CN116758987A - 对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法及应用 - Google Patents

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CN116758987A CN202310695445.5A CN202310695445A CN116758987A CN 116758987 A CN116758987 A CN 116758987A CN 202310695445 A CN202310695445 A CN 202310695445A CN 116758987 A CN116758987 A CN 116758987A
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Abstract

本发明公开了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法，该方法包括如下步骤：1)对未知病原进行采集和分离，并进行全基因组测序；2)未知病原的菌株或毒株的蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选；3)对筛选出来的靶标进行体外表达；4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为未知病原的抗体检测靶标。由此，当有新的病原产生或者该病原核心基因序列/蛋白序列未知时，采用本方法来实现对该未知病原的抗体检测靶标的快速高效筛选及对该未知病原的抗体检测方法的建立，进而为该未知病原的诊断、治疗和防控奠定基础。

Description

对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法及应用。
背景技术
当未知病原的疾病来临时，如何可以高效快速的对该未知病原进行确诊/检测，成了一个棘手的问题。
在畜牧养殖中，鸭支原体(Mycoplasma anatis，MA)病又称鸭传染性窦炎，是由支原体(霉形体)引起的鸭的一种呼吸道传染病，国际上较少报道，研究不多，基因组与其他支原体物种的ANI值低于74％，是一个全新的物种。鸭支原体在鸭体内具有发展时间比较缓慢、持续时间长、传播时间长的特点。支原体病鸭和带菌鸭是主要传染源，易感鸭通过空气经呼吸道感染，也可经支原体病鸭和带菌鸭分泌物、排泄物污染的种蛋垂直传播。2～3周龄鸭易感，发病率最高可达80％，死亡率低，患病鸭表现为眶下窦发炎、肿大，有浆液性、粘液性或干酪样分泌物。鸭支原体为条件致病菌，在体弱或某些应激条件下有致病性，这种病的发生会降低鸭的抵抗力，常与A型流感、大肠杆菌疾病等并发，影响生产成绩。
而病原检测方法分为抗体检测方法和抗原检测方法，抗原检测方法的建立是基于已知的保守基因序列，而抗体检测方法是以保守的、有良好免疫反应蛋白为基础，难度更大。对于参考序列不多，蛋白功能不明的病原，建立对应的抗体检测方法难度很大，但研究病原特性抗原和抗体检测方法都必不可少。
所以，急需创建一种适用性高的对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法，为建立未知病原的抗体检测方法提供基础，为未知病原的研究、诊断和治疗奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用性高的对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法及应用，来解决当病原基因序列或者蛋白序列未知时，对该未知病原的抗体检测靶标进行快速有效的筛选及对该未知病原的抗体检测方法的快速高效的建立。
根据本发明的第一个方面，提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法，该方法包括如下步骤：
1)对未知病原进行采集和分离，并进行全基因组测序；
2)未知病原的毒株或菌株的蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选；
3)对筛选出来的靶标进行体外表达；
4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；
5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为未知病原的抗体检测靶标。
由此，当有新的病原产生或者该病原核心基因序列/蛋白序列未知时，采用本方法来实现对该未知病原的抗体检测靶标的快速有效筛选及对该未知病原的抗体检测方法的建立。
在某些实施方式中，蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选包括：使用Prokkav1.13.7软件对未知病原的全基因组序列进行分析来预测其蛋白质编码基因；基于膜蛋白和脂蛋白的抗原性更好，以筛选出未知病原中同时具备膜蛋白和脂蛋白特性的靶标蛋白为目的：首先使用Prokka v1.13.7软件分析假定蛋白的膜定位，选取定位于膜上的蛋白，由此筛选出膜蛋白，然后在筛选出的膜蛋白中结合蛋白的结构域，以及注释的蛋白功能，再筛选出同时具有脂蛋白信号肽酶SpII的蛋白，最后筛选出同时满足软件预测的膜蛋白和脂蛋白特性的蛋白作为潜在靶标。
在某些实施方式中，该未知病原为鸭支原体。
根据本发明的第二个方面，提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法在筛选未知病原的抗体检测靶标上的应用。由此，可以在未知病原来袭时，实现对该未知病原的快速抗体检测。
根据本发明的第三个方面，提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法在筛选鸭支原体病的抗体检测靶标上的应用。由此，可以实现对该鸭支原体病的快速抗体检测。
在某些实施方式中，一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法在筛选鸭支原体病的抗体检测靶标上的应用包括如下步骤：
1)对鸭支原体病的病原菌株进行采集和分离，并进行全基因组测序；
2)鸭支原体菌株的蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选；
3)对筛选出来的靶标进行体外表达；
4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；
5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为鸭支原体病的抗体检测靶标。
在某些实施方式中，筛选出的编码鸭支原体病的抗体检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示或如SEQ ID No:5所示或如SEQ ID No:7所示；
