CN116745678A - 在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备 - Google Patents

在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备 Download PDF

Info

Publication number
CN116745678A
CN116745678A CN202280010063.8A CN202280010063A CN116745678A CN 116745678 A CN116745678 A CN 116745678A CN 202280010063 A CN202280010063 A CN 202280010063A CN 116745678 A CN116745678 A CN 116745678A
Authority
CN
China
Prior art keywords
axial
positioning
fluorophore
lateral
stimulable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280010063.8A
Other languages
English (en)
Inventor
R·施密特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aberina Instrument Co ltd
Original Assignee
Aberina Instrument Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aberina Instrument Co ltd filed Critical Aberina Instrument Co ltd
Publication of CN116745678A publication Critical patent/CN116745678A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0072—Optical details of the image generation details concerning resolution or correction, including general design of CSOM objectives
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B27/00—Optical systems or apparatus not provided for by any of the groups G02B1/00 - G02B26/00, G02B30/00
    • G02B27/58—Optics for apodization or superresolution; Optical synthetic aperture systems
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B2207/00—Coding scheme for general features or characteristics of optical elements and systems of subclass G02B, but not including elements and systems which would be classified in G02B6/00 and subgroups
    • G02B2207/113—Fluorescence

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明涉及MINFLUX纳米显微术。本发明改进了孤立荧光团的三维定位。根据MINFLUX原理，使用3D激发圆环(8)将定位分为一系列单独的步骤，来改进利用孤立的可激发荧光团(4)的荧光光子来进行三维定位，其中在一个步骤中确定荧光团的轴向位置或侧向位置。在此，对轴向位置更精确的了解会提高后续侧向定位的质量，反之亦然。三维定位通过以下方法进一步改进：该方法通过用3D激发圆环(8)扫描轴向扫描范围并优选地通过形成矢量和对测量的强度或光子数进行后续评估来进行轴向定位。

