CN116769776A - 一种诱导甘蔗茎绵心发育的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导甘蔗茎绵心发育的启动子ProSsNAC1‑1及其应用。所述启动子ProSsNAC1‑1是从蔗茎绵心的甘蔗割手密种中克隆得到，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。分别将ProSsNAC1‑1和蔗茎实心的甘蔗热带种来源的启动子ProSoNAC1‑1与GUS基因构建融合表达载体，转化拟南芥，将T3代纯合转基因拟南芥植株分别在不同组织及低温和干旱胁迫下进行表达模式分析和组织化学染色。结果证实，启动子ProSsNAC1‑1比ProSoNAC1‑1具有较强的表达量；启动子ProSsNAC1‑1能驱动NAC1‑1基因在甘蔗叶脉和茎秆的维管束组织高效表达，且其受低温和干旱诱导。本发明的启动子ProSsNAC1‑1对甘蔗茎绵心发育调控、甘蔗品质改良具重要价值。
Description
技术领域
本发明属于植物分子生物学技术及分子检测技术领域，具体涉及一种诱导甘蔗茎绵心发育的启动子及其应用。
背景技术
现代甘蔗栽培品种是由热带种(Saccharum officinarum L.,2n＝80,x＝10)和割手密种(Saccharum.spontaneum L.,2n＝40～128,x＝8)经过种间杂交后，杂种与其他热带种进行回交，形成了遗传背景复杂的异源非整倍体，其有70～80％的染色体来自热带种，5～10％的染色体来自割手密种，其余的部分来自种间重组部分，杂种后代结合了祖先种的高糖、高产和高抗逆性等优良特性。同时，也携带了不良生物性状。比如:蔗叶的毛群发达、出苗率不整齐、蔗茎细小及绵心等不良性状。这些都给甘蔗杂交育种工作带来不小的挑战，严重阻碍甘蔗常规杂交新品种的选育进程。
启动子的调控可以控制基因表达水平、位置和表达方式，其是位于基因5’端近旁的一段具有调控作用，能作为RNA聚合酶和转录因子的结合位点。启动子的功能可以用报告基因进行检测，目前在植物启动子的研究中常用的报告基因包括β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)、绿色荧光蛋白基因(GFP)及其衍生出来的其他荧光蛋白(GFP和YFP)和荧光素酶基因(LUC)等，其中GUS报告基因存在于大肠杆菌(Escherichiacoli)等细菌的基因组中，编码β-葡萄糖苷酸酶。因为葡萄糖苷酶的背景活性在大多数植物中检测不到，因此该基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。转化拟南芥稳定表达也是常见的方式，研究表明MfNAC63基因启动子含有受光照、赤霉素、脱落酸、生长素调控的顺式作用元件，通过构建GUS融合表达载体、转化拟南芥和GUS组织化学染色表明MfNAC63启动子受到脱落酸、生长素和赤霉素的调节来驱动基因的表达。棉花GhKLCR1在非生物胁迫期间上调，GUS染色活性会随着处理的时间而增加。由此可见，遗传转化和组织化学染色对研究启动子功能具有重要的辅助作用。
甘蔗蔗茎富含水分与糖分，作为重要的糖料作物和生物能源作物，为全世界提供80％的食糖和26％的生物燃料。蔗茎是获取蔗糖分的最重要组织器官，对甘蔗产量起到决定性作用。但在实际甘蔗育种和种植过程中，常常会发现蔗茎组织出现绵絮状的结构，我们称之为“绵心”，会直接导致一些优良株系在品种育种过程中被淘汰，严重影响甘蔗杂交育种进程。但在甘蔗近缘属物种高粱中，已有研究表明甜高粱是持汁性基因的功能丧失导致，但在甘蔗中，已发现控制高粱的茎秆持汁性的直系同源基因NAC1-1基因在甘蔗割手密种和热带种中呈显著性差异表达，且已证实该基因是引起蔗茎绵心发育的关键基因之一。因此，研究分析蔗茎绵心发育特异性表达启动子，挖掘其受到哪些非生物胁迫引发靶标基因高效表达，使得蔗茎在不同生长发育时期或者生长年份中产生绵心现象，对甘蔗产量或经济效益造成重大损失。本发明不仅有助于解释甘蔗栽培品种蔗茎在不同年份的绵心现象，而且对于蔗茎实心新品种选育具有重要价值和意义。
