CN116768966A - 单甲基澳瑞他汀e单晶、其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及单晶制备技术领域，具体而言，涉及单甲基澳瑞他汀E单晶、其制备方法和应用。单甲基澳瑞他汀E单晶的分子中手性中心的绝对构型为：{C2(S),C7(S),C13(S),C14(S),C18(R),C25(S),C26(R),C28(R),C31(R),C33(S)}2。本发明提供一种新的单甲基澳瑞他汀E单晶，其能够作为对照品或者标准品确认单甲基澳瑞他汀E的手性结构。
Description
技术领域
本发明涉及单晶制备技术领域，具体而言，涉及单甲基澳瑞他汀E单晶、其制备方法和应用。
背景技术
单甲基澳瑞他汀E(MMAE，Monomethyl auristatin E,CAS:474645-27-7)是一种新型抗有丝分裂的Auristatin衍生物，通常被用于抗体偶联药。单甲基澳瑞他汀E手性中心较多，而手性的确认对单甲基澳瑞他汀E的结构确认以及药效等都有显著影响，而现有技术中还没有确认的单甲基澳瑞他汀E的单晶以及其制备方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供单甲基澳瑞他汀E单晶、其制备方法和应用。本发明提供一种新的单甲基澳瑞他汀E单晶，其能够作为对照品或者标准品确认单甲基澳瑞他汀E的手性结构。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶，其分子中手性中心的绝对构型为：{C2(S),C7(S),C13(S),C14(S),C18(R),C25(S),C26(R),C28(R),C31(R),C33(S)}2。
在可选的实施方式中，所述单甲基澳瑞他汀E单晶属于单斜晶，P21空间群；
优选地，所述单甲基澳瑞他汀E单晶的单胞参数1为：{ α＝90°,β＝90.1530(10)°,γ＝90°,}。
在可选的实施方式中，所述单甲基澳瑞他汀E单晶为水合物；
优选地，所述单甲基澳瑞他汀E单晶中不对称单元由6个MMAE分子以及8个水分子所构成。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：将单甲基澳瑞他汀E样品制备为无定形样品，而后再利用缓慢挥发混合溶剂进行单晶培养。
在可选的实施方式中，形成所述无定形样品的步骤包括：将所述单甲基澳瑞他汀E样品与溶解溶剂混合溶解形成澄清溶液，而后让所述溶解溶剂快速挥发形成胶状的无定形样品；其中，所述溶解溶剂包括烷烃类溶剂。
在可选的实施方式中，所述溶解溶剂包括C1-C10取代或未取代烷烃溶剂；
优选地，所述溶解溶剂包括C1-C6取代或未取代烷烃溶剂；
优选地，所述溶解溶剂包括二氯甲烷、氯仿、正戊烷和正己烷中的任意一种。
在可选的实施方式中，单晶培养的步骤包括：将所述无定形样品与混合溶剂混合溶解，而后过滤，并进行密封，密封后在密封口设置一个小孔，接着，在室温下使得溶剂缓慢挥发，其中，所述混合溶剂选自醇类溶剂或腈类溶剂和水的混合溶剂。
在可选的实施方式中，所述醇类溶剂选自C1-C5一元醇，优选为甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的任意一种；
所述腈类溶剂选自乙腈。
在可选的实施方式中，所述混合溶剂中所述醇类溶剂或所述腈类溶剂与所述水的体积比为1-10:1；优选为5-8:1。
第三方面，本发明提供一种前述实施方式所述的单甲基澳瑞他汀E单晶作为标准品或对照品中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶，其能够作为对照品或者标准品确认单甲基澳瑞他汀E的手性结构。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的照片；
图2为本发明实施例1提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的不对称单元示意图；
图3为本发明实施例1提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的不对称单元示意图；
图4为本发明实施例1提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的XPRD图；
图5为本发明对比例1提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的照片；
图6为本发明对比例6提供的单甲基澳瑞他汀E单晶的照片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶，其结构式为：
可见，其分子中手性中心的绝对构型为：{C2(S),C7(S),C13(S),C14(S),C18(R),C25(S),C26(R),C28(R),C31(R),C33(S)}2。
进一步地，SCXRD表征显示该单晶属于单斜晶系，P21空间群，其单胞参数1为：{α＝90°,β＝90.1530(10)°,γ＝90°,/>}。单晶结构解析显示该单晶结构的不对称单元由6个MMAE分子以及8个水分子所构成。这表明该晶体为水合物(该分子与结晶水分子的化学计量比为3:4)。