Description

在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备
发明技术领域
本发明涉及MINFLUX纳米显微术(Nanoskopie)。本发明改进了对孤立荧光团的三维定位。
现有技术
MINFLUX纳米显微术是在现有技术中仍然新兴的显微术方法。MINFLUX纳米显微术涉及定位显微术方法。荧光团的定位是借助于结构化的激发光分布来实现的。MINFLUX纳米显微术的基本特点是，对荧光团的激发以如下方式进行，即待定位的荧光团总是置于激发光分布的最小值附近或最小值处，该最小值理情况下是零值，其中激发光分布具有一个邻近最小值的强度上升区域。这就实现了在获得有关相应发射的荧光团的位置的信息方面对荧光光子的特别好的利用。这也适用于需要跟踪荧光团随时间移动的应用。例如，从专利DE10 2011 055 367 B4(最初仅用于跟踪样本中单个分子的运动)、EP 3 055 674 B1和DE 102013 114 860 B3中已知使用激发最小值对样本进行观测，这是MINFLUX纳米显微术的基础。在专利EP 3 055 674 B1中建议，为了跟踪样本中的粒子，在多个空间方向上交替地使用不同的激发光分布，利用这些激发光分布分别在彼此正交的方向上跟踪粒子。
在此基础上，形成一系列用于信息获取的改进措施，这些改进措施使得荧光团定位的不确定度能够在2nm以内的范围内。这个不确定度的大小对应于荧光团的范围。关于MINFLUX纳米显微术的详细介绍参见Francisco Balzarotti等人的“Nanometerresolution imaging and tracking offluorescent molecules with minimal photonfluxes”，arXiv:1611.03401[physics.optics](2016)。实验表明非迭代的MINFLUX定位和借助MINFLUX跟踪孤立荧光团。此外，还提出了迭代的MINFLUX的概念。原则上，为了能够借助MINFLUX纳米显微术定位荧光团，必须将强度最小值或者强度零值置于相对于荧光团位置的多个位置处。为此，必须在准备步骤中以最初较低的精确度估计或获知荧光团的位置。例如，这可以借助传统定位显微技术(PALM、STORM)或借助其他已知方法来完成。为此，在上述公开物中描述了一种方法，其中用高斯强度分布扫描样本，直到在扫描位置处探测到以一定概率来自孤立分子的荧光。然后停止扫描，并随后将强度分布定位在扫描位置周围与扫描位置的距离小于光波长的四个位置处。在每种情况下，根据在相对于扫描位置彼此相对的两个单独位置测量到的光子数，基于在公开物中描述的方法估计孤立发射器相对于连接直线方向的位置，从而在垂直于光轴的两个空间方向上总体上确定发射器位置。虽然这种用于预定位的方法与后续跟踪荧光团的运动是联系起来进行描述的，但也可以与定位联系起来使用。每个方向的估计实质上对应于光子数的比率评估。然后，将具有中心最小值的激发光的强度分布(例如，从STED显微术中已知的圆环形形状的强度分布)放置在已知位置处，该位置被选择成使得荧光团的估计位置接近强度分布的最小值。测量荧光团的荧光响应。对强度分布的一个或更多个进一步的位置重复相同的步骤。借助于对强度比的比率评估，可以以更高的精确度确定荧光团的位置。原则上，荧光团离激发最小值越远或者荧光团在强度上升区域位移得越远，发射速率就越大。这个更精确地确定的位置现在可以用作重复上述步骤序列的初始位置，其中激发光的强度分布的最小值的位置可以更接近荧光团的估计位置。强度分布的最小值位置越接近荧光团的实际位置，在给定的不确定度或精确度下，定位所需的荧光光子就越少。在该出公开物中指出，二维定位可以通过首先用一维曲线在一个方向上执行定位，然后用同一个、但旋转之后的曲线在另一个方向上执行定位。进一步指出，未来的工作将涉及使用z圆环的三维定位。
关于MINFLUX显微术的专利公开文件特别是文件WO 2018/069 283A1、US 2019/0235220 A1、US 2019/0234882 A1和US 2019/0234879 A1，其中所提到的美国专利申请是前述临时国际专利申请的所有后续申请，其中也公开了随后参照美国公开文件提及的所有概念。
US 2019/0235220 A1涉及一种使用少量或最小数量的位置的方法，在这些位置处放置激发强度曲线的强度最小值以便确定荧光团的位置，该强度最小值在要确定荧光团的位置的每个空间方向上在两侧与强度上升区域相邻。
US 2019/0234882 A1涉及在上文进一步描述的方法，其中使用从第一MINFLUX步骤获得的位置信息，以便在后续步骤中将强度光分布的最小值放置得更接近荧光团，并由此导出更精确的位置信息。
US 2019/0234879 A1涉及一种方法，其中将激发强度曲线的强度最小值非常快速地、几乎同时地放置在荧光团的估计位置周围的多个位置处。然后，如果确定在单个位置处发射速率增加，则推动该单个位置更接近假定的最小值。
根据WO 2018/069 283A1，可以通过如下方式在多个空间方向上进行定位：对不同的取向依次执行根据该发明的方法的任何方法，例如首先在第一方向上借助于一维激发强度曲线，然后在不同于第一方向的方向上进行。
在Klaus C.Gwosch等人的公开物“MINFLUX nanoscopy delivers 3Dmulticolornanometer resolution in cells”，Nat Methods 17,217-224(2020)，https://doi.org/10.1038/s41592-019-0688-0(连同所属的“SupplementaryInformation”)中，描述了借助于MINFLUX进行三维定位的具体实现方式。在样本的子区域中，借助于聚焦的活化光将孤立荧光团置于可激发状态。在第一步骤中，借助于聚焦的激发光(其中，焦点处的强度分布基本上对应于高斯分布)对这个荧光团进行定位，其方式为将激发光的焦点置于活化焦点位置周围的四个位置处。根据两个相对位置的分别测量到的荧光信号，相应地确定荧光团位置在两个位置的连接直线方向上的位置坐标，从而在总体上确定侧向位置。然后，在第二步骤中，向样本施加聚焦的激发光，其中焦点具有3D环形的形状，即强度分布具有在所有三个空间方向上被强度上升区域包围的局部最小值。在此，将3D环形依次放置在总共两个位置处，其中局部强度最小值在侧向方向上分别位于在第一步骤中确定的位置处。在轴向方向上，局部最小值沿光轴在预期的荧光团位置的上方和下方各放置一次(英语：“the 3Ddonut is targeted in two positionsabove and below the anticipated fluorophoreposition(3D圆环锚定在预期的荧光团位置的上方和下方的两个位置)”)。这种预定位之后是更精确的定位，其中使用具有七个位置的扫描模式，其中五个位置位于扫描模式平面中，这当中的一个位置又位于扫描模式平面的中心以及四个位置均匀地分布在中心位置周围的圆上。扫描模式具有另外两个位置，这两个位置与扫描模式平面的中心位置一起位于扫描模式轴线上，因此在该扫描模式轴线上总共有三个位置。现在依次将3D环形放置到扫描模式的七个位置处，其中将扫描模式的中心位置放置到在预定位时确定的荧光团位置处。在这次定位之后再进行一次定位，其中使用了一个缩小的、但在其他方面相同的扫描模式。这可以迭代地继续进行，直到荧光团失去其荧光能力。
在Jasmin K.Pape等人的公开物“Multicolor 3D MINFLUX nanoscopyofmitochondrial MICOS proteins”，PNAS 2020年8月25日，117(34)20607-20614，2020，https://doi.org/10.1073/pnas.2009364117中，描述了公开物“MINFLUX nanoscopydelivers 3D multicolor nanometer resolution incells”中提出的方法的进一步应用。
在基于图像的定位方法(例如，PALM或STORM)中，在这些定位方法中记录孤立荧光团的衍射图像，然后从这些衍射图像中确定荧光团的位置，分辨率一方面与所用光的波长基本上成正比，另一方面又与探测到的光子数的根成反比，而在迭代的MINFLUX方法中，分辨率取决于迭代的确切类型。这既适用于二维定位，也适用于三维定位。这是因为荧光团的位置在给定的迭代步骤中(即，在给定的扫描模式范围下)的不确定度恰恰取决于扫描模式范围。在此要注意的是，只有当荧光团的实际位置与中心位置的距离相对于扫描模式范围不是太大时，定位才会成功。
在上述公开物“Nanometer resolution imaging and tracking offluorescentmolecules with minimal photon fluxes”中指出，在用2D激发圆环进行扫描时使用具有总共四个扫描模式位置(其中三个在圆上，一个在圆的中心)的扫描模式可以实现的二维定位的最小不确定度与扫描模式的直径L成正比，此外又与探测到的光子数的根成反比。这导致目标必须是迭代地达到扫描模式的小直径，其中要注意的是，在后续步骤中扫描模式的直径应足够大，以确保荧光团的实际位置与在前一个迭代步骤中确定的位置的距离相对于该扫描模式的范围不会太大，否则在该后续步骤中的定位将不会成功。使用最大似然估计可以实现对信息的理想利用。然而前提是，激发圆环的强度曲线和例如背景荧光的量是已知的。此外，借助于最大似然法进行定位是耗时的，因此不适用于迭代应用，因为必须尽可能快地缩小扫描模式并将模式位移到在某一步骤中估计的位置处。因此，在实际应用中，根据现有技术，使用以下所谓的修正最小均方估计器(mLMSE)的公式：
(在公开物的方程式S50和所有基于该方程式的方程式中，底数被错误地称为“log(2)”，而不是“ln(2)”)，其中在每种情况下都是归一化为位置/>处探测到的光子总数的光子数。fwhm是在激发圆环的局部最小值周围区域的全半值宽度；k是估计器的阶，其选择影响可以进行定位的区域；以及βj是标量参数，其特别地根据预期的信噪比来选择，以获得具有尽可能小的系统性位移的定位。
在实践中应用的这种估计器基于所谓的线性最小均方(LMS)估计器来展开：
该估计器又是通过将最大似然确定的解线性化而导出的。根据“MINFLUXnanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”中的信息，LMS估计器的缺点是，在扫描模式中心测量到的光子数不纳入位置确定中。这个缺点是一个决定性缺点，因为虽然在中心测量到的值不包含任何关于荧光团位置在平面中的方向的直接信息，但是包含关于荧光团位置与中心的距离的信息。因此，mLMSE展开的目的是使来自在中心的测量的信息可用。这一点是重要的，因为否则的话，现有的定位模糊性可以通过在中心的测量来避免。如果不评估在中心获得的测量值，则存在这种模糊性，因为在某些情况下，根据测量无法决定荧光团是在扫描模式的外侧位置的圆内，还是在扫描模式的外部位置的圆外。
原则上，mLMSE具有偏差，即借助于mLMSE确定的荧光团位置相对于实际位置存在系统性位移，然而通过根据对背景荧光的假设并根据所选的估计器的阶来优化地选择参数βj，使这种偏差最小化。原则上，只有当扫描模式在中心具有实际上在其处也进行扫描的位置时，该估计器才能用作估计器。这是因为项基于对扫描模式中心的光子数的测量，该项确保了估计器的适当缩放，以使偏差最小化。虽然在测量完成后进一步分析数据是可行也是常见的，以便与测量期间获得的估计值相比，获得以上述方式定位的所有荧光团的位置的改进估计值，但由此获得的分析质量仍关键地取决于在测量期间获得的估计值的质量，因为这些估计是迭代过程的基础，因此是扫描模式的最小可能直径的基础以及使用该最小扫描模式可测得的光子数的基础。
在“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolutionincells”和所属的“Supplementary Information”中描述的方法现在直接建立在上述方法和关于该方法的理论工作上。为了在用3D圆环进行测量期间估计荧光团的位置，使用以下广义公式的mLMSE：
(其中，在右边的求和中，索引i＝0的值不提供任何贡献)。对于具体展示的测量，选择阶k＝1，因此总体上对于如上所述的测量(四个位置在圆上，三个位置在轴线上)，估计器的公式为：
在此，分别为标量值的参数βj针对典型的信噪比进行数值优化，其中3D圆环的形状通过平方函数近似，即假定强度随着与3D激发圆环的中心强度最小值的距离呈平方增加。迭代的MINFLUX定位的优化参数(即，迭代阶段的数量、每个扫描阶段的扫描模式的直径L和每个扫描阶段的光子数N)是通过模拟确定的，该模拟基于荧光团位于直径为360nm的活化体积内这一假设，这也包括借助最大似然估计的最终定位。在这个模拟的范围内，还考虑了高斯激发点和2D圆环在轴向方向上的变化，其中未明确是否借助2D圆环来研究3D定位的特性。
借助MINFLUX纳米显微术，可以通过实验在三个空间方向上确定荧光团的位置，其不确定度为几个纳米，也就是说，位置确定的精确度与荧光团本身的范围相当。如果要以给定的测量不确定度确定单个荧光团的位置，则为此需要比借助常规定位显微术确定单个荧光团的位置更短的时间，特别是更少的荧光光子数。在现有技术中，根据MINFLUX方法在三个空间方向上定位单个荧光团具体地仅显示了定位与待定位荧光团的活化的直接耦合。在这种情况下，由于局部活化，待定位荧光团的轴向位置往往是足够多次充分了解的，以便使用z圆环激发光来更精确地估计轴向位置，该z圆环激发光一次放置在该轴向位置的上方，一次放置在该轴向位置的下方。如果孤立荧光团的轴向位置不能从活化中足够精确地知道，则在现有技术中描述的方法将失败。原则上，如果要对孤立荧光团进行定位，而不在定位之前立即明确活化这些孤立荧光团，则该方法不适用。此外，从现有技术中已知的方法的弱点是，随时间在测量期间获得的位置估计值的质量不仅被背景信号本身降低，而且如果背景信号偏离了在优化参数βj时使用的关于背景信号的假设，则质量会系统性地进一步降低。
