CN115398307A - 用于显微镜的参考样品、方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于校准和/或调整显微镜(9)的参考样品(1)并且涉及参考样品(1)的用途。后者具有由载体材料(3)制成的至少一个载体结构(2)，该载体材料(3)至少在其延伸范围内可被激发以发射冷光，以及至少一个二维和/或三维结构(5、6、7、8、14)，由多个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)构成。根据本发明，载体材料(3)是金刚石或碳化硅并且掺杂在二维和/或三维结构(5、6、7、8、14)的区域中或周围，以便可激发以发射冷光。

Description

用于显微镜的参考样品、方法及用途

本发明涉及根据独立权利要求1的前序部分的参考样品以及参考样品的用途。

光学成像系统，特别是高分辨率显微镜，可以使用参考样品进行校准和/或调整。这样的参考样品配备有测试图案形式的二维结构，该测试图案在参考样品的载体材料中产生或被施加到载体材料上。这些测试图案具有子结构，该子结构的在参考样品上的定位、该子结构的尺寸和彼此之间的距离(特别是它们的横向距离)是预先已知的。

例如，在光学显微术领域中常用的载物片或比色皿形式的参考样品是已知的。它们由玻璃构成，并且具有可激发以发射荧光辐射的二维测试图案(结构)。例如，显微镜的使用配置的分辨率可以基于捕获的测试图案的荧光辐射来估计。

荧光辐射的激发和发射基于掺杂玻璃，尤其是掺杂有已知的稀土。虽然以这种方式生成的荧光中心目前在激发辐射和环境条件下不如基于蛋白质或无机标记物分子的荧光标记物那么快地退化，但甚至掺杂玻璃也示出在多次激发下发射强度有时会显著降低(例如，Royon,A.和Converset,N.于2017年：Quality Control of Fluorescence ImagingSystems–A new tool for performance assessment and monitoring(荧光成像系统的质量控制——性能估计和监测的新工具)；Optik&Photonik 2/2017:22–25)。

迄今为止，用作测试图案的结构已经使用技术方法引入到载体材料中，其分辨率对应于待测量、校准或调整的光学系统，特别是显微镜的分辨率。因此，用现有技术已知的参考样品对高分辨率显微镜的分辨率进行计量确定仅在非常有限的范围内是可能的。

因此，本发明还基于提出与现有技术相比能够改进分辨率测量的参考样品的目的。此外，本发明旨在创造一种可能性，用于在光学系统和成像系统(特别是显微镜)上进行比较测量，它们不受来自样品的冷光强度的退化影响。

该目的通过根据独立权利要求的主题实现。在从属权利要求中发现本发明的有利改进。

参考样品用于测量、校准和/或调整光学成像系统，诸如显微镜(特别地高分辨率显微镜)，并且具有由载体材料制成的至少一个载体结构，该载体材料至少在其范围内(即至少在区域或区段中)可激发以发射光(冷光)。载体材料还具有至少一个二维和/或三维结构，该结构在其尺寸和形状方面是预先确定的并且由多个子结构构成。这种二维和/或三维结构形成了测试图案。参考样品可以具有几个结构，其在它们的尺寸和形状方面也可以彼此不同。这些结构在下面也称为测试图案。

根据本发明，载体材料由金刚石构成，其特别是可以通过技术制造。根据本发明的其他实施例使用碳化硅(SiC)作为载体材料。为了使载体材料可激发以发射光，将载体材料掺杂在结构的区域中或周围。

载体结构允许测试图案被重复提供和使用并含有或携带该结构。例如，载体结构可以放置在显微术中常用的载物片上。

相应的子结构横向和/或轴向形成为区域、为点、为三维结构和/或为至少两个线区段的组合。在这种情况下，横向子结构在参考样品的表面上或下方延伸并实质上与其平行，而轴向子结构在z方向上或与其成角度地延伸到载体材料中。

光学成像系统(例如显微镜)如果可以用于显示小于阿贝极限的结构，则被称为高分辨率。下面将使用一个或多个显微镜的示例来解释本发明。

发射冷光的激发特别地凭借具有合适波长和强度的激发辐射来发生。

在参考样品的有利实施例中，载体材料掺杂有氮空位对。例如，也称为NV金刚石(氮空位金刚石)的载体材料用具有可见光范围内波长的激光辐射是可激发的并且同样在可见光波长范围内发射(例如参见Weil,T.于2017年的：晶格缺陷纳米金刚石作为生物医学应用的创新材料(Nanodiamanten mit Gitterdefekten als innovative Materialien für biomedizinische Anwendungen)；2017年的《研究报告》——马克斯普朗克聚合物研究所)。

