CN116732019A - 一种磁力加速的细胞分选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磁力加速的细胞分选方法，在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性后，在细胞的上方施加磁场以对细胞施加向下的作用力，与细胞向下的重力同时作用，驱动细胞沉降至上表面修饰有可与细胞特异性结合的分子的底板上；在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性是通过向细胞悬液中的液体中加入顺磁剂实现的；顺磁剂为投入临床应用的钆的大分子络合物；加入顺磁剂后，细胞悬液中的液体中顺磁剂的浓度为10‑150mM。本发明的方法简单，能快速捕获目的细胞。

Description

一种磁力加速的细胞分选方法
技术领域
本发明属于细胞分选技术领域，涉及一种磁力加速的细胞分选方法。
背景技术
细胞分选技术是被生物医学实验室广泛应用的一种手段，其作用是从杂细胞群体中分离出目的细胞。生物组织内的细胞具有丰富的异质性，因此，若需要从形态功能各异的细胞中分离纯化出研究所需的目的细胞，细胞分选是必不可少的手段。在生命科学领域，随着单细胞与多组学研究的发展，细胞分选已成为众多前沿科学实验必不可少的程序之一。同时，下游研究手段的进步对上游的分选技术提出了更高的要求。
目前主流的细胞分选方式包括流式分选和磁珠分选。此二类方法需要利用荧光素或磁珠偶联的抗体，对目的细胞进行特异性标记，并相应应用流式细胞术或磁力架分选出目的细胞。在目的细胞占总群数量较多时，流式分选与磁珠分选可获得良好效果。但在目的细胞占总群数量极少时，如分离循环肿瘤细胞、循环胚胎细胞、组织中的驻留干细胞等情况下，如图1所示，目标细胞难以在经过较长的分选通道后富集到收集容器中。此外，磁珠和荧光素在细胞表面的残余可能会影响后续细胞功能的表征。
对于目标细胞量稀少的细胞，微流道是报道得较多的分选富集方法。通过对微流道内表面做抗非特异粘附处理，并将可特异性结合目标细胞的分子修饰到微流道底板表面，从而特异性捕获目的细胞是此方法的基本原理。这类方法避免了荧光素和磁珠与细胞的偶联，但仅在底板上存在与细胞特异性结合分子导致细胞需沉降至底部后方能与表面分子结合，单纯重力作用的沉降速度较慢，可能导致细胞在流场作用下不能与底板充分接触，造成细胞捕获失败。当目标细胞量极为稀少时，是否能充分捕获对实验成功的影响极大，而目前采用的手段大都是通过降低流速或增加静置时间来实现。若降低流速或增加静置时间以确保细胞充分沉降，势必会造成分选时间延长，时间延长可能会导致以下问题：1)细胞活性下降，影响后续细胞培养或检测；2)增加非目标细胞在底板黏附的概率，导致分选特异性降低；3)细胞与底板的接触时间延长后分离困难，分离过程可能会进一步导致细胞破坏。
专利CN217868922U公开了一种促进细胞贴壁的电磁设备，利用在薄层培养容器上方施加电磁作用力，以加快细胞沉降至培养皿底部，来促进细胞向下沉降和贴壁。
专利CN113699045A公开了一种促进细胞贴壁和生长的装置及其使用方法，通过驻极体产生的电场来促进细胞的贴壁与增殖，来促进细胞向下沉降和贴壁，该方法应用的是细胞所带电荷为负电荷的特点，细胞自身所带电荷弱，因此驻极体的静电作用力亦较弱、作用距离有限，因此仅应用于难贴壁细胞的体外静态培养，难以与微流道装置进行整合，也难以与特异性分子表面修饰结合实现细胞分选。
文献《Diéguez,L.；Winter,M.A.；Pocock,K.J.；Bremmell,K.E.；Thierry,B.,Efficient microfluidic negative enrichment of circulating tumor cells inblood using roughened PDMS.Analyst 2015,140(10),3565-72》，公开了通过增加底板表面粗糙度从而增加修饰的特异性分子的密度。
文献《Abdulla,A.；Zhang,Z.；Ahmad,K.Z.；Warden,A.R.；Li,H.；Ding,X.,Rapidand efficient capturing of circulating tumor cells from breast cancerPatient's whole blood via the antibody functionalized microfluidic(AFM)chip.Biosensors and Bioelectronics 2022,201,113965》，公开了通过改变微流道的流道结构以增加细胞在流道中的运动时间或驻留时间，通过时间的延长增加细胞捕获概率。
