CN116769010A - 一种人源重链铁蛋白突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛋白工程和生物医药技术领域，具体涉及一种人源重链铁蛋白突变体及其制备方法和应用。本发明利用结构信息学的分析方法，确定铁蛋白亚基中可以替换成糖基化位点且不影响铁蛋白自组装成笼特性的关键区域。其中，loop是蛋白质最活跃的部分，决定着蛋白质的稳定性、柔韧性和动态活性。最后，在不影响蛋白质整体骨架结构的前提下，选择在灵活摆动的AB loop位置和DE转角位置进行糖基化识别序列替换，从而使亚基发生重排，获得具有多靶点糖基化序列的人源重链铁蛋白突变体，从而可作为药物载体应用于药物制备中，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种人源重链铁蛋白突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于蛋白工程和生物医药技术领域，具体涉及一种人源重链铁蛋白突变体及其制备方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

纳米药物载体是癌症免疫治疗领域的研究热点，能够有效解决传统癌症治疗药物水溶性差、易降解、毒副反应高等问题。然而，现有的纳米递送系统仍存在靶向性不足、生物安全性差及药物包封率低等弊端，距离临床应用还有一定的差距。因此，研发具有较强负载能力、良好生物安全性和精准靶向性的理想纳米药物载体对肿瘤治疗具有重要意义。

蛋白质作为药物载体不仅能够减少药物副作用，还可以提高药物的治疗效果，从而帮助药物更好地发挥药效。当前，利用蛋白质的自组装特性构建具有特定生物学功能的可控自组装载体在材料科学和纳米生物技术中已被广泛应用。其中，铁蛋白作为低毒性、高生物相容性的天然蛋白质纳米笼一直是生物纳米材料领域的研究焦点。

铁蛋白是生物体内能够储存铁的必需蛋白，在不同物种中结构高度同源。铁蛋白形状尺寸均匀，结构稳定，具有较高的生物相容性和生物降解性，且易于功能化修饰。此外，由于其尺寸较小，更容易渗透进入肿瘤组织且滞留时间更长。因此，铁蛋白具有作为纳米药物载体的潜力。并且铁蛋白作为药物递送系统(Drug delivery systems，DDS)能够以重组蛋白的形式进行高产量生产，易于纯化。基于以上特性，铁蛋白纳米笼被广泛用于各种传染病及癌症免疫治疗中。

而糖类作为天然有机化合物，具有较好的靶向特异性和安全性，能够修饰药物载体并定向释放抗癌药物。目前已有大量糖类修饰的纳米递送系统如脂质体、聚合物纳米粒子和共聚物胶束等被广泛用于治疗肿瘤等疾病。糖基化修饰能够影响蛋白质的生物合成、折叠和免疫原性，且已成功应用于增强蛋白药物药效和延长蛋白在血浆中的半衰期。因此，对铁蛋白进行糖基化修饰，有望提高蛋白药物载体的靶向性和生物安全性，推动癌症治疗技术的发展。

已经报道的人源重链亚基铁蛋白(Ferritin heavy chain，FTH)的亚基的α-螺旋上存在天然的N-糖基化位点，由于空间位阻导致糖基转移酶对识别位点产生影响，导致糖基化修饰比较困难，对糖供体的利用效率并不高，导致难以合成糖蛋白。

在现有的研究中，对铁蛋白的改造大都集中在探究铁蛋白的N端，通过基因融合用于呈递抗原，以及利用各种方法对铁蛋白进行改造来探究亚基各个区域或氨基酸残基对铁蛋白功能及自组装的影响。目前尚未有研究报道对人源重链铁蛋白的糖基化位点进行改造以及铁蛋白糖基化修饰的功能探究。