在根据本发明的参考样品的其他实施例中，载体材料至少在具有在硅空位对(SiV中心)、磷空位、氧空位、硫空位、锡空位和/或锰空位对的区域中掺杂。

参考样品可以具有一个或多个结构。这些相应由至少一个子结构形成，该子结构可以不同地设计，以便进行不同的测量或可用于不同的光学系统，特别是不同的显微镜或相机。

例如凭借光刻方法将结构引入到载体结构的载体材料中。例如，Michl等人(Michl,J.等人:A Diamond Nanoscale Reference for Super-Resolution Microscopy(用于超分辨显微术的金刚石纳米尺度参考件)，未发表，已提交给发表的期刊)描述了这样的结构的制造。

结构的横向子结构可以是彼此相邻布置的线区段的对(线对)，线区段的对具有相应的线区段之间的距离。该结构的这种实施例使得可以取决于选择的线区段之间的距离来确定相应的子结构的线区段是否可以光学分辨。取决于结构的范围，可以附加地检验分辨率是仅存在于区域之上还是存在于整个视场之上。例如，可以凭借适当尺寸的结构，也就是说包括对应大量子结构的结构，检验分辨率是否存在于例如视场的中心区域以及在更外围的区域中。无误差成像的区域的范围(例如在可实现的分辨率中没有畸变和/或没有损失)可以用于确定在各个情况下可以使用的图像区域尺寸。

为了有效地找到分辨率极限，如果在参考样品上存在多个结构，该多个结构的子结构或线区段位于彼此不同的距离处，则是有利的。例如，可以存在至少一个结构，该至少一个结构内子结构的线区段之间的距离随着不同的对而逐步改变。例如，线区段之间的距离可以选自25nm到500nm的范围，并且可以例如是25、50、75、100、125、150、200、250、300、400和/或500nm。

使用现代微结构化技术，可以实现5nm的横向分辨率和定位准确度。在这种情况下，例如，相应对的线区段之间的距离的变化小于2％或小于2nm，这取决于哪个值更大。子结构的线的宽度有利地不大于50nm，优选地不大于20nm，并且它们的长度例如为10μm。线区段的单独对以例如10μm的恒定节距彼此间隔开。

该实施例对于测量构件或光学系统的比较以及分辨率的确定具有很大的优势，因为如果结构尺寸相同或略小于待确定的尺寸，则该结构尺寸对感知或确定的分辨率具有显著影响。与所需结构形状/尺寸的偏差也经受该限制。

子结构(特别是当它们被实施为线区段的对时)可以彼此平行地布置。它们可以垂直于(虚拟)参考线或以指定角度倾斜，例如30°、45°或90°。在其他实施例中，子结构也可以以线或行的方式彼此相邻地布置。

在其他可能的实施例中，子结构例如形成为线区段，这些线区段彼此平行布置并且布置成在一个方向上它们之间的距离增加。其他实施例例如是二维网格，其网格线彼此平行并且布置成在至少一个方向上它们之间的距离增加。

使用以这种方式设计的参考样品，除了或作为确定像场尺寸的替代例，可以分析例如相应的光学传递函数(OTF)、调制传递函数(MTF)和点扩散函数(PSF)。在此，MTF描述了系统的所有空间频率的对比度，例如每单位长度(例如每毫米)的线区段的数目。PSF指定图像点的映射函数。如果对PSF进行傅里叶变换，则得到OTF。除了MTF之外，OTF还含有与连接OTF＝MTF*e^(i*PTF)意义上的已知的PTF(相位传递函数)有关的信息。替代地，连接也可以表示为

其中

作为光学传递函数，

作为调制传递函数，以及

作为相位传递函数(例如，参见Hecht,E.(1987)：Optics(光学)；508ff；ISBN:0-201-11611-1)。

实际上，这意味着可以借助于线区段形式的子结构直接测量MTF。OTF很大程度上取决于系统的PSF。PSF可以使用不同的子结构来确定。例如，可以为此使用小的点状子结构，其例如相当于光学系统的最小可分辨结构尺寸的大约十分之一到五分之一。

这种测量不仅与高分辨率光学系统相关，而且同样可以用于具有不同分辨率的光学系统。这里的优点是系统的可能的可比较性和非常良好的可校准性，其特别地基于参考样品对不希望的淬灭的稳健性。

有利的是，不仅估计图像的一部分，而且可以在记录状态或配置状态下测量整个光学系统以用于记录荧光图像的实际用途。与现有技术相比，使用根据本发明的参考样品，不需要单独记录照明和检测束路径，并且可以提供系统的分辨率的直接且易于追溯的证明。

在本发明的其他实施例中，相应结构的横向子结构可以形成为可激发以发射冷光的区域。例如，这些区域可以布置在网格中。网格的单独区域有利地具有预先确定的尺寸、形状和彼此之间的距离。例如，即使参考样品上的网格具有直的轮廓和直角，这种网格也可以用于检测任何出现的畸变，例如，在网格的弯曲轮廓中存在这种畸变。例如，网格的维度为250x250μm、1x1mm或6x6mm。区域之间的节距例如为2μm、10μm或25μm。如果区域是圆形区域(“点”)的形式，则它们具有例如100nm、250nm或500nm的直径。如果区域形成为矩形，则它们的边缘长度例如为100nm、250nm或500nm。其他可能的实施例例如是十字、线或类似形状。子结构在z方向上的厚度有利地小于或等于50nm，优选地小于或等于25nm。