发明内容：
本发明的目的是为了解决现有甘蔗育种过程中，经常发现一些甘蔗品系蔗茎出现的绵心表型，进而提出一种诱导甘蔗茎绵心发育特异性启动子及其应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种诱导甘蔗茎绵心发育的启动子ProSsNAC1-1，所述启动子ProSsNAC1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，扩增上述启动子ProSsNAC1-1的引物的核苷酸序列为：
F：5’-GGTCATCGCAAGATTGCACCG-3’，
R：5’-CGTCGCTGGGATAGAACCTGA-3’。
一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述的启动子ProSsNAC1-1。
进一步的，在上述重组表达载体中，启动子ProSsNAC1-1连接于载体中待表达的基因序列的上游。
一种重组菌，所述重组菌包含上述的重组表达载体。
进一步的，上述重组菌为重组农杆菌。
上述一种启动子ProSsNAC1-1在驱动目的基因表达中的应用。
上述一种启动子ProSsNAC1-1在研究甘蔗茎绵心发育调控机制中的应用。
上述一种启动子ProSsNAC1-1在甘蔗的遗传育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次发现、鉴定驱动目的基因表达诱导蔗茎产生绵心表型的启动子ProSsNAC1-1，未来可通过改造启动子碱基序列(改成热带种ProSoNAC1-1启动子)或沉默、干扰目的基因表达，并借助甘蔗遗传转化技术，对培育蔗茎非绵心的甘蔗新品种和新种质资源具有重要价值和意义。
附图说明
图1：蔗茎Evans-Blue染色及表型分析。
图2：NAC1-1基因在甘蔗叶片和蔗茎中的表达量。
图3：甘蔗割手密种NAC1-1基因在低温和干旱胁迫下的表达。
图4a：NAC1-1基因启动子的克隆。图4b：NAC1-1基因启动子的序列比对。
图5：转基因拟南芥的检测及GUS染色。
图6：干旱胁迫下转基因拟南芥叶片GUS基因表达。
图7：干旱胁迫下转基因拟南芥叶片染色。
图8：低温胁迫下转基因拟南芥叶片GUS基因表达。
图9：低温胁迫下转基因拟南芥叶片染色。
具体实施方式
下面结合实施例附图对本发明实施例中的技术方案做进一步的清楚、完整的描述，以便使本领域技术人员能够更好的理解本发明的创新点和特征。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1甘蔗野生割手密种和热带种蔗茎Evans-Blue染色和NAC1-1表达量分析Evans-Blue是一种非膜渗透性的染料，当细胞质膜受损，染料能进入细胞质和细胞核，从而将其染成蓝色。分别将蔗茎绵心的甘蔗野生割手密种SES208和蔗茎实心的甘蔗热带种Badila取蔗茎用去离子水清洗干净，用锋利的刀片切成2mm左右的小段，将新鲜材料浸泡在0.25％w/vEvensBlue(伊文思蓝)溶液中，染色5min，取出材料后用去离子水充分清洗，然后于去离子水中浸泡20min漂洗掉细胞表面多余的染液，再用滤纸吸干材料表面水分，在LeicaM125C立体显微镜(德国曼海姆莱卡)下观察拍照。结果如图1所示，甘蔗割手密种SES208蔗茎的绵心部位被染成蓝色，表明其蔗茎的维管束细胞部分死亡导致；相反，甘蔗热带种Badila蔗茎组织几乎没有染成蓝色，表明其蔗茎组织没有细胞死亡发生，显微镜观察结果与表型鉴定基本一致。