糖基化修饰对铁蛋白的结构和功能具有重要影响。而酶法合成是一种安全、温和、高效的技术手段，利用N-糖基转移酶可直接将糖供体中的单糖部分转移至铁蛋白天冬酰胺侧链上，快速实现铁蛋白糖基化。此外，由于铁蛋白靶向肿瘤具有广谱性，利用不同的糖基配体修饰铁蛋白，还可以进一步精准增强其靶向特异性。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供一种人源重链铁蛋白突变体及其制备方法和应用。本发明利用结构信息学的分析方法，确定铁蛋白亚基中可以替换成糖基化位点且不影响铁蛋白自组装成笼特性的关键区域。其中，loop是蛋白质最活跃的部分，决定着蛋白质的稳定性、柔韧性和动态活性。最后，在不影响蛋白质整体骨架结构的前提下，选择在灵活摆动的AB loop位置和DE转角位置进行糖基化识别序列替换，从而使亚基发生重排，获得具有多靶点糖基化序列的突变体。基于上述研究，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种人源重链铁蛋白突变体，所述人源重链铁蛋白突变体具有如SEQ ID NO.1-4任意一项或多项所示的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码上述第一方面所述的人源重链铁蛋白突变体。

本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述第二方面所述的多聚核苷酸。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的载体或染色体整合有上述第二方面所述的多聚核苷酸或表达上述第一方面所述人源重链铁蛋白突变体。

本发明的第五方面，提供了一种制备上述人源重链铁蛋白突变体的方法，包括步骤：培养上述第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的人源重链铁蛋白突变体；以及分离纯化获得人源重链铁蛋白突变体。

本发明的第六方面，提供上述第一方面所述人源重链铁蛋白突变体、第二方面所述多聚核苷酸、第三方面所述重组表达载体、第四方面所述宿主细胞在制备药物或药物载体中的应用。

具体的，所述药物可以包含现有任意已知具有预防和/或治疗疾病的成分，包括但不限于核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。更具体的，所述药物可以为抗肿瘤药物。

所述药物载体可以为糖蛋白纳米药物载体。

具体的，上述人源重链铁蛋白突变体作为药物载体，在不影响自组装的前提下，相较于野生型FTH酸稳定性显著降低，解聚条件更温和，并且得到loop区存在糖基化位点，利用N-糖基转移酶能将单糖快速转移至含有N-X-S/T序列的蛋白上，形成糖蛋白；进一步利用其它的糖基转移酶对合成的糖蛋白进行修饰，能用于生产带有多糖修饰的药物载体蛋白。

本发明的第七方面，提供一种药物，所述药物其载体至少包含上述人源重链铁蛋白突变体。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案提供的人源重链铁蛋白突变体，属于药物载体中的一种具有良好生物相容性的基于生物内源性大分子的“纳米笼”结构，其与野生型FTH相比酸稳定性显著降低，解聚条件更温和可控，并且改造后实现纳米笼存在多靶点糖基化序列，可以在体外简单快速的进行N-糖基化修饰生产带有一个糖的铁蛋白，进一步可以利用其他的糖基转移酶对糖链进行修饰，从而获得目的糖蛋白。这为优化铁蛋白糖基化修饰提供了一种新的途径，并为其他笼形蛋白的设计改造提供新思路，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：FTH-13、FTH-16是蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果

其中：M表示蛋白Maker；FTH-13理论分子量为27.13kDa；FTH-16理论分子量为27.21kDa。

图2：野生型蛋白及FTH-13、FTH-16突变体非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。

图3：Native-PAGE探究FTH-13、FTH-16突变体的酸碱稳定性。

图4：在中性条件下，透射电镜(TEM)分析FTH-13、FTH-16突变体蛋白

图5：FTH-4DANYTK，FTH-4DANYTK-13和FTH-4DANYTK-16的序列比对。

图6：铁蛋白突变体FTH-16的体外糖基化修饰的SDS-PAGE验证。

图7：FTH-8、FTH-19蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果。

其中：M表示蛋白Maker；FTH-8理论分子量为27.30kDa；FTH-19理论分子量为27.38kDa。

图8：野生型蛋白及FTH-8、FTH-19突变体非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)。

图9：Native-PAGE探究FTH-8、FTH-19突变体的酸碱稳定性。

图10：在中性条件下，透射电镜(TEM)分析FTH-8、FTH-19突变体蛋白。

图11：FTH-4DANYTK，FTH-4DANYTK-8和FTH-4DANYTK-19的序列比对。

图12：FTH-8、FTH-19突变体体外糖基化修饰的SDS-PAGE验证。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种人源重链铁蛋白突变体，所述人源重链铁蛋白突变体具有如SEQ ID NO.1-4任意一项或多项所示的氨基酸序列。