在其他实施例中，根据本发明的参考样品可以具有机器可读代码作为结构。这样的代码可以是二维或三维代码并且可以是例如已知的QR码、条形码或单独限定的形状和/或颜色组合的形式。

在参考样品的一个可能的实施例中，该结构在中心区域具有第一横向范围(例如第一直径、第一周长或第一边缘长度)的子结构并且在外围区域中具有第二横向范围(例如第二直径、第二周长或第二边缘长度)的子结构。

在本发明的其他实施例中，二维子结构可以例如形成为已知的西门子星形的部分。设计为扇形的二维子结构与不可激发以发射冷光的扇形交替布置。西门子星形的射线数目例如为n＝16，其直径例如为20μm。这样的实施例实现了分辨率的定性测量和不同显微镜的比较。

在根据本发明的其他实施例中，参考样品配备有轴向子结构，以便能够确定相应显微镜在其光轴方向(z方向)上的分辨率。在有利的实施例中，这包括在一个点相交的至少一对线。这些线在载体材料中倾斜于z方向延伸。交叉点的准确位置以及位置和分布，特别是载体材料中线的长度、角度和厚度或宽度是已知的。

具有轴向子结构的结构的这种实施例允许确定显微镜的轴向分辨率。此外，可以确定显微镜的光轴相对于交点的瞬时对准的偏差。为此，显微镜或其对应的光学元件在z方向上聚焦。焦点在z方向上移位，并且检测到产生的发射辐射。如果交点恰好位于光轴上，则当焦点指向交点并在那里激发冷光时，只会捕获一次冷光。如果焦点在z方向上移位的路径远离交点，则当焦点指向这些线中的一条时，激发冷光。参考样品与光轴的相对位置关系可以从相应冷光源的位置(＝当前焦点位置)、线的粗细和两个原点之间的距离推断出来。

此外，这种轴向子结构允许测量的轴向分辨率。为此，参考样品相对于光轴移位，特别是沿着XY平面移位，因此与在z方向上延伸的光轴正交。由于线的位置和分布是已知的，因此可以例如从交点开始搜索光轴与两条线相交的(边界)位置，并且两条线仍然可以基于由它们发射的荧光辐射彼此区分。还必须考虑线的粗细。基于以这种方式找到的边界位置距交点的距离，并在知道线的位置和分布的情况下，可以确定边界位置处的线之间的距离。该距离反映了所讨论的显微镜可实现的轴向分辨率。

在根据本发明的参考样品的其他实施例中，相交线被实施为横向子结构。这些线平行于载体材料的表面，特别是在参考样品的XY平面中。在此，也可以基于所确定的极限位置来确定分辨率，这次是在横向方向上。例如，可以使用相交点的已知位置和极限位置以及线的分布来计算分辨率。也可以使用先前编译的查找表(LUT)用于横向或轴向分辨率。

在根据本发明的参考样品的其他实施例中，至少一条线同样在载体材料中倾斜地延伸，但是这些线在这些线的中点中的至少一个之外的点处相交。同样可能的是，至少一条斜线不与至少另一条线相交而仅仅接近它。如果结构的不同位置处的线之间的距离是已知的，则它们可以用于确定分辨率，如上所述。

在其他实施例中，结构包括区域或长方体形式的轴向子结构。例如，它们的边缘长度为100nm、250nm或500nm。在替代实施例中，该结构被实现为具有例如5×5mm的尺寸并且在载体材料的表面下方近似25nm，但有利地10nm处产生的区域。该区域相对于表面的深度的变化优选为5nm或更小。

如果球体形成为轴向子结构，则例如这些子结构的直径可以为25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、1000或1400nm。球体可以布置成网格(阵列)。这种网格的尺寸例如为10×10μm。

如果球体彼此线性布置或布置成网格，例如在4x4网格中，则球体之间的距离例如为25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、1000和/或1400nm。在球体或区域或长方体的所有实施例的情况下，它们在阵列或线内的范围在其他实施例中可以不同。例如，范围在一个方向上增加。

至少一个球体形式的子结构的实施例允许测量光学成像系统的点扩散函数(PSF)。PSF可以用于校准光学成像系统。取决于配置，二维和/或网格状子结构不仅允许测量横向和/或轴向分辨率，还允许确定其他光学效应，诸如渐晕(“阴影”)。在这种情况下，例如在相同照度的情况下，检测到的强度是在相对于视场中心的视场外围来确定的。

在参考样品的其他可能的实施例中，空位的对作为结构被二维地产生。在该可激发以发射冷光辐射的区域内，存在例如圆形区域、三角形、矩形、多边形和/或其他形状形式的区域，在这些区域上不产生空位对。这些不可激发区域可以布置在网格中。因此，测试图案因此至少在视场的区域上被设计为可激发以发射冷光辐射并且在具有其中存在不可激发区域的基体(matrix)。当使用具有这种测试图案的参考样品时，检测到可激发基体内的非可激发区域并且确定分辨率。

