CN116730891A - 马齿苋中两种新生物碱类化合物及其提取分离方法 - Google Patents

马齿苋中两种新生物碱类化合物及其提取分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋中提取、分离和鉴别出的两种新生物碱类化合物及其提取分离方法。所述的生物碱类化合物，分子式分别为C15H25NO6和C9H15NO，分别命名为(Z)‑2‑((1‑(1H‑azirin‑1‑yl)‑5‑methylhex‑1‑en‑3‑yl)oxy)‑6‑(hydroxymethyl)tetrahydro‑2H‑pyran‑3,4,5‑triol和(Z)‑1‑(1H‑azirin‑1‑yl)‑5‑methylhex‑1‑en‑3‑ol。还提供上述两种新生物碱类化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔树脂柱层析、ODS中压柱、Sephadex LH‑20及HPLC进行分离纯化与制备。成功的提取分离出两种新生物碱类化合物。其结构由碳谱，氢谱及二维核磁波谱解析的方法确定。两个化合物具有潜在的抗炎活性和抗胆碱酯酶活性，并提供制备方法，为开发新药和开发新成分提供先导物和理论依据。

Description

马齿苋中两种新生物碱类化合物及其提取分离方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的一种新生物碱类化合物及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋（Portulaca oleraceaL.），又名长命菜、马苋菜，为马齿苋科植物。马齿苋性喜肥沃土壤，耐旱亦耐涝，生命力强，分布广泛，资源丰富，而以我国东北部的更为常见。马齿苋既可入药，又可食用，是我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
现代药理学研究表明，马齿苋具有降血脂、降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、松弛或兴奋平滑肌及增强免疫力等功效。研究表明马齿苋中所含多种化学成分与其多样的药理作用息息相关，其主要化学成分包括：黄酮类、生物碱类、萜类、香豆素类、有机酸类、挥发油、多糖、氨基酸、各种色素类和矿物质类等。其中生物碱是马齿苋中的一大类活性成分，目前已报道的生物碱类成分有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A-I、K、L、N-S。
目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和研究其活性是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供马齿苋中提取的一种新天然产物，经研究发现本发明的一种新天然产物具有抗炎和抗胆碱酯酶的作用，同时提供一种针对本发明新天然产物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
为实现本发明的上述目的，本发明提供两种新生物碱类化合物，分子式分别为C15H25NO6和C9H15NO，并分别命名为(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol，化学结构式分别为：
。
为实现本发明的上述目的，本发明还提供马齿苋中两种新生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取两次，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上AB-8大孔树脂，其中大孔树脂16-60目，采用乙醇-水梯度洗脱，20%乙醇部分浓缩蒸干后得浓缩物备用；
步骤3、将步骤2中所得浓缩物经预处理的ODS柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料）层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤4、将步骤2中所得浓缩物再经预处理的ODS柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料）层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇-水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤5、将步骤3中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析分离，用10%甲醇等度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC（高效液相）分离制备，以甲醇-0.1%甲酸水为流动相进行等度洗脱，最终得到本发明所述的两种新生物碱。
所述ODS的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡。
所述Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明中所述马齿苋中两种新生物碱的分离和药理活性研究未被发现有论文期刊所报道；本发明提供来源于马齿苋的两种新生物碱类化合物及一种针对本发明化合物的提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔树脂柱、ODS中压柱、Sephadex LH-20及HPLC进行分离纯化与制备，从马齿苋中提取分离出两种新生物碱，该方法操作步骤仅为六步，操作方法简便及快速，提取分离过程主要采用水煎煮，工艺方法环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高均大于90%，此外经研究表明以上化合物具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明两种新生物碱类化合物及其盐和衍生物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，亦可用于制备抗炎和抗胆碱酯酶的药物。
附图说明
图1为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的1H-NMR光谱图。
图2为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的1H-NMR光谱图局部放大图。
图3为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的1H-NMR光谱图局部放大图。
图4为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的13C-NMR光谱图。
图5为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的DEPT光谱图。
图6为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的HMBC光谱图。
图7为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的HSQC光谱图。
图8为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的1H-1HCOSY光谱图。