根据甘蔗NAC1-1基因的CDS序列设计实时荧光定量PCR引物：F：5’-GTGTTCCAGAAGCGGAAAGA-3’，R：5’-CCCGGCTGGTCTACTACATA-3’。分别选取甘蔗割手密种SES208和甘蔗热带种Badila在35d的苗期、9个月的成熟前期和12个月的成熟期的组织，包括正一叶(leaf)、茎3(由上至下第3茎节，stem3)、茎6(由上至下第6茎节，stem6)和茎9(由上至下第9茎节，stem9)，并提取RNA，反转录为cDNA为模板，利用RT-qPCR方法验证NAC1-1基因在甘蔗野生割手密种和热带种不同组织和不同发育时期表达量。结果如图2所示，与热带种相比，甘蔗割手密种NAC1-1基因在成熟前期的Stem6和Stem9呈现显著性高表达，分别为热带种的3.14和3.33倍，而在叶片和Stem3中的表达量与热带种没有差异。
选取生长45d的甘蔗割手密SES208植株幼苗进行非生物胁迫，以不进行非生物胁迫作为对照。低温处理：将幼苗放入4℃培养箱(光照及湿度充足)；干旱胁迫处理：将幼苗置于30℃培养箱，光照适宜，停止浇水。分别在处理0、12、24、48、72h采集甘蔗叶片样品，每5株设置1次生物学重复，每个样品3个重复，进行RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR验证。结果表明(图3)，在低温胁迫处理下，甘蔗割手密种NAC1-1基因的表达呈现先增加后降低的趋势，在处理第24h达到最大值，为对照的3.83倍；在干旱胁迫处理下，甘蔗割手密种NAC1-1基因的表达呈现逐渐上升的趋势，在处理第72h达到最大值，约为对照的11.94倍。以上结果表明，甘蔗割手密种NAC1-1基因可快速响应低温和干旱胁迫，尤其对干旱胁迫响应极为显著，该结果与实际生产过程中蔗茎产生绵心表型基本一致，如在有些天气极端(干旱、低温)的年份，甘蔗割手密SES208蔗茎常显示绵心表型，对其产量及品质造成严重危害。
实施例2甘蔗野生割手密种和热带种NAC1-1基因启动子序列的克隆分别以蔗茎实心的甘蔗热带种Badila和蔗茎绵心的甘蔗割手密种SES208蔗茎组织基因组DNA为模板，根据甘蔗割手密种基因组和甘蔗热带种基因组数据库参考基因组调取甘蔗NAC1-1基因起始密码子(ATG)上游2kb序列为靶标基因的启动子序列，运用Primer软件设计引物PCR扩增甘蔗NAC1-1基因启动子。
扩增甘蔗热带种NAC1-1基因启动子的引物的核苷酸序列为：
F：5’-TCGCTGGGATAGAACCTGAAC-3’，
R：5’-GCTCTACACCACGCCGAACACCTG-3’。
扩增甘蔗割手密种NAC1-1基因启动子的引物的核苷酸序列为：
F：5’-GGTCATCGCAAGATTGCACCG-3’，
R：5’-CGTCGCTGGGATAGAACCTGA-3’。
PCR扩增结果如图4a所示，获得符合预期目标片段序列，将其进行胶回收并送铂尚生物技术有限公司测序。甘蔗割手密种NAC1-1基因启动子命名为ProSsNAC1-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；甘蔗热带种NAC1-1基因启动子命名为ProSoNAC1-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。对克隆的启动子序列进行相似性比对，结果显示，两者DNA序列相似性高达77.49％；其中，位于第1～1260bp的序列相似性较低，约为65.51％；其余1261～2000bp相似性较高，约为99.05％(图4b)。
