CN116751893A - 用于以rt-era法检测基孔肯雅病毒的p1型成套核酸、试剂盒以及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于以RT‑ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸、试剂盒以及检测方法。该P1型成套核酸由荧光探针和引物对组成；引物对由正向引物和反向引物组成；荧光探针为CHIKV NS1P1，引物对为正向引物F5和反向引物R5，或正向引物F6和反向引物R6。该试剂盒含有P1型成套核酸。该检测方法采用该试剂盒。本发明以基孔肯雅病毒CHIKV的NS1基因保守序列为目的片段构建标准质粒，建立CHIKV的RT‑ERA简单、快速、准确、灵敏的检测方法，结果可靠，成本相对较低，尤其适用于现场或野外即时检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸、试剂盒以及检测方法，该成套核酸包括引物和探针，属于生物技术领域。
背景技术
基孔肯雅病毒(Chikungunya Virus,CHIKV)是一种RNA病毒，属于披膜病毒科甲型病毒属，是导致基孔肯雅热(Chikungunya fever)的病原体。基孔肯雅热经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节痛为主要临床特征。人和灵长类动物是CHIKV的主要宿主，急性期患者、隐性感染者和感染病毒的灵长类动物是该病的主要传染源。该病毒主要分布在非洲、东南亚等地区，近年来在印度洋地区造成大规模流行。我国目前以输入性病例为主，但后续大规模流行的风险不容忽视，迫切需要现场快速检测方法用于监测和预警。
病原现场快速检测方法的金标准为病原核酸检测技术，主要有变温扩增技术、等(恒)温扩增技术(如日本学者发明的LAMP扩增技术)、基因芯片技术三大类。其中等温扩增技术是在病原核酸的现场快速检测中最有优势。目前主要的恒温扩增技术有：环介导等温扩增(LAMP)、切口内切酶恒温扩增技术(NEAR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、滚环核酸扩增(RCA)、解链酶扩增(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和酶促重组恒温扩增技术(ERA)，这些技术各有特点。
逆转录酶促重组等温扩增(Reverse Transcription Enzymatic RecombinaseAmplification，RT-ERA)，是中国苏州先达基因科技有限公司开发的等温扩增技术，利用来源于细菌、病毒和噬菌体的特定工具酶进行改造突变并筛选其功能，在低温条件下(25℃-42℃)可对痕量的靶DNA片段进行特异性的扩增，在最适温度37℃-42℃时，扩增反应时间可在15分钟内，与日本荣研公司的LAMP技术，英国TwistDx公司的RPA技术，以及目前广泛使用的荧光定量PCR技术相比，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破。
目前，针对基孔肯雅病毒的实验室检测常用方法主要有病毒分离、血清学抗体检测、抗原检测、分子生物学检测含基因芯片、RT-PCR以及宏基因组测序等。然而，目前尚未出现利用ERA恒温扩增技术快速检测基孔肯雅病毒的技术手段。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸，以基孔肯雅病毒CHIKV的NS1基因保守序列作为靶基因，能用于RT-ERA法检测基孔肯雅病毒；同时，还提供含有P1型成套核酸的试剂盒、以及相应的检测方法，可准确、快速、有效检测基孔肯雅病毒CHIKV。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸，其特征是，所述P1型成套核酸由荧光探针和引物对组成，所述引物对由正向引物和反向引物组成；所述荧光探针为CHIKV NS1 P1；所述引物对由正向引物F5和反向引物R5组成，或由正向引物F6和反向引物R6组成；
所述荧光探针CHIKV NS1 P1的序列为在SEQ ID NO:1中将第31位碱基标记荧光基团、将第32位碱基替换为四氢呋喃、将第33位碱基标记淬灭基团、并在3`端加入阻断基团；