图9为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的ROESY光谱图。
图10为本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的高分辨质谱图。
图11为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的1H-NMR光谱图。
图12为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的1H-NMR光谱图局部放大图。
图13为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的1H-NMR光谱图局部放大图。
图14为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的13C-NMR光谱图。
图15为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的DEPT光谱图。
图16为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的HMBC光谱图。
图17为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的HSQC光谱图。
图18为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的1H-1HCOSY光谱图。
图19为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的ROESY光谱图。
图20为本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1。
本发明提供一种新生物碱类化合物，分子式为C15H25NO6，命名为(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol，化学结构式为：
。
所述新生物碱类化合物，根据结构命名为(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol，表1为该生物碱化合物的核磁数据：1H-NMR与13C-NMR在DMSO中。
表1：本发明生物碱类化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的核磁数据
。
本发明生物碱化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的结构鉴定与推导。
得到的化合物为黄色油状物质，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。分子量为314.1608。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点显橘黄色，提示该化合物为生物碱成分。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C15H25NO6，不饱和度为4。
13C-NMR谱、HMBC谱和DEPT谱显示15个碳信号，分别为2个CH3（δC22.65，21.10），2个CH2（δC63.06，40.74)，11个CH（δC135.02，132.69，131.65，127.78，100.15，77.08，72.48，70.56，70.21，68.15，24.54）。在1H NMR谱中，δH0.89（d，J=6.54Hz），δH0.83（d，J=6.60Hz）证明两个甲基的存在。δH3.27（s），δH2.08（m）证明2个亚甲基的存在。δH8.64（d，J=4.08），8.56（d，J=5.04）δH7.90（d，J=7.86），δH7.88（t，J=5.70），δH5.25（d，J=5.16），δH7.26（t，J=7.44Hz）证明11个次甲基存在。
通过13C-NMR谱图可以看出C-2（δC132.69），C-3（δC131.65）和C-4（δC135.02）具有低场化学位移，根据δH8.64（d，1 H），δH7.90（d，1H）和δH8.56（d，1H）处的信号，可以说明C-2，C-3，C-4和与N原子相连，且在HMBC光谱中，C-4（δC135.02）与H-2（δH8.64），H-3（δH7.90），H-6（δH5.25）相关，证明存在一个含N的三元杂环。C-6（δH72.48）具有低场化学位移，说明C-6与O原子相连。根据HMBC的相关性可知，C5（δC127.78）与H-4（δH8.56）相关。C-7（δC40.72）与H-6（δH5.25），H-9（δH0.89），H-10（δH0.83）相关。根据C-1´（δC100.15）与H-3´（δH3.04），H-5´（δH3.06）、C-2´（δC100.15）与H-4´（δH3.12）、C-3´（δC70.56）与H-5´（δH3.06）、C-4´（δC77.08）与H-2´（δH3.51），H-6´（δH3.27）的HMBC相关性，证明该结构中存在一个葡萄糖。
根据以上信息，可以确定此化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol的结构。
本发明提供一种新生物碱类化合物，分子式为C9H15NO，命名为(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol，化学结构式为：
。
所述新生物碱类化合物，根据结构命名为(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol，表2为该生物碱化合物的核磁数据：1H-NMR与13C-NMR在DMSO中。
表2：本发明生物碱类化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的核磁数据
。
本发明生物碱化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的结构鉴定与推导。
得到的化合物为黄色油状物质，易溶于甲醇，不溶、微溶于水。分子量为152.1080。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点显橘黄色，提示该化合物为生物碱成分。结合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT数据，推测该化合物可能的分子式为C9H15NO，不饱和度为3。
13C-NMR谱、HMBC谱和DEPT谱显示9个碳信号，分别为2个CH3（δC22.82，21.31），1个CH2（δC41.43)，6个CH（δC134.29，132.67，131.60，127.54,73.69， 24.76）。在1H-NMR谱中，δH0.79（d，J=5.52Hz），δH0.73（d，J=5.64Hz）证明两个甲基的存在。δH1.97（s）证明个亚甲基的存在。δH8.52（s），8.37（s），δH7.72（s），δH7.71（s），δH4.99（s），δH1.07（s）证明6个次甲基存在。
