CN116769720A

CN116769720A - 靶向gpc3且高表达ccl-19的四代cart细胞及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116769720A
Application number: CN202310671540.1A
Authority: CN
Inventors: 卢莉莉; 吴伟忠; 肖淑秀; 白金金
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2023-06-07
Filing date: 2023-06-07
Publication date: 2023-09-19

Abstract

本发明公开了一种靶向GPC3且高表达CCL‑19的四代CART细胞及其制备方法与应用。本发明根据GPC3单克隆抗体的氨基酸序列，按照VL‑Linker‑VH方式拼接成scFv，并根据密码子偏爱性转换为核苷酸序列，同时5’端加入BamHI酶切位点和信号肽，3’端加入NheI酶切位点，之后进行全基因合成，然后，CAR载体通过病毒转染进入到T淋巴细胞内。本发明针对肿瘤细胞具有免疫逃逸的特性，将高特异性GPC3抗体的单链可变区融合构建入CAR载体，能够更特异性识别和杀伤GPC3阳性表达的肝癌细胞；通过调整合适长度且灵活性的铰链区，保障CART的有效杀伤性；同时，高表达CCL‑19具有更强的活性。

Description

靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

目前靶向GPC3的四代CART细胞已有部分项目在开展临床试验，但临床疗效有限，CART细胞所具备的靶向性、释放细胞因子的水平、甚至体外扩增的活力等问题是限制其有效杀伤肿瘤细胞的重要因素。

目前许多针对该靶点的GPC3单克隆抗体存在质控困难、批间差异大、成本高、不稳定等缺点。因此，前期课题组利用表达全长GPC3的工程细胞，而非通过线性肽段或大肠杆菌来源方法免疫小鼠获取了GPC3单克隆抗体。该抗体能够特异性识别表达在工程细胞表面的GPC3，并在本课题组收集的肝癌组织以及细胞系中验证了其特异性表达。因此，选择此抗GPC3单克隆抗体的轻链可变区(V_L)及重链可变区(V_H)构建入第三代CAR载体中，期望有更强的组织特异性及靶向性。

抗原结合结构域和跨膜结构域之间的连接依赖于间隔域的存在。间隔域最简单的形式即IgG1铰链区，足以用于大多数基于scFv的结构。目前的CAR铰链区通常来自CD8α或免疫球蛋白分子。铰链区的大小和空间构象可以直接影响

CAR在体外的扩增效率以及体内的抗瘤效果。因此，在载体构建过程中需要选择合适长度且灵活性的铰链区，保障CART有效性杀伤的功能。

跨膜结构域，来自胞内结构域中最靠近膜的部分，由跨膜的疏水性α螺旋组成。嵌合抗原受体的稳定性与跨膜结构域有关。目前，使用较多的有CD3、CD28跨膜区。但有研究表明，CD28跨膜结构域相对更稳定，而CD3跨膜结构域对T细胞激活更明显。因此，构建的CAR结构中采用CD3跨膜区有望增强T细胞激活能力。

胞内区是嵌合抗原受体发挥功能的末端，抗原识别后受体聚集并激活信号传导给T细胞。在这过程中，需要有共刺激分子的参与。共刺激分子可以是CD28、CD134、CD137、Lck、ICOS以及DAP10等，其在决定CAR修饰淋巴细胞激活阀值、应答类型和存活时间等方面具有重要作用。但最近的研究表明，CD28和4-1BB信号的联合递送信号不仅可以增强CAR亲和力，提高其体外免疫治疗的潜力，而且不会增加脱靶的毒性。

随着CAR技术的优化以及对T细胞信号传导的深入研究并结合特定肿瘤免疫微环境因素，产生了第四代CAR，也称为TRUCK(T cells redirected for universalcytokinemediated killing)。其引入的结构域能诱导分泌大量细胞因子，进一步增强T细胞应答。目前已陆续开发出不同类型的分子用于构建TRUCK，例如IL-12、IL-15、IL-18，以及组成性活跃的细胞因子受体，例如IL-7受体(C7R)等。