正向引物F5的序列为SEQ ID NO:2，反向引物R5的序列为SEQ ID NO:4；正向引物F6的序列为SEQ ID NO:3，反向引物R6的序列为SEQ ID NO:5。
采用P1型成套核酸后，即能以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
优选地，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，所述阻断基团为C3-spacer。
优选地，所述P1型成套核酸针对的靶基因是基孔肯雅病毒的NS1基因保守序列，如SEQ ID NO:6所示。
采用以上优选方案，能更好地实现以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
本发明还提供：
一种以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：含有前文所述P1型成套核酸的探针引物混合液。
优选地，在探针引物混合液中，P1型成套核酸的荧光探针、正向引物、反向引物的摩尔比为1:3.5:3.5。
优选地，所述试剂盒还包括RT-荧光扩增试剂、溶解剂、激活剂、超纯水、以及CHIKV阳性对照品。
优选地，所述CHIKV阳性对照品的制备过程如下：
构建含有CHIKV NS1基因保守序列的质粒，经体外转录反应获得NS1基因的RNA片段，纯化后即得到CHIKV阳性对照品；所述CHIKV NS1基因保守序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述RT-荧光扩增试剂和溶解剂均由市售的基础通用型RT-ERA法试剂盒提供；所述激活剂为280mM乙酸镁溶液；所述CHIKV阳性对照品的浓度为10ng/μl。
采用上述试剂盒，可有效实现以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV。
本发明还提供：
一种非诊断目的检测基孔肯雅病毒的RT-ERA检测方法，其特征是，采用前文所述试剂盒；所述RT-ERA检测方法包括以下步骤：
第一步、将反应管分为样本组和阳性对照组；向各反应管中加入试剂盒的溶解剂、探针引物混合液以及超纯水，获得混合反应液；
第二步、将混合反应液转移至RT-荧光扩增试剂中，震荡混匀直到RT-荧光扩增试剂重悬，离心；
第三步、向样本组的反应管中加入待测核酸样品，混匀后离心；向阳性对照组的反应管中加入CHIKV阳性对照品，混匀后离心；
第四步、在反应管盖上加入激活剂，盖紧管盖，通过离心使激活剂进入管内液体中，震荡混匀并再次离心；
第五步、将反应管置于荧光恒温扩增仪中进行RT-ERA扩增，并采集荧光值；
第六步、反应结束，保存数据；根据阳性对照组的时间-荧光值曲线，判断本次检测是否有效；若本次检测有效，则根据样本组的时间-荧光值曲线，判断待测核酸样品是否含有基孔肯雅病毒。
优选地，第五步中，在RT-ERA扩增时，温度为40℃-42℃，持续5-20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。
采用上述检测方法可顺利实现以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒CHIKV，且能直观地在普通荧光扩增仪(常规的荧光定量PCR仪或迷你型恒温荧光仪)上判断结果，快速准确。
与现有技术相比，本发明针对基孔肯雅病毒CHIKV以RT-ERA法进行检测，设计筛选了专门的P1型成套核酸，包含P1型成套核酸的试剂盒，以及采用该试剂盒的检测方法。该试剂盒使用简单，易于实验操作；不需要大型复杂昂贵的仪器；结果鉴定方便直观，反应结束后无需开盖，可避免开盖导致的后续气溶胶污染假阳性问题，无需后续核酸电泳等繁琐过程；快速高效，在5分钟即可判定阳性，20分钟内即可完成扩增；检测敏感性高，经实验对比测试，该试剂盒检测CHIKV NS1基因的敏感性最低可检测到10拷贝。
本发明以基孔肯雅病毒CHIKV的NS1基因保守序列为目的片段构建标准质粒，建立CHIKV的RT-ERA简单、快速、准确、灵敏的检测方法，结果可靠，成本相对较低，尤其适用于现场或野外即时检测，并适用于国内大多数缺乏实时荧光定量PCR仪的医院、防疫疾控部门实验室使用，适合对海关或边境内CHIKV输入性病例快速初步鉴定及其流行现状筛查，对于CHIKV感染防控工作具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例2的CHIKV阳性对照品合成图谱。