通过13C-NMR谱图可以看出C-2（δC132.6，7），C-3（δC131.60）和C-4（δC134.29）具有低场化学位移，根据δH8.52（s，1H），δH7.72（s，1H）和δH8.37（s，1H）处的信号，可以说明C-2，C-3，C-4和与N原子相连。在HMBC光谱中，C-3与H-2（δH8.52），H-4（δH8.36）相关。C-4（δC135.02）与H-2（δH8.52），H-3（δH7.72），H-5（δH7.71）相关，证明存在一个含N的三元杂环。C-6（δH72.48）具有低场化学位移，说明C-6与羟基相连。根据HMBC的相关性可知，C-6（δC72.48）与H-4（δH8.36）相关。C-7（δC40.72）与H-5（δH7,71），H-9（δH0.79），H-10（δH0.73）相关。
根据以上信息，可以确定此化合物(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的结构。
本发明还提供上述两种新生物碱类化合物的提取分离方法，具体步骤为。
步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用水煎煮提取，水用量为药材的10倍，每次煎煮2h，提取液滤过，合并滤液，100℃加热浓缩至23kg，放凉至室温，得药液备用。
步骤2：将步骤1中药液蒸干后上AB-8大孔树脂，其中大孔树脂16-60目，采用乙醇-水（0/100，20/80，40/60，60/40，v/v）梯度洗脱，20%乙醇部分浓缩蒸干，得浓缩物备用。
步骤3：将步骤2中所得浓缩物经预处理的ODS中压柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料）层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇-水（0/100，5/95，10/90，20/80，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v）梯度洗脱，得到16个洗脱部位（即共得到16个瓶，每瓶500mL），经薄层色谱进行检测，显色，将20%（体积分数）甲醇显色部位合并减压浓缩至干，得浓缩物备用。
步骤4：将步骤3中所得浓缩物再经预处理的ODS中压柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料）层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇-水（20/80，40/60，60/40，80/20，v/v）梯度洗脱，得到21个洗脱部位（即梯度洗脱得21个瓶，每瓶200mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色11部位保留，50℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤5：将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析分离，用10%甲醇等度洗脱，得到15个洗脱部位（即等度洗脱得15个瓶，每瓶30mL），经薄层色谱进行检测，显色，将显色6、8部位于65℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤6：将步骤5中所得浓缩物通过HPLC（高效液相）分离制备，以甲醇-0.1%甲酸水（30/70，v/v）为流动相进行等度洗脱，检测波长为210nm和254nm，分离制备得到本发明所述的(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol，归一化法测定纯度为90～99％；以甲醇-0.1%甲酸水（20/80，v/v）为流动相进行等度洗脱，检测波长为210nm和254nm，分离制备得到本发明所述的(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol，归一化法测定纯度为90～99％。
所述ODS和Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以初始流动相平衡。
实施例2本发明生物碱化合物的抗炎作用。
1、主要材料。
1.1 药品和试剂：实验所用的化合物由上述方法制备，纯度为99%，精密称取，用DMSO稀释至下述各剂量组所需溶液。DMEM高糖培养基、胎牛血清（美国Hyclone公司）；青霉素、链霉素（杭州四季青公司）；LPS（美国Sigma公司）；IL-1β和TNF-α的ELISA试剂盒（美国Cayman公司）；细胞裂解液（碧云天生物技术有限公司）。
1.2 细胞株：RAW 264.7巨噬细胞（美国ATCC细胞库）。
1.3 分组：对照组、LPS组和实验组，各一组。
2 实验方法。
2.1 细胞培养，DMEM高糖培养基，加入10%的胎牛血清，l%抗菌素（100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素），置于37℃，5%CO2培养箱中培养。
2.2 MTT比色法测定细胞活力：RAW 264.7细胞系在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）和抗生素（100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的DMEM中在37℃和5%CO2的湿化培养箱中培养。通过3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）测定法评估细胞活力。然后将RAW264.7细胞以1×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，随后在有或没有各种浓度（5、10、25、50和100μM）的新化合物的情况下在培养箱中预孵育1小时，然后加入1μg/mL LPS孵育24小时。处理后除去培养基并与5mg/mL MTT溶液在37℃下孵育4小时。弃去上清液，将甲臜溶解在150μL DMSO中。使用BIO-TEK酶标仪在570nm处检测吸光度值，而未处理组的吸光度为100%。
2.3 ELISA法测定炎症因子IL-1β和TNF-α：将对数生长期RAW264.7巨噬细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为1×105个/mL，每孔1mL，温度37℃，5%CO2条件下培养过夜，实验组加入本发明的新化合物（1μM～20μM），培育1h后，在每孔加入LPS（终浓度为1μg/mL），共孵育24h，每组处理重复3孔。ELISA法测定该马齿苋来源新化合物处理后的RAW264.7巨噬细胞分泌的IL-1β和TNF-α的含量。
3实验结果。
实验结果表明本发明两种新生物碱化合物对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7的增殖无影响，安全无毒；并可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7所产生过量炎症细胞因子IL-1β和TNF-α，且呈浓度依赖。
细胞相对存活率实验结果如表3所示。
表3：本发明对RAW264.7巨噬细胞相对存活率的影响
注：*P<0.05与对照组比较（高浓度组有显著性差异）。
ELISA法测定炎症因子IL-1β和TNF-α结果如表4所示。
表4：本发明对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的IL-1β和TNF-α含量的影响（均数±标准差，n=3）
注：*P<0.05与对照组比较，#P<0.05与LPS组比较。
本发明生物碱类化合物的抗胆碱酯酶作用。
1 主要材料。