其中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的人源重链铁蛋白突变体命名为铁蛋白突变体FTH-13，其对人来源(Homo sapiens)的重链亚基铁蛋白经过43-DRDDVA-48→GGNWTT单点突变获得。

氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的人源重链铁蛋白突变体命名为铁蛋白突变体FTH-16，其对人来源(Homo sapiens)的重链亚基铁蛋白经过43-DRDDVA-48→DANYTK单点突变获得。

其中，铁蛋白突变体FTH-13、铁蛋白突变体FTH-16这两种突变体经改造后，ABloop仅发生轻微摆动，尚未影响亚基间和界面间的相互作用，蛋白质空间结构没有改变，仍然可以自组装成笼。并且铁蛋白笼上的糖基化位点数目大幅提高，显著增强糖基化效率，能够实现在体外简单快速的合成末端为半乳糖或葡萄糖的糖蛋白。此外，突变后还能够影响铁蛋白的酸稳定性，使得自组装调控方式更加温和(pH为6.0)，这为药物包载与递送提供了新方法。

氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的人源重链铁蛋白突变体命名为铁蛋白突变体FTH-8，其对人来源(Homo sapiens)的重链亚基铁蛋白经过160-GAPESG-165→GGNWTT单点突变获得。

氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的人源重链铁蛋白突变体命名为铁蛋白突变体FTH-19，其对人来源(Homo sapiens)的重链亚基铁蛋白经过160-GAPESG-165→DANYTK单点突变获得。

铁蛋白突变体FTH-8和铁蛋白突变体FTH-19这两种突变体经改造后，DE转角仅发生轻微摆动，同样尚未影响亚基间和界面间的相互作用，蛋白质空间结构没有改变，仍然可以自组装成笼。并且铁蛋白笼上的糖基化位点数目大幅提高，显著增强糖基化效率，能够实现在体外简单快速的合成末端为半乳糖或葡萄糖的糖蛋白。此外，突变后还能够影响铁蛋白的酸稳定性，使得自组装调控方式更加温和(pH为5.0)，这为药物包载与递送提供了新方法。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码上述人源重链铁蛋白突变体。

本发明的又一具体实施方式中，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述多聚核苷酸。

本发明的又一具体实施方式中，所述重组表达载体通过上述多聚核苷酸有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；优选的，所述表达载体为质粒，在本发明的一个具体实施方式中，所述质粒为pET28a。

本发明的又一具体实施方式中，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组表达载体、染色体整合有上述多聚核苷酸或表达上述人源重链铁蛋白突变体。

所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。

本发明的又一具体实施方式中，所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞中的任意一种或多种；

其中所述细菌细胞为埃希氏菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属或葡萄球菌属内的任何种；

本发明的又一具体实施方式中，所述细菌细胞为大肠杆菌(如大肠杆菌BL21)、根癌农杆菌(如GV3101)、发根农杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌或假单胞菌等。

所述真菌细胞包括酵母菌(如毕赤酵母)等。

本发明的又一具体实施方式中，提供了一种制备上述人源重链铁蛋白突变体的方法，包括步骤：培养本发明上述宿主细胞，从而表达出所述的人源重链铁蛋白突变体；以及分离纯化获得人源重链铁蛋白突变体。