文献《Zhang,H.；Yu,X.；Liu,Y.；Lin,B.；Jiang,M.；Song,J.；Di,W.；Zhu,Z.；Yang,C.,HUNTER-Chip:Bioinspired Hierarchically Aptamer Structure-Based CirculatingFetal Cell Isolation for Non-Invasive Prenatal Testing.Analytical Chemistry2021,93(19),7235-7241》，公开了通过在微流道内部引入柱状结构，通过细胞与柱状结构的碰撞增加接触机率。
上述专利及文献都基于微流道的结构设计，虽然在一定程度上增加了细胞与特异性结合分子的接触概率，但是加工方法较为繁琐。
因此，研究一种能快速捕获目的细胞且操作简单的细胞分选方法及装置，具有十分重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中问题，本发明提供一种磁力加速的细胞分选方法，如图2所示，利用细胞本身的抗磁性，制备顶部带永磁体的微流道装置，同时在细胞悬液中加入顺磁剂，使细胞外溶液从抗磁变为顺磁环境，产生细胞悬液中的液体和细胞自身固有的磁化率差异，利用磁化率的差异(即细胞悬液中的液体的顺磁性和细胞的抗磁性)，通过顶部的永磁体对细胞产生向下的作用力，驱动细胞快速向底部运动，增加细胞与底部特异性分子的接触时间和接触作用力，从而增加目标细胞与特异性结合分子的结合概率，增加细胞捕获效率，达到细胞快速分选的目的。
为达到上述目的，本发明采用的方案如下：
一种磁力加速的细胞分选方法，在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性后，在细胞的上方施加磁场以对细胞施加向下的作用力，与细胞向下的重力同时作用，驱动细胞沉降至上表面修饰有可与细胞特异性结合的分子的底板上。
若无人为干扰，细胞和细胞悬液中的液体都具有天然抗磁性，没有磁化率差异，不受磁场影响。因此，如图3中(a)所示，细胞无法受到顺着磁力线方向的磁场作用力，仅通过重力作用沉降，沉降速度较慢。
当调整细胞悬液中的液体为顺磁性后，磁化率差异导致细胞受磁场的排斥力作用，向磁场相对较弱的位置移动，因此，通过在细胞悬液的上方施加磁场，可间接对细胞施加向下的作用力；如图3中(b)所示，细胞在磁场排斥力和重力的双重作用下，可快速向下运动到底板表面与特异性分子接触，减少细胞沉降时间，从而增加细胞与特异性分子的接触力和接触时间，使得目标细胞表面受体更易与特异性分子结合，加速目标细胞的识别和捕获，减少等待时间；相比传统方式中等待细胞因重力作用的自然沉降，额外增加的向下的磁力可显著增加细胞被底板上特异性结合捕获的机率。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性是通过向细胞悬液中的液体中加入顺磁剂实现的；
顺磁剂为投入临床应用的钆的大分子络合物，例如钆喷酸葡胺、钆贝葡胺、钆特酸葡胺、钆布醇、钆特醇、钆双胺或钆弗塞胺；加入顺磁剂后，细胞悬液中的液体中顺磁剂的浓度为10-150mM；本发明选用的顺磁剂水溶性良好，性状稳定，并且不扩散进入细胞，也不被细胞主动摄取，在应用浓度(10-150mM)下不影响细胞活性。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，细胞悬液呈流动状态，流速为0.01-10ml/min，通过控制流速，可使在无磁场作用下时，细胞流动速度大于黏附速度，有效避免了非目的细胞的黏附。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，细胞悬液流过底板后，采用缓冲液I冲洗底板，以去除未被捕获的细胞。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，采用缓冲液I冲洗底板后，还采用缓冲液II或缓冲液III冲洗底板，以洗脱被捕获的细胞；缓冲液II同缓冲液I，且缓冲液II的流速为缓冲液I的流速的1.2倍以上；缓冲液III相对于缓冲液I增加了酶或表面活性剂，且缓冲液III的流速同缓冲液I。