图2为本发明实施例2的阳性对照品系列稀释浓度扩增图。
图3为本发明实施例2的阳性对照品标准曲线。
图4为本发明实施例3中筛选的探针和引物的所有组合。
图5为本发明实施例3中探针引物筛选柱状图和散点图。
图6为本发明实施例3中最终筛选所得四组探针引物RT-ERA扩增图。
图7为本发明实施例4中P1+F5R5引物组合对CHIKV检出限的RT-ERA扩增图，其最低检出限为10copies/μl。
图8为本发明实施例4中P1+F6R6引物组合对CHIKV检出限的RT-ERA扩增图，其最低检出限为10copies/μl。
图9为本发明实施例5中作为示例的探针引物组合特异性RT-ERA扩增图，其中HFRS为肾综合征出血热病毒，YFV为黄热病病毒，JEV为日本脑炎病毒，DENV为登革热病毒，SFTSV为新型布尼亚病毒。
具体实施方式
本发明的发明人课题组获得了基孔肯雅病毒活毒株以及标准品，针对基孔肯雅病毒NS1蛋白基因的序列，设计出RT-ERA方法的2条荧光基团修饰的荧光探针，13条正向引物，13条反向引物。利用含NS1基因的阳性对照品，进行了2×13×13＝338种组合测试，筛选出四对最佳组合的探针引物序列，经实际病毒株的核酸检测测试，在5分钟即可判定阳性，20分钟内即可完成扩增。本发明根据上述研究成果提出了用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸、含有P1型成套核酸的试剂盒、以及相应的检测方法。
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBROOK.J等编著的《分子克隆实验指南》第4版(Molecular Cloning:ALaboratory Manual；NEW York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2017)中述及的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
以下内容中涉及的实验材料和试剂，如未特别说明则为市售品。
实施例1
本实施例为设计合成基孔肯雅病毒ERA检测的荧光探针及引物。
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中不同亚型基孔肯雅病毒CHIKV的序列检索对比，确定NS1基因保守区域为靶序列。
ERA反应的探针和引物设计遵循以下原则：(1)引物长度以28-35nt为宜；(2)引物GC含量控制在35％-60％；(3)引物扩增片段长度在100-250bp之间；(4)探针长度为46-52nt，其中限制酶切位点的5`端至少30nt，3`端至少15nt；(5)探针荧光团和淬灭团标记在胸腺嘧啶上；(6)探针的3`端加上阻断基团。
根据以上原则，先利用Primer Premier 5.0软件设计探针和引物序列，然后利用oligo7软件分析并评估引物质量(是否含发夹结构、二聚体、错配双链)，再经过Primer-blast验证引物特异性，最终筛选出2条探针序列(CHIKV NS1 P1、CHIKV NS1 P2)、13条正向引物序列(F1至F13)和13条反向引物序列(R1至R13)，具体序列如表1所示；其中，荧光探针中插入四氢呋喃(THF)作为限制外切酶的酶切位点，THF左右碱基分别加上FAM荧光基团和BHQ淬灭基团，3`端加入C3-spacer阻断基团。以上所有引物和修饰探针由苏州梓熙生物科技有限公司合成。
表1.筛选的探针和引物序列
实施例2
本实施例为合成ERA检测用阳性对照品，并经检测获得标准曲线。
该阳性对照品的获得方法如下：将NS1靶序列克隆至pUC18载体(金斯瑞生物科技股份有限公司)并测序，命名为CHIKV NS1质粒。将CHIKV NS1质粒用SmaI限制性内切酶(日本Takara公司)，分别割胶纯化后作为模板，使用RiboMax T7 In Vitro TranscriptionSystem(美国Promega公司)进行体外转录，用Dnase酶试剂将DNA模板分别完全降解，获得的RNA产物分别使用RNA纯化试剂盒(Qiagen)纯化，使用Qubit4.0测定浓度，所得RNA片段即为CHIKV阳性对照品，其浓度为10ng/μl，通过公式(6.02×1023)×[浓度(ng/μl)×10-9)]/(质粒全长×660)计算得到阳性对照品的拷贝数浓度约为3×109copies/μl。通过10倍倍比稀释，获得阳性对照品的1×102copies/μl、1.0×103copies/μl、1.0×104copies/μl、1.0×105copies/μl、1.0×106copies/μl、1.0×107copies/μl系列稀释浓度，采用基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒(江苏硕世YJC40104N)对系列稀释浓度的阳性对照品进行检测，并绘制标准曲线。