更具体的，通过将人源重链铁蛋白FTH(NCBI Reference Sequence:WP_AAI05803.1)基因构建于载体pET28a上，利用诺唯赞一步法单点突变试剂盒(C214)构建突变体FTH-8和FTH-19，通过大肠杆菌BL21发酵诱导表达、纯化回收获得所得。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述人源重链铁蛋白突变体、上述多聚核苷酸、上述重组表达载体、上述宿主细胞在制备药物或药物载体中的应用。

所述药物可以包含现有任意已知具有预防和/或治疗疾病的成分，包括但不限于核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。

所述药物可以为抗肿瘤药物。

所述药物载体可以为糖蛋白纳米药物载体。

具体可采用如下方法制备：上述人源重链铁蛋白突变体作为多靶点糖基化序列的纳米药物载体，再利用工具酶和糖供体将含有N-X-S/T序列的蛋白进行糖基化从而制备获得所述糖蛋白纳米药物载体。

具体的，上述人源重链铁蛋白突变体作为药物载体，在不影响自组装的前提下，相较于野生型FTH酸稳定性显著降低，解聚条件更温和，并且得到loop区存在糖基化位点，利用N-糖基转移酶能将单糖快速转移至含有N-X-S/T序列的蛋白上，形成糖蛋白；进一步利用其它的糖基转移酶对合成的糖蛋白进行修饰，能用于生产带有多糖修饰的药物载体蛋白。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种药物，所述药物其载体至少包含上述人源重链铁蛋白突变体。

具体的，所述药物可以为抗肿瘤药物。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。其中所涉及的试剂和耗材来源见表1。

表1实施例所涉及的试剂和耗材来源明细

实施例1：人源重链铁蛋白FTH突变体FTH-13、FTH-16的构建及蛋白的表达与纯化和鉴定

1、表达菌株的构建

人源重链铁蛋白FTH(NCBI Reference Sequence:WP_AAI05803.1)基因由南京金斯瑞公司合成并构建于载体pET28a上，其商品化菌株为DH5α-pET28a-FTH-4D菌株(4D：在FTH的C末端添加4个DANYTK糖基化位点)。

使用DH5α-pET28a-FTH-4D菌株，提前用含0.1mg/mL的LB液体培养基180rpm，37℃培养DH5α-pET28a-FTH-4D菌株至OD₆₀₀达到0.6，并提取质粒作为模板。

按照诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C214)说明书，结合诺唯赞在线设计引物程CEDesign设计诱变引物(见表2)。对FTH氨基酸序列的43-DRDDVA-48→GGNWTT、43-DRDDVA-48→DANYTK进行单点突变，获得FTH-13、FTH-16。

表2：构建FTH-13、FTH-16突变体所需要的引物

使用诱变引物分段扩增携带突变的片段，并使用琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段大小的正确，确定正确后进行Dpn I酶消化，去除甲基化模板质粒。然后按照试剂盒的重组环化系统将携带突变的片段进行重组环化，重组之后转入DH5α感受态细胞，涂含有0.1mg/mL的氨苄青霉素固体LB平板，培养16h后挑取克隆交于北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确后确定为是FTH的突变体(命名为FTH-13、FTH-16，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2所示)，重新提质粒转入BL21(DE3)感受态细胞进行表达。

2、FTH-13、FTH-16蛋白的表达与纯化和鉴定

待突变体FTH-13、FTH-16转入BL21感受态细胞后，接种于1L含有0.1mg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养至OD₆₀₀达到0.6，降温至16℃培养20h。结束培养后8000rpm，离心10min收集菌体。使用50mL PBS溶液重悬菌体并在冰水环境下中300W，持续2s，间停2s超声30min以破碎细胞释放蛋白，之后10000rpm，离心30min分离沉淀，取上清过Ni-填料柱纯化。

上清过Ni-填料柱后，使用10倍柱体积Washing buffer洗脱杂蛋白。之后用10倍柱体积Elution buffer洗脱并收集目的蛋白。之后收集的洗脱液加入到超滤管，每次离心30min，离心后下管液体弃掉，上管加满PBS，重复离心4次以去除咪唑，获得的目的蛋白4℃保存。