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，采用缓冲液I冲洗底板后，还采用细胞裂解液冲洗底板，以收集细胞RNA等组分。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，可与细胞特异性结合的分子通过化学反应或物理吸附的方法修饰在底板的上表面上。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，可与细胞特异性结合的分子为抗体、适配体、多肽、多糖或糖基。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，在底板的上表面修饰可与细胞特异性结合的分子前，还在底板的上表面修饰具有防粘附功能的聚合物。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，具有防粘附功能的聚合物通过化学反应或物理吸附的方法修饰在底板的上表面上。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，具有防粘附功能的聚合物为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基羟乙酯或两性离子聚合物。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，底板的上方设有盖板，二者共同围成微流道；盖板和底板都平行于水平面，盖板的下表面设有凹槽，凹槽的槽口由底板密封；盖板上设有至少一个入口和至少一个出口，凹槽同时与入口和出口连通。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，在细胞的上方施加磁场是通过在盖板的上表面放置永磁体实现的，永磁体位于凹槽的正上方；本发明通过调节永磁体的相对位置即可控制细胞的主要沉降区域，使细胞在磁场区域快速沉降至抗体修饰的底板面，以在底板面单向滚动的形式通过微流道，从而使表达相应抗原的细胞捕获在底板表面。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，永磁体的磁场强度≥100GS；如此可保证细胞受到向下的作用力。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，底板为玻璃板、石英板、硅片或PET板，底板的厚度小于3mm；盖板为PDMS板或PET板。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，入口通过软管与细胞悬液供液装置连通，出口通过软管与注射泵或蠕动泵连通。
如上所述的一种磁力加速的细胞分选方法，软管为硅胶管、聚偏氟乙烯管、PP管或PET管。
有益效果
(1)本发明的一种磁力加速的细胞分选方法，与流式分选和磁分选相比，无需对细胞进行预标记，不会在细胞表面造成荧光分子、磁珠等外来分子的残留；
(2)本发明的一种磁力加速的细胞分选方法，与常规微流道底板捕获相比，减少了等待细胞沉降所需的时间，可显著加快细胞分选速度和效率；
(3)本发明的一种磁力加速的细胞分选方法，利用磁力驱动细胞快速运动至底板表面，显著提高了对目的细胞与特异性结合分子的接触概率，增加了细胞捕获速度，有利于维持细胞活性，减少了因时间延长造成的非特异性黏附(非特异性黏附会降低目标细胞纯度且增加细胞洗脱难度)，有效避免了分选过程对目标细胞的后续培养和表征造成的不利影响；
(4)本发明的一种磁力加速的细胞分选方法，装置组装上更加简单易行，在实现加速细胞沉降过程中不需要特殊的外置材料或设备，并且加速沉降的效果快速而确切，符合针对微流道中流动状态的条件要求。
附图说明
图1为现有技术中基于微流道的细胞分选示意图；
图2为本发明基于微流道的细胞分选示意图；
图3为细胞受力分析示意图；其中，图中(a)为无磁力驱动情况下的细胞受力分析，图中(b)为在磁力驱动情况下的细胞受力分析；
图4为实施例1所用的分选装置侧视结构示意图；图中箭头方向为液体流动方向；