实施例3对甘蔗野生割手密种和热带种NAC1-1基因启动子预测顺式作用元件基于PlantCARE数据库预测启动子的顺式作用元件，结果如表1。甘蔗NAC1-1基因启动子具有RNA聚合酶结合的TATA框和CAAT框的转录调控元件，符合启动子的基本结构特征，能够保证基因转录的正常功能；此外，其还含有激素、非生物胁迫、生长发育及转录因子等相关顺式作用元件，在启动子ProSsNAC1-1和ProSoNAC1-1上存在明显差异的顺式作用元件，如非生物胁迫响应元件：低温(Low-temperature responsiveness,LTR)、干旱(MYB binding siteinvolve in drought-inducibility,MBS)和受伤诱导(Wound responsiveness,WUN-motif)及激素响应元件生长素(Auxin-responsive element,GA)，表明甘蔗NAC1-1基因启动子可能在干旱、低温和生长素诱导胁迫下，导致甘蔗割手密种和热带种NAC1-1基因表达量出现差异。
表1顺式作用元件预测
注：ABRE：参与非生物胁迫响应；TCA-elements：参与水杨酸响应；TGA-element：参与生长素响应；TGACG of CGTCA motif：参与茉莉酸响应；TATC-box：参与赤霉素响应；ARE：厌氧诱导有关；GC-motif：参与缺氧特异性诱导；LTR：参与低温响应；as-1 motif：与低温响应相关；WRE1 or 3：参与损伤反应；MBS：参与干旱诱导的MYB结合位点；WUN-motif：参与损伤反应；CAT-box：与分生组织表达有关；O2-site：参与玉米醇溶蛋白代谢调节；MYBandMYB-like：MYB结合位点；MYC：MYC结合位点；W-box：WRKY结合位点。
实施例4转基因拟南芥植株的检测及启动子活性验证
以pMDC163载体为骨干载体，通过同源重组的方法，将克隆的启动子ProSsNAC1-1或ProSoNAC1-1全长序列替换骨干载体GUS基因上游的CaMV35S启动子，从而构建重组表达载体ProSsNAC1-1::GUS和ProSoNAC1-1::GUS，以甘蔗NAC1-1基因启动子驱动GUS报告基因的表达。将重组表达载体转化农杆菌GV3101，制备农杆菌侵染液，利用农杆菌介导的花序浸染法获得转基因拟南芥植株。
转基因拟南芥的筛选：将在37℃恒温烘干3d的种子依次用75％+0.05％Tween20震荡浸泡2min，75％乙醇处理2min，无菌水清洗4次、每次2min；后将种子用枪头吸取点在1/2MS平板(潮霉素)上，4℃春化2～5d，放于22℃恒温人工气候室培养。
转基因拟南芥的鉴定：提取20d龄拟南芥莲座叶片DNA进行潮霉素抗性基因及目的启动子片段PCR验证，采用CTAB法进行DNA提取。
GUS组织化学染色：
(1)消毒后的种子放入1/2MS平板培养基，于人工气候室培养3～5d后，移植盆钵培养，约20d后进行染色；
(2)组织化学染色：先用无菌水冲洗阳性拟南芥植株，将其放置于GUS染色液中，于37℃恒温箱染色过夜以上，同时以野生型拟南芥为空白对照。
(3)用70％乙醇溶液中，连续洗脱2～3次，晾干。最后，将其放置在白纸上，分离茎、叶和花等组织并拍照保存，如果有GUS活性的部位，会呈现明显的蓝色。GUS染色液配制方法参考王晓雯等[119]和ShimingNi等[120]的报道。
将重组表达载体ProSsNAC1-1::GUS和ProSoNAC1-1::GUS遗传转化拟南芥，分别获得11株转ProSsNAC1-1启动子拟南芥植株和5株转ProSoNAC1-1启动子拟南芥植株，提取基因组DNA后，PCR扩增后电泳结果图5a显示，外源启动子的检测均符合预期目标片段大小，部分株系GUS报告基因的表达如图5b所示。随后对转基因拟南芥筛选纯合株系，选取萌发10d的T3代幼苗及25d拟南芥的叶、茎和花进行GUS染色分析，与野生型相比，转基因拟南芥叶片、叶脉、茎和花中均有被染成蓝色(图5c)，茎秆和叶脉的染色较深，表明GUS基因在拟南芥叶片、叶脉、茎和花中都表达，ProSsNAC1-1和ProSoNAC1-1属于组成型启动子，ProSsNAC1-1启动子驱动GUS基因活性明显高于ProSoNAC1-1。
