝胶基底的共聚焦小皿基底（b）、附有弹性模量为8.73 kPa的水凝胶基底的共聚焦小皿基底（c）、附有弹性模量为1 GPa的水凝胶基底的共聚焦小皿基底（d）。图中标尺为10μm。
对比细胞在不同弹性模量的的水凝胶基底和共聚焦小皿基底的细胞干涉条纹随时间变化规律的灵敏度，方法如下：
将上述细胞完全贴壁的培养小皿中的培养基换成含有死亡诱导剂的培养基，含有死亡诱导剂的培养基具体为星形孢素终浓度为1μM的培养基，然后置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，开启延时采集功能，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%，采集时间为120min。
采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行降噪和增强后再进行分析，得到干涉条纹波长平均数、细胞铺展面积平均数、细胞圆度平均数随时间变化关系的数据信息，将所述数据信息以坐标轴的形式表示，如图3（a.平均干涉条纹波长-时间关系，b.细胞平均铺展面积-时间关系，c平均.细胞圆度-时间关系）。所述平均数是指平均每个细胞的参数特征。
综上两个试验结果可知，附有水凝胶基底的共聚焦小皿能够加强干涉条纹信号、对变化的灵敏度更高，且弹性模量为8.73kPa的基底具有更好的成像效果。
实施例2
将小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）用0.25wt%的含EDTA的胰蛋白酶消化3分钟，将细胞从培养瓶中取出，然后将细胞离心后重新悬浮于PBS中备用，将细胞接种在附有水凝胶基底的共聚焦小皿上，加入培养基（DMEM＋10% CS＋1% P/S）放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养，待细胞完全贴壁，将培养基换成含有铁死亡诱导剂的培养基，含有铁死亡诱导剂的培养基具体为RSL-3浓度为5μM的培养基，然后置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，开启延时采集功能，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%，采集时间为180min。
采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行降噪和增强后再进行分析，得到干涉条纹波长平均数、细胞铺展面积平均数、细胞圆度平均数随时间变化关系的数据信息，将所述数据信息以坐标轴的形式表示，如图4。所述平均数是指平均每个细胞的参数特征。
然后采用深度神经网络的目标检测模型、分割模型、分析模型对采集到的完整数据进行分析，即：将采集得到的某一时间干涉条纹图像信息使用深度神经网络的目标检测模型对干涉条纹图像中的单个细胞进行识别与定位，提取单个细胞图像，此时得到若干个单个细胞图像；使用深度神经网络的分割模型对单个细胞的干涉条纹图像进行分割，分别得到单个干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息；利用深度神经网络的分析模型对所述数据信息进行分类判断，得出细胞死亡类型结论。设置结论的输出阈值为：图像中被目标检测模型识别得到的单个细胞总数的80%以上符合三组关系均对应同一死亡结论，即被深度神经网络的目标检测模型识别得到的单个细胞总数为X时，有80%X的细胞的三组关系（干涉条纹波长随时间变化关系、细胞铺展面积随时间变化关系、细胞圆度随时间变化关系）的规律均符合同一种死亡类型，则输出结果；否则需要重复试验。
实施例3
将小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）用0.25wt%的含EDTA的胰蛋白酶消化3分钟，将细胞从培养瓶中取出，然后将细胞离心后重新悬浮于PBS中备用，将细胞接种在附有水凝胶基底的共聚焦小皿上，加入培养基（DMEM＋10% CS＋1% P/S）放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养，待细胞完全贴壁，将培养基换成含有铜死亡诱导剂的培养基，含有铜死亡诱导剂的培养基具体为伊利司莫浓度为1μM的培养基（氯化铜终浓度为10 μM），然后置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，开启延时采集功能，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%，采集时间为120min。
采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行降噪和增强后再进行分析，得到干涉条纹波长平均数、细胞铺展面积平均数、细胞圆度平均数随时间变化关系的数据信息，将所述数据信息以坐标轴的形式表示，如图5。所述平均数是指平均每个细胞的参数特征。
然后采用深度神经网络的目标检测模型、分割模型、分析模型对采集到的完整数据进行分析，即：将采集得到的某一时间干涉条纹图像信息使用深度神经网络的目标检测模型对干涉条纹图像中的单个细胞进行识别与定位，提取单个细胞图像，此时得到若干个单个细胞图像；使用深度神经网络的分割模型对单个细胞的干涉条纹图像进行分割，分别得到单个干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息；利用深度神经网络的分析模型对所述数据信息进行分类判断，得出细胞死亡类型结论。设置结论的输出阈值为：图像中被目标检测模型识别得到的单个细胞总数的80%以上符合三组关系均对应同一死亡结论，即被深度神经网络的目标检测模型识别得到的单个细胞总数为X时，有80%X的细胞的三组关系（干涉条纹波长随时间变化关系、细胞铺展面积随时间变化关系、细胞圆度随时间变化关系）的规律均符合同一种死亡类型，则输出结果；否则需要重复试验。
从上述实施例1~3三组对应关系的规律可知，不同的细胞死亡类型，三个特征随时间的变化规律不同，具体规律如下：星形孢素诱导的细胞凋亡时，细胞干涉条纹波长随时间的变化近似线性下降；RSL-3诱导的细胞铁死亡时，细胞干涉条纹波长随时间的变化是在前30min趋于不变，随后开始近似线性下降，且在2h时下降为0；Elesclomol（CuCl2）诱导的细胞铜死亡时，细胞干涉条纹波长随时间变化是在前30min近似线性下，在40min下降为0。同样的，细胞的铺展面积与圆度随时间的变化关系也遵循类似的规律，且不同类型死亡的细胞表现出不同的终形态，如图6所示，因此可以根据这一规律判断外加剂或药物造成的细胞死亡遵循哪种机理；进一步的，通过深度神经网络对大量样本数据的学习，可以提高这三组关系细微变化的识别敏感度。
实施例4
将人骨肉瘤细胞（U2OS）用胰蛋白酶消化，将细胞离心后重新悬浮于PBS中备用，将细胞接种在附有水凝胶基底的共聚焦小皿上，加入培养基（DMEM）放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养，待细胞完全贴壁，将培养基换成含有铁死亡诱导剂的培养基，含有铁死亡诱导剂的培养基具体为RSL-3浓度为5μM的培养基，然后置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，开启延时采集功能，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%，采集时间为5h。