CHIKV阳性对照品的合成图谱如图1所示，SmaI限制性内切酶切割pUC18载体，将CHIKV NS1靶基因重组成标准质粒，经转录为RNA后成为上述CHIKV阳性对照品。图中所示的PCR Product为CHIKV NS1靶基因(即基孔肯雅病毒的NS1基因保守序列)，长度为1605bp，序列为SEQ ID NO:6：atggatcctgtgtacgtggacatagacgctgacagcgcctttttgaaggccctgcaacgtgcgtaccccatgtttgaggtggaacccaggcaggtcacaccgaatgaccatgctaatgctagagcgttctcgcatctagctataaaactaatagagcaggaaattgatcccgactcaaccatcctggacatcggcagtgcaccagcaaggaggatgatgtcggacaggaagtaccactgcgtctgcccgatgcgcagcgcagaagaccccgagagactcgccaattatgcgagaaagctagcatctgctgcaggaaaagtcctggacagaaacatctctggaaagatcggggacttacaagcagtaatggccgtgccagacacggagacgccaacattctgcttgcacacagatgtctcatgtagacagagagcagacgtcgcgatataccaagacgtctatgctgtacacgcacccacgtcgctataccaccaggcgattaaaggggtccgagtggcgtactgggtagggttcgacacaaccccgttcatgtacaatgccatggcgggtgcctacccctcatattcgacaaactgggcagacgagcaggtactgaaggctaagaacataggattatgttcaacagacctgacggaaggtagacgaggtaaattgtctattatgagagggaagaagctaaaaccgtgtgaccgtgtgctgttctcagtagggtcaacgctctacccggaaagccgcaagctacttaagagctggcacttaccatcggtgttccatctaaagggcaaactcagcttcacatgccgctgtgatacagtggtttcgtgcgagggctacgtcgttaagagaataacgatgagcccaggcctttatggaaaaaccacagggtatgcggtaacccaccacgcagacggattcttgatgtgcaagactaccgacacggttgacggcgaaagagtgtcattctcggtgtgcacatacgtgccggcgaccatttgtgatcaaatgaccggcatccttgctacagaagtcacgccggaggatgcacagaagctgttggtggggctgaaccagagaatagtggttaacggcagaacgcaacggaatacgaacaccatgaaaaactatctgcttcccgtggtcgcccaagccttcagtaagtgggcaaaggagtgccggaaagacatggaagatgaaaaactcctgggggtcagagaaagaacactgacctgctgctgtctatgggcattcaagaagcagaaaacacacgcggtctacaagaggcctgatacccagtcaattcagaaggttcaggccgagtttgacagctttgtggtaccgagcctgtggtcgtccgggttgtcaatccccttgaggactagaatcaaatggttgttaagcaaggtgccaaaaaccgacctgatcccatatagcggggacgcccaagaagcccgggacgcagaaaaagaagcagaggaagaacgagaagcagaactgactcgtgaagccctaccacctctacaggcagcacaggaagatgttcaggtcgaaatcgacgtggaacagcttgaggacagagcgggtgca