或筛选出的鸭支原体病的抗体检测靶标蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示或如SEQ ID No:6所示或如SEQ ID No:8所示。
根据本发明的第四个方面，提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标，编码该鸭支原体病的抗体检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示或如SEQ ID No:5所示或如SEQID No:7所示。由此，通过该靶标的核苷酸序列即可以用于制备检测鸭支原体病的试剂，进而实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
根据本发明的第五个方面，提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标，该鸭支原体病的抗体检测靶标蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示或如SEQ ID No:6所示或如SEQID No:8所示。由此，通过该靶标蛋白的氨基酸序列即可以用于制备检测鸭支原体病的试剂，进而实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
根据本发明的第六个方面，提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标在制备鸭支原体病抗体检测试剂上的应用。由此，通过使用该试剂可以实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
根据本发明的第七个方面，提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标在制备具有鸭支原体病抗体检测功能的试剂盒上的应用。由此，通过使用该试剂盒可以实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
本申请的有益效果：
1、提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法，通过该方法来实现对该未知病原的抗体检测靶标进行快速高效的筛选及对该未知病原的抗体检测方法的快速高效的建立，进而为该未知病原的诊断、治疗和防控奠定基础。
2、提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法在筛选未知病原的抗体检测靶标上的应用。由此，可以在未知病原来袭时，实现对该未知病原的快速抗体检测。
3、提供了一种对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法在筛选鸭支原体病的抗体检测靶标上的应用。由此，可以实现对该鸭支原体病的快速抗体检测。
4、提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标的核苷酸序列，通过该靶标的核苷酸序列即可以用于制备检测鸭支原体病的试剂，进而实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
5、提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标的氨基酸序列，通过该靶标的氨基酸序列即可以用于制备检测鸭支原体病的试剂，进而实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
6、提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标在制备鸭支原体病抗体检测试剂上的应用，通过使用该试剂可以实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
7、提供了一种鸭支原体病的抗体检测靶标在制备具有鸭支原体病抗体检测功能的试剂盒上的应用，通过使用该试剂盒可以实现快速高效的对鸭支原体病进行抗体检测。
附图说明
图1为16株MA菌株基因组序列：最里面的两个环表示GC含量和GC偏斜图，最外面的16个环显示了作为参考的LC01的完整基因组和其他MA菌株的基因组组装之间的成对核苷酸序列；
图2为鸭支原体全基因组蛋白序列分析结果：以膜蛋白和脂蛋白特性为标准，选取定位在膜上面的蛋白，根据COG的注释分类，脂蛋白分类，蛋白功能，选定13个蛋白为潜在的疫苗设计后续靶标，分别为：GIG_00396、GIG_01286、GIG_01885、GIG_03093、GIG_03662、GIG_00030、GIG_03894、GIG_00346、GIG_02828、GIG_03188、GIG_03969、GIG_02453、GIG_00456；
图3为纯化的融合蛋白SDS-PAGE分析结果：M为蛋白分子质量标准，1为纯化后的01885融合蛋白，2为纯化后的03093-1融合蛋白，3为纯化后的03093-2融合蛋白，4为纯化后的03093-3融合蛋白，5为纯化后的00396融合蛋白，6为纯化后的03662融合蛋白，7为空白对照；
图4未免疫鸭血清阴性样本OD450nm值计算的临界值结果；
图5为以03093-1作为靶标的灭活疫苗抗体消长规律测定结果：横坐标为抗体检测时间点，纵坐标为OD450nm值
图6为以03093-1靶标蛋白作为鸭支原体抗体检测的靶标对广东某未免疫鸭场不同日龄阶段的种鸭进行鸭支原体抗体检测的结果。
具体实施方式
对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法包括如下步骤：
1)对未知病原进行采集和分离，并进行全基因组测序；
2)未知病原蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选：使用Prokka v1.13.7软件对未知病原的全基因组序列进行分析来预测其蛋白质编码基因；基于膜蛋白和脂蛋白的抗原性更好，以筛选出未知病原中同时具备膜蛋白和脂蛋白特性的靶标蛋白为目的：首先使用Prokka v1.13.7软件分析假定蛋白的膜定位，选取定位于膜上的蛋白，由此筛选出膜蛋白，然后在筛选出的膜蛋白中结合蛋白的结构域，以及注释的蛋白功能，再筛选出同时具有脂蛋白信号肽酶SpII的蛋白，最后筛选出同时满足软件预测的膜蛋白和脂蛋白特性的蛋白作为潜在靶标进行后续验证；
3)对筛选出来的靶标进行体外表达；
4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；
5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为未知病原的抗体检测靶标。
实施例：以未知病原的鸭支原体(Mycoplasma anatis，MA)病为例筛选其抗体检测靶标：
一、鸭支原体的全基因组序列