第二方面，本发明提供一种前述实施方式所述的单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
S1、形成无定形样品；
将单甲基澳瑞他汀E样品与溶解溶剂混合溶解形成澄清溶液，而后让所述溶解溶剂快速挥发形成胶状的无定形样品。
具体地，将单甲基澳瑞他汀E样品置于一个单晶生长瓶中加入溶解溶剂溶解，适当超声振动促进固体样品完全溶解，形成澄清溶液。随后将该单晶瓶敞口静置于通风橱内让溶解溶剂快速的挥发。数小时后得到了胶状的化合物，无定形样品。
可见，本发明实施例提供的快速挥发溶解溶剂，也就是在室温下将装呈有澄清溶液的器件的开口完全敞开，并在通风橱内，使得溶解溶剂自然挥发。例如，1～10毫升的混合液，3～8小时溶解溶剂挥发完全。
溶解溶剂的量使得其完全溶解单甲基澳瑞他汀E样品即可，不过最好采用饱和溶液。例如；所述溶解溶剂与所述单甲基澳瑞他汀E样品的用量为1-10:1。
其中，所述溶解溶剂包括烷烃类溶剂。C1-C10取代或未取代烷烃溶剂；优选为C1-C6取代或未取代烷烃溶剂；例如溶解溶剂包括二氯甲烷、氯仿、正戊烷和正己烷中的任意一种。
先形成无定形样品才能在单晶培养过程中形成单晶。
S2、单晶培养；
将无定形样品与混合溶剂混合溶解，而后过滤，并进行密封，密封后在密封口设置一个小孔，接着，在室温下使得溶剂缓慢挥发。
具体地，将上述无定形样品置于玻璃瓶中，加入的混合溶剂使得无定形样品溶解，可以适当采用超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发，数天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
需要说明的是，上述本发明实施例提供的过滤装置和过程仅仅是举例，也可以采用其他的过滤装置。
本发明实施例提供的缓慢挥发，也就是仅在封口处开设一个小孔，而后在室温下，混合溶剂自行通过小孔缓慢挥发。孔的大小根据溶剂沸点不同而适当调整。例如，1～10毫升的混合液，3～8天溶解溶剂挥发完全。
进一步地，混合溶剂选自醇类溶剂或腈类溶剂和水的混合溶剂。其中，所述醇类溶剂选自C1-C5一元醇，优选为甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的任意一种；所述腈类溶剂选自乙腈；无定形样品与所述混合溶剂的质量比为1:1-10。
进一步地，上述混合溶剂中所述醇类溶剂或所述腈类溶剂与所述水的体积比为1-10:1；例如有机溶剂：水的体积比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1以及10:1等1-10:1之间的任意数值或者任意两个数值之间的范围值。
本发明实施例通过采用特定地混合溶剂以及溶剂缓慢挥发，能够形成单甲基澳瑞他汀E单晶，且保证形成单晶的结构和形态。
进一步地，本发明提供一种前述实施方式所述的单甲基澳瑞他汀E单晶作为标准品或对照品中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
MMAE的制备，参照下述合成路径：
步骤1：Fmoc-MMAE的合成。
将化合物1(300mg,0.93mmol)和化合物2(Fmoc-(N-Me)-L-Val-L-Val-Dil-OH)(464mg,0.73mmol)溶于15mL的DCM中，依次加入HATU(461mg,1.2mmol)和DIEA 600μL，室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，加入DCM萃取三遍，合并有机相，分别用2％的柠檬酸溶液和饱和NaCl溶液各萃取一遍，加入无水Na2SO4干燥过夜。抽滤并旋干DCM，加入乙醚洗涤3次，无需进一步纯化，得微黄色固体495mg。
步骤2：MMAE的合成。
将350mg Fmoc-MMAE溶于10mL DCM中，加入300μL二乙胺，室温下搅拌反应过夜，反应结束后旋干反应溶剂，使用制备液相进行分离纯化，色谱条件如下：A相H2O+0.08％TFA，B相乙腈+0.08％TFA，0-35min B相45％等梯度洗脱，收集纯品，冻干反应产物。
称取77.0mg上述MMAE样品置于4-mL单晶生长瓶中，加入0.1mL正庚烷溶剂，适当超声促其溶解后形成澄清溶液，随后将单晶瓶敞口静置于通风橱内进行快速挥发，挥发约5小时后得到胶状的无定形样品。
称取上述第一步中制备得到的5.6mg毫克无定形样品置于4ml玻璃瓶中，加入0.5ml乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和水的体积比为5：1，并适当超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头(0.45μm PTFE滤膜)进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的4mL单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该4mL单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发。六天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