根据生工BAC蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。样品添加SDS-PAGE上样缓冲液后，煮沸10min，上样到12.5％SDS-PAGE胶中，120V电泳90min，之后考马斯亮蓝R-250染色2h，再用脱色液脱色。FTH-13、FTH-16蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图1。

制作非变性聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶4％,分离胶6％)。实验时电泳电压和时间程序设定为：浓缩胶80V、30min,然后分离胶150V、60min，电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，最后用脱色液脱色。蛋白样品离心取上清与2×Native-PAGE样品缓冲液混合，上样缓冲液中不含SDS和2-巯基乙醇,并在4℃下进行电泳。在此条件下，蛋白基本保持原有形状和电荷，电泳条带出现的位置不同表明了蛋白聚合态的不同。FTH-13、FTH-16蛋白的Native-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图2。

根据上述的实验结果已经可以确定经过对铁蛋白的设计改造，突变体蛋白自组装成笼的特性没有被破坏。为了更加直观的观测突变体蛋白的四级结构，我们采用了透射电子显微镜技术来观察突变体FTH-13、FTH-16蛋白。TEM结果见图3，在pH为7.0时，两种突变体蛋白形貌均呈圆形单分散状态，且经ImageJ测量可知外直径均与野生型FTH相同。说明在ABloop位置进行糖基化序列替换改造铁蛋白的方法，并未影响铁蛋白整体的四级结构和自组装成笼的特性。实施例2：铁蛋白突变体FTH-13、FTH-16利用调节pH方法在包埋药物中的应用

将蛋白溶于不同的pH缓冲溶液中，不同的pH缓冲溶液包括:不同浓度的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 2.5-8)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9-11)。每种重组蛋白的Native-PAGE凝胶电泳独立重复至少两次，重复得到相似的结果。

铁蛋白突变体FTH-13、FTH-16的酸碱稳定性结果见图4，与野生型FTH相比，突变体FTH-13、FTH-16均在pH小于6时完全解聚。实验结果表明在AB loop位置进行2种糖基化位点替换的铁蛋白突变体均影响了酸稳定性，使解聚条件更加温和可控，为药物包载与递送提供了新方法，为肿瘤治疗提供了新的治疗手段。

实施例3：铁蛋白突变体FTH-16的体外糖基化修饰

1、FTH-16的体外糖基化反应

利用BL21表达的AaNGT催化带糖基化位点的FTH-16进行体外糖基化反应，反应体系如下：

表3AaNGT催化底物蛋白糖基化反应体系

在37℃条件下反应30min，将反应产物放至4℃进行保存。12000rpm离心10min后取上清液进行SDS-PAGE检测。

FTH-16蛋白体外糖基化修饰的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图6。

经SDS-PAGE结果比较对照FTH-16(27.21kDa)与产物Glc-FTH-16、Gal-FTH-16的迁移，可以明显看出糖基化修饰后的产物的迁移速度比对照FTH-16慢，说明Glc-FTH-16和Gal-FTH-16分子量增大。

因此铁蛋白突变体FTH-16作为底物蛋白利用AaNGT可以在体外实现糖基化，分别合成了带有一个半乳糖和一个葡萄糖的铁蛋白，这为优化铁蛋白糖基化修饰提供了新思路。

实施例4：人源重链铁蛋白FTH突变体FTH-8、FTH-19的构建及蛋白的表达与纯化和鉴定

1、表达菌株的构建

人源重链铁蛋白FTH(NCBI Reference Sequence:WP_AAI05803.1)基因由南京金斯瑞公司合成并构建于载体pET28a上，其商品化菌株为DH5α-pET28a-FTH-4D菌株(4D：在FTH的C末端添加4个DANYTK糖基化位点)。

使用DH5α-pET28a-FTH-4D菌株，提前用含0.1mg/mL的LB液体培养基180rpm，37℃培养DH5α-pET28a-FTH-4D菌株至OD₆₀₀达到0.6，并提取质粒作为模板。