出于以上制约CART疗效的因素出发，因此通过体外结构改造，培养方案优化，增强CART杀伤肿瘤细胞效应具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是：针对目前四代CART细胞所存在的靶向性不足、释放细胞因子的水平有限、甚至体外扩增活力不高、杀伤肿瘤细胞水平有限等问题限制了其临床应用，本发明提出一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞的构建及体外扩增方法，所构建的CART细胞进入体内可抵抗肿瘤抑制性免疫微环境，同时产生的记忆表型CART细胞能够长效地杀伤肿瘤细胞。

为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞，所述CART细胞通过以下步骤获得：

步骤1：从GPC3抗体杂交瘤细胞中提取RNA，经过反转录PCR获得cDNA，并通过核苷酸沉淀法纯化产物；

步骤2：利用cDNA为模板，扩增出GPC3单克隆抗体的VH和VL基因；

步骤3：LV载体通过限制性内切酶BamHI和NheI酶切获得CAR载体质粒，再与目的基因片段VH和VL基因连接，获得含有GPC3单克隆抗体的VH和VL可变区的目的质粒；

步骤4：将目的质粒转化扩增，通过慢病毒包装系统进行病毒包装，制备成病毒液，将制备好的慢病毒液体进行浓缩、纯化，以保证一定的病毒滴度；

步骤5：采用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中进行T细胞分选，然后来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞；其中，T细胞的激活采用含IL-15细胞因子的血清培养基培养，并在转染后的第二天和每传代一次的培养体系中添加IL-15细胞因子进行培养。

本发明还提供了一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤2：利用cDNA为模板，扩增出GPC3单克隆抗体的VH和VL基因；

步骤3：LV载体通过限制性内切酶BamHI和NheI酶切获得CAR载体质粒，再与目的基因片段VH和VL基因连接，再通过源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2A(简称T2A)片段将IL-7及CCL-19元件构建入CAR载体中，获得含有GPC3单克隆抗体的VH和VL可变区的目的质粒载体GPC3-IL-7-CCL-19-CAR；

步骤5：采用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中进行T细胞分选，然后来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞；其中，T细胞的激活采用含IL-15细胞因子的血清培养基培养，并在转染后的第二天以及每传代一次的培养体系中需添加IL-15细胞因子。

本发明还提供了上述的靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞在制备治疗肝癌的产品中的应用。

本发明中，根据GPC3单克隆抗体的氨基酸序列，按照VL-Linker-VH方式拼接成scFv形式，并根据密码子偏爱性转换为核苷酸序列，同时5‘端加入BamHI酶切位点和信号肽，3’端加入NheI酶切位点，之后进行全基因合成。在这之后，CAR载体可以通过病毒转染技术、转座酶或转座子系统或mRNA电穿孔方式进入到T淋巴细胞内。

目前CAR T细胞制品多以CAR T阳性细胞数作为临床使用剂量，而非总CAR T细胞数。以此来评价CAR T细胞发挥杀瘤效果更具科学性。因此，在构建CAR T细胞时，建立稳定且高效的CAR T转染及扩增技术，是研究的基石。

本发明是在三代CAR结构上通过源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2A(简称T2A)片段将IL-7及CCL-19元件构建入CAR载体中，因此，连同载体长度，整个四代目的CAR片段大小达到10000多bp，这意味着对于转染的技术要求是十分高的。

影响CAR转染效率的因素有很多。决定性因素包括：包装细胞(HEK-293T)的状态、质粒大小特别是包装片段的大小、包装质粒浓度、病毒滴度等。为了提高转染效率本发明中进行了如下优化：首先，需要将制备好的慢病毒液体进行浓缩、纯化，以保证一定的病毒滴度。感染T细胞操作时，T细胞应处于活化的状态。