对该板状单晶样品进行拍照、X射线衍射以及单晶结构分析，参见图1-图4和表1。其中，图1为板状单晶样品的照片，图2为板状单晶样品的不对称单元示意图，图3为板状单晶样品的另一张不对称单元示意图，图4为板状单晶样品的XPRD图。
图2的单晶结构解析显示该晶体的不对称单元由6个MMAE分子(它们在晶体学上独立，分别以MMAE分子(A)～(F)表示，它们的原子标签分别以(A)～(F)作为尾缀)以及8个水分子(图中分别以水分子(1)～(8)标示)所构成。这表明该晶体为化合物MMAE的水合物晶型，其晶格中MMAE分子与结晶水的化学计量比为3:4。
为了更清晰的展示该单晶结构特征，在另一张不对称单元示意图(图3)中，这6个晶体学独立的MMAE分子(A)～(F)分别以蓝色、青色、绿色、黄色、橙色以及红色高亮显示。它们具有相同的绝对构型，仅在构象上由于单键的旋转而存在差异，基于该MMAE水合物的单晶结构数据，项目确证了化合物MMAE的立体化学如结构式所示，其分子中手性中心的绝对构型为{C2(S),C7(S),C13(S),C14(S),C18(R),C25(S),C26(R),C28(R),C31(R),C33(S)}1。
表1单晶的晶体结构数据及结构精修参数
实施例2
本实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
称取60毫克化合物MMAE置于4-mL玻璃瓶中，加入0.1ml相应氯仿，适当超声促其溶解后形成澄清溶液。所得样品溶液转移至洁净4-mL单晶瓶中，随后将单晶瓶敞口静置于通风橱内进行挥发，挥发约3小时后得到胶状的无定形样品。
称取上述第一步中制备得到的5.8毫克无定形样品置于一4-mL玻璃瓶中，加入乙醇和水的混合溶液0.5mL，其中乙醇和水的体积比为8：1，并适当超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头(0.45μm PTFE滤膜)进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的4mL单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该4mL单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发，五天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
实施例3
本实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
称取56.0mg MMAE样品置于4-mL单晶生长瓶中，加入0.1mL正庚烷溶剂，适当超声促其溶解后形成澄清溶液，随后将单晶瓶敞口静置于通风橱内进行快速挥发，挥发约5小时后得到胶状的无定形样品。
称取上述第一步中制备得到的6.3mg毫克无定形样品置于4ml玻璃瓶中，加入0.5ml乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和水的体积比为5：1，并适当超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头(0.45μm PTFE滤膜)进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的4mL单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该4mL单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发。五天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
实施例4
本实施例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
称取56毫克化合物MMAE置于4-mL玻璃瓶中，加入0.3毫升相应二氯甲烷适当超声促其溶解后形成澄清溶液。所随后将单晶瓶敞口静置于通风橱内进行快速挥发，挥发约3小时后得到胶状的无定形样品。
称取上述第一步中制备得到的8.3毫克无定形样品置于一4-mL单晶生长瓶中，加入异丙醇和水的混合溶液0.6mL，其中异丙醇和水的体积比为4：1，并适当超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头(0.45μm PTFE滤膜)进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的4mL单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该4mL单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发。四天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
实施例5
称取58.0毫克化合物MMAE置于4-mL玻璃瓶中，加入0.5毫升相应正戊烷适当超声促其溶解后形成澄清溶液。适当超声促其溶解后形成澄清溶液，随后将单晶瓶敞口静置于通风橱内进行快速挥发，挥发约4小时后得到胶状的无定形样品。