按照诺唯赞一步法多点突变试剂盒(C214)说明书，结合诺唯赞在线设计引物程CEDesign设计诱变引物(见表4)。对FTH氨基酸序列的160-GAPESG-165→GGNWTT、160-GAPESG-165→DANYTK进行单点突变，获得突变体FTH-8、FTH-19。

表4：构建FTH-8、FTH-19突变体所需要的引物

使用诱变引物分段扩增携带突变的片段，并使用琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段大小的正确，确定正确后进行Dpn I酶消化，去除甲基化模板质粒。然后按照试剂盒的重组环化系统将携带突变的片段进行重组环化，重组之后转入DH5α感受态细胞，涂含有0.1mg/mL的氨苄青霉素固体LB平板，培养16h后挑取克隆交于北京擎科生物科技有限公司测序，测序正确后确定为是FTH的突变体(命名为FTH-8、FTH-19，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示)，重新提质粒转入BL21(DE3)感受态细胞进行表达。

2、FTH-8、FTH-19蛋白的表达与纯化和鉴定

待突变体FTH-8、FTH-19转入BL21感受态细胞后，接种于1L含有0.1mg/mL的氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养至OD₆₀₀达到0.6，降温至16℃培养20h。结束培养后8000rpm，离心10min收集菌体。使用50mL PBS溶液重悬菌体并在冰水环境下中300W，持续2s，间停2s超声30min以破碎细胞释放蛋白，之后10000rpm，离心30min分离沉淀，取上清过Ni-填料柱纯化。

上清过Ni-填料柱后，使用10倍柱体积Washing buffer洗脱杂蛋白。之后用10倍柱体积Elution buffer洗脱并收集目的蛋白。之后收集的洗脱液加入到超滤管，每次离心30min，离心后下管液体弃掉，上管加满PBS，重复离心4次以去除咪唑，获得的目的蛋白4℃保存。

根据生工BAC蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。样品添加SDS-PAGE上样缓冲液后，煮沸10min，上样到12.5％SDS-PAGE胶中，120V电泳90min，之后考马斯亮蓝R-250染色2h，再用脱色液脱色。FTH-8、FTH-19蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图7。

制作非变性聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶4％，分离胶6％)。实验时电泳电压和时间程序设定为:浓缩胶80V、30min,然后分离胶150V、60min，电泳结束后，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，最后用脱色液脱色。蛋白样品离心取上清与2×Native-PAGE样品缓冲液混合，上样缓冲液中不含SDS和2-巯基乙醇,并在4℃下进行电泳。在此条件下，蛋白基本保持原有形状和电荷,电泳条带出现的位置不同表明了蛋白聚合态的不同。FTH-8、FTH-19蛋白的Native-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图8。

根据上述的实验结果已经可以确定经过对铁蛋白的设计改造，突变体蛋白自组装成笼的特性没有被破坏。为了更加直观的观测突变体蛋白的四级结构，我们采用了透射电子显微镜技术来观察突变体FTH-8、FTH-19蛋白。TEM结果见图9，在pH为7.0时，两种突变体蛋白形貌均呈圆形单分散状态，且经ImageJ测量可知外直径均与野生型FTH相同。说明在loop位置进行糖基化序列替换改造铁蛋白的方法，并未影响铁蛋白整体的四级结构和自组装成笼的特性。

实施例5：铁蛋白突变体FTH-8、FTH-19利用调节pH方法在包埋药物中的应用

将蛋白溶于不同的pH缓冲溶液中，不同的pH缓冲溶液包括:不同浓度的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 2.5-8)和碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH 9-11)。每种重组蛋白的Native-PAGE凝胶电泳独立重复至少两次，重复得到相似的结果。

铁蛋白突变体FTH-8、FTH-19的酸碱稳定性结果见图10，与野生型FTH相比，突变体FTH-8、FTH-19均在pH小于6时完全解聚。实验结果表明在loop位置进行2种糖基化位点替换的铁蛋白突变体均影响了酸稳定性，使解聚条件更加温和可控，为药物包载与递送提供了新方法，为肿瘤治疗提供了新的治疗手段。