由于发明人已经在文献(Zhou Q,Mai K,Yang D,Liu J,Yan Z,Luo C,Tan Y,CaoS,Zhou Q,Chen L,Chen F.Comparative genomic analysis of Mycoplasma anatisstrains.Genes Genomics.2021Nov；43(11):1327-1337.)中公开了鸭支原体病的病原菌株序列信息，因此可以直接对这些序列进行全基因组分析，绘制鸭支原体全基因组序列图谱：该文献采集并分离出鸭支原体病的病原菌株(尽可能分离出全部毒株，文献中共分离出15株)，对分离的15株鸭支原体病的病原菌株进行测序并做比较基因组学研究，分离测序的15株鸭支原体病的病原菌株信息如表1所示，其中表1中“GenBank accession”为对应毒株的NCBI登录号，表1中最后一株NCTC 10156为其它文献中公开的唯一一株鸭支原体全基因组序列。文献中通过PacBio Sequel和IonTorrent Personal Genome Machine(PGM)的测序仪对毒株序列进行草图基因组测序和全基因组测序，获得鸭支原体的全基因组序列，如图1所示为鸭支原体病全基因组序列图谱：最里面的两个环表示GC含量和GC偏斜图，最外面的16个环显示了作为参考的LC01的完整基因组和其他MA菌株的基因组组装之间的成对核苷酸序列。
表115种鸭支原体菌株在NCBI上的具体信息
二、蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的选定
蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选：使用Prokka v1.13.7软件对鸭支原体的全基因组序列进行分析来预测其蛋白质编码基因；基于膜蛋白和脂蛋白的抗原性更好，以筛选出鸭支原体中同时具备膜蛋白和脂蛋白特性的靶标蛋白为目的：首先使用Prokkav1.13.7软件分析假定蛋白的膜定位，选取定位于膜上的蛋白，由此筛选出膜蛋白，然后在筛选出的膜蛋白中结合蛋白的结构域，以及注释的蛋白功能，再筛选出同时具有脂蛋白信号肽酶SpII的蛋白，最后筛选出同时满足软件预测的膜蛋白和脂蛋白特性的蛋白作为潜在靶标进行后续验证；
结果如图2所示：筛选出13个靶标，根据Seq ID(该ID对应鸭支原体全基因组上的位点)分别记为：GIG_00396、GIG_01286、GIG_01885、GIG_03093、GIG_03662、GIG_00030、GIG_03894、GIG_00346、GIG_02828、GIG_03188、GIG_03969、GIG_02453、GIG_00456，分别简写为：00396、01286、01885、03093、03662、00030、03894、00346、02828、03188、03969、02453、00456。
其中：01286、03188和02453基因PCR未能扩增；02828、00030、00456、03894、00346、03969同源性不高，也需要排除；所以最终获得4个可能的候选靶标：01885、00396、03093和03662。但是，在候选01885、00396、03093和03662的4个靶标中：00396和03662并无信号肽；03093全长2616bp，去除前端的信号肽后，还有2541bp，可能不利于原核表达，所以需要将03093分段表达，根据抗原表位分析结果分成前段和后段；01885需要截去信号肽。由此，4个候选靶标经优化改进后为新的6个靶标序列：即01885截去信号肽序列记为01885靶标，03093完整序列、前段及后段进行分段表达后记为03093-1靶标、03093-2靶标、3093-3靶标，00396靶标和03662靶标。该改进后新的6个靶标的核苷酸及氨基酸序列如下(SEQ ID No:1-12)：
01885靶标核苷酸序列(SEQ ID No:1)(1008bp)：ATGAACAAGAACCGTGAGAATAACGACGTGATCAACATCAGTCTGATCAGCCCGTGGATGGAGGATGAGAACAAGCCGGAACAGATCCGCAAGAGTTTCGAGAGCAAGCTGCAAGCCATCATCGGCAACAAAGTGAAGATTAAAGTGAGCTACAGCAGCGATGATTATCTGGTGAATCTGCAGAACATTAACAAGGGTGTGGTGGATCTGGCGTTTGTGAGCCACAGCAGCTTCGAGAATTACATCAGCGAAAACCAAGAAAAAAGCAACCGCATCAAGCCGATCATCCAGACGCTGACCAAGAGCTTCAAGTACGACACCGACAACTTTATCTACGTGGACGGCACGGAGAACGACAAGATTATCAGCAACGCCAAGCTGCAGAGCGAACTCTTCAACGAGAAACGCTACAGCGAGTGGGATTACCCGTGGAATGGCAGCGTGTACGAGTACTTCTACGACGACAAACTGGTGGACTTCCAGCGCGGCATCATCTGGATCAGCGGCACGGACGAGGTTCGCGAGAAAATCATCAAGGCGTGGAACGAGAAAGACTGGAAGACCTTCCGCAGCTTCGGTATCGTGCATGGTAGCGCCGATAGCGGCAGCAAATATCTGCTGCCGGAGAAGCTGCTGAAAAAACACTTTAATAAAAACGATAACGCCTTCAGTAGTCTGGCCAGCGAGATCACCAATTACAGCAACTACTTCATTAACGGCAAAACCAAAGACATGCTGAAAAATAATCACTTCCACATCTGCTTCGACAACGAGGGCAGCTACAGCTGGACCCAGAACACGAAGGACAACATCAACAAGTACACCCCGCTGAACAACGAGAAGATGGAAATTCTGGCGCTCACCGATCCGCTGCAGTACAACATTGGCGTGGTGAACACCAACAAGGTGAACTACGAGATCCAGAACCTCATCGTGAGCAGTCTGATCCAGCTGTACACGAGCAAACAAGATGACTGGGGTAAGACCGTTGGTTTTTACGGCTACTAA
01885靶标氨基酸序列(SEQ ID No:2)：
MNKNRENNDVINISLISPWMEDENKPEQIRKSFESKLQAIIGNKVKIKVSYSSDDYLV
NLQNINKGVVDLAFVSHSSFENYISENQEKSNRIKPIIQTLTKSFKYDTDNFIYVDGTE
NDKIISNAKLQSELFNEKRYSEWDYPWNGSVYEYFYDDKLVDFQRGIIWISGTDEVR
EKIIKAWNEKDWKTFRSFGIVHGSADSGSKYLLPEKLLKKHFNKNDNAFSSLASEITN
YSNYFINGKTKDMLKNNHFHICFDNEGSYSWTQNTKDNINKYTPLNNEKMEILALTDPLQYNIGVVNTNKVNYEIQNLIVSSLIQLYTSKQDDWGKTVGFYGY.