图5为实施例1相同时间内细胞捕获结果对比图；图中(a)为无磁力作用下分选表面的显微镜明场照片，图中(b)为磁力作用下分选表面的显微镜明场照片；
其中，1-入口，2-出口，3-永磁体，4-盖板，5-底板。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例中相关物质的来源：
Silane-PEG-NH2：厂商为上海芃硕生物科技有限公司，牌号为PS2-NL-5K；
EpCAM抗体溶液：厂商为Abcam(艾博抗(上海)贸易有限公司)，牌号为ab223582；
Biotin-CD147抗体溶液：厂商为Thermo Fisher(赛默飞世尔(中国)科技公司)，牌号为MA1-19511；
红细胞裂解液：厂商为北京索莱宝科技有限公司，牌号为R1010；
淋巴细胞分离液：厂商为北京索莱宝科技有限公司，牌号为P8610；
钆布醇：厂商为拜耳(中国)有限公司，牌号为GadobutrolInjection；
钆特醇：厂商为MedChemExpress(上海皓元医药股份有限公司(代理))，牌号为HY-B0933A；
钆喷酸葡胺：厂商为北京北陆药业股份有限公司，国药准字号为H10860002；
PBS缓冲液：厂商为武汉赛维尔生物科技有限公司，牌号为G4200；
TRIZOL试剂：厂商为南京诺唯赞生物科技股份有限公司，牌号为R411-01；
PDMS(聚二甲基硅氧烷)：厂商为DOWSIL(道康宁(张家港)有机硅有限公司)，牌号为SYLGARDTM 186Silicone Elastomer Kit；
核酸适配体(SYL3C)序列：5’-cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg-3’(上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并做5’端生物素修饰)；
链亲和素溶液：厂商为上海源叶生物科技有限公司，牌号S12020；
DNA酶Ⅰ：厂商为Thermo Fisher(赛默飞世尔(中国)科技公司)，牌号EP0041；
BSA(牛血清白蛋白)：厂商为Thermo Fisher(赛默飞世尔(中国)科技公司)，牌号为V900933；
硅烷偶联剂KH550：厂商为Thermo Fisher(赛默飞世尔(中国)科技公司)，牌号为A3648；
Biotin-PEG-Amine：厂商为上海芃硕生物科技有限公司，牌号为PS2-NBN-5K；
PET(聚对苯二甲酸乙二酯)：厂商为Dupont(杜邦中国集团有限公司)，牌号为FR530。
实施例1
一种磁力加速的循环肿瘤细胞分选方法，具体步骤如下：
(1)制备盖板；
如图4所示，通过3D打印PET制作盖板4，盖板4的下表面设有凹槽；盖板4上设有一个入口1和一个出口2，直径均为3mm，入口1和出口2一端都和凹槽连通；入口1的另一端用于通过硅胶管与微量进样泵连通，出口2的另一端用于通过硅胶管与注射泵或蠕动泵连通；
(2)制备底板；
如图4所示，将无水玻璃进行等离子体预处理后，使用10mg/ml的Silane-PEG-NH2溶液(溶剂为二甲苯)浸没等离子体预处理的无水玻璃表面10分钟，再依次使用丙酮、无水乙醇浸泡并使用摇床漂洗以除去二甲苯，再浸泡纯水洗去乙醇，得到表面修饰有具有防粘附功能的聚合物的底板5；
(3)如图4所示，将步骤(1)制得的盖板4与步骤(2)制得的底板5水平放置，盖板4位于底板5的上方且与其紧密贴合，二者共同围成用于分选的微流道；其中，凹槽的槽口由底板5密封；
(4)如图4所示，将长宽为15×15mm、磁场强度为1000GS的永磁体3紧贴在盖板的上表面，并使其位于凹槽的正上方，即得分选装置；
(5)分选前，使用体积浓度为0.25％的戊二醛水溶液注满分选装置内的微流道空间30分钟后立即用纯水清洗；使用PBS缓冲液稀释EpCAM抗体溶液至1μg/ml，注满微流道空间，室温反应1小时后用PBS缓冲液清洗微流道，再使用含有1％ BSA(质量浓度)的PBS缓冲液注满流道，室温静置1小时，获得抗体修饰的微流道；
(6)在收集到的外周血样本中加入红细胞裂解液，去除红细胞，得到待分选的外周血样本；
(7)在待分选的外周血样本中加入钆布醇并混合均匀得到2ml含50mM钆布醇的待分选细胞混合液，通过微量进样泵将待分选细胞混合液以0.1ml/min的流速送入分选装置；
(8)待分选细胞混合液通过微流道后保持流速不变，使用PBS缓冲液冲洗底板5min以去除未被捕获的细胞；