用于3D-MINFLUX纳米显微术的已知方法的另一个关键弱点是，荧光团位置的实时估计基于通过二次函数对3D激发圆环形状的近似以及轴向位置和侧向位置的耦合估计。由于这种近似充其量是对与中心最小值的非常小的距离的一种很好的近似，因此与已知估计器的使用相结合的这种假设特别是在MINFLUX迭代的早期步骤中，当使用具有大直径的扫描模式时，会导致荧光中可用信息的利用性降低。
发明任务
本发明的任务在于给出用于定位三维扩展的样本或样本区域中的孤立荧光团的改进的MINFLUX方法。一方面，即使是那些从一开始就不太了解的轴向位置也应能够被可靠地定位。另一方面，在确定三维扩展的样本或样本区域中的孤立荧光团的定位方面，应进一步改进对荧光的利用。
解决方案
本发明的任务通过具有独立专利权利要求1的特征的定位显微方法和具有并列专利权利要求5的特征的另一定位显微方法以及具有权利要求25的特征的显微镜来实现，该显微镜被配置用于执行根据本发明的方法。从属权利要求2至4和12至19涉及根据专利权利要求1的方法的优选实施方式，从属权利要求6至11涉及根据专利权利要求5的方法的优选实施方式，从属权利要求20至24涉及根据权利要求1的方法和根据权利要求5的方法的优选实施方式，以及从属权利要求26涉及根据权利要求25的显微镜的优选设计方案。
发明描述
为了进一步改进在确定三维扩展的样本或样本区域中孤立荧光团的定位时对荧光的利用，根据本发明的第一方面，在根据MINFLUX方法使用3D激发圆环(即，激发光的强度分布，该强度分布具有局部最小值，该局部最小值在所有三个空间方向上被强度上升区域包围)定位样本中的孤立的可激发荧光团时，定位分为两个步骤：轴向(axial)定位步骤和侧向(lateral)定位步骤。虽然在现有技术中已知在一个步骤中使用3D激发圆环(3D-Anregungsdonut)用于轴向定位，但在该步骤中不会新确定侧向位置。在该轴向定位中，将3D圆环的中心局部最小值放置在穿过可激发荧光团的估计位置的扫描模式轴线上的两个轴向样本位置处，然后在该轴向定位之后是在侧向方向和轴向方向上同时定位，对此，将3D激发圆环的中心局部最小值放置在可激发荧光团的估计位置周围的在三个空间方向上扩展的扫描模式上。
因此，根据本发明的第一方面的通过用具有中心局部最小值的3D激发圆环扫描可激发荧光团以高分辨率地确定可激发荧光团在样本中三个空间方向上的位置的方法，包括从现有技术中已知的轴向定位步骤，
-在该轴向定位步骤中，将中心局部最小值按顺序放置在穿过可激发荧光团的估计位置延伸的扫描模式轴线上的两个轴向样本位置处，其中样本位置对包围可激发荧光团的估计位置，
-其中在该轴向定位步骤中，针对轴向样本位置中的每个轴向样本位置测量由可激发荧光团发射的荧光，并且将测量值分配给相应的轴向样本位置，
-其中在该轴向定位步骤中，根据分配给轴向样本位置的测量值来确定可激发荧光团的轴向位置的新估计。
然而，现在与现有技术不同的是，随后不是在侧向方向和轴向方向上同时进行定位，而是随后进行侧向定位步骤，
-在该侧向定位步骤中，仅在垂直于扫描模式轴线定向的扫描模式平面中，将中心局部最小值按顺序放置于在一个或更多个先前执行的步骤中估计的可激发荧光团位置周围布置的至少三个侧向样本位置处，
-其中在该侧向定位步骤中，针对侧向样本位置中的每个侧向样本位置测量由可激发荧光团发射的荧光，并将测量值分配给相应的侧向样本位置，
-其中在该侧向定位步骤中，根据分配给侧向样本位置的测量值来确定可激发荧光团的侧向位置的新估计。
使用至少三个侧向样本位置，因为这是可以在两个侧向空间方向上进行侧向定位的最小样本位置数。优选地，选择样本位置，使得这些样本位置均匀地位于可激发荧光团的估计位置周围的一个圆上。选择六个这样的样本位置是有利的，因为由此提供了非常对称的记录条件，其结果是估计荧光团位置的不确定度与荧光团的精确的实际位置几乎无关。原则上，除了位于荧光团的估计位置周围的样本位置之外，还可以使用与荧光团的估计位置相对应的另外的样本位置。
为了现在能够可靠地定位其轴向位置从一开始不太清楚的荧光团，根据本发明的第二方面，提出了用于轴向定位的方法，该方法适于确定其轴向位置在执行根据本发明的这一方面的方法之前很不清楚(其不确定度例如为±250nm或±500nm或甚至更大)的荧光团的轴向位置。本发明说明书开篇所提到的方法不适用于此，因为用该方法只能定位如下荧光团：当3D圆环的中心局部最小值位于扫描模式轴线上的两个样本位置中的一个样本位置时以及位于另一个样本位置时，这些荧光团明显地位于轴向强度曲线的最大值之间的范围内。在根据现有技术的排列中，最大值之间的这个范围扩展约为500nm。
根据本发明的第二方面，通过用聚焦的激发光扫描可激发荧光团对可激发荧光团进行轴向定位，其中轴向扫描范围大于500nm或大于1000nm。轴向扫描范围特别地平行于或沿着光轴延伸，沿着光轴用激发光照射样本。轴向定位特别地是平行于或沿着该光轴的定位。光轴可以与根据第一方面的方法限定的扫描模式轴线相同或与其平行。
原则上，根据本发明的这个第二方面的方法可以用高斯激发焦点来执行。于是，激发光的轴向强度分布具有中心最大值。稍后将解释，在某些情况下，对于定位来说，轴向强度曲线并非直接起到决定性作用，而是有效轴向强度曲线起到决定性作用，该有效轴向强度曲线考虑到探测的点扩散函数从轴向强度曲线得出。该有效轴向强度曲线也具有中心最大值。
然后，在扫描时，相邻扫描点的距离最多为轴向有效强度曲线的半值宽度的一半是有利的。由此实现了，在扫描进程中，向可激发荧光团至少施加一次与最大强度相差不大的强度，施加一次降低的强度，并且额外施加极大降低的强度；或者，在相对于扫描位置模式的不同位置处施加两次降低的、但仅与最大强度相差很小的强度。
如果扫描是用高斯激发焦点进行的，这就要求，如果在用于轴向定位的方法之后要应用3D激发圆环进行MINFLUX定位，则必须在两种照射类型之间进行切换。现有技术中存在针对此类措施的解决方案。反之，放弃切换则要求用与MINFLUX定位所用相同的轴向强度曲线(即，具有中心最小值的轴向强度曲线)进行扫描。后者最初似乎不适于扫描，因为激发强度并非集中在一个狭窄的区域，而是恰恰在轴向强度曲线的中心区域中有一个最小值，因此在中心周围的区域中提供的激发强度特别低。然而，在本发明人的研究中发现，尽管对扫描有这些明显的缺点，但即使用3D圆环的轴向强度曲线进行扫描，轴向定位也能取得令人惊讶的成功。
因此，根据本发明的第二方面的方法可以特别优选地执行成使得聚焦的激发光是3D激发圆环，该3D激发圆环具有有效轴向强度曲线，该有效轴向强度曲线具有中心局部最小值和与最小相邻的最大值。在这种情况下，也可以参考有效轴向强度曲线的最大值的距离来指定扫描范围和样本位置的距离。于是，轴向扫描范围大于有效轴向强度曲线的最大值的距离，优选地，扫描范围至少是有效轴向强度曲线的最大值的距离的两倍。
在这里，捕获范围应理解为当应用所相关的扫描模式时(即，当应用相关的扫描点集合时)可以在其中进行明确定位的范围。在根据本发明的第二方面的方法中，当3D激发圆环用于轴向定位时，优选地，轴向捕获范围至少与有效轴向强度曲线的最大值的距离一样大。
在应用3D激发圆环进行轴向定位时，可以优选地将扫描模式选择成使得相邻的扫描点的距离最多为轴向有效强度曲线的最大值的一半。然而，在中心(其位置通常与可激发荧光团的估计位置重合)的扫描位置的模式可能具有间隙。这意味着与轴向范围的中心位置相邻的扫描点彼此间的距离可能较大。这个更大的距离最多与轴向有效强度曲线的最大值的距离一样大。
后面将给出进一步优选的实施方式，因为它们的具体特性同时也对应于根据本发明的第一方面的方法的具体特性。
现在可以优选地执行根据本发明的第一方面的方法(其进一步改进了在确定三维扩展的样本或样本区域中孤立荧光团的定位中对荧光的利用)，使得用于获得可激发荧光团的估计位置的步骤包括用于估计可激发荧光团的侧向位置的侧向预定位的步骤，该侧向预定位在轴向定位步骤和侧向定位步骤之前执行，即在执行本发明的第一方面所必需的步骤之前执行。在现有技术中，这种侧向预定位是在使用高斯激发光执行与本发明不对应的MINFLUX方法之前进行的。这需要将激发光从高斯激发光切换到3D圆环的切换可能性，其在技术上并因此在经济上都是相对耗费的。优选地，通过用3D激发圆环激发可激发荧光团发出荧光(其中，用探测器检测受激发的荧光)来执行预定位，以减少技术耗费，同时提高测量速度。
在这种方法中，可以优选地根据在包含与激发焦点共焦的点的图像平面中对荧光的空间分辨率检测来估计可激发荧光团的侧向位置。在此，可以例如使用光子计数雪崩二极管阵列来在图像平面中对荧光发射进行空间分辨率检测。根据测量到的光子数的分布，或者在使用非计数探测器阵列或探测器阵列的情况下根据图像平面中荧光的测量值分布，然后可以估计样本中荧光团的位置，也就是说，可以估计可激发荧光团在激发焦点内的位置。这不需要使激发焦点移位，也不需要调整扫描仪。
可替代地，通过使与激发焦点共焦的点在图像平面中相对于带孔光阑(Lochblende)移位、优选地在中心周围的圆形轨道上移位，可以在图像平面中对荧光发射进行空间分辨率检测，其中穿过带孔光阑的荧光使用不必具有空间分辨率的探测器来检测并被分配给共焦的点的相应位置。在这里，根据图像平面中荧光的测量值分布也可以估计样本中荧光团的位置，也就是说，可以估计可激发荧光团在激发焦点内的位置。在此，激发焦点应保持位置固定。这可以在图像平面中使与激发焦点共焦的点移位的同时以如下方式实现：仅作用于激发光而不作用于荧光的偏转单元与既作用于激发光也作用于荧光的偏转单元进行反向运动。
优选地，根据本发明的第一方面的方法可以与根据本发明的第二方面的方法相结合，这样就可以可靠地定位其轴向位置并非预先已知的荧光团，同时进一步改进在确定三维扩展的样本或样本区域中孤立荧光团的定位时对荧光的利用。在这种组合中，用于获得可激发荧光团的估计位置的步骤包括轴向预定位的步骤用于确定估计位置的轴向坐标，该轴向预定位在轴向定位步骤和侧向定位步骤之前根据本发明的第二方面的用于对可激发荧光团进行轴向定位的方法执行。
于是优选地，侧向定位步骤在轴向预定位步骤之后(优选地紧接着轴向预定位步骤)并且在轴向定位步骤之前(也就是说，特别是在例如仅关于在本发明的第一方面提到的轴向定位步骤首次进行之前)首次进行。为了清楚起见，在此规定，根据第二方面的方法本身在本文中被称为轴向定位，其与根据第一方面的方法相结合承担起轴向预定位的作用，并因此还被称为轴向预定位。与根据本发明的第二方面的轴向定位不同，轴向定位步骤用于第一方面；因此，该术语在每种情况下都表示根据本发明的第一方面的方法的一个步骤。
无论是根据本发明的第一方面的方法本身，还是该方法与根据本发明的第二方面的方法的结合，都可以以如下方式执行：在首次执行侧向定位步骤之前首次执行轴向定位步骤。可激发荧光团的轴向位置已知得越好，根据MINFLUX方法的侧向定位应用3D激发圆环可以执行得越好。特别地，在某种意义上，用3D激发圆环在轴向方向上进行定位比在侧向方向上进行定位表现得更好，因为侧向方向上的不确定度对轴向定位的精确度不太关键。因此，每当根据第二方面的方法或根据给定的可替代方案(其中，切换了激发光的强度分布)不将轴向定位执行为预定位时，非常优选地，在首次执行侧向定位步骤之前首次执行轴向定位步骤。
根据本发明的第一方面的方法可以优选迭代地执行。如果根据本发明的第一方面的方法与根据本发明的第二方面的方法结合为用于预定位的方法，则该方法至少通常只执行一次，然后在整体方法之后迭代地执行根据本发明的第一方面的方法。在迭代执行中，执行多个轴向定位步骤、多个侧向定位步骤或者既执行多个轴向定位步骤也执行多个侧向定位步骤。在此，将三维定位分为两个分开的子步骤能够使步骤序列与精确的观测目标和样本特性相适配。
例如，在侧向定位步骤之后，如果在侧向定位步骤中以给定精度确定了可激发荧光团的侧向位置的新估计时，则随后可以执行轴向定位步骤。根据可激发荧光团的实际位置与估计位置的偏差，可以在一个或更多个侧向定位步骤中实现预定精度。
此外，无论是结合所提到的精度标准的应用，还是一般地在其他类型的迭代执行中，都可以优选地连续执行多个侧向定位步骤。在这种情况下，进一步优选地从可激发荧光团的估计位置和在侧向定位步骤中获得的可激发荧光团的侧向位置的新估计来确定可激发荧光团的新估计位置，该新估计位置为相应的后续侧向定位步骤构成可激发荧光团的估计位置。例如，如果主要寻求良好的侧向定位，则这种类型的迭代执行是优选的。
特别地，如果在所寻求的定位精确度方面没有优选方向，或者如果样本中待定位的荧光团沿所有空间方向移动且如果要跟踪荧光团的这种移动，则优选的是，执行轴向定位步骤和侧向定位步骤的交替序列，其中分别从可激发荧光团的估计位置和在一个步骤中获得的可激发荧光团的轴向位置或侧向位置的新估计来确定可激发荧光团的新估计位置，该新估计位置为相应的后续步骤构成可激发荧光团的估计位置。
分别从估计位置和新估计中确定新估计位置可能意味着，例如，如果新估计是轴向位置的估计，则通过直接用新估计的轴向位置替换原来的轴向坐标来确定新估计位置，而在本示例情况中侧向坐标不变。但是，例如，也可以从先前确定的多个估计中确定新估计位置的新轴向坐标，也就是说，在确定新估计位置时特别地也考虑原来的估计位置的轴向坐标。同样，这也适用于相反的情况，其中新估计是轴向位置的估计，或者也适用于依次执行多个轴向定位或多个侧向定位的情况。在许多情况下，在确定一个位置方向的位置坐标时，不只考虑最后一个值是有意义的。即使在样本中荧光团移动时也适用如此。然后，根据一系列前面的轴向估计和侧向估计，可以确定荧光团移动的方向和速度，并且可以预先估计未来的位置，即荧光团在下一步的位置。
优选地，迭代方法可以以如下方式执行：在较晚的轴向定位步骤中，样本位置对比在较早的轴向定位步骤中更紧密地包围可激发荧光团的估计位置，或者在较晚的侧向定位步骤中，将中心局部最小值放置在比在较早的侧向定位步骤中更紧密地布置在可激发荧光团的估计位置周围的侧向样本位置处。上述两种措施也可以组合。也就是说，迭代的MINFLUX方法的基本原理在此可以分别单独应用于侧向定位和轴向定位。因此，正如在迭代的MINFLUX中已知的那样，可以分别根据扫描模式的大小(即，直径，或者在轴向定位的情况下为样本位置的轴向距离)来选择3D激发圆环的强度。也可以执行与改变3D激发圆环的强度的效果类似的改变相应的观测持续时间。