与此同时，在加入病毒液后，使用病毒感染增强剂如NovoNectin或Polybrene(有一定细胞毒性)，采用水平离心的方法进行感染，这样使病毒颗粒能够更好地与T细胞接触增加感染效率。在感染12-24小时期间要密切观察CART细胞状态，及时换液。

对于将来有临床转化应用转化考虑的CART研究，若为检测方便而使用GFP等标记基因的做法不可取。标记基因添加与否，会影响病毒包装效率和CAR的表达效率，回输至患者体内也是不可取的。本发明中，只有一组对照GPC3-CAR结构中加入EGFP，仅为了方便观察转染效率，而目的GPC3-IL-7-CCL19-CART细胞将来展望应用于临床研究中，故不添加任何荧光基团。

本发明中，在转染后的第二天以及每传代一次的培养体系中添加了IL-15细胞因子，也证实了相较于单纯添加IL-2，CART细胞状态更佳，增殖效率更高。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明针对肿瘤细胞具有免疫逃逸的特性，高特异性GPC3抗体的单链可变区融合构建入CAR载体，该CART细胞对GPC3阳性表达肝癌细胞存在更特异性识别和杀伤；在载体构建过程中调整合适长度且灵活性的铰链区，进一步保障CART有效性杀伤的功能；

(2)本发明构建的四代靶向GPC3且高表达CCL-19的CART细胞，加入了高剂量的CCL-19趋化因子元件和低剂量的IL-7细胞因子，低剂量的IL-7可维持CAR-T细胞活力，并且不会过度刺激T细胞发展为终末端分化表型导致细胞耗竭状态，与此同时，联合体外添加的rhIL-15细胞因子可更有效地维持后期体内CAR-T细胞的增殖活力及对抗细胞凋亡能力；高剂量的CCL-19趋化因子元件可以使CART细胞招募更多的DC细胞，从而更为有效地激活初始T细胞；

(3)本发明在培养CART过程中，加入rhIL-15细胞因子组合，联合GPC3-IL-7-CCL-19-CART细胞分泌的IL-7，可使细胞具有长效增殖活性及具有记忆表型，可更高效且持续地杀伤肿瘤细胞。

附图说明

图1为CAR载体质粒结构图；

图2为T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞的流程图；

图3为肝细胞癌组织及癌旁组织中的GPC3表达情况；A&B：GPC3单克隆抗体染色后，在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况；C：GPC3分别在肝癌组织及癌旁组织中IOD值统计；****，p≤0.001；

图4为GPC3蛋白在各正常组织中表达情况，200倍拍摄，标尺：100μm；

图5为GPC3蛋白在HCC细胞系中的表达水平；

图6为CAR载体及其对照组结构设计示意图；

图7为包装辅助质粒转化扩增验证图；A：慢病毒包装所需辅助质粒Plp-1，Plp-2及p-LP-VSVG结构图；B.Plp-1，Plp-2及p-LP-VSVG酶切后跑胶验证条带；

图8为GPC3-CAR在HEK-293T细胞中转染效率；A：GPC3-CAR质粒转染HEK-293T细胞后的荧光及白光效果图；B：24和48小时感染效率统计图；

图9为各组CAR T细胞培养及鉴定；A：GPC3-CAR病毒感染活化后T细胞培养至第5天、第7天及第10天时，荧光显微镜下拍摄CAR阳性细胞图；B：CAR病毒液感染T细胞后第10天，通过流式鉴定各组CAR CAR阳性细胞T细胞比例；

图10为细胞生长增殖曲线图；A：GPC3-IL-7-CCL-19-CART细胞分别在第6天、第12天时，添加/不添加IL-15细胞因子镜下观察生长情况图；B：各组CART细胞增殖曲线图；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.005；

图11为肝癌原代细胞杀伤试验；A：通过CFSE/PI分别对患者肝肿瘤消化后单细胞及CART细胞进行染色，12小时共培养后，流式检测杀伤效率图(效靶比5：1)；B：效靶比分别为1：1和5：1时，各组CART细胞对于肝癌细胞的杀伤效率统计图，n＝3，GPC3⁺HCC样本，采用Two-way ANOVA分析，****，p≤0.001；**，p≤0.01；*，p≤0.05；