根据本发明的参考样品可以用于校准高分辨率显微镜。对应设计的方法包括在待校准的显微镜的束路径中提供参考样品的步骤，其中参考样品的选择的结构的至少一个子结构被引入到显微镜的物场(视场；FoV)中。使用显微镜获取至少一个子结构的图像数据并且凭借分析单元进行评估。评估结果以可检索的形式存储，并且因此可用于后续的数据技术处理。分析单元例如是计算机。

可以通过用户放置和定位参考样品以这种方法和其他方法提供参考样品。还可以使用人工智能算法来选择和/或正确定位参考样品。在其他配置中，可以通过检测、捕获和评估机器可读代码来识别和正确定位参考样品。可以基于评估结果生成必要的控制命令，并且例如可以相应地控制样品台的驱动。

取决于当前待实行的校准，可以识别并检验参考样品中含有的哪些测试图案适合于当前校准。如果合适的测试图案可用，则将其定位，使得然后可以实行校准。单独的校准可以一个接一个地自动实行。在校准期间或之后，可以给予用户与当前状态和相应校准结果有关的信息，以便允许成功监测并使用户进行任何必要的干预成为可能。在校准结束时，可以向用户示出校准过程的报告，其中具有成功评级和其他参数。

如果然后要实行其他校准，例如为了校准光学系统的其他部件(特别是显微镜的其他部件)，这同样适用。

参考样品还可以用于将至少两个显微镜相互参考的方法。这种方法包括在第一显微镜的束路径中提供参考样品的步骤，其中参考样品的选择的结构的至少一个子结构被引入到第一显微镜的物场(视场；FoV)中。凭借第一显微镜获取和评估至少一个子结构的图像数据，并且以可检索的形式存储第一评估结果。可选地，还可以存储第一显微镜的设置或操作参数。为了能够将两个或更多个显微镜相互比较，如果图像的记录条件尽可能地是可比较的，则是有利的。例如，可以存储照明功率、像素分辨率和所用物镜参数的设定，以便用第二显微镜的对应操作参数设定它们或至少使它们近似。

参考样品被配备在第二显微镜的束路径中，其中参考样品的选择的结构的至少一个(优选相同的)子结构再次被引入到第二显微镜的物场(视场；FoV)中。使用第二显微镜，获取和评估至少一个子结构的图像数据，并且评估结果作为第二评估结果提供。将第一和第二评估结果相互比较。

参考样品可以根据预先定义的例程进行识别和评估，该例程例如存储在控制单元中并在需要时撷取。备选地，可以实行使用人工智能和/或神经网络的方法，以便例如使捕获的参数适配于记录的图像内容并优化图像捕获。

在该方法的其他配置中，第一和/或第二评估结果凭借比较单元与期望值进行比较。

附加地或替代地，可以基于评估结果或比较结果对所讨论的显微镜进行分类。为此，例如，所述显微镜可以分配给预先定义的组。

根据确定的测量值，可以导出光学系统的技术参数并例如使用它们来控制电动部件等。

此外，可以基于涉及的部件的确定参数和检测到的指定光学效应来调整信号曲线，以提高所获取的图像数据的质量。

除了自动校准和调整以外，参考样品的捕获结果及其评估还可以用于自动捕获指定样品区域。

此外，可以创建例如照明功率的校准曲线，并将它们存储在例如查找表或函数中。

本发明的优点特别是使用无淬灭样品。这使得可以在系统之间进行直接比较，而不会由于在相同照度下的不同冷光响应(例如，由于淬灭)而导致退化效应或不确定性。因此，无需观察样品在已经被使用后恢复的等待时间。测量和比较的可重复性显著提高。此外，系统的非常良好的长期曝光和长期稳定性的比较是可能的。根据本发明的测试图案可以在20nm至2μm的横向方向上的尺寸以高重复性和小偏差来制造。此外，根据本发明的参考样品在不同实施例中的吸收光谱和它们的宽发射光谱使得在许多不同的光学系统中的使用成为可能。

下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明，附图中：

图1示出了根据本发明的参考样品的示例性实施方案的示意图，其具有五个不同的结构，每个结构由多个子结构构成；

图2示出了带有根据本发明的参考样品的其他示例性实施例的显微镜的的示例性实施例的示意图；

图3a到3e示出了具有增加的子结构之间的距离的五个测试图案；示出了布置成一行的线对，图3a中为垂直或竖直线对，图3b中为倾斜线对，图3c中为水平线对；图3d中距离增加，并且图3e为网格；