在执行根据本发明的第一方面的方法以及执行根据本发明的第二方面的方法时，通过经由可变形的反射镜将激发光引导穿过物镜到达样本中，可以实现激发光在轴向方向上的各自必要的移位，其中通过改变可变形的反射镜的形状来实现轴向定位。也就是说，在执行轴向定位步骤时，优选地通过使激发光束路径中的可变形的反射镜相应地变形，将3D激发圆环定位在轴向位置处，以便按顺序放置到两个轴向样本位置处；同样，优选地通过使激发光束路径中的可变形的反射镜相应地变形，将3D激发圆环定位到轴向位置，以便调整扫描模式平面；最后，通过使激发光束路径中的可变形的反射镜相应地变形，定位聚焦的高斯激发光或3D激发圆环，以便在轴向定位时进行扫描。为此目的，优选地将可变形的反射镜放置在物镜的背面孔径的平面中或与其共轭的平面中，即可以形成物镜的瞳孔的平面中。
在根据本发明的第一方面的方法和根据本发明的第二方面的方法中，根据相应的测量值确定位置可以特别简单地通过评估矢量和来实现。这意味着，可激发荧光团的轴向位置的新估计或可激发荧光团的侧向位置的新估计是通过评估矢量和获得的，或者在轴向预定位时确定估计位置的轴向坐标，或者轴向定位通过评估矢量和来实现。优选地，矢量和的公式为其中pj表示在3D激发圆环或聚焦的激发光的位置/>处探测到的光子数或强度。
在对该矢量和的简单计算中，在给定扫描模式的每个方法中，如果不考虑噪声的影响，并且如果不存在背景信号，则在一定的位置范围内对于荧光团的每个实际位置都精确获得一个确定的值，也就是说，一个位置恰好有一个计算的值。因此，在每种情况下，都可以根据预定的校准函数来校正矢量和的值，以获得轴向位置的新估计或侧向位置的新估计，或者在轴向预定位的情况下获得估计位置的轴向坐标或轴向定位。相应地，可以从模拟中确定要应用的相应校准函数。
现有的背景信号(例如，背景荧光、散射进入的环境光或在显微镜内散射或反射的光)平均来看不会影响矢量和的分子项，但会影响分母。这意味着，上述公式中矢量和的值系统性地取决于背景信号的量。因此，在评估矢量和时，优选地考虑背景信号的量。这可以通过在上述公式的分母中减去背景信号的值来特别简单地实现。为此目的，优选地从测量数据中以平滑的方式(gleitend)确定背景信号的量。
上述两种方法，即根据本发明的第一方面的方法以及根据本发明的第二方面的方法，优选实时地执行。这是有利的，因为在根据本发明的第一方面的方法中，新位置可以分别通过评估简单的矢量和来获得，或者在根据本发明的第二方面的方法中，定位可以根据评估简单的矢量和来获得。
在执行实时方法之后，或者在时间上在执行实时方法之后的任何时间段内，可以进行进一步的数据分析。为此目的，永久存储在执行期间获得的各个步骤的数据。例如，从这样的数据分析中可以获得更精确的定位。然而，可达到的精确度取决于所获得的数据的质量。这意味着，根据本发明的方法不仅能够进行更好的实时评估，而且能够改进后续分析结果的质量。
根据本发明的显微镜的特征在于其具有控制装置，该控制装置被配置成控制显微镜执行根据本发明的第一方面的方法或根据本发明的第二方面的方法。优选地，控制装置被配置成使得可以执行根据本发明的第一方面的方法和根据本发明的第二方面的方法或组合方法，这取决于用户的选择。
特别优选地，根据本发明的显微镜具有可变形的反射镜，该可变形的反射镜用于使激发焦点在样本中轴向移位(这也包括使3D激发圆环的轴向移位)。可变形的反射镜优选地被放置在物镜的背面孔径的平面中或与其共轭的平面中，即可以形成物镜的瞳孔的平面中。
从专利权利要求书、说明书和附图以及对附图的相关阐述中得出本发明的有利的改进方案。其中一些附图是流程图，根据这些流程图在整体上对根据本发明的方法进行非常详细地阐述。
权利要求不应被理解为，本发明的可能的改进方案只能是除了独立方法权利要求1和5以及设备权利要求25的特征之外仅具有从属权利要求的全部特征或不具有从属权利要求的任何特征的设备或方法的主题。更确切地，进一步的改进方案可以从说明书中所提到的特征以及从附图和相关阐述中得出的特征中得出，这些特征可以单独地或累积地产生效果。
附图简述
图1示出了根据现有技术的迭代的MINFLUX方法进行二维定位的流程。
图2是根据现有技术的三维MINFLUX定位的流程的图示。
图3是根据本发明实施方式的三维MINFLUX定位的流程的图示。
图4是根据本发明的一个方面使用3D激发圆环进行轴向预定位的方法的图示。
图5是根据本发明的一个方面进行轴向预定位的方法的图示，该方法具有扩大得更多的捕获范围。
图6是3D激发圆环8沿光轴的有效强度分布的剖面的等高线图。
图7至图10示出了使用3D激发圆环和各种扫描模式确定可激发荧光团的轴向位置的模拟计算结果。
图11至图13示出了捕获范围扩大的优选扫描模式的相应结果。
图14是在用3D激发圆环进行连续或精细的网格化扫描的基础上，用扩大的捕获范围进行轴向预定位的另一方法的图示。
图15是根据本发明的显微镜的实施方式的示意图。
附图描述和本发明基于附图的阐述
下面基于附图中所示的实施例进一步解释和描述本发明。为了说明与现有技术的区别，首先基于图1和图2对现有技术进行解释。
在图1中示出了根据现有技术的迭代的二维MINFLUX定位的可能流程。向孤立荧光团4施加高斯激发强度分布3，该高斯激发强度分布3放置在荧光团的估计位置16周围的四个位置处，使得在第一位置方向5上和在第二位置方向6上各有两个位置相对于估计位置16彼此相对。根据对每两个测量到的荧光强度或光子数，确定可激发荧光团在第一位置方向5和第二位置方向6上的位置。涉及侧向预定位17的预定位10这一步骤是已知的，例如从现有技术部分中提到的与随后跟踪荧光团的运动有关的公开物“Nanometer resolutionimaging and tracking of fluorescent moleculeswith minimal photon fluxes”已知。预定位10之后是迭代的实时MINFLUX定位33，其包括侧向MINFLUX定位30、30’、30”三个步骤。对于侧向MINFLUX定位30、30’、30”，将激发光分布(其在侧向方向上在焦点中心具有局部强度最小值，理想情况下为零值，简称为2D激发圆环32)放置在预定位中确定的荧光团4位置周围的圆上的三个位置处和在预定位中确定的荧光团4位置本身处。因此，扫描模式9包含四个扫描位置。探测荧光，直到可以从测量结果中(例如，以一预定量)更精确地估计出可激发荧光团4位置。如何进行这一评估在这一公开物中进行了描述，并在现有技术部分中提到了。随后，在执行侧向MINFLUX定位30’之前，将扫描模式9移位，使得其中心与在前一步骤中确定的、更接近可激发荧光团4的实际位置的可激发荧光团4位置重合；同时缩小扫描模式9的直径19。再次探测荧光，直到可以从测量结果中(例如，以一预定量)更精确地估计出可激发荧光团4位置，并且随后以同样的方式进行移位并缩小扫描模式9的直径19，最后执行进一步的侧向MINFLUX定位30”。在迭代的实时MINFLUX定位33之后是最终定位43，最终定位43在分析中获得在迭代的实时MINFLUX定位33中获得的测量数据。
在图2中示出了具有预定位步骤的迭代的三维实时MINFLUX定位的流程，该流程基本上对应于现有技术部分中提到的公开物“MINFLUXnanoscopy delivers 3D multicolornanometer resolution in cells”中所描述的流程。在样本的子区域中，借助于聚焦的活化光将孤立荧光团置于可激发状态。可替代地，第一步骤是发现1可激发荧光团4。如结合图1所述，在侧向预定位17步骤的预定位中，借助于高斯激发强度分布3(在图2中由黑色四角星表示)实时定位该可激发荧光团4。为此，将高斯激发强度分布3放置在第一位置方向5上的两个侧向位置11、11’处和第二位置方向6上的两个侧向位置12、12’处。然后，在轴向预定位18的步骤中，向样本施加聚焦的激发光，其中焦点具有3D圆环的形状，即强度分布具有在所有三个空间方向上都被强度上升区域包围的局部最小值。因此，用3D激发圆环8照射样本。在此，将3D激发圆环8依次放置在总共两个轴向位置15、15’处，其中局部强度最小值在侧向方向上分别位于在侧向预定位17中确定的位置处。在轴向位置方向7上，局部最小值沿光轴放置在预期荧光团位置的上方一次，下方一次。虽然上述关于现有技术的公开物中没有明确说明这两个位置彼此间的距离，但根据关于设定3D激发圆环8的轴向焦点位置的信息得出，该距离最大可以为400nm。这意味着，如果要使用该方法更精确地确定可激发荧光团4的轴向位置，则对于3D激发圆环8的两个位置，可激发荧光团4必须位于3D激发圆环8的轴向强度曲线的上强度最大值和下强度最大值之间。根据在轴向位置15、15’处测量到的荧光信号，确定可激发荧光团4的轴向位置。这个预定位10之后是实时执行的更精确的3D定位20，其中使用具有七个位置21至27的扫描模式，其中五个位置21至25位于扫描模式平面29中，当中的一个位置又是扫描模式平面29中心的中心位置25并且四个位置均匀地分布在中心位置25周围的圆上。扫描模式9具有另外两个位置26、27，它们与扫描模式平面29的中心位置25一起位于扫描模式轴线28上，因此共有三个位置25、26、27位于扫描模式轴线28上。现在，按顺序将3D激发圆环8放置到扫描模式9的七个位置21至27处，其中将扫描模式9的中心位置25放置到在预定位10中确定的可激发荧光团4位置处。在这一3D定位20之后是进一步的3D定位20’，其中使用具有位置21’到27’的缩小的、但在其他方面相同的扫描模式9。这可以迭代地继续，直到可激发荧光团4失去其荧光能力。在此，使用以下公式的估计器在第一位置方向5、第二位置方向6和轴向位置方向7上进行3D定位20、20’：
其中，βj是标量校准值，其被选择成使得在实时定位中出现的偏差平均来看尽可能小。由于3D激发圆环8的强度分布走向不是球形对称的，这导致校准值βj要么被选择成有利于更好的轴向位置确定，因此侧向位置确定不是最优的，要么反过来选择，因此轴向位置确定不是最优的。另一个困难在于，3D激发圆环8沿相对于轴线的垂直线的强度走向强烈地取决于该垂直线与3D激发圆环8中心的轴向距离。因此，与二维比较方法的情况相比，利用上述估计器的根据现有技术的方法对发射的光子的利用较差。
在图3中结合预定位步骤示出了根据本发明的一个实施方式的迭代的三维MINFLUX定位的流程。该方法从发现1可激发荧光团4开始。这可以通过不同的方式进行，例如通过激发并在宽视场中观测或者通过对样本的共焦扫描来进行。根据样本，除了激发光外，还可以使用活化光来发现。如果用激发光扫描样本，则为此可以使用高斯激发强度分布3。但也可以优选地使用3D激发圆环8。因为由此避免了对多个光路(在这些光路之间可以快速进行切换)的需要，因此这是优选的。如果发现可激发荧光团4，则可激发荧光团4的位置通常是已知的，其不确定度为衍射极限的数量级。
在发现1之后执行预定位10。在执行根据本发明的方法中，这个预定位10也可以根据从现有技术中已知的方法进行。在所示的实施方式中，预定位是使用3D激发圆环8进行的。用3D激发圆环执行侧向预定位17。在此，可激发荧光团4在第一位置方向5和第二位置方向6上的位置是根据在与激发焦点共焦的图像平面中对荧光发射(即，图像平面中的衍射盘)的空间分辨率检测来估计的。例如，这种空间分辨率检测可以使用光子计数雪崩二极管阵列，英语简称为SPAD阵列来进行，或者如图所示，通过在探测平面中用带孔光阑扫描衍射盘来进行。在此有利的是，将带孔光阑的中心在中心周围的圆形路径上引导，或者将带孔光阑按顺序地放置在这样的圆形路径上的数量为至少三个(例如，六个)优选均匀分布的位置处。在此，中心就成为正好位于3D激发圆环8的中心的假想点光源的假想成像的中心。圆形轨道在图中作为带孔光阑轨道13由三个在圆周区段上标出的较小的圆和一个箭头来标记。在这里，较小圆的直径不代表带孔光阑的直径。更确切地，带孔光阑可以大到使得带孔光阑在样本中的成像在任何时刻都包括激发焦点的中心。带孔光阑轨道13的直径被有利地选择为尽可能大，其中具体条件一方面可以取决于可获得的荧光信号和荧光背景，但也特别地取决于实际的边界条件。例如，本申请人使用这样的装置，其中3D激发圆环8既被电光扫描仪偏转(借助于该电光扫描仪分别移向扫描模式9的各个点)，又被引导到用于扫描样本的振镜扫描仪上。在此，振镜扫描仪也位于探测光束路径中，但电光扫描仪不位于探测光束路径中。具体地，现在对带孔光阑轨道13的扫描是在同时用3D激发圆环8保持激发的位置的情况下进行的，其方式为借助于振镜扫描仪将放置在探测光束路径中的带孔光阑朝向样本的投影按顺序放置到带孔光阑轨道13的选定位置处，而电光扫描仪向激发光施加反向运动，使得3D激发圆环在样本中保持位置固定。由此得出带孔光阑轨道13的最大范围，该最大范围对应于仅由电光扫描仪驱动的扫描场的大小。由于在这种类型的位置确定中，无论其如何具体实现，3D激发圆环8保持位置固定，因此可激发荧光团4在定位期间始终暴露在相同的激发强度下，因此3D激发圆环8的强度分布的形状不直接影响侧向预定位17的质量，而是至多受到取决于可激发荧光团4相对于3D激发圆环8中心的实际位置的不同信号-背景比的间接影响。
发现1和侧向预定位10也可以在一个步骤中同时进行。例如，可以分别用3D激发圆环8向样本中的一位置移动，并以上述方式探测荧光。根据信号，特别是根据是否探测到荧光或探测到多少荧光，可以知道在3D激发圆环8的焦点区域中是否存在可激发荧光团4。然而，根据在这种情况下获得的测量值，也可以直接获得在焦点区域内的可激发荧光团4的位置。如果没有检测到荧光或仅检测到少量信号，则可以向样本中的另一个(例如，相邻)位置移动，在该位置处重复上述测量。
在本申请人的研究中发现，即使在发现1中或侧向预定位17中或甚至在稍后的定位步骤中，在3D激发圆环的焦点区域内实际存在多个可激发荧光团4，并对信号有贡献，也可以执行迭代的实时MINFLUX定位33。然后，虽然在所涉及的步骤中，没有一个可激发荧光团的位置被以在该步骤中仅可能最佳的精确度确定，而是获得一种平均位置，但在后续步骤中，有一定概率出现两种有利情况中的一种。在一种情况下，多个可激发荧光团4彼此靠得如此之近，以至于它们在整个迭代的实时MINFLUX定位33期间没有被分开，即共同位于扫描模式9的一范围内，在该范围内可以用给定的扫描模式9进行MINFLUX定位。然后，在迭代的实时MINFLUX定位33中，获得可激发荧光团4的平均位置。这种情况尤其出现在做出贡献的荧光团的距离相比于可分解生物结构的大小较小的情况。在其他情况下，多个可激发荧光团4相距较远。然后，在缩小激发模式9时，位于外部的可激发荧光团4处于激发光强度或激发光量非常大的区域中。这就导致这些位于外部的荧光团(如果它们通常是相应的可切换的荧光团)置于暗状态，因此它们随后不再对荧光信号做出贡献，从而最终只对孤立的可激发荧光团4或多个紧密相邻的可激发荧光团4进行定位。