图12为四组CART细胞对于肝癌组织微球的杀伤作用，激光共聚焦下，20倍镜拍摄，CART细胞(绿色，CFSE，激发光494nm)，肿瘤组织微球(紫色，violet，镜下呈现蓝色，激发光450)，细胞死活(红色为死细胞，DRAQ7，激发光647nm)；

图13为各组CART分泌细胞因子水平；微流控芯片中收集各组CART与HCC组织微球培养后上清，检测分泌细胞因子水平；n＝3，采用Two-way ANOVA分析，****，p≤0.001；***，p≤0.005；**，p≤0.01；*，p≤0.05；

图14为不同剂量的IL-7(A)和CCL-19趋化因子(B)培养CART细胞的结果；*，p≤0.05；**，p≤0.01；***，p≤0.005；****，p≤0.001。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

本发明实施例中所用实验材料列举如下：

1.GPC3单克隆抗体特异性验证所需材料：

1)临床组织标本：

37对肝细胞肝癌组织及癌旁组织；

人肝、肺、肾、睾丸、胃、卵巢、输卵管组织。

2)肝癌细胞株：

HepG2，Hep3B，SMMC7721，Huh7，MHCC97L，MHCC97H；

2.CAR载体的构建及体外高效扩增体系建立所需材料：

1)GPC3(GC33)人源化抗体；

2)质粒：

i.Vector-CAR；

ii.GPC3-CAR-EGFP(实施例中构建)；

iii.GPC3-IL-7-CCL-19-CAR(实施例中构建)；

iv.IL-7-CCL-19-CAR(实施例中构建)；

v.G：包装质粒Gag/pol；

vi.R：包装质粒REV；

vii.V：包装质粒VSVG；

3)细胞株：

HEK-293T细胞；

4)临床样本：

住院患者/志愿者外周血50ml。

实施例

一、四代CART细胞的构建及体外扩增方法：

1、从GPC3抗体杂交瘤细胞中提取RNA，经过反转录PCR获得cDNA，并通过核苷酸沉淀(NaAc-EtOH法)纯化产物，反转录PCR反应体系如表1所示，反应条件为：42℃，15分钟；95℃，3分钟。

表1cDNA合成和gDNA去除反应体系

2、GPC3单克隆抗体可变区扩增：cDNA用RNase-Free Water稀释5倍后使用，根据表2条件配置PCR反应体系。根据表3设置PCR仪反应条件及时间，扩增出VH和VL基因。之后通过凝胶电泳验证、回收及纯化产物。

表2PCR反应体系

表3PCR反应条件

3、CAR载体质粒酶切：载体由二军大陆斌教授提供，LV载体全长7400bp，加上CAR结构约1600bp，结构如图1所示，按照表4配制质粒酶切体系，放入掌上离心机快速混匀，并做好标记。放置于37℃水浴反应1～3小时；然后70℃水浴10分钟中止反应，最后，电泳检测并跑胶验证酶切效果。

表4质粒酶切体系

再通过源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2A(简称T2A)片段将IL-7及CCL-19元件构建入CAR载体中，经过PCR程序，得到GPC3-IL-7-CCL-19-CAR质粒载体。

4、质粒转化扩增，然后按照表5配制慢病毒包装质粒体系，与HEK-293T细胞共培养，制备成病毒液，将制备好的慢病毒液体进行浓缩、纯化，以保证一定的病毒滴度。

表5慢病毒包装质粒体系

5、利用外周血淋巴细胞分离液Ficoll提取健康人外周血中单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，采用免疫磁珠法(MACS)进行T细胞分选，接下来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞，流程如图2所示，具体过程如下：