1.1 药品和试剂：实验所用生物碱类化合物由上述方法制备，纯度为90%～99%，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司），毒扁豆碱（瀚香生物科技），磷5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，上海金穗生物科技有限公司），乙酰胆碱酯酶（AChE）和碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide，ATCI，大连美仑生物技术有限公司）。
1.2 分组：分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，各一组。
2 实验方法。
2.1 样品准备，分别精密称取样品和毒扁豆碱1mg，分别以甲醇为溶剂，配置成lmg/mL、0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL的五个梯度浓度。分别精密称取7.098g的磷酸二氢钠和5.999g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至50mL，取3.40mL的磷酸二氢钠和46.6mL的磷酸氢二钠，配制成50mL的PBS（0.1M，pH=8.0）；精密称取0.0594g的DTNB，加入10mL的PBS，配制成DTNB溶液(15mmol/L)；精密称取0.01g的AChE，加入10mL的PBS，配制成AChE溶液（0.2U/mL）；精密称取0.044gATCI，用蒸馏水定容至10mL，配制成ATCI溶液（15mmol/L）。
2.2 改进的Ellman方法测定抗胆碱酯酶活性，在96孔酶标板中依次加入140μL的PBS（0.1M，pH=8.0），10μL的DTNB（15mmol/L），15μL的AChE（0.2U/mL），20μL样品溶液。阴性对照组实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10μL的ATCI（15mmol/L）。20℃孵育10min后，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值。
根据下式计算抑制率：抑制率（%）=（空白组－样品）/空白组×100%。
3 实验结果。
实验结果表明本发明有抗胆碱酯酶作用。
实验结果如表5所示。
表5：本发明抗胆碱酯酶抑制活性
。
综上所述，本发明提供两种新生物碱化合物及其提取分离方法，依次采用水煎煮提取、大孔树脂层析、ODS柱层析、Sephadex LH-20及HPLC进行分离纯化与制备，成功的从马齿苋中分离得到两个化合物。该方法简便、快速、环保，且经该方法分离得到的化合物纯度较高。由于所得化合物化学结构独特，从常用中药马齿苋中提取出来，其具有抗炎和抗胆碱酯酶作用，因此本发明的两个新化合物(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol及其盐和衍生物可以作为天然产物开发中药新药，具有广阔的前景。

Claims (10)

1.从马齿苋药材中分离出的两种生物碱类化合物，其特征在于，分子式分别为：C15H25NO6和C9H15NO，根据结构分别命名为(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol，其化学结构式如下：
。
2.如权利要求1所述的化合物的提取分离方法，其特征在于，具体步骤为：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液滤过，合并滤液直接加热浓缩，放凉至室温，得药液备用；
步骤2、将步骤1中药液蒸干后上AB-8大孔树脂柱，用乙醇∶水洗脱，将20%乙醇部分浓缩蒸干，得浓缩物备用；
步骤3、将步骤2中所得物经预处理的ODS中压柱层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇∶水梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤4、将步骤3中所得物经ODS中压柱层析分离，填料粒度为40～70μm，用甲醇∶水进行梯度洗脱，得到若干洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将显色部位减压浓缩至干，得到浓缩物备用；
步骤5、将步骤4中所得浓缩物经预处理的Sephadex LH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）层析分离，用10%甲醇等度洗脱，经薄层色谱进行检测，显色，将显色的洗脱部位6、8分别减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物通过HPLC（高效液相）分离制备，以甲醇∶0.1%甲酸水为流动相进行等度洗脱，最终得到所述的两种生物碱类化合物。
3.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤1中水煎煮提取两次，每次煎煮2小时，水用量为药材的10倍。
4.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中大孔树脂柱层析分离用体积比为0∶100、20∶80、40∶60和60∶40的乙醇∶水进行梯度洗脱。
5.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中ODS中压柱层析分离用体积比为0:100、5∶95、10∶90、20∶80、30∶70、50∶50、70∶30、100:0的甲醇∶水进行梯度洗脱；加压，使流速为1mL/min，温度为室温，其中填料粒度为40～70μm。
6.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中的ODS中压柱层析分离用体积比为20∶80、40∶60、60∶40和80∶20的甲醇∶水进行梯度洗脱；加压，使流速为1mL/min，温度为室温，其中填料粒度为40～70μm。
7.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤5中的Sephadex LH-20凝胶的预处理过程为甲醇浸泡过24小时，上柱，以10%甲醇为初始流动相平衡，所用流动相洗脱程序为等度洗脱。
8.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤6中所用甲醇∶0.1%甲酸水等度洗脱，其中甲醇和水的体积比为30∶70，得到(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol化合物。
9.如权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤6中所用甲醇∶0.1%甲酸水等度洗脱，其中甲醇和水的体积比为20∶80，得到(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol化合物。
10.一种如权利要求1所述的(Z)-2-((1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-yl)oxy)-6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H-pyran-3,4,5-triol和(Z)-1-(1H-azirin-1-yl)-5-methylhex-1-en-3-ol的化合物在制备抗炎和抗胆碱酯酶药物或保健品中的应用。
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