阳性对照品系列稀释浓度扩增图如图2所示，每个浓度重复三遍，为阳性对照品标准曲线提供依据。阳性对照品标准曲线如图3所示，拟合直线为Y＝-3.681X+39.55，通过此标准曲线可用于后续计算CHIKV活病毒株拷贝数。
实施例3
本实施例以实施例2所得阳性对照品为模板筛选最优荧光探针和引物。
利用CHIKV RT-ERA检测试剂盒，该试剂盒包括探针引物混合液，RT-荧光扩增试剂，溶解剂(基础通用型RT-ERA法试剂盒提供，产品货号为KS104)，激活剂(乙酸镁280mM)及超纯水，以实施例2所得CHIKV阳性对照品为模板筛选最优荧光探针和引物。每份样本的反应体系如下：
具体实施步骤如下：
第一步、向透明反应管加入溶解剂、探针引物混合液、超纯水、阳性对照品，混合获得反应液；
第二步、将混合反应液转移至RT-荧光扩增试剂(冻干粉)中，震荡混匀直到扩增试剂重悬，并短暂离心；
第三步、在反应管盖上加入2μl激活剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂震荡混匀并再次快速离心；
第四步、将反应管置于荧光恒温扩增仪GS8(40℃-42℃)中进行RT-ERA扩增，持续20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值；
第五步、反应结束，保存数据。
其中，探针引物混合液包含一条荧光探针、一条正向引物和一条反向引物，利用实施例1中筛选的2条探针、13条正向引物和13条反向引物，每条荧光探针各对应13×13＝169种引物组合，一共有338种可能的组合方式，具体如图4所示。
每个反应体系中投入1μl标准质粒(109拷贝数)。探针引物筛选柱状图和散点图如图5所示：柱状图表示荧光探针P1对应的引物组合中有40种引物组合扩增有效，而荧光探针P2对应的引物组合中只有20种引物组合扩增有效；散点图则根据扩增时间进一步说明荧光探针P1和荧光探针P1各有两对引物组合时，扩增效率较高。
当荧光探针为CHIKV NS1 P1时，扩增效率最高的两对引物组合为F5R5和F6R6，当荧光探针为CHIKV NS1 P2时，扩增效率最高的两对引物组合为F11R11和F13R13。由此最终筛选获得4种探针引物组合，其RT-ERA扩增图如图6所示，均在5分钟即可达到荧光值5000以上(可判定阳性)，20分钟内完成扩增，其中荧光探针P1组对应的荧光值起峰时间比荧光探针P2更早(后续灵敏度测试亦显示P1组更佳)，P1+F5R5和P1+F6R6均呈稳定典型的S型扩增曲线；而荧光探针P2组对应的荧光值比荧光探针P1更高(提示扩增效率可能更高)，同时P2+F11R11亦呈现稳定典型的S型扩增曲线。以上结果提示P1组、P2组扩增效果均良好。
这4种探针引物组合分别为P1+F5R5、P1+F6R6、P2+F11R11和P2+F13R13，具体序列如表2所示。
表2.筛选的4组探针引物组合
实施例4
本实施例为鉴定实施例3所得探针引物组合P1+F5R5、P1+F6R6的敏感性。
采用基孔肯雅病毒核酸检测试剂盒对CHIKV活病毒株进行qPCR扩增，通过检测的CT值和实施例2中获得的阳性对照品标准曲线计算得到其拷贝浓度为106copies/μl。通过10倍倍比梯度稀释，得到浓度为1.0×100copies/μl、1.0×101copies/μl、1.0×102copies/μl、1.0×103copies/μl、1.0×104copies/μl、1.0×105copies/μl、1.0×106copies/μl的CHIKV活病毒株系列稀释液，利用实施例3筛选所得探针引物组合P1+F5R5、P1+F6R6进行检测，结果如图7、图8所示，CHIKV的检出限(检测灵敏度)可以达到10copies/μl。
实施例5
本实施例为分析实施例3所得探针引物组合的特异性。
选取与基孔肯雅病毒感染部位相同或感染症状相似且可能存在潜在交叉反应的其它病原体(肾综合征出血热病毒HFRS、黄热病病毒YFV、日本脑炎病毒JEV、登革热病毒DENV、新布尼亚病毒SFTSV)，提取其核酸，利用实施例3筛选所得四组最优探针引物组合进行检测，使用荧光恒温扩增仪GS8观察实验结果。结果显示，除CHIKV为阳性，其他病毒均为阴性结果，提示实施例3所得探针引物组合的特异性良好。实施例3筛选所得四组最优探针引物组合的检测结果是一致的，其中作为示例的结果示意图如图9所示。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效