实施例5转基因拟南芥植株在干旱胁迫下GUS基因的表达量及染色干旱胁迫处理：转基因拟南芥正常生长20d后，停止浇水进行干旱胁迫处理，每3d采样一次，采样时间点分别为停水后0、3、6和9d，以相同处理的野生型为对照。检测转ProSoNAC1-1启动子拟南芥和转ProSsNAC1-1启动子拟南芥幼苗GUS基因表达量并进行化学染色。
结果表明(图6)，干旱胁迫可显著诱导GUS基因的表达，并且转ProSsNAC1-1启动子拟南芥随着干旱胁迫天数的增加GUS基因呈现先增加后降低的趋势，在胁迫第3d表达量达到峰值，转ProSoNAC1-1启动子拟南芥GUS基因表达量也有一个短暂的增加，但ProSsNAC1-1驱动的GUS基因表达量显著高于ProSoNAC1-1。GUS组织化学染色表明(图7)，转ProSsNAC1-1启动子拟南芥和转ProSoNAC1-1启动子拟南芥叶片颜色呈现与定量结果一致的趋势，在胁迫第3d染色最蓝，与叶片叶肉组织相比，在叶脉中是更蓝的，这可能与在ProSsNAC1-1和ProSoNAC1-1驱动下GUS基因在叶脉高表达相关。总体上，转ProSsNAC1-1启动子拟南芥对干旱胁迫的响应明显的强于转转ProSoNAC1-1启动子拟南芥。
实施例6转基因拟南芥植株在低温胁迫下GUS基因的表达量及染色低温胁迫处理：在转基因拟南芥正常生长到20d大小时放入4℃恒温培养箱(湿度和光照充足)，取样的时间点为0、12、24、48、72h，以同样处理的野生型为对照。利用4℃低温胁迫生长20d的转ProSoNAC1-1启动子拟南芥幼苗和转ProSsNAC1-1启动子拟南芥幼苗，检测GUS基因的表达量，并对叶片进行GUS组织化学染色。
结果表明(图8)，低温胁迫能显著诱导GUS基因的表达，并且随着低温胁迫时间的增加，转ProSsNAC1-1启动子拟南芥GUS基因表达呈现逐渐上升的趋势，在胁迫72h表达量达到峰值；转ProSoNAC1-1启动子拟南芥GUS基因表达量也有增加，但相对于转ProSsNAC1-1启动子拟南芥明显更低，与野生型相比差异不显著。GUS组织化学染色表明(图9)，转ProSsNAC1-1启动子拟南芥和转ProSoNAC1-1启动子拟南芥叶片颜色与定量结果的趋势一致，在胁迫72h染色最深。总体上，转ProSsNAC1-1启动子拟南芥对低温胁迫的响应明显的强于转ProSoNAC1-1启动子拟南芥。
Claims (9)
1.一种诱导甘蔗茎绵心发育的启动子ProSsNAC1-1，其特征在于：所述启动子ProSsNAC1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的启动子ProSsNAC1-1，其特征在于：扩增所述启动子ProSsNAC1-1的引物的核苷酸序列为：
F：5’-GGTCATCGCAAGATTGCACCG-3’，
R：5’-CGTCGCTGGGATAGAACCTGA-3’。
3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含权利要求1所述的启动子ProSsNAC1-1。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于：在所述重组表达载体中，启动子ProSsNAC1-1连接于载体中待表达的基因序列的上游。
5.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含权利要求4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组农杆菌。
7.如权利要求1所述的启动子ProSsNAC1-1在驱动目的基因表达中的应用。
8.如权利要求1所述的启动子ProSsNAC1-1在研究甘蔗茎绵心发育调控机制中的应用。
9.如权利要求1所述的启动子ProSsNAC1-1在甘蔗的遗传育种中的应用。
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