图4示出了具有西门子星形的测试图案的参考样品的示例性实施例的示意图；

图5示出了参考样品的示例性实施例的示意图，其具有作为子结构的规则布置区域的网格形式的测试图案；

图6示出了参考样品的示例性实施例的示意图，其具有作为第一子结构的规则布置的区域的内部网格和有第二子结构的外部网格的形式的测试图案；

图7示出了参考样品的示例性实施例的示意图，其具有在可激发以发射的基体中作为不可激发以发射的区域的网格形式的测试图案；

图8示出了在z方向上相交的两条线的形式的轴向子结构的第一示例性实施例的示意图，以及用于确定轴向分辨率的过程；

图9a和9b以透视图(图9a)和平面图(图9b)示出了彼此接近的两条线形式的轴向子结构的第二示例性实施例的示意图；

图10a和10b以透视图(图10a)和平面图(图10b)示出了球面轴向子结构的布置形式的轴向子结构的第三示例性实施例的示意图；

图11示出了根据本发明凭借参考样品校准显微镜的方法的版本的流程图；以及

图12示出了使用根据本发明的参考样品将第一显微镜与第二显微镜进行比较的方法的版本的流程图。

图1示意性示出的参考样品1具有由作为载体材料3的NV金刚石制成的载体结构2。将第一至第四结构5、6、7和8(分别地＝测试图案5、6、7和8)应用到载体结构2的侧表面，该第一至第四结构由按行布置成线的形式的子结构5.1、矩形区域形式的子结构6.1，同心环形式的子结构7.1，以及点形区域形式的子结构8.1构成。附加地存在子结构，其为QR码形式的机器可读代码17的形式。具有结构5、6、7和8的侧表面在与笛卡尔坐标系的XY平面平行的平面中延伸。

第一结构5的子结构5.1是线对，其彼此之间相应的距离di(i＝1,2,...,n)变化(参见图3a至3c)。这同样适用于第四子结构8.1。同样，第三测试图案7的子结构7.1的半径从内向外随着增量的增加而增加。

图2示出了根据本发明的参考样品1用于校准和/或调整特别是高分辨率显微镜9的用途。显微镜9具有评估和控制单元10，凭借该评估和控制单元10，对获取的图像数据的评估以及控制命令的生成和传输是可能的。为此相应地配置评估和控制单元10。图像数据的获取以及可选地参考样品1的照明凭借物镜11发生，该物镜11的光轴oA在z方向上指向参考样品1和结构5、7和8。参考样品1的该示例性实施例不具有第二结构6。另外的或第二个显微镜9(未示出)可以具有与图2中所示相同的元件。

参考样品1布置在样品台12上。后者可选地凭借驱动器13在至少一个轴x、y和z的方向上以受控方式可移动。样品台12的移动可以通过来自评估和控制单元10的控制命令来控制。同样存在的比较单元15例如形式为计算机并且被配置用于将评估和控制单元10的评估结果相互比较并且使比较结果可用。比较单元15可以附加地实施为接收来自另一个光学系统(例如另一个显微镜)的评估结果，并且将它们与来自第一显微镜9的评估结果(由死端连接表示)进行比较。

为了校准的目的，用合适的激发辐射照射结构5、7和8中的至少一个，并且激发光(例如荧光辐射)的发射。发射的光用显微镜9捕获，并且相关结构5、7和/或8的图像数据在为此配置的评估和控制单元10中分析。如果尺寸已知的对应的捕获的结构5、7和8可以以允许的确定性或预先确定的程度分辨，则正确校准了显微镜9。

另一方面，如果捕获的结构5、7和8不能被充分分辨，则可以生成控制命令，这会导致样品台12移动、显微镜9的技术参数改变和/或图像数据的计算评估被调整。采取这些措施以便校准显微镜9。

替代地或附加地，还可以通过将物镜11的光轴oA引入相对于子结构5.1、7.1(为清楚起见未全部标出)和/或8.1中的至少一个的预先确定的位置中来进行调整。测试图案8的点状子结构8.1特别地适用于调整。

图3a到3c示出了第一测试图案5的三个修改例，它们每个都形成为为子结构5.1的线区段的多个对(线对)。术语线区段被选择，因为单独的子结构5.1的长度较短，近似为10μm。在全部三个实施例(图3a至3c)中，线对的线区段之间的距离di(i＝1、2、...、n)从左到右增加(仅以示例的方式指定少数)。在图3a中，第一线对的线区段之间的距离d1小于第三线对的距离d3。图3a中所示的子结构5.1是彼此平行的线对并且相对于行方向从左到右垂直布置。虽然距离d1至d4在行方向上逐步改变，但线对的相应第一线区段以恒定节距a彼此间隔开，该节距a为例如10μm(仅针对第一和第二线对示出)。这同样适用于图3b和3c中所示的子结构5.1的实施例。图3b中所示的线对同样彼此平行，但相对于垂直方向倾斜。在图3c中，线对水平地成行布置。