03093-1靶标核苷酸序列(SEQ ID No:3)(2439bp)：ATGGAAGAGAAGGCCAAACCGAAAGAACCAGCCGAGAACCCGAACATCCCGAGTGAGCCGGGCGATCAGCCAACCAATCCGGAAACCGGCGATACGAATAGCGGCAGCAGCAACAGTGGTAGCAACAGCGGTAGCGACAATGGCAACAGCAATGGCACGGAACAGACGAAGAAGCTCACGCTGAAGATCGTGGGCACCATTCCAGAAGCCCTCAG
CGGTCTGAAAATTGTTCTGAATAATAAAACCATTCCGGAAGTTTTCTACAATACCC
AGTTTACCATGGAAAATCTGATCCTCACGAACTACAAAAAAGACAAATTTATCGA
AAATGAGACGCTGCTCCTCACCCAGATCCAGAATAGCAAGACGAATGAGCTCAAA
GCGCAGATCAAATTCGTTGATAAGAATAATGTTCCGTACAACGTGGACATTCTCAT
CACCAACTTCGCCGAATGGCCAACGTTTGACGAAGCCGCGAGTAACGTGAGTTTC
GATAACCTCACCAAGAAGGACTATCTGGCGAAGTATACCAAAGACGACGACATCA
AATTTGTGAGCAATTATCCAAGCAGTATCATTAGTACGCAAGATCTGAAATGGCGC
ATCGATGAGGAAAGCAACCGTGTGTTCGTGACGACCAAGTTTCGCTACACGGTTA
AGCCGAGTGAGATCAGCACCAAAACCTACGAGTTTACCATCGATAACTACGGTCA
AGGCGACCGTCGCGAAATCGGTAATGTGGAGATCGGTAGCAGCAAGATCGAAGT
GGGTGACGATGGTAAGGGCAAGGTGGATACCAACGTGAAGGCCAGCTTTGGCGC
GCTGCTGCAAGAAATTGCGGAGATGAACAACAAGTTCGACGCGTGGATCTATGAC
ATCACGAACAACAGCAGCATTAACCAGAGTGGCCACTTTTGGCTCACCGGTGTTC
GCGAAAACAGCCTCAATGCGCTGCGCGAATTTCAAGAAATCTACAATAGCATCCG
CAACACGGATGACGCGAACCGCATCCGTGAGGCGGCCGAAGAAATCAAAAGCAA
AATCAACGAGATCCAGAAGAATTGGGAGAGCTACATCGCCCGTACCTTCCCGCCA
AGCCTCGAATTTGCGAGCAATCCGAACAAGGCGGAGATCAAGAAGATGATTCTGG
ACACCTTCGCGGGTCTGAAAAACAAGAGTTACGAAAATCTGATTTTTCGCGAGTA
CAAGCCAAACTACAAGCCGACGGAAGAAGATAACAAGCCGAACATCAAGATTGA
CGCGGACTACGCCTACAATGCGATGATGGAGATTCTGAAAGATGAATATTACAAGT
ATCCGTACGTGAGTCTGGTGGCGGAAAGCGAGCTGAAATTTACGACCAAAAACA
ACAGTCTGATCGGCTTCAGCGTTGGTAACAGTCTGCTCAATACGCGCGTGCAGAC
CAAAAAGGACATGGTGCAGTATGCCATCAATGCCCTCAGTCAGATCGAGAGCAGT
ATGCCGGTGCACCAGAAGGTGTATCTGCTGGGTCGTTTTGTGATGGAAAATCTGG
TGTATACCAGCGCCAGTAACAGCGCCGGCCTCAGCACCCTCGATGAAGCCTATGC
GCTGAATGAAGGCGTGTGCAAGGAGTACGTTGAGCAGCTCGCGCTGCTGCTCAGT
CTGGCGAACATCCGCTTCAAGATCTACACCGGTGAGCAACACACGTGGCTGAGTA
TCCAAGACGAGAACAATAATTGGTTTATTAGCGACCCGACCCACAGCGACTTCGG
CATCCCGGAGAAATACCATCCGGTTGGCAAGGATAGCACGTTCAACCAAGATGAG
GAAATGCTGCAGTTCATCCGTCGCGTGCACAGCGTTAGCAGCAACCAAACGCTCT
TTAGTCTGACGCCGACCAACGCGTTCAACGACAGCAGCCTCATCAGCGAGAGCTA
CCAGAGCAATCTGTTCACGACGAAGGTGATCGGTAAGATCCGCACGGAGAAAAG
CAAAAGCAGCGCGCTGAGCTTCTACAATAATAACTTCTATCTCATCGTGGACAATG
GCAGCGGTGCGAAACTGTTCAACTTTGACCCGAACGACACGAGCCACGAGTATG
TGTTCAACCAAGTGAGCAACTTTAACAACTACAGTGGTACGCTGACGACCAACGC
GGTGAATATCGGCAAGTATCTGTACTTTATGACGAACAATGGCAGCAGTAAGAGCA
TCTATAGCCTCAATCTGGAGACGAACCAGACCGAGCTGATCCGCAACAATCTGAC