第一天(T细胞激活)：

(1)将分离出的T细胞用含10％血清，IL-15细胞因子(1：1000)的培养基重悬，计数；

(2)24孔板铺板，1×10 ⁶cells/well/1ml淋巴细胞培养基；

(3)加入每孔加入25μl CD3/CD28 beads(beads预先用培养基洗涤3次，清洗beads不要取下离心管，重悬液体加入其中，旋转管子，静置2分钟后再走上清液)；

第二天(慢病毒感染T细胞)：

(4)观察细胞状态，是否成团；

(5)状态好的情况下，吸取一半的PBMC(500ml)到新的孔；

(6)加入0.5μl(1:2000，5ng/ml，50IU/ml)IL-2，500ml新鲜培养基；

(7)将冻存的病毒液恢复室温，用移液枪轻轻吹打10秒，再加入孔板，50ml/well。

(8)加入1μl Polyberene(5mg/ml)，混匀；

(9)离心32℃，800g，升速5，降速0，45分钟；

(10)离心结束后，用枪头混匀或者轻拍孔板混匀；

(11)6～12小时，观察细胞状态，若没有明显的细胞毒性，24小时后吸除上清，加入2ml培养基；

第四—七天(CAR T细胞扩增)：

(12)每天，每孔吸除1ml培养基，加入1ml新鲜的含IL2、IL15的完全培养基，共2ml。第二天，吸除1ml，剩余1ml，一分为二，每孔500ml，每孔补加1.5ml含IL2、IL15的培养基。以此方法培养四天；

(13)取100μl用于流式检测；

第八天(去磁珠)：

(14)将所有细胞放入流式或15ml离心管，离心，1200rpm，5分钟，用2ml含有培养基重悬；

(15)放于磁柱上去除磁珠；

(16)再加入12.5ml只含有IL15的培养基，转入T25培养瓶；

(17)加入25μlCD3/CD28 beads；

第九天-十二天：

(18)计数，按照每1×10 ⁶个细胞量加入1ml培养基量加入淋巴细胞培养基。

以上流程中，需要注意的是，感染T细胞操作时，T细胞应处于活化的状态(利用CD3CD28beads刺激)。与此同时，在加入病毒液后，使用病毒感染增强剂如Polybrene(有一定细胞毒性)，采用水平离心的方法进行感染，这样使病毒颗粒能够更好地与T细胞接触增加感染效率。在感染12-24小时期间要密切观察CART细胞状态，及时换液。

二、实验结果

1、检测了37例配对的肝细胞癌组织及癌旁组织中的GPC3表达情况，根据统计，在接近60％的肝细胞癌中，GPC3呈现强阳性表达(++和+++)，还有15％左右的肝细胞癌组织呈现弱阳性表达。

如图3A，B所示，GPC3分子定位于细胞膜、细胞外基质；在肝癌组织中的染色情况明显高于癌旁组织(0.6684±0.02499vs.0.2449±0.01843，P<0.0001，N＝37；图3C)。

2、在CART细胞治疗在临床试验开展以来，细胞因子风暴、脱靶效应以及神经毒性是CART疗法在应用过程中最为常见也最为棘手的安全性问题。针对细胞因子风暴的控制，已有不少研究及临床干预方案进行有效控制。然而，针对CART脱靶效应的风险控制研究多停留血液肿瘤中，如采取双特异性(双靶点)CART策略。针对实体肿瘤，在靶点的挑选上应尽量选择在人体正常组织中低表达甚至不表达的蛋白。

如图4所示，GPC3蛋白在成年人的正常肾脏、卵巢、肺、输卵管等组织中均表达阴性。可初步证明我们用此单克隆抗体构建的CAR是相对安全的。

3、通过蛋白质印迹检测，考察GPC3蛋白在七株常用肝癌细胞系HepG2，Hep3B，SMMC7721，Huh7，MHCC97L，MHCC97H，PLC中的本底表达水平，如图5所示。条带显示：HepG2和细胞均高表达GPC3蛋白，Huh7细胞次之，而SMMC 7721几乎不表达GPC3分子。因此，HepG2、Hep3B和SMMC 7721细胞可被筛选为后期功能验证性试验所需的GPC3阳性及GPC3阴性肝癌细胞以验证目的CAR-T细胞的体外杀伤活性研究。