(9)将流速增加到1ml/min，洗脱被捕获的细胞，收集1min内流出的PBS缓冲液，离心后提取沉淀即为分选所得循环肿瘤细胞。
对于总量为2ml的待分选的去红细胞外周血样本、样本细胞密度在106ml-1以内，细胞从开始分选至获取可在30min内完成。
无磁力作用下分选表面的显微镜明场照片如图5(a)所示，磁力作用下分选表面的显微镜明场照片如图5(b)所示，图中边缘清晰的为对焦的捕获细胞，边缘模糊的为离焦的未捕获细胞，从图中看出相同作用时间内磁场作用下捕获的细胞数量明显大于无磁场作用时捕获的细胞数量，说明磁场作用能加速细胞的捕获。
实施例2
一种磁力加速的循环胚胎有核红细胞分选方法，具体步骤如下：
(1)制备盖板；
利用模板法制作PDMS盖板，盖板的下表面有长宽高为20×20×0.5mm的凹槽；盖板上设有一个入口和一个出口，直径均为3mm，入口和出口一端都和凹槽连通；入口的另一端用于通过PP管与微量进样泵连通，出口的另一端用于通过PP管与注射泵或蠕动泵连通；
(2)制备底板；
将无水玻璃进行等离子体预处理后，使用体积浓度为0.1％的硅烷偶联剂KH550溶液(溶剂为二甲苯)浸没等离子体预处理的无水玻璃表面10分钟，再依次使用丙酮、无水乙醇浸泡并使用摇床漂洗以除去二甲苯；随后用体积浓度为0.25％的戊二醛水溶液浸泡无水玻璃表面30分钟后立即用纯水清洗，清洗后，置于5mg/ml的Biotin-PEG-Amine水溶液中4h后用纯水清洗，得到表面修饰有具有防粘附功能的聚合物的底板；
(3)将步骤(1)制得的盖板与步骤(2)制得的底板水平放置，盖板位于底板的上方且与其紧密贴合，二者共同围成用于分选的微流道；其中，凹槽的槽口由底板密封；
(4)将长宽为25×25mm、磁场强度为1500GS的永磁体紧贴在盖板的上表面，并使其位于凹槽的正上方，即得分选装置；
(5)分选前，用含有1％ BSA(质量浓度)的PBS缓冲液稀释链亲和素溶液至10μg/ml，注满微流道空间，室温反应1小时后用PBS缓冲液冲洗；用含有1％ BSA(质量浓度)的PBS缓冲液稀释Biotin-CD147抗体溶液至1μg/ml，注满微流道空间，室温反应1小时后用PBS缓冲液冲洗，获得抗体修饰的微流道；
(6)将外周血样(临床收集的常规EDTA抗凝血样)和PBS缓冲液按体积比1:1稀释后，加入盛有淋巴细胞分离液的离心管进行离心处理，去除上层血清后，收集中间层的单核细胞层，重悬于含有1％ BSA的PBS缓冲液，调整细胞密度至105ml-1-106ml-1，即为待分选的细胞悬液；
(7)向待分选的细胞悬液中加入钆喷酸葡胺并混合均匀得到5ml含50mM钆喷酸葡胺的待分选细胞混合液，通过微量进样泵将待分选细胞混合液以0.5ml/min的流速吸入分选装置；
(8)待分选细胞混合液通过微流道后保持流速不变，使用PBS缓冲液冲洗分选装置底壁3min，以去除未被捕获的细胞；
(9)向微流道中注入TRIZOL试剂，将被捕获的细胞裂解，收集裂解液。
对于临床收集的常规EDTA抗凝血样所得的待分选的细胞悬液，本实施例可在30min内完成分选捕获目的细胞1-10个，并提取目的细胞的核酸用于分析或诊断。
实施例3
一种磁力加速的循环胚胎细胞分选方法，具体步骤如下：
(1)制备盖板；
利用模板法制作PDMS盖板，盖板的下表面有长宽高为30×15×0.5mm的凹槽；盖板上设有一个入口和一个出口，直径均为3mm，入口和出口一端都和凹槽连通；入口的另一端用于通过PTFE管与微量进样泵连通，出口的另一端用于通过PTFE管与注射泵或蠕动泵连通；
(2)制备底板；
将无水玻璃进行等离子体预处理后，使用体积浓度为0.1％的硅烷偶联剂KH550溶液(溶剂为二甲苯)浸没等离子体预处理的无水玻璃表面10分钟，再依次使用丙酮、无水乙醇浸泡并使用摇床漂洗以除去二甲苯，随后用体积浓度为0.25％的戊二醛水溶液浸泡无水玻璃表面30分钟后立即用纯水清洗，置于5mg/ml的Biotin-PEG-Amine水溶液中反应4h后用纯水清洗，得到表面修饰有具有防粘附功能的聚合物的底板；
(3)将步骤(1)制得的盖板与步骤(2)制得的底板水平放置，盖板位于底板的上方且与其紧密贴合，二者共同围成用于分选的微流道；其中，凹槽的槽口由底板密封；
(4)将长宽为40×20mm、磁场强度为1500GS的永磁体紧贴在盖板的上表面，并使其位于凹槽的正上方，即得分选装置；