在侧向预定位17之后可以是轴向预定位18。执行轴向预定位18的特别有利的方法在图4和图5中示出，并将结合图4和图5进行阐述。然而，图3中所示的方法的出发点如下：可激发荧光团4的轴向位置在没有轴向预定位18的情况下就以足够的精确度已知，以便在没有轴向预定位18的情况下能够执行MINFLUX定位。例如，如果待研究的样本是薄的，或者在发现1中恰好发现在发现1期间借助于活化光(特别是短波活化光)才被活化的可激发荧光团4，或者活化是借助于侧面入射的薄光片实现的，就会出现这种情况。然后，在侧向预定位17之后可以直接是迭代的实时MINFLUX定位33。与从现有技术中已知的方法不同，在根据本发明的迭代的实时MINFLUX定位33的本实施方式中，MINFLUX定位借助于强度曲线来执行，该强度曲线具有在所有三个位置方向上被强度上升区域包围的局部中心强度最小值(在这里具体是3D激发圆环8)，但侧向MINFLUX定位30、30’、30”与在轴向位置方向7上的轴向MINFLUX定位40、40’、40”是分开执行的，也就是说，按时间序列依次执行。根据本发明，当轴向MINFLUX定位40、40’、40”是下一个步骤时，使用在侧向MINFLUX定位30、30’、30”中获得的信息，以便考虑到在该下一个步骤中待探测的荧光光子所包含的信息的利用，最佳地放置轴向样本位置(即，位置15、15’)。反过来，当侧向MINFLUX定位30、30’、30”是下一个步骤时，使用在轴向MINFLUX定位40、40’、40”中获得的信息，以便考虑到在该下一个步骤中待探测的荧光光子所包含的信息的利用，最佳地放置轴向样本位置31，特别是扫描模式9的中心。
在图3所示的实施方式中，对于第一轴向MINFLUX定位40，将(有利地与在侧向预定位17中使用的3D激发圆环8相同的)3D激发圆环8放置在沿相对于侧向预定位17的焦平面的垂直线的两个位置15、15’处，一个在焦平面的下方，另一个在焦平面的上方。在此，第一位置方向5和第二位置方向6的垂直线的位置对应于在侧向预定位17中确定的可激发荧光团4的侧向位置，该侧向位置通常不完全对应于可激发荧光团4的实际侧向位置。在此，选择轴向距离，使得可以从在两个位置15、15’处测量到的荧光值确定可激发荧光团4的轴向位置。相应的步骤从现有技术中已知，并且在图2中描述为轴向预定位18。为此，选择下部位置15，使得该位置以足够的确定度(例如，以大约90％或更大的概率)位于可激发荧光团4的实际轴向位置的下方，并且相应地，上部位置15’在该轴向位置的上方。适于进行MINFLUX定位的两个位置15、15’彼此间最大距离根据以下得出：可激发荧光团4理想情况下应靠近3D激发圆环8的中心最小值，并且在任何情况下都不应暴露于3D激发圆环8的具有最大强度的区域或与中心最小值的距离比3D激发圆环8的第一局部轴向最大值更远的区域。根据在位置15、15’处测量到的光子数或强度，确定可激发荧光团4的轴向位置。然后进行侧向MINFLUX定位30。为此，将3D激发圆环8在垂直于光轴的平面中放置在六个规则地布置在圆上的侧向样本位置31处，该圆的中心对应于在侧向预定位17中确定的可激发荧光团4的位置。设置侧向样本位置的平面，使得其轴向位置对应于在轴向MINFLUX定位40中确定的可激发荧光团4的位置。由此，确保了3D激发圆环8的侧向强度曲线具有尽可能明显的局部强度最小值，这非常适于侧向MINFLUX定位30。在该步骤中使用的扫描模式恰好在侧向样本位置31的平面之外没有样本位置。在所示的实施方式中，在这个侧向MINFLUX定位30之后又是轴向MINFLUX定位40’，该轴向MINFLUX定位40’根据第一轴向MINFLUX定位40执行；选择在该轴向MINFLUX定位40’时将3D激发圆环8放置在其上的轴向位置15、15’，使得在轴向方向上的这两个位置15、15’之间的中点对应于在先前的轴向MINFLUX定位40中获得的可激发荧光团4的轴向位置，并且其侧向位置对应于在前一次侧向MINFLUX定位30中获得的可激发荧光团4的位置。在所示的实施方式中，随后相应的是进一步的侧向MINFLUX定位30’、进一步的轴向MINFLUX定位40”和最后的侧向MINFLUX定位30”。所有的定位都是根据MINFLUX原理使用合适的估计器实时执行的。如同在现有技术中，在许多情况下，在迭代的实时MINFLUX定位33之后可以并且将是最终定位43，该最终定位43在后续数据分析过程中获得。这在这个图中未示出。
将MINFLUX定位在三个空间方向上划分为轴向MINFLUX定位40、40’、40’和侧向MINFLUX定位30、30’、30’，提供了迭代执行的可能性，例如紧接着执行两个轴向MINFLUX定位的可能性。因此，例如在第一轴向MINFLUX定位40之后执行第二轴向MINFLUX定位40’可能是有利的，其中在这两个轴向MINFLUX定位40、40’之间仅改变相应的位置15、15’之间的距离或这两个位置15、15’之间的中点的轴向位置，而不改变这些位置15、15’的侧向位置。因此这可能是有利的，因为在借助于螺旋相位板产生的3D激发圆环8中，径向强度曲线强烈地取决于径向截面的轴向位置，而轴向强度曲线45较少地取决于径向位置。这意味着，在利用在荧光光子中包含的信息方面，在执行侧向MINFLUX定位30之前，首先以较低的不确定度确定轴向位置可能是有利的。在现有技术的公开物中已经表明，迭代的位置确定通常在每种情况下都是有利的，即使仅在一个位置方向上进行位置确定也是如此。
通常，在根据本发明的迭代的MINFLUX方法33中，每个单次定位都是基于对在可激发荧光团4的先前估计位置周围的样本位置的测量，其中扫描模式恰好不包含在可激发荧光团4的位置处的样本位置。这样做的原因是，一般来说，根据本发明人的发现，在扫描模式的中心不进行测量的实时定位比根据现有技术提到的科学公开物的方法更加成功。根据在此描述的根据本发明的方法，这也更容易提供将MINFLUX定位相应地划分为轴向MINFLUX定位和侧向MINFLUX定位的可能性，因为对于实时执行的整体定位的校准，不需要在中心进行测量。然而，这并不排除在执行根据本发明的方法的情况下，在各别步骤或所有步骤中也在中心位置处进行测量。可以有利地执行这种测量以用于控制目的，特别是关于背景信号的检查，例如估计背景信号的大小，或者根据获知在检测区域中是否有一个或更多个可激发荧光团来有利地执行这种测量。在通常情况下，可激发荧光团4的位置的确定不直接取决于在中心的这个测量值。这并不应意味着，如果可激发荧光团4的位置的确定也直接取决于在中心的测量，那么根据本发明将定位分为轴向MINFLUX定位40、40’、40”和侧向MINFLUX定位30、30’、30”是不可能的。
在图4中，示出了轴向预定位18的流程。对于预定位，使用3D激发圆环8，优选使用与随后用于迭代的实时MINFLUX定位33相同的3D激发圆环8。3D激发圆环8具有有效轴向强度曲线45，该有效轴向强度曲线45具有中心局部最小值46。如果只有激发曲线轴向移位，但探测孔径保持位置固定，则有效轴向强度曲线45对应于样本中的实际强度曲线。如果探测孔径与激发曲线一起轴向移位，则有效轴向强度曲线45是探测点扩散函数和实际轴向强度曲线的乘积。在实践中，还需要考虑出现的像差。
典型的3D激发圆环8在焦平面中在径向方向上具有最大值，最大值的距离与2D激发圆环的相应距离相比较大，例如，在642nm的激发波长下该距离可以是520nm。根据3D激发圆环8的宽度，轴向平行的强度曲线45在距轴线的径向距离的范围是非常相似的。对于在图6中作为等高线图示出并在稍后针对有效强度分布44进一步阐述的示例，这适用的是±100nm以上的距离。在这个范围内，随着距轴线的距离的增加，局部最小值也只是缓慢地增加。图4中所示的方法可用于以下情况：在发现1之后并且必要时在侧向预定位之后，已知侧向位置，其不确定度与上述径向距离范围相匹配，并且已知可激发荧光团4的轴向位置，其不确定度最多略大于有效强度曲线45的最大值的一半距离。
可激发荧光团的估计位置16是轴向样本位置50。于是，在所示的实施方式中，将3D激发圆环8按顺序放置在沿光轴的四个轴向样本位置(轴向样本位置48、轴向样本位置49、轴向样本位置51和轴向样本位置52)处。轴向样本位置48、49、51、52的集合在此形成轴向扫描模式59。在此省略了对应于可激发荧光团的估计位置16的中心轴向样本位置50。在此，轴向样本位置49和51与可激发荧光团4的估计位置16有一距离，该距离对应于有效强度曲线45的中心局部最小值46与最大值的距离，例如为360nm，其中该距离此外还取决于所用激发光的波长和样本的折射率。轴向样本位置48和52与可激发荧光团4的估计位置16分别有两倍的距离。根据以这种方式获得的荧光测量值的集合，可以可靠地估计可激发荧光团4的轴向位置。例如，如果在测量值上形成一个矢量和，则将估计值分配给可激发荧光团4的每个实际位置，其中每个估计值分别仅分配给刚好一个位置。这是通过选择轴向样本位置彼此间的距离来保证的。距离也可以选择得较小，但优选地不能选择得较大。就这方面而言，具体指定的距离是一个特别好的选择，因为在这些距离中，捕获范围(即，荧光团必须处于其中的范围，以便可以用该方法定位该荧光团)相对于扫描点的数量是非常大的。由于分配的唯一性，可以通过校准(例如，借助于模拟计算)通过校正函数修改矢量和，使得获得的估计器无偏差地估计可激发荧光团4的实际位置。在没有背景荧光的情况下，两个相距较远的轴向样本位置原则上足以对存在的单个可激发荧光团进行轴向定位。然而在实践中，有必要在定位过程期间相对于背景相对强烈地激发待定位的荧光团。这是借助于所选的四个扫描位置来实现的。例如，用放置在轴向样本位置49和51处的3D激发圆环8的强度最大值检测实际上具有估计位置16的荧光团。然后，随着与该位置的距离的增加，可激发荧光团4从两个进一步间隔开的3D激发圆环8中的一个所经历的激发强度增加。
在图5中，示出了另一轴向预定位18的流程。在该轴向预定位18中，不必满足在上述方法中提出的对预知可激发荧光团4的轴向位置的要求。因此，该方法例如特别适于定位已借助于具有较低景深的宽视场定位方法进行侧向预定位的可激发荧光团4。
同样，在该方法中，轴向样本位置彼此间具有距离，该距离对应于中心局部最小值46与有效强度曲线45的最大值的距离。在此，所选距离也是特别合适的距离，但原则上也可以选择较小的距离。在该方法中不排除可以对应于可激发荧光团4的估计位置的中心轴向样本位置50。轴向样本位置的数量至少为六个，具体示出了七个，但可以选择更大的数量。这里的限制是通过使激发焦点相对于样本在轴向方向上移位的设备方面的可能性以及出现的光学像差来设定的。通过奇数个轴向样本位置47-53和在可激发荧光团4的估计位置16处的一个中心轴向样本位置50位置，实现了捕获范围(在其内可以进行轴向定位)相对于可激发荧光团4的估计位置16是对称的。如果在可激发荧光团4的实际位置的两个方向上都有两个轴向样本位置，则在任何情况下都可以用该方法明确地确定可激发荧光团4的轴向位置；对由所有轴向样本位置47至53的集合形成的轴向扫描模式59’的计算结果如图13所示，表明捕获范围甚至更大。因此，在具体示出的示例中，如果可激发荧光团实际上位于轴向样本位置48和52之间的区域内，就可以在每种情况下始终可靠地定位该可激发荧光团。在所示的情况下，可激发荧光团4直接位于轴向样本位置51和52之间。轴向定位可以再次借助于校准的矢量和进行。
在一个简单的实现方式中，可以分两步进行，其方式为：首先粗略地确定轴向位置，然后根据四个轴向样本位置的测量值进行矢量求和来执行更精确的位置确定，选择这些轴向样本位置，使得用于这种评估的排列对应于图4所示的排列。然后不评估与可激发荧光团4的粗略估计位置相邻的轴向样本位置的测量值，而是随后评估在每个轴向方向上剩余的最近的两个相邻位置；因此在所示情况下，将评估轴向样本位置49、50、52和53。如果粗略估计在可激发荧光团4是否略微高于或低于轴向样本位置(例如，轴向样本位置51)方面不明确，则这是无害的。随后，在更精确的轴向定位中，就不考虑这个样本位置了，在所述示例(未示出)中是轴向样本位置51。在更精确的定位中，通常可以不考虑与可激发荧光团的粗略确定位置最接近的样本位置。
3D激发圆环8向轴向样本位置47-53的移位一方面可以在结合图4和结合图5阐述的实施方式中以这样的方式实现，在每种情况下，带孔光阑或一般的结构在检测平面中的投影与3D激发圆环8一起移位到样本中，或者另一方面以这样的方式实现，带孔光阑或结构在探测平面中的投影在可激发荧光团4的估计位置16的平面中保持固定。也可以设想这样的解决方案，其中带孔光阑或结构在探测平面中的投影与3D激发圆环8的移位程度不同。如果只有3D激发圆环8移位，则样本中实际的激发光强度曲线对于确定轴向样本位置的距离(即，对于确定轴向样本位置)具有决定性作用。如果带孔光阑或探测结构(例如，对衍射图像进行局部解析的探测器的探测器元件)在探测平面的投影与3D激发圆环8一起移位，则有效强度曲线45具有决定性作用，该有效强度曲线45是由实际的激发光强度曲线与探测的点扩散函数的乘积得出的。
特别地，如果轴向扫描位置47-53的距离比所示示例中的距离小并因此相对于捕获范围选择更多的扫描点，则不需要有一个与可激发荧光团的估计位置16重合的中心轴向扫描位置50。
在许多情况下，通过使用一个或多个最小扫描模式9重复一个MINFLUX定位步骤或多个MINFLUX定位步骤，可以多次执行可激发荧光团4的位置的高精确度定位，即高精确度确定。这意味着，该方法可以迭代地执行，其中特别是在小的扫描模式9下省略了从一个步骤到下一个步骤(在该下一个步骤中定位是在同一取向，即侧向或轴向上执行的)的进一步缩小。在许多情况下，在随后执行的步骤中仍实现了位置确定的较低的不确定度。