CGGTGAGAATTTCTTTATCAAACAGAATATCAACACGAAAGAACTCGACTTCTATC
TGGGTGTGGACGATAGCAGCAAATACACGCTGGCCTTCAGCATTAGCCCGAAAGA
AGATAGCTATAAGCAGCTGGAAGTGAACACGATCAAACGCGTGGCCTACATGGCG
ATCGGTCTGCTGAACTTCGAGTAA
03093-1靶标氨基酸序列(SEQ ID No:4)：
MEEKAKPKEPAENPNIPSEPGDQPTNPETGDTNSGSSNSGSNSGSDNGNSNGTEQTK
KLTLKIVGTIPEALSGLKIVLNNKTIPEVFYNTQFTMENLILTNYKKDKFIENETLLLTQ
IQNSKTNELKAQIKFVDKNNVPYNVDILITNFAEWPTFDEAASNVSFDNLTKKDYLA
KYTKDDDIKFVSNYPSSIISTQDLKWRIDEESNRVFVTTKFRYTVKPSEISTKTYEFTID
NYGQGDRREIGNVEIGSSKIEVGDDGKGKVDTNVKASFGALLQEIAEMNNKFDAWI
YDITNNSSINQSGHFWLTGVRENSLNALREFQEIYNSIRNTDDANRIREAAEEIKSKIN
EIQKNWESYIARTFPPSLEFASNPNKAEIKKMILDTFAGLKNKSYENLIFREYKPNYKP
TEEDNKPNIKIDADYAYNAMMEILKDEYYKYPYVSLVAESELKFTTKNNSLIGFSVGN
SLLNTRVQTKKDMVQYAINALSQIESSMPVHQKVYLLGRFVMENLVYTSASNSAGLS
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SDFGIPEKYHPVGKDSTFNQDEEMLQFIRRVHSVSSNQTLFSLTPTNAFNDSSLISESY
QSNLFTTKVIGKIRTEKSKSSALSFYNNNFYLIVDNGSGAKLFNFDPNDTSHEYVFNQ
VSNFNNYSGTLTTNAVNIGKYLYFMTNNGSSKSIYSLNLETNQTELIRNNLTGENFFIKQNINTKELDFYLGVDDSSKYTLAFSISPKEDSYKQLEVNTIKRVAYMAIGLLNFE.03093-2靶标核苷酸序列(SEQ IDNo:5)(900bp)：ATGAGCGCCAGTAACAGCGCCGGCCTCAGCACCCTCGATGAAGCCTATGCGCTGAATGAAGGCGTGTGCAAGGAGTACGTTGAGCAGCTCGCGCTGCTGCTCAGTCTGGCGAACATCCGCTTCAAGATCTACACCGGTGAGCAACACACGTGGCTGAGTATCCAAGACGAGAACAATAATTGGTTTATTAGCGACCCGACCCACAGCGACTTCGGCATCCCGGAGAAATACCATCCGGTTGGCAAGGATAGCACGTTCAACCAAGATGAGGAAATGCTGCAGTTCATCCGTCGCGTGCACAGCGTTAGCAGCAACCAAACGCTCTTTAGTCTGACGCCGACCAACGCGTTCAACGACAGCAGCCTCATCAGCGAGAGCTACCAGAGCAATCTGTTCACGACGAAGGTGATCGGTAAGATCCGCACGGAGAAAAGCAAAAGCAGCGCGCTGAGCTTCTACAATAATAACTTCTATCTCATCGTGGACAATGGCAGCGGTGCGAAACTGTTCAACTTTGACCCGAACGACACGAGCCACGAGTATGTGTTCAACCAAGTGAGCAACTTTAACAACTACAGTGGTACGCTGACGACCAACGCGGTGAATATCGGCAAGTATCTGTACTTTATGACGAACAATGGCAGCAGTAAGAGCATCTATAGCCTCAATCTGGAGACGAACCAGACCGAGCTGATCCGCAACAATCTGACCGGTGAGAATTTCTTTATCAAACAGAATATCAACACGAAAGAACTCGACTTCTATCTGGGTGTGGACGATAGCAGCAAATACACGCTGGCCTTCAGCATTAGCCCGAAAGAAGATAGCTATAAGCAGCTGGAAGTGAACACGATCAAACGCGTGGCCTACATGGCGATCGGTCTGCTGAACTTCGAGTAA
03093-2靶标氨基酸序列(SEQ ID No:6)：
MSASNSAGLSTLDEAYALNEGVCKEYVEQLALLLSLANIRFKIYTGEQHTWLSIQDE
NNNWFISDPTHSDFGIPEKYHPVGKDSTFNQDEEMLQFIRRVHSVSSNQTLFSLTPTN
AFNDSSLISESYQSNLFTTKVIGKIRTEKSKSSALSFYNNNFYLIVDNGSGAKLFNFDP
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IRNNLTGENFFIKQNINTKELDFYLGVDDSSKYTLAFSISPKEDSYKQLEVNTIKRVAYMAIGLLNFE.