4、实验中为了考察GPC3-7-19-CAR感染的T细胞体内外对抗GPC3阳性肝细胞癌的作用及机制，设计并构建了四组CAR质粒，结构如图6所示。其中，Vector-CAR作为其阴性对照质粒，GPC3-CAR则是作为传统靶向GPC3蛋白的CAR，比较其与目的GPC3-7-19-CAR T细胞对肝癌细胞的杀伤作用。与此同时，构建的7-19CAR则不具有GPC3靶向性结构，比较其对GPC3阳性和阴性肝癌细胞的抑制作用强弱。

5、在构建CAR T细胞前，首先对转染所需的辅助包装质粒系统进行转化扩增与鉴定，以保证慢病毒转染效率。包装质粒结构及酶切位点如图7A所示，酶切后片段大小经跑胶后条带如图7B所示。

6、由于考虑到后期临床转化需求，在设计目的CAR T细胞(GPC3-IL-7-CCL-19-CART)时，并未加入任何荧光报告基因及EGFP，而是将作为对照组中的传统GPC3-CAR载体中加入了EGFP序列，以便于在体外研究中检测。通过脂质体Fugene HD转染GPC3-CAR至HEK-293T细胞的的转染效率在24小时后可达80％左右，而由于细胞状态不佳的原因，48小时病毒液转染效率明显降低，如图8所示，因此选择24小时收集的病毒液进行下一步T淋巴细胞的转染。

7、将包装好的四组CAR慢病毒液通过离心法感染激活状态下的T细胞，前期构建的传统GPC3-CAR结构中自带EGFP荧光序列，即希望通过荧光显微镜随时可观察到CAR病毒转染的效率。但由于CAR载体片段较大，因此在感染5天后才可在荧光显微镜下明显观察到对照组GPC3-CAR T(含EGFP)细胞感染情况。如图9A所示，随着感染天数的增长，荧光信号逐渐增强，成团的大部分T细胞已被感染上。

进一步通过流式检测，结果显示，各组CAR阳性T细胞比例均在50％-60％左右(图9B)，符合了目前报道的CAR T类产品的质量标准(一般要求临床用CAR阳性T细胞比例达到20％以上)。这为后期探索CAR T细胞在肝癌中的作用及机制研究提供了基础。

8、只有T细胞在体外能够持续地扩增才能够保证将来临床应用的可行性，因此，我们在体外培养过程中，从刺激后的第二天开始添加IL-15细胞因子，并比较了添加IL-15因子后CART细胞的增殖效率，结果发现在有IL-15因子的培养下，CAR T细胞在培养至第七天后迅速增殖，细胞总量12天即能扩增200倍左右，高于常规只添加IL-2因子培养方法的增殖效率，如图10所示。

实施例2

本实施例利用微流控3D培养技术(由哈佛医学院，Belfer中心研究人员共同研发，已被美国FDA批准应用于某些肺癌临床药物评价)进一步验证GPC3-IL-7-CCL19-CART在HCC患者新鲜肝癌组织球体外模型中的作用。

1、患者组织样本的获取

在手术前一天，核对患者信息及待取肿瘤类型，组织的大小。取既往穿刺切片GPC3阳性HCC患者，共计5例，既往均有HBVG感染史，手术前HBV量低于检出下线。

手术当日，取HCC患者手术切除的新鲜肝癌组织样本1～2cm³。

2、肝细胞肝癌原代细胞与CART细胞共培养杀伤试验；为了验证GPC3-IL-7-CCL19-CART细胞在临床患者的治疗及应用前景，将新鲜手术切除的GPC3阳性肝肿瘤组织消化后成单细胞，与各组CART细胞进行共培养24小时后，通过流式鉴定杀伤效率。实验结果显示，在效靶比达到5：1时，GPC3-IL-7-CCL19-CART细胞的杀伤效率可达到70％左右，高出传统GPC3-CART细胞杀伤效率25％左右(图11)，而另外两组CART细胞(Vec-CART，7-19-CART)对于肝癌原代细胞的杀伤能力更弱。