图3d中示出了相邻线区段之间距离增加的可能实施例。例如，可以使用测试图案5的这样的其他设计来确定MTF。

具有改变距离的测试图案5的二维修改在图3e中以网格的形式实现。

根据本发明的测试图案6的其他示例性实施例是所谓的西门子星(图4)。后者由许多楔形扇形构成，这些扇形交替地可激发(阴影所示)和不可激发(未加阴影)以发射冷光。在所示的示例性实施例中，总共有八个楔形区域。在其他的示例性实施例中，例如，形成十六个楔形表面(为了更好的概览而未示出)。例如，西门子星的外径可以是20μm。西门子星的形式的测试图案6允许以已知方式通过在检测侧搜索朝向测试图案6的中心逐渐变窄的扇形的最大可实现分辨率来确定分辨率。此外，西门子星的形式的测试图案6可以用于校准显微镜9和/或将至少两个显微镜9(例如参见图11和12)进行比较。

如关于图1已经描述的，测试图案6可以是相同类型的子结构6.1的网格。在根据图5的示例性实施例中，子结构6.1是正方形，它们布置成具有恒定节距a的规则网格。所示的测试图案6允许检验图像中畸变的出现。因此，子结构6.1的轮廓的正确的、未畸变的图像可以用作无畸变图像的证据。此外，可以确定光轴上和场中的亮度，并且可以检测和捕获任何渐晕。

在测试图案6的其他实施例中，子结构6.1可以是点或圆的形式(未示出)。

在参考样品1中，不同尺寸和/或不同形状的子结构6.1也可以存在于测试图案6内(图6)。多个子结构6.1在此可以布置在内部网格中，例如以具有第一边缘长度的正方形的形式。内部网格的子结构6.1沿网格的行和列具有恒定的第一节距a1。内部网格由外部网格包围，该外部网格由具有第二边缘长度并且彼此间隔第二间距a2的子结构6.1形成。第二边缘长度和第二节距a2大于内部网格的子结构6.1的第一边缘长度和第一节距a1。

在根据本发明的参考样品1的其他实施例中，子结构6.1可以形成为不可激发以发射冷光辐射的区域，例如嵌入在可激发以发射冷光辐射的区域(基体16)中的圆形区域中(图7)。

除了借助横向子结构5.1、6.1、7.1、8.1(见图1至3)确定横向方向的分辨率以外，根据本发明的参考样品1可以附加地或替代地具有至少一个轴向子结构5.1ax。在示例性实施例(图8)中，轴向测试图案5ax由两条线形成，该两条线在交叉点S处在z轴方向(z方向)相交并且形成为在载体材料3中倾斜地延伸。

如果显微镜9(参见图2)相对于参考样品1布置为使得其光轴oA指向子结构5.1ax的交点S(场景I)，则仅在该交点S处产生冷光并且从与交点S在z方向上的位置相对应的z位置得到图像I(用椭圆形BI表示)。在此通过在z方向上移位显微镜9或物镜11的焦点来找到交点S。图像BI1的z位置可以与交点S的预期z位置进行比较，并用于校准或调整显微镜。

另一方面，如果参考样品1和光轴oA处于横向移位的相对位置(场景II)，则当焦点入射到靠近载体结构2的表面延伸的子结构5.1ax上时会产生冷光。该冷光被显示为捕获为第一图像B_Ⅱ1并与相关联的z位置一起存储。如果焦点然后沿着光轴oA进一步移位，则沿光轴oA的路径、沿着与子结构5.1ax的中间空间相对应的路径距离不捕获任何冷光。如果焦点位置与位于载体结构2更深处的子结构5.1ax的z位置重合，则再次产生冷光。第二图像B_Ⅱ2被捕获并与相关联的z位置一起存储。参考样品1和光轴oA的当前相对位置可以基于以下来推断：基于存储的图像B_II1和B_II2的z位置并且基于第一图像B_II1在焦点已经行进了小于到达交点的预期z位置所需的移位距离的移位距离之后被捕获的事实。

这些轴向子结构5.1ax用于确定显微镜9的轴向分辨率。能够分辨结构之间产生的间隙的能力是系统的轴向区分结构尺寸的能力的量度。

在本发明的修改中，测试图案5ax的轴向子结构5.1ax同样被实现为在载体材料3中倾斜延伸的两条线(图9a)，但它们不相交。子结构5.1ax在载体材料3中三维地(即在两个相互倾斜的平面中)延伸。图9b(其示出了载体结构2在z方向上的平面图)示出了子结构5.1ax彼此接近但不相交。

原则上，针对图8描述的程序可以用于调整和/或校准的目的。代替寻找交点S，子结构5.1ax之间的距离可以用作分辨率或调整的量度。

另外的轴向测试图案14的轴向子结构14.1还可以是具有不同直径的球体，如图10b示意性所示。子结构14.1可以形成在共同的z位置(图10a)。在测试图案14的其他实施例中，球体也可以布置在不同的深度，即，在不同的z位置。

将参照图11解释根据本发明的用于校准高分辨率或超分辨率光学装置，特别是显微镜9的方法的版本。随后的步骤中的每一个都可以包括多个单独的措施，为了在图11中(然后对应地也在图12中)更清楚，这些措施在功能上和图形上组合成块。