采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行降噪和增强后再进行分析，首先采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行分析，得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息，将所述数据信息以坐标轴的形式表示，如图8。
另外采用深度神经网络的目标检测模型、分割模型、分析模型对采集到的数据信息进行分析。
实施例5
将培养至细胞融合达60% ~ 80%的乳腺癌细胞（MDA-MB-231）用胰蛋白酶消化，将细胞离心后重新悬浮于PBS中备用，将细胞接种在附有水凝胶基底的共聚焦小皿上，加入培养基（DMEM）放入温度为37℃，二氧化碳浓度为5%的细胞恒温培养箱中过夜培养，待细胞完全贴壁，将培养基换成含有铜死亡诱导剂的培养基，含有铜死亡诱导剂的培养基具体为伊利司莫浓度为1μM的DMEM培养基，然后置于共聚焦显微镜适配的活细胞工作站上，打开共聚焦显微镜的反射模块，开启延时采集功能，调整共聚焦的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，滤光片选择RT 15/85，激光强度为1%，采集时间为30min。
采集得到如附图9所示的细胞干涉条纹图像，采用图像处理软件image.J对获取的不同时间的干涉条纹图像进行降噪和增强后再进行分析，得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息，将所述数据信息以坐标轴的形式表示，如图10。
另外采用深度神经网络的目标检测模型、分割模型、分析模型对采集到的数据信息进行分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于反射共聚焦显微镜技术的细胞死亡类型识别方法，其特征在于，包括以下步骤：S1在共聚焦小皿上制备聚丙烯酰胺水凝胶基底，并进行黏附处理；S2接种细胞于基底中，使用诱导剂诱导细胞发生不同类型的死亡；S3使用反射共聚焦显微镜进行延时连续成像，采集细胞的干涉条纹图像，获得细胞干涉条纹图像随时间的变化信息；S4使用深度神经网络的目标检测模型对干涉条纹图像进行分割，提取单个细胞图像；S5使用深度神经网络的分割模型对干涉条纹图像进行分割，分别得到干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度随时间变化关系的数据信息；S6利用深度神经网络的分析模型对步骤S5得到的数据信息进行分类判断，得出细胞死亡类型结论。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺水凝胶基底的弹性模量7~10kPa；厚度为50~150μm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺水凝胶基底的制备方法如下：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺在催化剂和引发剂的作用下进行聚合得到；所述催化剂选自过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的一种；所述引发剂为TEMED(N,N,N',N'-四甲基二乙胺)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表面黏附处理具体为：（1）将附有基底的共聚焦小皿浸泡于PBS溶液使其达到溶胀平衡，取出备用；（2）取适量交联剂Sulfo-SANPAH，用无菌水稀释成500μg/mL的浓度，滴加至基底表面，并使用紫外灯照射10min，用PBS溶液冲洗3次，将表面多余的Sulfo-SANPAH洗掉；（3）将配制好的100μg/mL的Ⅰ型胶原蛋白溶液缓慢滴加至经表面固化处理的水凝胶基底上，均匀表面覆盖，37℃孵育2h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标检测模型对检测图像进行识别和定位之前，获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，并对所述图像中的单个细胞进行标注；以及使用带标注的所述图像训练神经网络模型，以得到所述目标检测模型。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分割模型对检测图像进行分割之前，获取大样本的细胞干涉条纹图像信息，对细胞干涉条纹图像中某一时间的干涉条纹波长、细胞铺展面积、细胞圆度进行标注，并使用带标注的干涉条纹图像对神经网络模型进行训练，得到分割模型。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析模型对所述数据信息进行分类之前，获取大样本的细胞死亡类型信息，所述细胞死亡类型信息包括细胞类型、细胞死亡类型、所述分割模型得到的数据信息；使用上述数据对神经网络模型进行训练，得到分析模型。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S6对结果输出阈值进行设定。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4采用图像处理软件对干涉条纹图像进行降噪和增强。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，反射共聚焦显微镜的激发光波长为638 nm，发射光谱为630-650 nm，激发光强度为1%，滤光片选择RT 15/85。
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| CN1288456A (zh) * | 1998-01-19 | 2001-03-21 | 宝酒造株式会社 | 具有细胞凋亡诱发能力的物质 |
| CN102037343A (zh) * | 2008-06-12 | 2011-04-27 | 东卡莱罗纳大学 | 用于三维衍射成像的流式细胞仪系统及方法 |
| CN107944360A (zh) * | 2017-11-13 | 2018-04-20 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种诱导多能干细胞识别方法、系统及电子设备 |
| CN111767809A (zh) * | 2020-06-18 | 2020-10-13 | 湖南理工学院 | 一种基于激光共聚焦显微技术的细胞智能识别方法 |
| CN115005768A (zh) * | 2022-04-08 | 2022-09-06 | 中南大学湘雅三医院 | 皮肤病图片分类方法、装置、产品及存储介质 |
-
2023
- 2023-08-25 CN CN202311077339.7A patent/CN116778483B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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