称取上述第一步中制备得到的6.3毫克无定形样品置于一4-mL单晶生长瓶中，加入甲醇和水的混合溶液0.7mL，其中异丙醇和水的体积比为3：1，并适当超声振荡促进固体样品溶解。随后采用注射器及注射器式过滤头(0.45μm PTFE滤膜)进行过滤。所得滤液转移至一个洁净的4mL单晶生长瓶中。然后采用PE材质的单晶瓶塞将单晶瓶进行封口，并在该塞子上扎一个小孔。随后将该4mL单晶瓶静置于通风橱内进行室温溶剂缓慢挥发。六天后观察到体系中析出板状的单晶样品，并聚集成簇。
对比例1
本对比例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
将实施例1的装呈有无定形样品的单晶瓶装入预盛有5m乙醇：水＝8：1的20mL玻璃瓶中，最后将玻璃瓶加盖密封，静置于通风橱内进行常温气液扩散培养，最终得到板状单晶样品。
对该板状单晶样品进行拍照，结果参见图5，根据图1和图5可知，以无定形的MMAE样品为起始，在乙醇/水(8:1,v/v)的缓慢挥发实验体系中培养得到板状单晶。
对比例2-4
本对比例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
称取适量的化合物MMAE置于3-mL玻璃瓶中，加入相应溶剂，适当超声促进固体溶解后过滤，滤液转移至一4-mL单晶生长瓶中，使用单晶瓶塞封口并在塞子上扎一小孔。将单晶瓶静置于通风橱内进行溶剂缓慢挥发。具体见下表。
| 实验编号 | 物料(mg) | 溶剂(v:v)，ml | 温度 | 结果 |
| 对比例2 | 5.1 | 乙腈：水(5:1) | RT | 澄清 |
| 对比例3 | 5.0 | 异丙醇：水(4:1) | RT | 澄清 |
| 对比例4 | 5.1 | 甲醇：水(3:1) | RT | 澄清 |
可见，对比例2-4中，随着溶剂的减少，晶体在单晶瓶内缓慢生长，未析出晶体，说明直接从MMAE培养单晶是不成功的，需要先制备出无定型，在进行单晶培养。
对比例5-7
本对比例提供一种单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，包括：
称取适量的化合物MMAE置于3-mL玻璃瓶中，加入一定量的相应正溶剂溶解样品。所得样品溶液转移至洁净4-mL单晶瓶中，将该4-mL单晶瓶用PE材质的瓶塞封口，并在瓶塞上扎一个小孔。随后将单晶瓶装入预盛有3ml反溶剂的20-mL玻璃瓶中，最后将20-mL玻璃瓶加盖密封，静置于通风橱内进行常温气液扩散培养实验。
对对比例6的单晶进行拍照，参见图6，根据上述结果可知，以无定型为起始状态，用反溶剂进行常温气液扩散培养单晶，在正溶剂乙酸乙酯，反溶剂环己烷条件下，能得到薄片装晶体堆叠。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种单甲基澳瑞他汀E单晶，其特征在于，其分子中手性中心的绝对构型为：{C2(S),C7(S),C13(S),C14(S),C18(R),C25(S),C26(R),C28(R),C31(R),C33(S)}2。
2.根据权利要求1所述的单甲基澳瑞他汀E单晶，其特征在于，所述单甲基澳瑞他汀E单晶属于单斜晶，P21空间群；
优选地，所述单甲基澳瑞他汀E单晶的单胞参数1为：{ α＝90°,β＝90.1530(10)°,γ＝90°,}。
3.根据权利要求1所述的单甲基澳瑞他汀E单晶，其特征在于，所述单甲基澳瑞他汀E单晶为水合物；
优选地，所述单甲基澳瑞他汀E单晶中不对称单元由6个MMAE分子以及8个水分子所构成。
4.一种权利要求1所述的单甲基澳瑞他汀E单晶的制备方法，其特征在于，包括：将单甲基澳瑞他汀E样品制备为无定形样品，而后再利用缓慢挥发混合溶剂进行单晶培养。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，形成所述无定形样品的步骤包括：将所述单甲基澳瑞他汀E样品与溶解溶剂混合溶解形成澄清溶液，而后让所述溶解溶剂快速挥发形成胶状的无定形样品；其中，所述溶解溶剂包括烷烃类溶剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述溶解溶剂包括C1-C10取代或未取代烷烃溶剂；
优选地，所述溶解溶剂包括C1-C6取代或未取代烷烃溶剂；
优选地，所述溶解溶剂包括二氯甲烷、氯仿、正戊烷和正己烷中的任意一种。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，单晶培养的步骤包括：将所述无定形样品与混合溶剂混合溶解，而后过滤，并进行密封，密封后在密封口设置一个小孔，接着，在室温下使得溶剂缓慢挥发，其中，所述混合溶剂选自醇类溶剂或腈类溶剂和水的混合溶剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述醇类溶剂选自C1-C5一元醇，优选为甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的任意一种；
所述腈类溶剂选自乙腈。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述混合溶剂中所述醇类溶剂或所述腈类溶剂与所述水的体积比为1-10:1；优选为5-8:1。
10.一种权利要求1所述的单甲基澳瑞他汀E单晶作为标准品或对照品中的应用。
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