变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸，其特征是，所述P1型成套核酸由荧光探针和引物对组成，所述引物对由正向引物和反向引物组成；所述荧光探针为CHIKV NS1 P1；所述引物对由正向引物F5和反向引物R5组成，或由正向引物F6和反向引物R6组成；
所述荧光探针CHIKV NS1 P1的序列为在SEQ ID NO:1中将第31位碱基标记荧光基团、将第32位碱基替换为四氢呋喃、将第33位碱基标记淬灭基团、并在3`端加入阻断基团；
正向引物F5的序列为SEQ ID NO:2，反向引物R5的序列为SEQ ID NO:4；正向引物F6的序列为SEQ ID NO:3，反向引物R6的序列为SEQ ID NO:5。
2.根据权利要求1所述用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸，其特征是，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为BHQ，所述阻断基团为C3-spacer。
3.根据权利要求2所述用于以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的P1型成套核酸，其特征是，所述P1型成套核酸针对的靶基因是基孔肯雅病毒的NS1基因保守序列，如SEQ ID NO:6所示。
4.一种以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括：含有权利要求1至3任一项所述P1型成套核酸的探针引物混合液。
5.根据权利要求4所述以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，在探针引物混合液中，P1型成套核酸的荧光探针、正向引物、反向引物的摩尔比为1:3.5:3.5。
6.根据权利要求5所述以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包括RT-荧光扩增试剂、溶解剂、激活剂、超纯水、以及CHIKV阳性对照品。
7.根据权利要求6所述以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，所述CHIKV阳性对照品的制备过程如下：
构建含有CHIKV NS1基因保守序列的质粒，经体外转录反应获得NS1基因的RNA片段，纯化后即得到CHIKV阳性对照品；所述CHIKV NS1基因保守序列如SEQ ID NO:6所示。
8.根据权利要求6所述以RT-ERA法检测基孔肯雅病毒的试剂盒，其特征是，所述RT-荧光扩增试剂和溶解剂均由市售的基础通用型RT-ERA法试剂盒提供；所述激活剂为280mM乙酸镁溶液；所述CHIKV阳性对照品的浓度为10ng/μl。
9.一种非诊断目的检测基孔肯雅病毒的RT-ERA检测方法，其特征是，采用权利要求4至8任一项所述试剂盒；所述RT-ERA检测方法包括以下步骤：
第一步、将反应管分为样本组和阳性对照组；向各反应管中加入试剂盒的溶解剂、探针引物混合液以及超纯水，获得混合反应液；
第二步、将混合反应液转移至RT-荧光扩增试剂中，震荡混匀直到RT-荧光扩增试剂重悬，离心；
第三步、向样本组的反应管中加入待测核酸样品，混匀后离心；向阳性对照组的反应管中加入CHIKV阳性对照品，混匀后离心；
第四步、在反应管盖上加入激活剂，盖紧管盖，通过离心使激活剂进入管内液体中，震荡混匀并再次离心；
第五步、将反应管置于荧光恒温扩增仪中进行RT-ERA扩增，并采集荧光值；
第六步、反应结束，保存数据；根据阳性对照组的时间-荧光值曲线，判断本次检测是否有效；若本次检测有效，则根据样本组的时间-荧光值曲线，判断待测核酸样品是否含有基孔肯雅病毒。
10.根据权利要求9所述非诊断目的检测基孔肯雅病毒的RT-ERA检测方法，其特征是，第五步中，在RT-ERA扩增时，温度为40℃-42℃，持续5-20分钟，每30秒采集一次FAM通道荧光值。
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