开始时，将根据本发明的参考样品1放置到光学系统中以进行校准。放置可以由用户完成或自动完成。还可以使用人工智能算法来选择和/或正确地定位参考样品1。启动了为了实行测量任务或校准而设置的程序，并在必要时指定测量任务(步骤K1)。在要做出的第一决策(KE1)中，确定需要实行参考运行。如果答案是否定的(N)，则自动选择和/或确定图像记录的参数。然后捕获并存储第一图像(步骤K2)。

如果第一决策(KE1)是肯定的(Y)，则在步骤K3中实行参考运行和/或在继续步骤K2之前确定样品台12的当前位置。

随后的第二决策步骤KE2的主题是待成像的参考样品1在捕获的图像中是否可见的问题。如果不是这种情况(N)，则在第三决策步骤KE3中做出是在步骤K3中实行手动搜索还是在步骤K4中实行自动搜索的决策。在搜索的两种备选例中，可以使用参考标记，其在步骤K3中由用户提供或在步骤K4中由光学系统提供。

如果参考样品1包含在捕获的图像中，则该过程可以直接继续进行步骤K5。在该步骤中，将现有的参考标记归位，以便产生样品台12、显微镜9和参考样品1的所需起始位置。将待测量的结构5、6、7或8归位，并记录其图像。所获取的图像数据例如在图像内容，距离di、亮度、均匀性的确定等方面进行评估。另外地或替代地，所捕获的结构5、6、7或8可以用作参考标记。

以这种方式得到的结果以可检索的方式输出或存储并可用(步骤R1)。

如果来自步骤R1的结果为不(N)要与理论值进行比较(第四决策步骤KE4)，则该方法可以结束。另一方面，如果要实行这种比较(Y)，则实行步骤K6。可以可选地使用比较结果对系统进行分类(KE5)。如果不进行分类(N)，则以可检索的方式输出或存储比较结果(R2)并且该方法结束。

替代地(Y)，在步骤K7中，基于与理论值的一致程度或是否达到理论值对系统进行分类。

比较结果和产生的分类以可检索的方式输出或存储(R3)，并且方法结束。可以为第二显微镜9重复该该方法步骤。

参考图12描述了用于比较两个光学系统，特别是两个显微镜9的方法的版本。将参考样品1放置在第一显微镜9中，寻找相关的样品点，特别是所需的测试图案5、6、7或8，并且准备图像记录。为此，必须知道或存储图像记录的必要参数(步骤V1)。例如，这些参数是时间分辨率、像素分辨率、光强度、检测器增益、照明时间、扫描速度和光谱划分。图像捕获和获取的图像数据的评估也包含在步骤V1中。图像捕获可以包括所有空间维度(2D、3D)以及时间分布。评估的目标是，例如，被分类为相关的特征。这样的特征例如是测试图案5、6、7或8的捕获的强度分布，其中评估了强度的最大值之间的至少一个距离。

评估可以附加地或替代地基于被激发以发射冷光的子结构5.1至8.1、14.1的区域的尺寸(例如，使用半高宽)；基于激发区域之间的间隙的尺寸(例如，经由瑞利(Rayleigh)、Dawes、Sparrow准则)；激发区域的均匀性/均匀度；激发区域的时间恒定性或变化。评估可以基于诸如奈奎斯特-香农定理、信噪比等准则；对比度；所需的分辨率。从第一显微镜9中移除参考样品1。

确定的参数被输出和存储(R1)。在该方法的第一决策步骤VE1中，必须回答关于是否应将第一显微镜9的评估结果与第二显微镜9的评估结果进行比较的问题。如果答案为否定的(N)，则在步骤V4中与理论值进行比较。例如，这可以是根据阿贝准则的理论上可实现的分辨率。比较的结果被输出或者第一显微镜9被分类(R5)并且该方法结束。

另一方面，如果在决策步骤VE1中与第二显微镜9的比较是肯定的(Y)，则将参考样品1放置到第二显微镜9中并且在步骤V2中实行对应于V1的测量。输出并存储结果(R2)。

第一显微镜9的系统参数尽可能应用于第二显微镜9。例如，可以采用时间分辨率、像素分辨率、光强度、检测器增益、曝光时间、扫描速度和/或光谱划分。如有必要，用于图像捕获的参数适配于第二显微镜9的要求。例如，当将激光扫描显微镜与宽场显微镜或高分辨率SR显微镜与激光扫描显微镜或宽场显微镜进行比较时，可以需要进行调整。

然后在步骤V3中将来自R1的第一显微镜9的结果与来自R2的第二显微镜9的结果进行比较。V3的结果作为两个显微镜9之间的比较值被输出(R4)。在随后的步骤V4中，发生与理论值的比较，并且在R5中输出结果，并且该方法结束。