(5)分选前，用含1％BSA的超纯水稀释链亲和素溶液至10μg/ml，注满微流道空间，室温反应1小时后超纯水冲洗；将生物素修饰的核酸适配体(SYL3C)以200μM的浓度溶解于超纯水后，注满微流道空间，室温反应1小时后用PBS缓冲液洗去，即获得适配体修饰的微流道；
(6)在外周血样(临床收集的EDTA抗凝血样)本中加入红细胞裂解液，去除红细胞，离心后将细胞重悬于含1％BSA(质量浓度)的PBS缓冲液，并调整细胞密度至106ml-1，得到待分选的外周血样本；
(7)向待分选的外周血样本细胞悬液中加入钆特醇并混合均匀得到5ml含50mM钆特醇的待分选细胞混合液，通过微量进样泵将待分选细胞混合液以0.5ml/min的流速吸入分选装置；
(8)待分选细胞混合液通过微流道后保持流速不变，使用PBS缓冲液冲洗分选装置底壁5min以去除未被捕获的细胞；
(9)使用含1mg/ml DNA酶Ⅰ的PBS缓冲液以0.5ml/min的流速通过分选装置，室温灌注微流道后，37度反应5min，吸出微流道内液体，300g离心5分钟即获得目的细胞。
对于临床收集的EDTA抗凝血样所得的待分选的细胞悬液，本实施例可在30min内完成分选、捕获活率良好的目的细胞2-20个，用于形态功能分析，或其他分子生物学诊断。

Claims (10)

1.一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性后，在细胞的上方施加磁场以对细胞施加向下的作用力，与细胞向下的重力同时作用，驱动细胞沉降至上表面修饰有可与细胞特异性结合的分子的底板上。
2.根据权利要求1所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，在保留细胞自身的抗磁性和活性的前提下，调整细胞悬液中的液体为顺磁性是通过向细胞悬液中的液体中加入顺磁剂实现的；
顺磁剂为投入临床应用的钆的大分子络合物；加入顺磁剂后，细胞悬液中的液体中顺磁剂的浓度为10-150mM。
3.根据权利要求1所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，细胞悬液呈流动状态，流速为0.01-10ml/min。
4.根据权利要求3所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，细胞悬液流过底板后，采用缓冲液I冲洗底板，以去除未被捕获的细胞。
5.根据权利要求4所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，采用缓冲液I冲洗底板后，还采用缓冲液II或缓冲液III冲洗底板，以洗脱被捕获的细胞；缓冲液II同缓冲液I，且缓冲液II的流速为缓冲液I的流速的1.2倍以上；缓冲液III相对于缓冲液I增加了酶或表面活性剂，且缓冲液III的流速同缓冲液I；或者，采用缓冲液I冲洗底板后，还采用细胞裂解液冲洗底板。
6.根据权利要求1所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，可与细胞特异性结合的分子通过化学反应或物理吸附的方法修饰在底板的上表面上。
7.根据权利要求1所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，在底板的上表面修饰可与细胞特异性结合的分子前，还在底板的上表面修饰具有防粘附功能的聚合物；具有防粘附功能的聚合物通过化学反应或物理吸附的方法修饰在底板的上表面上。
8.根据权利要求1所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，底板的上方设有盖板，二者共同围成微流道；盖板和底板都平行于水平面，盖板的下表面设有凹槽，凹槽的槽口由底板密封；盖板上设有至少一个入口和至少一个出口，凹槽同时与入口和出口连通。
9.根据权利要求8所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，在细胞的上方施加磁场是通过在盖板的上表面放置永磁体实现的，永磁体位于凹槽的正上方。
10.根据权利要求9所述的一种磁力加速的细胞分选方法，其特征在于，永磁体的磁场强度≥100GS。
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