在图6中，示出了计算出的3D激发圆环8的有效强度分布44的剖面的等高线图。计算的前提条件是：3D激发圆环8的中心最小值与探测孔径一起在轴向和侧向上移位，使得探测孔径和中心最小值始终彼此共焦排列。此外，假定激发波长为642nm且探测孔径(即，共焦带孔光阑)的直径是确定的(这里不进一步指明)。对于所选参数，3D激发圆环8的侧向最大值的实际距离约为520nm，而在所示的有效强度分布44中，该距离约为400nm。这些侧向最大值不能从所示的等高线图中得出，原因仅仅是在轴向剖面中不存在相关最大值的闭合等高线。在等高线图中可以看到，同一有效强度的中心附近的线的形状近似于带圆角的矩形。上方和下方是具有相同有效强度的卵形线的区域。基于等高线图可以进一步看出，轴向强度曲线具有两个明显的最大值。可以看出，相对于轴线径向移位的平行线的强度曲线具有明显的最小值并且在每种情况下都具有两个高原状(plateauartig)的最大值区域，其中轴线方向上的高原中心与轴线上的最大值几乎在同一位置。这适用于大约±100nm的范围。对于更实际相关的情况，即当用于轴向预定位18的3D激发圆环8轴向移位时，探测孔径在侧向(即，在径向方向上)是位置固定的，轴向的有效强度曲线45具有上述特征的该区域实际上更宽。如果使用非常大的探测孔径，即不使用共焦探测，情况也是如此。只要已知可激发荧光团4的侧向位置，其不确定度对应于区域宽度，就可以借助于3D激发圆环8对该可激发荧光团进行轴向预定位。
在图7至图10中，示出了使用3D激发圆环8进行轴向预定位18的各种模拟计算的结果。在这里，光子数或荧光强度的矢量和的轴向坐标pj的计算结果分别绘制在可激发荧光团的假定轴向位置上，光子数或荧光强度是分别在假定的测量条件下不同的扫描位置的预期测量值。矢量和可以写为/>
在此，对于执行计算的所有轴向坐标，在对应于从0nm到100nm的与光轴的径向距离的范围内分别对多个径向坐标执行计算。因此，对于横坐标的每个值，确定纵坐标的多个值，其中计算得出的值也可能非常接近。出于对称性的原因，这些值对于横坐标值0原则上彼此完全重合。轴线的刻度为10-7m，即102nm，因此值1对应于100nm。
图7的图示现在基于具有两个扫描点的假定的轴向扫描模式，在这两个扫描点处放置3D激发圆环8的中心局部最小值，每个扫描点位于中心的上方和下方256nm的距离处。该距离大致相当于基于模拟的3D激发圆环8的轴向强度曲线的最大值的距离的四分之一。进一步假设有效强度分布44与样本中实际强度分布一致的观测条件。在这些条件下，不能区分距离中心比约260nm更近或比260nm更远的荧光团位置。因此，只有在预先已知可激发荧光团的轴向位置优于约±260nm的情况下，才有可能基于简单矢量和在假定的轴向扫描模式和假定的初始条件的基础上进行轴向定位或轴向预定位18。可以进行明确定位的这个范围随后被称为捕获范围或轴向扫描模式的捕获范围。
图8的图示现在基于具有三个扫描点的假定的轴向扫描模式。除了图7的轴向扫描模式的扫描点外，这里所基于的轴向扫描模式还包含在中心的一个扫描点。从图中可以看出，对于基于简单矢量和的评估，这种轴向扫描模式的捕获范围小于只具有两个扫描点的轴向扫描模式的捕获范围。
图9的图示现在基于具有两个扫描点的假定的轴向扫描模式，该轴向扫描模式对应于图7的轴向扫描模式。在观测条件方面对模拟进行了修改，假定借助于与3D激发圆环8一同轴向移位的共焦带孔光阑进行观测。在此，有效轴向强度曲线45是起作用的，其最大距离与图7的模拟所基于的强度曲线的最大距离相比减小了。因此，现在针对图9假定各个扫描点距中心的距离为180nm。数据曲线的走向对应于图7的数据曲线的缩小的走向，并补充了在图7中未包括的部分。根据有效轴向强度曲线45的变化，与图7所基于的强度曲线相比，捕获范围减小到约±180nm。
图10的图示现在也基于具有如关于图9的两个扫描点和观测条件的假定的轴向扫描模式，但这两个扫描点与中心的距离增加到两倍，即增加到360nm。因此，这两个扫描点彼此间的距离对应于3D激发圆环8的有效轴向强度曲线45的最大值的距离。从图示中可以看出，这种轴向扫描模式不适合基于矢量和定位荧光团，因为特别是对于靠近轴向扫描模式中心的荧光团，从矢量和获得的值与荧光团的实际位置的关系不大。
在图11至图13中，示出了使用3D激发圆环8的捕获范围扩大的轴向预定位18的各种模拟计算的结果。所有三个图示都涉及如关于图9假定的观测条件，即使用轴向共同移动的共焦带孔光阑或等效探测方案。根据图10表明，与现有技术中已知的捕获范围(大约相当于根据图9的捕获范围)相比，轴向捕获范围的相关扩大并不能简单地通过将扫描点(其测量值按比率进行评估)彼此间的距离拉大来实现。本发明人现在发现，借助用3D激发圆环8在轴向方向上扫描样本，可以在扩大的轴向捕获范围61内以令人惊讶的简单方式实现精确的轴向预定位18。为此，选择具有轴向样本位置的扫描，这些轴向样本位置彼此间的距离不大于有效强度曲线45的最大值的一半距离，其中在中心样本位置处不必有扫描点，因此两个中心轴向扫描位置的距离可以对应于有效轴向强度曲线45的最大值的距离。上文已经基于图4和图5已阐述了对扫描时获得的数据进行评估的具体示例。
关于图11假定的轴向扫描模式对应于关于图10假定的轴向扫描模式，分别在上方和下方360nm的距离(即，3D激发圆环8的有效轴向强度曲线45的最大值的一半距离)处分别补充了一个另外的扫描点；因此，轴向扫描模式具有四个扫描点，其中两个扫描点位于轴向扫描模式中心的上方和下方360nm的距离处，另外两个扫描点位于轴向扫描模式中心的上方和下方720nm的距离处。因此，基于模拟的这个扫描模式对应于图4所示的轴向扫描模式59。用于基于矢量和进行评估的这个轴向扫描模式59的轴向捕获范围61约为±400nm，这意味着，即使荧光团位于内部扫描模式点之间的区域之外高达约10％的扫描点距离，荧光团仍然可以被明确地定位。属于各个横坐标值的点云特别地在捕获范围的边缘处包括一个略微更宽的值范围，这表明对于给定的荧光团轴向位置，从矢量和获得的轴向值取决于荧光团的侧向位置。由矢量和获得的轴向位置与所基于的轴向位置的基本偏差可以通过校准曲线来补偿，因此在校准后，从矢量和获得的值反映了荧光团的实际位置，而没有系统性误差。对侧向位置的依赖导致轴向定位的不确定度。相比之下，曲线的斜率大(即，矢量和高估了与轴向扫描模式59中心的轴向距离)是有利的，因为这意味着矢量和对荧光团位置的变化反应灵敏。
关于图12是基于轴向扫描模式，该轴向扫描模式在图11的基础上通过在中心增加一个扫描点而得出。这种轴向扫描模式的捕获范围甚至扩展到超过±500nm，但对荧光团从约±400nm到边缘的位置的灵敏度较低。这种轴向扫描模式所具有的优点是，在所研究的±100nm的径向范围内，从矢量和获得的轴向位置在数据表示中没有显示出对荧光团径向位置的可见依赖关系。
关于图13是基于轴向扫描模式，该轴向扫描模式在图12的基础上通过在边缘处各增加一个另外的扫描点而得出。因此，这样获得的轴向扫描模式对应于图5所示的轴向扫描模式59’。模拟表明，这种轴向扫描模式的捕获范围包括执行模拟计算所针对的整个范围，即大于±500nm。基于结合图5陈述的基本考虑，可以认为捕获范围实际上至少约为±720nm。基于在图12中示出的模拟结果，可以进一步假定捕获范围实际上更大。
总体而言，图11至图13中所示的结果表明，3D激发圆环8令人惊讶地良好地适于对荧光团进行轴向定位，荧光团的侧向位置已知，其不确定度至少高达±100nm。
图7至图10和图11至图13的图示所基于的模拟计算未明确地将光子噪声和背景信号的影响包括在内。然而，本申请人从其他研究中了解到，矢量和在每种情况下都取决于背景信号。他通过观察矢量和 即可轻易看出这一点。在整个轴向扫描模式上，背景信号可以被认为是恒定的，至少是近似恒定的，该背景信号虽然不会导致上述方程的分子中矢量发生变化，但会导致分母发生变化，即变大。因此，背景信号越大，计算得出的矢量的长度就越小。出于这个原因，本申请人开发了一种方法，该方法能够在执行MINFLUX测量期间对背景信号进行校正。该方法是在本申请提交之日尚未公布的欧洲专利申请号为21190113.7的主题。该欧洲专利申请的全部内容在此通过引用并入本申请。根据在所提到的专利申请中描述的方法，在测量期间以平滑的方式确定平均背景信号。这个背景信号现在通过在分母中减去来考虑。这样就获得了校正后的矢量和，其值不再系统性地取决于背景信号。然后，如上文已经陈述的，可以通过应用校准函数来实现对定位的校准。例如，这可以通过多项式或查找表来描述。
光子噪声的影响直接取决于测量到的光子数。在这方面，本申请人执行了进一步的模拟，这些模拟表明，例如借助于图12所基于的具有五个扫描点和轴向共同移动的共焦带孔光阑的扫描模式，根据荧光团在所考虑体积内的位置，即可实现不确定度介于20nm与35nm之间的轴向定位，其中针对在第一方向和与第一方向正交的第二方向上的每±100nm的侧向范围内的荧光团，在大约±500nm的轴向捕获范围内仅探测到400个光子。这当然足以随后执行例如迭代的三维实时MINFLUX定位。
此外，本申请人从实验中了解到，特别是对于如图12所基于的具有五个点的轴向扫描模式，实际扫描模式距离与基于模拟的距离的偏差是可以容许的。因此，在真实样本中会出现像差，这些像差会导致有效轴向强度曲线45失真。这些失真取决于所考虑的轴向位置。尽管如此，使用上述用于轴向预定位18的方法，特别是结合像差校正，本申请人成功地对荧光团进行了足够精确的轴向预定位，以便随后执行迭代的三维实时MINFLUX定位33。
图14示出了用于使用3D激发圆环8进行轴向预定位18的另一扫描方法。基于图4和图5所阐述的方法是基于具有尽可能大的距离的离散扫描模式，以便用几个扫描点就实现尽可能大的轴向捕获范围61，而本方法则是基于更精细的网格化或连续的扫描运动。利用3D激发圆环8，扫描轴向扫描范围60，其中有效轴向强度曲线45的中心局部最小值46扫过整个轴向扫描范围。在这里，中心局部最小值46的位移64可以以离散的步长进行或连续地进行。根据本发明的一个方面，轴向扫描范围60大于轴向有效强度曲线45的最大值的距离。在图4所示的方法中，轴向扫描范围60(为了清晰起见未详细注明)是轴向强度曲线45的最大值的距离的两倍，在图5和图14所示的方法中，是轴向强度曲线45的最大值的距离的三倍。从轴向扫描范围60得出轴向捕获范围61。现在，在每种情况下，如果可激发荧光团4位于预定位体积63(其在此是由侧向预定位范围62和轴向捕获范围61得出的长方体或圆柱体)内，则可以对可激发荧光团4进行轴向预定位。侧向预定位范围62取决于有效强度分布44，其示例如图6所示。如上所述，侧向预定位范围可以包括边长为100nm两倍的正方形或半径大于100nm的圆形区域。如果扫描运动是连续的，则在扫描运动的一部分期间探测到的光子可以累积地记录并将分配到扫过的范围。轴向位置的确定现在也可以通过评估求矢量和并应用校准函数来特别简单地实现。原则上，还可以通过将有效轴向强度曲线45与测量到的强度的走向相适配，来确定可激发荧光团的轴向位置。然而在这种情况下，一方面存在有效轴向强度曲线的形状取决于与3D激发圆环8的整个有效强度分布44的中心局部最小值的径向距离的问题，另一方面，这种位置确定原则上计算较多，因此更耗时。
用于轴向预定位18的方法也可以有利地与随后的二维MINFLUX定位结合应用。在此已经证明，使用3D激发圆环8可以达到与使用2D激发圆环相当的好结果。这一点是重要的，因为这样可以弃用复杂的装置，该装置能够在不同的激发强度分布之间快速切换。此外，只要荧光团的轴向位置是足够好已知，3D激发圆环就通常比2D激发圆环具有更大的侧向捕获范围来进行MINFLUX定位。
在图15中，示意性地示出了根据本发明的显微镜70的实施方式。显微镜70具有激发光单元76，该激发光单元76包含光源和光束整形元件，使得激发光在样本75中形成3D激发圆环8。光束整形元件可以是可调节的，因此能够在样本75中形成具有中心最大值的激发焦点。此外，激发光单元76可以具有偏转单元，该偏转单元被配置成使3D激发圆环8或更一般而言是激发焦点在样本中特别是在侧向上快速地移位，即例如以便按顺序向侧向样本位置31、31’、31”移动。显微镜70还具有元件，借助该元件，激发光耦入到用于激发和检测的公共光束路径中，并且将从样本75发射的荧光朝向探测单元72的方向引导。示例性地，在图中，该元件构造成二向色元件78。此外，显微镜70具有可变形的反射镜73。在这里，可变形的反射镜放置在扫描单元77与物镜74之间。对可变形的反射镜的放置和配置是使得通过可变形的反射镜73的变形可以使激发焦点，特别是3D激发圆环在样本75中沿轴向方向移位。扫描单元77可以包括例如振镜扫描仪；扫描单元被设计成使激发焦点在样本75中沿侧向方向移位。探测单元72可以在一个平面中(激发焦点借助于物镜74和其他光学元件(未在附图中示出)成像到该平面中)包含带孔光阑或例如光子计数雪崩二极管阵列。扫描单元77和可变形的反射镜73都被放置成使得它们作用于激发光和待探测的荧光。因此，在图像平面中，借助于扫描单元77可以使在样本75中与固定位置共焦的点在图像平面中移位，例如在中心周围的圆形轨道上移位。如果激发光单元76具有偏转单元，则在该偏转单元和扫描单元77的共同作用下，激发焦点可以在样本75中保持位置固定，而借助于扫描单元77，激发焦点位置的图像在图像平面中可以相对于例如带孔光阑移位。此外，显微镜70具有控制单元71，该控制单元71被配置成控制显微镜70执行根据本发明的方法。控制单元71可以经由控制线路(未示出)与待驱动的元件连接，或者也可以无线连接，例如通过无线电连接。
参考标记列表
1发现荧光团
2高斯活化强度分布
3高斯激发强度分布
4可激发荧光团
5第一位置方向
6第二位置方向
7轴向位置方向
8 3D激发圆环
9扫描模式
10预定位
11、11’侧向位置
12、12’侧向位置
13带孔光阑轨道
15、15’轴向位置
16估计位置
17侧向预定位
18轴向预定位
19直径
20、20’3D定位
21、21’第一位置
22、22’第二位置
23、23’第三位置
24、24’第四位置
25、25’中心位置
26、26’第六位置
27、27’第七位置
28、28’扫描模式轴线
29、29’扫描模式平面
30、30’、30”侧向MINFLUX定位
31、31’、31”侧向样本位置
32 2D激发圆环
33迭代的实时MINFLUX定位
34圆
40、40’、40”轴向MINFLUX定位
43最终定位
44有效强度分布
45轴向强度曲线
46中心局部最小值
47轴向样本位置
48轴向样本位置
49轴向样本位置
50轴向样本位置
51轴向样本位置
52轴向样本位置
53轴向样本位置
59、59’轴向扫描模式
60轴向扫描范围
61轴向捕获范围
62侧向预定位范围
63预定位体积
64移位
70显微镜
71控制装置
72探测单元
73可变形的反射镜
74物镜
75样本
76激发光单元
77扫描单元
78二向色元件。