03093-3靶标核苷酸序列(SEQ ID No:7)(1263bp)：ATGGAAGAGAAGGCCAAACCGAAAGAACCAGCCGAGAACCCGAACATCCCGAGTGAGCCGGGCGATCAGCCAACCAATCCGGAAACCGGCGATACGAATAGCGGCAGCAGCAACAGTGGTAGCAACAGCGGTAGCGACAATGGCAACAGCAATGGCACGGAACAGACGAAGAAGCTCACGCTGAAGATCGTGGGCACCATTCCAGAAGCCCTCAGCGGTCTGAAAATTGTTCTGAATAATAAAACCATTCCGGAAGTTTTCTACAATACCCAGTTTACCATGGAAAATCTGATCCTCACGAACTACAAAAAAGACAAATTTATCGAAAATGAGACGCTGCTCCTCACCCAGATCCAGAATAGCAAGACGAATGAGCTCAAAGCGCAGATCAAATTCGTTGATAAGAATAATGTTCCGTACAACGTGGACATTCTCATCACCAACTTCGCCGAATGGCCAACGTTTGACGAAGCCGCGAGTAACGTGAGTTTCGATAACCTCACCAAGAAGGACTATCTGGCGAAGTATACCAAAGACGACGACATCAAATTTGTGAGCAATTATCCAAGCAGTATCATTAGTACGCAAGATCTGAAATGGCGCATCGATGAGGAAAGCAACCGTGTGTTCGTGACGACCAAGTTTCGCTACACGGTTAAGCCGAGTGAGATCAGCACCAAAACCTACGAGTTTACCATCGATAACTACGGTCAAGGCGACCGTCGCGAAATCGGTAATGTGGAGATCGGTAGCAGCAAGATCGAAGTGGGTGACGATGGTAAGGGCAAGGTGGATACCAACGTGAAGGCCAGCTTTGGCGCGCTGCTGCAAGAAATTGCGGAGATGAACAACAAGTTCGACGCGTGGATCTATGACATCACGAACAACAGCAGCATTAACCAGAGTGGCCACTTTTGGCTCACCGGTGTTCGCGAAAACAGCCTCAATGCGCTGCGCGAATTTCAAGAAATCTACAATAGCATCCGCAACACGGATGACGCGAACCGCATCCGTGAGGCGGCCGAAGAAATCAAAAGCAAAATCAACGAGATCCAGAAGAATTGGGAGAGCTACATCGCCCGTACCTTCCCGCCAAGCCTCGAATTTGCGAGCAATCCGAACAAGGCGGAGATCAAGAAGATGATTCTGGACACCTTCGCGGGTCTGAAAAACAAGAGTTACGAAAATCTGATTTTTCGCGAGTACAAGCCAAACTACAAGCCGACGGAAGAAGATAACAAGCCGAACATCAAGATTGACTAA
03093-3靶标氨基酸序列(SEQ ID No:8)：
MEEKAKPKEPAENPNIPSEPGDQPTNPETGDTNSGSSNSGSNSGSDNGNSNGTEQTK
KLTLKIVGTIPEALSGLKIVLNNKTIPEVFYNTQFTMENLILTNYKKDKFIENETLLLT
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IYDITNNSSINQSGHFWLTGVRENSLNALREFQEIYNSIRNTDDANRIREAAEEIKSKI
NEIQKNWESYIARTFPPSLEFASNPNKAEIKKMILDTFAGLKNKSYENLIFREYKPNYKPTEEDNKPNIKID.
00396靶标核苷酸序列(SEQ ID No:9)(183bp)：
ATGAGCTTCTGGATCTATCTGATCGCGCTGATCGTTTGTCTGGTTCTGGCCATCTT
CTGTCTGAGTCTGTACCCGATCAGCATGAAGAAGATGCGCAACTACAAGCAAGC
CCAGATGATCGAGTACAAGAAGAACCACCCGAAGAGCAAGCTGACCGATTACA
ATGCCACCGGCATGTACTAA
00396靶标氨基酸序列(SEQ ID No:10):
MSFWIYLIALIVCLVLAIFCLSLYPISMKKMRNYKQAQMIEYKKNHPKSKLTDYNAT GMY.