3、GPC3-IL-7-CCL19-CART在肝癌组织类器官体外3D培养模型中细胞杀伤作用，组织类器官3D培养芯片模拟了肿瘤细胞在体内的生产环境，并确保了正常的细胞行为。通过构建的GPC3阳性HCC组织微球体外模型，经7天培养后，与效应CART细胞共培养后，利用激光共聚焦显微技术，观察效应细胞的杀伤作用十分直观且对于评估CART细胞在临床治疗中的作用有重要意义。

因此，实验中选取了三例GPC3阳性的HCC患者肿瘤组织进行消化成单细胞后，通过Cell trace violet进行细胞染色后，将HCC原代细胞铺种至组织类器官微流控芯片的中央孔道中。随后，我们将各组CART细胞进行CFSE的染色(除了GPC3-CART组细胞自带EGFP及luciferase荧光基团)，并通过DRAQ7染料进行细胞死活的鉴定染色后，加入芯片的两侧通道，最终通过激光共聚焦成像系统观察CART细胞对于肝癌原代细胞的杀伤活力。结果显示，GPC3-IL-7-CCL19-CART细胞在12小时后，已经从两侧通道向中间种植有肿瘤组织微球的孔道迁移并开始对靶细胞进行杀伤，无论是杀伤效果还是向肿瘤组织的迁移过程都明显由于传统的GPC3-CART细胞组。而另外两组对照细胞的杀伤作用几乎观察不到(图12)。

4、GPC3-IL-7-CCL19-CART在肝癌组织类器官体外3D培养模型中分泌细胞因子水平，收集上述微流控芯片孔道中的上清液，通过ELISA检测四组CART分泌细胞因子情况。实验结果显示：相比对照组及传统GPC3-CART组，GPC3-IL-7-CCL19-CART组能够分泌更高水平的IL-7、CCL-19，以及效应分子IFN-γ、TNF-α，如图13所示。

5、低剂量的IL-7和高剂量的CCL-19是更有利的；随着培养时间的增长，低剂量的IL-7(10ng/ml)培养条件比高剂量的IL-7(50ng/ml)增殖效率明显高，高剂量组IL-7会逐渐失去扩增能力，如图14A所示；其次，我们体外通过加入不同剂量的CCL-19趋化因子(低剂量组10ng/ml，中剂量组50ng/ml，高剂量组100ng/ml)发现，随着CCL-19浓度的提高，CART细胞招募DC细胞的数量随之增加，如图14B所示。

上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞，其特征在于，所述CART细胞通过以下步骤获得：

步骤2：利用cDNA为模板，扩增出GPC3单克隆抗体的VH和VL基因；

步骤3：LV载体通过限制性内切酶BamHI和NheI酶切获得CAR载体质粒，再与目的基因片段VH和VL基因连接，再通过源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2A片段将IL-7及CCL-19元件构建入CAR载体中，获得含有GPC3单克隆抗体的VH和VL可变区的目的质粒；

步骤5：采用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中进行T细胞分选，然后来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞；T细胞的激活采用含IL-2和rhIL-15细胞因子的血清培养基培养，并在转染后的第二天以及每传代一次的培养体系中需添加IL-2和rhIL-15细胞因子。

2.一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤2：利用cDNA为模板，扩增出GPC3单克隆抗体的VH和VL基因；

步骤5：采用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中进行T细胞分选，然后来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞；其中，T细胞的激活采用含IL-2和rhIL-15细胞因子的血清培养基培养，并在转染后的第二天以及每传代一次的培养体系中需添加IL-2和rhIL-15细胞因子。

3.如权利要求1所述的靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞在制备治疗肝癌的产品中的应用。