附图标记

1 参考样品

2 载体结构

3 载体材料

4 载物片

5 第一结构/第一测试图案

5.1 (第一结构5的)子结构

5ax 轴向测试图案

5.1ax 轴向子结构

6 第二结构/第二测试图案

6.1 (第二结构6的)子结构

7 第三结构/第三测试图案

7.1 (第三结构7的)子结构

8 第四结构

8.1 (第四结构8的)子结构

9 显微镜

10 评估和控制单元

11 物镜

12 样品台

13 驱动器

14 第五结构/第五测试图案

15 比较单元

16 基体

17 机器可读代码

oA 光轴

BI 来自场景I的图像

B_II1 来自场景II的第一图像

B_II2 来自场景II的第二图像

Ki、Vi 方法步骤；其中i＝1到7

KEi、VEi 决策步骤，其中i＝1到5

Ri 结果步骤，其中i＝1到3

S 交点

Claims (13)

1.一种用于校准和/或调整显微镜(9)的参考样品(1)，

-具有由载体材料(3)制成的至少一个载体结构(2)，该载体材料(3)至少在其范围内是可激发的以发射冷光，

其中，所述载体材料(3)具有至少一个二维和/或三维结构(5、6、7、8、14、17)，其在尺寸和形状方面是预先确定的，并且由多个子结构(5.1、6.1、7.1、8.1、14.1)构成，

其特征在于，

-所述载体材料(3)为金刚石或碳化硅；

-将所述载体材料(3)掺杂在所述二维和/或三维结构(5、6、7、8、14、17)的区域中或周围，以便可激发以发射所述冷光；并且

-相应的子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)横向和/或轴向形成为区域、为点、为三维结构或为至少两个线区段的组合，其中横向子结构(5.1、6.1、7.1、8.1)在所述参考样品的表面上或下方延伸并实质地与其平行，而轴向子结构(5.1ax、14.1)在z方向上或倾斜于z方向延伸到所述载体材料中。

2.根据权利要求1所述的参考样品(1)，其特征在于，所述载体材料(3)具有掺杂有氮空位、硅空位、磷空位、氧空位、硫空位、锡空位和/或锰空位对的区域。

3.根据权利要求1或2所述的参考样品(1)，其特征在于，结构(5、6、7、8)的横向子结构(5.1、6.1、7.1、8.1)是线区段的对，所述线区段的对具有相应的所述线区段之间的距离(di)，其中，所述线区段之间的距离(di)随着不同的对而逐步改变。

4.根据权利要求3所述的参考样品(1)，其特征在于，所述距离(di)选自25nm至500nm的范围。

5.根据权利要求1或2所述的参考样品(1)，其特征在于，所述轴向子结构(5.1ax)包括至少一对相交线。

6.根据权利要求1或2所述的参考样品(1)，其特征在于，相应结构(6)的横向子结构(6.1)形成为可激发以发射冷光的区域。

7.根据权利要求6所述的参考样品(1)，其特征在于，所述子结构(6.1)在所述z方向上的厚度小于或等于50nm，优选地小于或等于25nm。

8.根据权利要求6或7所述的参考样品(1)，其特征在于，所述二维子结构(6.1)与不可激发以发射冷光的区域交替布置。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的参考样品(1)，其特征在于，所述子结构(6.1)形成为不可激发以发射冷光的区域并且被嵌入在可激发以发射冷光的基体(16)中。

10.根据权利要求1所述的参考样品(1)，其特征在于，结构17形成为机器可读代码。

11.一种根据权利要求1至10中任一项所述的参考样品(1)用于校准显微镜(9)的用途，包括以下步骤：

-在待校准的所述显微镜(9)的束路径中提供所述参考样品(1)，其中，所述参考样品(1)的选择的结构(5、6、7、8、14)的至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)被引入到所述显微镜(9)的物场中；

-凭借所述显微镜(9)获取所述至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)的图像数据；

-评估所获取的图像数据；以及

-以可检索的形式存储评估结果。

12.一种用于将至少两个显微镜(9)相互参照的方法，包括以下步骤：

-在第一显微镜(9)的束路径中提供根据权利要求1至10中任一项所述的参考样品(1)，其中，所述参考样品(1)的选择的结构(5、6、7、8、14)的至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)被引入到所述第一显微镜(9)的物场中；

-凭借所述第一显微镜(9)获取至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)的图像数据；

-评估所获取的图像数据，并将评估结果存储为第一评估结果；

-在第二显微镜(9)的束路径中提供所述参考样品(1)，其中，所述参考样品(1)的选择的结构(5、6、7、8、14)的至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)被引入到所述第二显微镜(9)的物场中；

-凭借所述第二显微镜(9)获取至少一个子结构(5.1、5.1ax、6.1、7.1、8.1、14.1)的图像数据；

-评估所获取的图像数据，并将评估结果提供为第二评估结果；以及

-将所述第一评估结果和所述第二评估结果相互比较。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述第一评估结果和/或所述第二评估结果通过比较单元(15)与预期值进行比较。

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