03662靶标核苷酸序列(SEQ ID No:11)(543bp):
ATGAACTTTCTGATCGCCACCTTCATCTTCGCGCTGATCGTGGTGATCAGTCTGGT
GTACCGCTTTCTGATCTACAACGCGCTGATCCAGAACAGCAAGGAGCTGAACAG
CAATCTGCCGTACACCAGCGTGAAGTACGCGAAGAAGGTGCTGGACAAGAAGA
ATCAGCTGATCCAGTTCGAATTCAACCAGAACTACTTCACGTTCGAGCTGGACAA
CCGCAAGAAGATCATTCATTTTAATGAGAGCATCATCGGCGACTACAGCGTGTA
CAGTCTGACCATGAGCTATCTGCAGTGCTACAAGTTCATGCTCACCAAAAAATGG
ATGAACATCGTGCAGTACGTGATCAAGCTGCTGTTCCCGATCATCTGGATCAGCA
TTTTCGTGCTGCTGTTCTTCCAGTTCTGGATCATCAGCGCGATTCTGTTCATCAGC
ATTCTGCTGATCGCGCTGCTGAGCTTCGGCATCTTCTACAAAACGCGCCGTCTGA
TCAACGACAGCGTGATGGAACAGCTGAAGTACGTGCTCGCCGAAAATTAA
03662靶标氨基酸序列(SEQ ID No:12)：
MNFLIATFIFALIVVISLVYRFLIYNALIQNSKELNSNLPYTSVKYAKKVLDKKNQLIQ
FEFNQNYFTFELDNRKKIIHFNESIIGDYSVYSLTMSYLQCYKFMLTKKWMNIVQYVI KLLFPIIWISIFVLLFFQFWIISAILFISILLIALLSFGIFYKTRRLINDSVMEQLKYVLAEN.三、靶标基因体外表达
pGEX质粒的构建：将01885、03093-1、03093-2、03093-3、00396与03662靶标序列片段连接至pGEX-4T-1骨架载体，转化和纯化获得测序正确的重组靶标质粒。
重组靶标蛋白原核表达：测序结果正确的靶标质粒转化表达菌Rosetta，无菌涂布于LB/AMP平板培养基，37℃培养18h。挑取PCR鉴定结果阳性的单克隆按照1:100接种到10mLLB/AMP液体培养基中，于摇床37℃、200r/min培养到OD600nm值约为0.6时加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，25℃150r/min诱导表达6h。取1mL菌液8000r/min离心5min，弃上清，用50μLPBS重悬，加入50μL 2×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸5min，离心取上清进行SDS-PAGE分析，选出蛋白表达阳性的菌株。
重组靶标蛋白的纯化方法如下：
用与凝胶等体积的缓冲液平衡GST-tag Purification Resin 2-3次后，按照每0.5mL凝胶中加入4mL细菌裂解液上清的比例(1：8)，4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60min。将裂解液和GST-tag Purification Resin的混合物装入适当的空柱管中，将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使柱内液体流出，洗柱5次，每次加入1-2个柱体积的裂解缓冲液。在GST标签蛋白结合于纯化柱并用洗涤液充分洗涤后，使用含谷胱甘肽的洗脱液重复三次洗脱，洗脱液即为目的蛋白，核酸蛋白浓度测量仪进行蛋白浓度的测定。
结果如图3所示，01885、03093-1、03093-2、03093-3四个靶标重组蛋白纯化成功，00396与03662未见表达带。因此，00396与03662不适宜做鸭支原体病的抗体检测靶标，而将01885、03093-1、03093-2、03093-3四个靶标继续进行筛选。
四、靶标蛋白进一步筛选
分别使用01885、03093-1、03093-2、03093-3四个靶标蛋白包被，随机选取8份阴性和8份阳性血清进行Elisa试验。如表2中结果表明：靶标蛋白01885未加血清的空白组OD450nm值异常高，所以排除此靶标。
表2靶标蛋白01885初步筛选结果
五、抗体检测方法建立
以棋盘法和单一变量法最终确定间接Elisa的反应条件，具体实验步骤如下：
(1)包被抗原：用包被液将靶标蛋白(即03093-1、03093-2、03093-3三个靶标蛋白分别进行试验)以1μg/mL的浓度加入到酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；
(2)洗涤：倒弃孔内液体，甩干，加入PBST洗涤，250μL/孔，重复3次，拍干；
(3)封闭：拍干孔内残留液体，加入PBST稀释的5％脱脂乳粉，300μL/孔，37℃，1h；洗涤，同步骤(2)；
(4)孵育一抗：拍干孔内残留液体，加入PBS稀释的一抗血清，1：200稀释，100μL/孔，37℃，1.5h；洗涤，同步骤(2)；
(5)孵育二抗：拍干孔内残留液体，加入PBS稀释的酶标二抗，1：1000稀释，100μL/孔，37℃，1.5h；洗涤，同步骤(2)；
(6)显色：加入TMB，100μL/孔，37℃，5min；
(7)终止：加入2M H2SO4，50μL/孔；
(8)读数：迅速将板放入酶标仪中，于450nm波长检测OD值。
如表3中结果表明：靶标蛋白03093-1以1μg/mL的浓度加入到酶标板中，100μL/孔，一抗血清，1：200稀释，P/N最高值，以此确定为Elisa的条件。