实施例6：铁蛋白突变体FTH-8、FTH-19的体外糖基化修饰

1、FTH-8、FTH-19的体外糖基化反应

利用BL21表达的AaNGT催化带糖基化位点的FTH-8、FTH-19进行体外糖基化反应，反应体系如下：

表5AaNGT催化底物蛋白糖基化反应体系

在37℃条件下反应30min，将反应产物放至4℃进行保存。12000rpm离心10min后取上清液进行SDS-PAGE检测。

FTH-8、FTH-19蛋白体外糖基化修饰的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果见图12。

经SDS-PAGE结果比较对照FTH-8(27.3kDa)与产物Glc-FTH-8、Gal-FTH-8的迁移，可以明显看出糖基化修饰后的产物相较于对照FTH-8迁移滞后，说明Glc-FTH-8、和Gal-FTH-8分子量增大。

经SDS-PAGE结果比较对照FTH-19(27.38kDa)与产物Glc-FTH-19、Gal-FTH-19的迁移，可以明显看出糖基化修饰后的产物的迁移速度比对照FTH-19慢，说明Glc-FTH-19和Gal-FTH-19分子量增大。

因此铁蛋白突变体FTH-8、FTH-19作为底物蛋白利用AaNGT可以在体外实现糖基化，分别合成了带有一个半乳糖和一个葡萄糖的铁蛋白，这为优化铁蛋白糖基化修饰提供了新思路。

本发明中所涉及的铁蛋白突变体的氨基酸序列

SEQ ID NO.1

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFGGNWTTLKNF

AKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMEC

ALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTN

LRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNESENLYFQGGHHHHHHSGDANYTKG

GDANYTKGGDANYTKGGDANYTKGSHHHHHH

SEQ ID NO.2

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDANYTKLKNF

AKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMEC

ALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTN

LRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNESENLYFQGGHHHHHHSGDANYTKG

GDANYTKGGDANYTKGGDANYTKGSHHHHHH

SEQ ID NO.3

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNF

AKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMEC

ALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTN

LRKMGGNWTTLAEYLFDKHTLGDSDNESENLYFQGGHHHHHHSGDANYTK

GGDANYTKGGDANYTKGGDANYTKGSHHHHHH

SEQ ID NO.4

MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNF

AKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMEC

ALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTN

LRKMDANYTKLAEYLFDKHTLGDSDNESENLYFQGGHHHHHHSGDANYTK

GGDANYTKGGDANYTKGGDANYTKGSHHHHHH

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人源重链铁蛋白突变体，其特征在于，所述人源重链铁蛋白突变体具有如SEQID NO.1-4任意一项或多项所示的氨基酸序列。

2.一种多聚核苷酸，其特征在于，所述多聚核苷酸编码权利要求1所述人源重链铁蛋白突变体。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述多聚核苷酸。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体通过所述多聚核苷酸有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述重组表达载体、染色体整合有权利要求2所述多聚核苷酸或表达权利要求1所述人源重链铁蛋白突变体。

6.如权利要求5所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞；

所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞中的任意一种或多种。

7.一种制备权利要求1所述人源重链铁蛋白突变体的方法，其特征在于，包括步骤：培养权利要求5或6所述宿主细胞，从而表达出所述的人源重链铁蛋白突变体；以及分离纯化获得人源重链铁蛋白突变体。

8.权利要求1所述人源重链铁蛋白突变体、权利要求2所述多聚核苷酸、权利要求3或4所述重组表达载体或权利要求5或6所述宿主细胞在制备药物或药物载体中的应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述药物包含核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、金属、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合；进一步的，所述药物为抗肿瘤药物；

所述药物载体为糖蛋白纳米药物载体。

10.一种药物，其特征在于，所述药物其载体至少包含权利要求1所述人源重链铁蛋白突变体。