Claims (26)

1.一种通过用具有中心局部最小值(46)的3D激发圆环(8)扫描可激发荧光团(4)以高分辨率地确定所述可激发荧光团(4)在样本中三个空间方向上的位置的方法，
其中，在轴向定位步骤中，将所述中心局部最小值(46)按顺序放置在穿过所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)延伸的扫描模式轴线(28)上的两个轴向样本位置(15、15’)处，其中，样本位置对(15、15’)包围所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)，
其中，在所述轴向定位步骤中，针对所述轴向样本位置(15、15’)中的每个轴向样本位置测量由所述可激发荧光团(4)发射的荧光，并将测量值分配给相应的轴向样本位置(15、15’)，
其中，在所述轴向定位步骤中，根据分配给所述轴向样品位置(15、15’)的所述测量值来确定所述可激发荧光团(4)的轴向位置的新估计，
其特征在于，
在侧向定位步骤中，仅在垂直于所述扫描模式轴线(28)定向的扫描模式平面(29)中，将所述中心局部最小值(46)按顺序放置于在一个或更多个先前执行的步骤中估计的所述可激发荧光团(4)的位置(16)周围布置的至少三个侧向样本位置(31)处，
其中，在所述侧向定位步骤中，针对所述侧向样本位置(31)中的每个侧向样本位置测量由所述可激发荧光团(4)发射的荧光，并将测量值分配给相应的侧向样本位置(31)，
其中，在所述侧向定位步骤中，根据分配给所述侧向样本位置(31)的测量值来确定所述可激发荧光团(4)的侧向位置的新估计。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于获得所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)的步骤包括用于估计所述可激发荧光团(4)的侧向位置的侧向预定位(17)的步骤，所述侧向预定位在所述轴向定位步骤和所述侧向定位步骤之前执行，在所述侧向预定位中，用3D激发圆环激发所述可激发荧光团(4)发出荧光，并且其中，检测激发出的荧光。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据在包含与激发焦点共焦的点的图像平面中对荧光的空间分辨率检测来估计所述可激发荧光团(4)的侧向位置。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用光子计数雪崩二极管阵列或通过使与所述激发焦点共焦的点在所述图像平面中相对于带孔光阑移位、优选地在中心周围的圆形轨道上移位，来实现在所述图像平面中对荧光发射的空间分辨率检测，其中穿过所述带孔光阑的荧光用探测器进行检测并被分配给所述共焦的点的相应位置。
5.一种通过用聚焦的激发光扫描可激发荧光团(4)来对所述可激发荧光团(4)进行轴向定位的方法，其特征在于，轴向扫描范围(60)大于500nm或大于1000nm。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚焦的激发光是3D激发圆环(8)，所述3D激发圆环具有有效轴向强度曲线(45)，所述有效轴向强度曲线具有中心局部最小值(46)和与所述中心局部最小值(46)相邻的最大值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，轴向扫描范围(60)大于所述有效轴向强度曲线(45)的最大值的距离。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述轴向扫描范围(60)至少是所述有效轴向强度曲线(45)的最大值的距离的两倍，并且轴向捕获范围(61)至少与所述有效轴向强度曲线(45)的最大值的距离一样大。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其特征在于，相邻的扫描点的距离最多为所述轴向有效强度曲线(45)的最大值的一半，其中，与所述轴向范围的中心位置相邻的扫描点彼此间的距离能够较大，该较大的距离最多相当于所述轴向有效强度曲线的最大值的距离。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚焦的激发光具有有效轴向强度分布(45)，所述有效轴向强度分布具有中心最大值。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，相邻的扫描点的距离最多为所述轴向有效强度曲线(45)的半值宽度的一半。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，用于获得所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)的步骤包括确定所述估计位置的轴向坐标的轴向预定位(18)的步骤，所述轴向预定位(18)在所述轴向定位步骤和所述侧向定位步骤之前根据权利要求5至11中任一项所述的对可激发荧光团(4)进行轴向定位的方法执行。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，在所述轴向预定位(18)的步骤之后且在首次执行所述轴向定位步骤之前，首次执行所述侧向定位步骤。
14.根据权利要求1至4和12中任一项所述的方法，其特征在于，在首次执行所述侧向定位步骤之前，首次执行所述轴向定位步骤。
15.根据权利要求1至4和12至14中任一项所述的方法，其特征在于，执行多个轴向定位步骤和/或多个侧向定位步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在侧向定位步骤之后，如果在所述侧向定位步骤中以给定精度确定了所述可激发荧光团(4)的侧向位置的新估计，则随后执行轴向定位步骤。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其特征在于，连续执行多个侧向定位步骤，其中，从所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)和在侧向定位步骤中获得的所述可激发荧光团(4)的侧向位置的新估计来确定所述可激发荧光团(4)的新估计位置，所述新估计位置为相应的后续侧向定位步骤构成所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，执行轴向定位步骤和侧向定位步骤的交替序列，其中分别从所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)和在一个步骤中获得的所述可激发荧光团(4)的轴向位置或侧向位置的新估计来确定所述可激发荧光团(4)的新估计位置(16)，所述新估计位置为相应的后续步骤构成所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其特征在于，在较晚的轴向定位步骤中，所述样本位置对(15、15’)比在较早的轴向定位步骤中更紧密地包围所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)，以及/或者，在较晚的侧向定位步骤中，将所述中心局部最小值(46)放置在比在较早的侧向定位步骤更紧密地布置在所述可激发荧光团(4)的估计位置(16)周围的侧向样本位置处。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，将所述3D激发圆环(8)定位在轴向位置处，以便按顺序放置到两个轴向样本位置(15、15’)处以及/或者调整所述扫描模式平面(29)以及/或者在所述轴向定位和/或所述轴向预定位(18)中进行扫描，以及/或者，通过经由可变形的反射镜将激发光引导穿过物镜到达所述样本中，定位所述聚焦的激发光，以便在所述轴向定位中进行扫描，其中通过改变所述可变形的反射镜的形状来实现所述轴向定位。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，通过评估矢量和获得所述可激发荧光团(4)的轴向位置的新估计和/或所述可激发荧光团(4)的侧向位置的新估计，以及/或者，在所述轴向预定位(18)中确定所述估计位置的轴向坐标，以及/或者，通过评估矢量和实现所述轴向定位。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述矢量和的公式为其中pj表示在所述3D激发圆环(8)或所述聚焦的激发光的位置/>处探测到的光子数或强度，进一步地特征在于，根据预定的校准函数来校正所述矢量和的值，以获得所述轴向位置的新估计或所述侧向位置的新估计，或者在所述轴向预定位(18)的情况下获得所述估计位置的轴向坐标或所述轴向定位。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其特征在于，在评估所述矢量和时考虑背景信号的量，其中从测量数据中以平滑的方式确定所述背景信号的量。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法实时执行。
25.一种显微镜，其特征在于，所述显微镜具有控制装置，所述控制装置被配置成控制所述显微镜执行根据权利要求1至24中任一项所述的方法。
26.根据权利要求25所述的显微镜，其特征在于，所述显微镜具有可变形的反射镜，所述可变形的反射镜用于使激发焦点在样本中轴向移位。
CN202280010063.8A 2021-01-13 2022-01-13 在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备 Pending CN116745678A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102021100564.7 2021-01-13
DE102021100564.7A DE102021100564B4 (de) 2021-01-13 2021-01-13 Verfahren und Vorrichtung zur hochaufgelösten Ortsbestimmung eines einzelnen Farbstoffmoleküls in mehreren Raumrichtungen
PCT/EP2022/050626 WO2022152785A1 (de) 2021-01-13 2022-01-13 Verfahren und vorrichtung zur hochaufgelösten ortsbestimmung eines einzelnen farbstoffmoleküls in mehreren raumrichtungen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116745678A true CN116745678A (zh) 2023-09-12