如表4中结果表明：靶标蛋白03093-3以1μg/mL的浓度加入到酶标板中，100μL/孔，一抗血清，1：200稀释，P/N最高值，以此确定为Elisa的条件。
而采用上述同样的方法：靶标蛋白03093-2也是以1μg/mL的浓度加入到酶标板中，100μL/孔，一抗血清，1：200稀释，P/N最高值，以此确定为Elisa的条件。
至此，03093-1、03093-2、03093-3三个靶标经Elisa验证特性均良好，由于考虑03093-1是包括03093-2和03093-3的完整的03093蛋白，理论上特异性更加优良，遂理论上初步选定03093-1进行进一步验证。
用建立的间接Elisa方法检测30份临床未免疫鸭血清，每个样品重复3孔平行，计算出阴性样本OD450nm值的平均值(X)和方差(SD)。临界值＝X+3SD，计算的临界值为0.3657，结果如图4所示。由此，确定了鸭支原体阴、阳性的判定标准即OD450nm值大于等于0.3657判定为阳性，小于0.3657判定为阴性。
五、抗体检测靶标的确定
使用鸭支原体灭活疫苗免疫9日龄健康鸭群，每隔一周采血，连续采4周，使用“四、抗体检测方法建立”中方法检测灭活苗免疫后的抗体消长规律。结果如图5表明：03093-1靶标蛋白可以反应出免疫后抗体增长规律，最终确定3093-1靶标蛋白可以作为鸭支原体病抗体检测靶标。六、鸭支原体病的抗体检测靶标(03093-1靶标)的应用
该03093-1靶标蛋白作为鸭支原体抗体检测的靶标，对广东某未免疫鸭场不同日龄阶段的种鸭进行鸭支原体抗体检测，检测结果显示(图6)：该场育雏期鸭群抗体水平相对较低，育成和产蛋鸭群抗体水平较高，提示场内鸭支原体广泛存在，需要加强防控。
鸭场内鸭支原体病的日常监测方法仅需要对鸭群体进行定期采血，然后采用“四、抗体检测方法建立”中方法检测血液中的抗体情况，即可知悉该鸭群体的鸭支原体感染状况。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
本发明不限于以上对实施例的描述，本领域技术人员根据本发明揭示的内容，在本发明基础上不必经过创造性劳动所进行的改进和修改，都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.对未知病原的抗体检测靶标的筛选方法，其中，所述方法包括如下步骤：
1)对未知病原进行采集和分离，并进行全基因组测序；
2)未知病原的蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选；
3)对筛选出来的靶标进行体外表达；
4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；
5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为未知病原的抗体检测靶标。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其中，所述方法的步骤2)包括使用Prokkav1.13.7软件对未知病原的全基因组序列进行分析来预测其蛋白质编码基因；基于膜蛋白和脂蛋白的抗原性更好，以筛选出未知病原中同时具备膜蛋白和脂蛋白特性的靶标蛋白为目的：首先使用Prokka v1.13.7软件分析假定蛋白的膜定位，选取定位于膜上的蛋白，由此筛选出膜蛋白，然后在筛选出的膜蛋白中结合蛋白的结构域，以及注释的蛋白功能，再筛选出同时具有脂蛋白信号肽酶SpII的蛋白，最后筛选出同时满足软件预测的膜蛋白和脂蛋白特性的蛋白作为潜在靶标。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其中所述未知病原为鸭支原体。
4.权利要求1或2所述的方法在筛选未知病原的抗体检测靶标上的应用。
5.权利要求1-3任一项所述的方法在筛选鸭支原体病的抗体检测靶标上的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述的应用方法包括：
1)对鸭支原体病的菌株进行采集和分离，并进行全基因组测序；
2)鸭支原体菌株的蛋白质编码基因的预测及潜在靶标的筛选；
3)对筛选出来的靶标进行体外表达；
4)用筛选出来的靶标进行抗体检测；
5)步骤4)抗体检测中符合抗体消长规律的即可作为鸭支原体病的抗体检测靶标。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，筛选出的编码鸭支原体病的抗体检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示或如SEQ ID No:5所示或如SEQ ID No:7所示；
或筛选出的鸭支原体病的抗体检测靶标蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示或如SEQ ID No:6所示或如SEQ ID No:8所示。
8.一种鸭支原体病的抗体检测靶标，其中，所述编码鸭支原体病的抗体检测靶标的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示或如SEQ ID No:5所示或如SEQ ID No:7所示。
9.一种鸭支原体病的抗体检测靶标，其中，所述鸭支原体病的抗体检测靶标蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示或如SEQ ID No:6所示或如SEQ ID No:8所示。
10.权利要求8或9所述的鸭支原体病的抗体检测靶标在制备鸭支原体病抗体检测试剂上的应用；或在制备具有鸭支原体病抗体检测功能的试剂盒上的应用。
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