Family

ID=80001495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280010063.8A Pending CN116745678A (zh) 2021-01-13 2022-01-13 在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230350179A1 (zh)
EP (1) EP4278226A1 (zh)
CN (1) CN116745678A (zh)
DE (1) DE102021100564B4 (zh)
WO (1) WO2022152785A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102022109027B4 (de) 2022-04-13 2023-12-21 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum Kartieren der Oberfläche eines Makromoleküls
DE102022119327B4 (de) 2022-08-02 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, vorrichtung und computerprogramm zur lokalisierung vereinzelter emitter in einer probe
DE102022119589B3 (de) * 2022-08-04 2023-11-23 Abberior Instruments Gmbh Verfahren, Lichtmikroskop und Computerprogramm zur Lokalisierung einzelner Emitter in einer Probe
DE102022120952B4 (de) * 2022-08-18 2024-03-14 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum simultanen verfolgen zweier emitter

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120104279A1 (en) * 2009-05-20 2012-05-03 Deutsches Krebsforschungszentrum Fluorescence Light Scanning Microscope Having a Birefringent Chromatic Beam Shaping Device
DE102015002205A1 (de) * 2015-02-24 2016-08-25 PicoQuant Innovations GmbH Mikroskopische Vorrichtung mit Verfahren zur verbesertem Analyse von Photonendaten
CN107636447A (zh) * 2015-03-31 2018-01-26 哥廷根激光实验室 用于多维高分辨率地成像样品中的结构或颗粒的路径的方法和扫描荧光显微镜
WO2020128106A1 (de) * 2018-12-21 2020-06-25 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum punktförmigen beleuchten einer probe in einem mikroskop
US20200393378A1 (en) * 2017-03-07 2020-12-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung dert Wissenschaften e.V. Method of and Apparatus for Spatially Measuring Nano-Scale Structures

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102011055367B4 (de) 2011-11-15 2017-02-09 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zum Verfolgen einer Bewegung eines Partikels, insbesondere eines einzelnen Moleküls, in einer Probe
US9291562B2 (en) 2011-11-15 2016-03-22 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. Method and apparatus for tracking a particle, particularly a single molecule, in a sample
DE102013114860B3 (de) 2013-12-23 2015-05-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Orte einzelner Moleküle einer Substanz in einer Probe
JP7180964B2 (ja) 2014-01-17 2022-11-30 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 三次元イメージング装置および方法
DE102016104651A1 (de) 2015-03-24 2016-09-29 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und Rasterfluoreszenzlichtmikroskop zum dreidimensional hochauflösenden Abbilden einer mit Fluorophoren markierten Struktur einer Probe
WO2018069283A1 (de) 2016-10-10 2018-04-19 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zum räumlich hochauflösenden bestimmen des orts eines vereinzelten, mit anregungslicht zur emission von lumineszenzlicht anregbaren moleküls in einer probe

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120104279A1 (en) * 2009-05-20 2012-05-03 Deutsches Krebsforschungszentrum Fluorescence Light Scanning Microscope Having a Birefringent Chromatic Beam Shaping Device
DE102015002205A1 (de) * 2015-02-24 2016-08-25 PicoQuant Innovations GmbH Mikroskopische Vorrichtung mit Verfahren zur verbesertem Analyse von Photonendaten
CN107636447A (zh) * 2015-03-31 2018-01-26 哥廷根激光实验室 用于多维高分辨率地成像样品中的结构或颗粒的路径的方法和扫描荧光显微镜
US20200393378A1 (en) * 2017-03-07 2020-12-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Foerderung dert Wissenschaften e.V. Method of and Apparatus for Spatially Measuring Nano-Scale Structures
WO2020128106A1 (de) * 2018-12-21 2020-06-25 Abberior Instruments Gmbh Verfahren und vorrichtung zum punktförmigen beleuchten einer probe in einem mikroskop

Also Published As

Publication number Publication date
EP4278226A1 (de) 2023-11-22
WO2022152785A1 (de) 2022-07-21
US20230350179A1 (en) 2023-11-02
DE102021100564A1 (de) 2022-08-04
DE102021100564B4 (de) 2023-12-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN116745678A (zh) 在多个空间方向高分辨率定位单个染料分子的方法和设备
JP5718329B2 (ja) 適応光学系を有する顕微鏡検査法
JP6411472B2 (ja) レーザスキャニング顕微鏡、および特に高解像度のスキャニング顕微鏡法で結像収差を修正する方法
CN107238919B (zh) 用于图像扫描的方法和装置
CN108982452B (zh) 基于双螺旋点扩散函数的多焦点扫描三维成像方法及系统
US9389405B2 (en) Autofocus method for microscope and microscope with autofocus device
JP2009543101A (ja) 対象物の薄層の画像を生成するための方法および装置
EP4075180A1 (en) Method, device and computer program for determining a position of at least one emitter in a sample
US20240085680A1 (en) Method and light microscope for a high-resolution examination of a sample
US20200240774A1 (en) Method of measuring 3d profile
US11276551B2 (en) Inspection device
US20230251479A1 (en) Method, apparatus and computer program for localizing an emitter in a sample
KR20170058179A (ko) 광학 현미경 장치
CN111399204B (zh) 一种基于后瞳面成像的环状扫描成像系统校正方法
CN115398307A (zh) 用于显微镜的参考样品、方法及用途
JP2023503742A (ja) 画像から値を推定する装置及び方法
EP4067878A1 (en) Method, apparatus and computer program for localizing an emitter in a sample
US20230288689A1 (en) Method, device, microscope and computer program for estimating a position of an emitter in a sample
US20230204514A1 (en) Method and device for determining positions of molecules in a sample
EP4095583A1 (en) Method, device, microscope and computer program for estimating a position of an emitter in a sample
US20240183782A1 (en) Method, device and computer program for determining a position of at least one emitter in a sample
CN117369106B (zh) 一种多点共聚焦图像扫描显微镜及成像方法
US20230008453A1 (en) Laser scanning microscope and method for determining a position of a fluorophore
WO2000067060A1 (en) Methods and apparatus for improved depth resolution using out-of-focus information in microscopy
KR100447456B1 (ko) 에지산란광을 이용한 위치검출장치의 반도체기판 및 노광마스크

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination