CN116726069A - 广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。同时提供了一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料，该功能性饲料包含质量体积比为5～15μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料。利用上述功能性饲料饲喂鱼类时，能够有效减轻无乳链球菌引起的病理损伤，增强鱼类的免疫力和抗氧化能力，同时还能促进鱼类的进食和消化，提高饲料利用率，进而提高罗非鱼的产量；并且该功能性饲料所含的广藿香挥发油易代谢，在生物体内不易产生耐药性，也不会产生环境污染，在防治无乳链球菌病的同时，符合现代水产养殖无公害可持续发展的要求。

Description

广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高 鱼类增重率的药物中的应用
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，具体地，涉及一种广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。
背景技术
广藿香(Pogostemon cablin(Blanco)Benth)为唇形科刺蕊草属植物，以干燥第四部分入药，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑之功效，是著名的“十大南药”之一，被历代医家视为暑湿时令之要药，是“藿香正气丸”、“抗病毒口服液”等30多种中成药的重要原料。广藿香挥发油(Patchouli oil，PO)为广藿香提取的挥发油混合物，具有抗细菌、抗真菌、抗疟原虫、抗植物病原真菌、调节胃肠运动功能、促进消化液分泌、保护肠道屏障功能和免疫调节等药理活性。
罗非鱼(Oreochromis niloticus)是一种原产于中东和非洲的慈鲷科鱼类的统称，目前已经成为仅次于鲤鱼的第二大水产养殖鱼类，罗非鱼品种繁多，目前主要养殖品种是吉富罗非鱼、奥尼罗非鱼和红罗非鱼；2010年，全球罗非鱼产量超过350万吨，2017罗非鱼年产量达到659万吨。
罗非鱼无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，SA)感染是水产养殖中常见的流行性疾病，由于具有很强的环境适应性和宿主交叉感染，能对各种海水和淡水养殖鱼类产生严重危害。无乳链球菌目前是罗非鱼感染的主要病原菌，能够引起罗非鱼短期内大量死亡，造成极大的经济损失，严重危害了养殖业的健康发展，其已成为罗非鱼养殖业最严重的的危险，每年因无乳链球菌病造成的经济损失超过1.5亿美元。目前，防治无乳链球菌病多使用化学药物，如抗生素等，在单个鱼类物种群体中，罗非鱼抗菌素消费量占全球鱼类的抗菌素消费量的3.4％，仅次于鲶鱼(8.3％)，使用抗生素治疗虽然方便且见效快，但是容易产生耐药性，引起环境污染，并且饲喂抗生素的罗非鱼中也会出现药物残留等问题。
中药材具有安全、有效、稳定、可控的特点，中草药是天然物质，保持了各种成分的自然性和生物活性，其成分容易被吸收利用，在体外能被细菌等分解，不会污染环境；中草药免疫活性物质能够增强机体免疫机能，提高动物抗病能力，改善动物生长性能，且具有无残留、不易产生耐药性的优点。
因此，目前急需一种能够添加到鱼类基础饲料中用于防治无乳链球菌病的中草药，在防治无乳链球菌病的同时还不易产生耐药性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。
本发明的第一目的是提供广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。
本发明的第二目的是提供一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料。
本发明的第三目的是提供上述饲料在提高鱼类增重率中的应用。
本发明的第四目的是提供一种提高鱼类增重率的方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。
优选地，所述鱼类为罗非鱼。
更优选地，所述罗非鱼为吉富罗非鱼。
优选地，所述药物为鱼类饲料。
一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料，所述功能性饲料包含质量体积比为5～15μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料。
功能性饲料包含质量体积比为15μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料时，饲喂的鱼类的鱼肠组织的抗氧化能力最强，防治无乳链球菌病的效果最优；功能性饲料包含质量体积比为5μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料时，鱼类每日进食量最大，显著促进鱼类的生长，在提高鱼类增重率的同时还能防治无乳链球菌病。
优选地，所述功能性饲料包含质量体积比为5μL：1g的广藿香挥发油和鱼类基础饲料。
本发明还请求保护上述功能性饲料在提高鱼类增重率中的应用。
一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料的制备方法，包括以下步骤：
将广藿香挥发油与水充分混合，接着按照广藿香挥发油和鱼饲料体积质量比为5～15μL：1g充分混合，即得。
优选地，所述广藿香挥发油和鱼饲料的体积质量比为5μL：1g。
一种提高鱼类增重率的方法，具体为：利用上述功能性饲料饲喂鱼类。
优选地，按照鱼类体重1～4％的饲料质量进行饲喂。
更优选地，按照鱼类体重2％的饲料质量进行饲喂。
更优选地，所述鱼类为罗非鱼。
进一步优选地，所述罗非鱼为吉富罗非鱼。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。同时提供了一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料，该功能性饲料包含质量体积比为5～15μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料。利用上述功能性饲料饲喂鱼类时，能够有效减轻无乳链球菌引起的病理损伤，增强鱼类的免疫力和抗氧化能力，同时还能促进鱼类的进食和消化，提高饲料利用率，进而提高罗非鱼的增重率；并且该饲料所含的广藿香挥发油易代谢，在生物体内不易产生耐药性，也不会产生环境污染，在防治无乳链球菌病的同时，符合现代水产养殖无公害可持续发展的要求。
附图说明
图1为罗非鱼感染无乳链球菌后的生存曲线图；A为无乳链球菌在LD50浓度下罗非鱼的生存曲线图，B为无乳链球菌在10倍在LD50浓度下罗非鱼的生存曲线图；
图2为培养12h的罗非鱼肠组织的检测结果图；
图3为培养60h的罗非鱼肠组织的检测结果图；
图4为罗非鱼肠组织病理结构切片图；
图5为无乳链球菌处理后罗非鱼免疫相关基因的检测结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
广藿香挥发油：购自广州晶晶生物科技有限公司；
丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法，A003-1-2)；总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法，A001-1-1)；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(A005-1-2)；总蛋白(TP)测定试剂盒(带标准：考马斯亮蓝法)，A045-2-2；均购自南京建成生物科技有限公司；
TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂盒，购自广州创伟生物科技有限公司；
SYBR green荧光染料，购自广州东盛生物科技有限公司；
罗非鱼鱼苗购自台山市康良水产养殖有限公司。
鱼类基础饲料购自广东京基智农科技有限公司。
本发明实施例中罗非鱼饲料的浓度单位“μL/g”代表：每1g罗非鱼饲料中所添加的广藿香挥发油的体积。
实施例1一种罗非鱼饲料的制备及其对罗非鱼重量的影响
1、实验方法
(1)罗非鱼饲料的制备
将500μL广藿香挥发油加入9.5mL纯水中，摇匀混合后得到广藿香挥发油乳浊液，将广藿香挥发油乳浊液均匀喷洒于200g鱼类基础饲料，充分混合后得到5μL/g的罗非鱼饲料1，密封冷藏于4℃，备用。
将1.5mL广藿香挥发油加入8.5mL纯水中，摇匀混合后得到广藿香挥发油乳浊液，将广藿香挥发油乳浊液均匀喷洒于200g鱼类基础饲料，充分混合后得到15μL/g的罗非鱼饲料2，密封冷藏于4℃，备用。
(2)罗非鱼饲料对重量的影响
挑选健康活泼、体长体重规格基本一致，初始平均体重约为(15.97±3.76)g的168尾罗非鱼，随机平均分为3组，分别为CK组(饲喂鱼类基础饲料)、PO5组(饲喂罗非鱼饲料1)和PO15组(饲喂罗非鱼饲料2)。
以PO5组为例，具体饲喂方式如下：
将PO5组罗非鱼饲养在1T循环水箱中，水温维持在25～28℃，pH为7.0～7.5，水中溶氧量保持＞5mg/L；按照组内罗非鱼总体重的2％的饲料质量，在每天早上9点和每天下午18点分别饲喂罗非鱼，饲喂30min后，记录饲料损耗量并打捞出未进食饲料，连续饲养28天。
饲养28天后，禁食24h测定罗非鱼的重量，并计算生长性能，包括：增重率(weightgain rate，WGR)、日均增重(Average daily gain weight，ADG)、特定生长率(Specificgrowth rate，SGR)、饲料转化率(Feed conversion rate，FCR)和每日饲料耗损率(DailyFeed loss rate，FLR)；随机选取组内6尾罗非鱼，测量肥满度(Condition facter，CF)、肝体比(Hepatobody ratio，HBR)和脏体比(Viscerobody ratio，VBR)。
上述所有生长性能测试结果均取平均值作为结果，具体计算公式如下：
WGR＝[最终体重(g)-初始体重(g)]/初始体重(g)；
ADG＝[最终体重(g)-初始体重(g)]/喂食天数；
SGR＝([ln(终末平均体重)-ln(平均初始体重)]/天数)×100；
FCR＝[终末总重(g)-初始总重(g)]/[投饲总量(g)-饲料耗损量(g)]；
FLR＝每日饲料耗损量/每日饲料量×100；
CF＝最终体重(g)/[最终体长(cm)]3；
HBR＝[肝脏重量(g)/最终体重(g)]×100％；
VBR＝[内脏重量(g)/最终体重(g)]×100％。
对CK组和PO15组进行同等处理，并计算相应生长性能。
2、实验结果
各组罗非鱼的生长性能如表1所示。
表1各组罗非鱼的生长性能
其中，a，b，c代表不同组间存在显著差异，p＜0.05。
结果显示：与CK组相比，饲喂罗非鱼饲料1的PO5组的增重率、日均增重、特定生长率、肝体比和脏体比均增高，并且每日饲料耗损率显著降低，饲料转化率较高；说明使用罗非鱼饲料1饲喂罗非鱼，能够增加罗非鱼的进食量和体重，进而增加罗非鱼的产量。
实施例2罗非鱼饲料对无乳链球菌感染后罗非鱼存活率的影响
1、实验方法
(1)无乳链球菌在LD50浓度下罗非鱼的存活率测试
选取45尾体重在(70.60±20.17)g的罗非鱼，平均分为3组，分别为对照组CK-M组(饲喂鱼类基础饲料)、SP5-M组(饲喂罗非鱼饲料1)和SP15-M组(饲喂罗非鱼饲料2)，每组饲养7天后，将400μL的LD50＝1.35×108CFU/mL的无乳链球菌溶液腹腔注射到各组罗非鱼体内，保持水温32℃，持续培养14天，各组饲喂对应的饲料，并且每日记录罗非鱼生存状态和死亡数目，绘制罗非鱼生存曲线图。
(2)无乳链球菌在10倍LD50浓度下罗非鱼的存活率测试
选取60尾体重在50g的罗非鱼，平均分为4组，分别为NC-H组(饲喂鱼类基础饲料)、CK-H组(饲喂鱼类基础饲料)、SP5-H组(饲喂罗非鱼饲料1)和SP15-H组(饲喂罗非鱼饲料2)，各组饲养28天后，NC-H组罗非鱼腹腔注射200μL的PBS溶液；CK-H组、SP5-H组和SP15-H组罗非鱼腹腔注射200μL浓度为2.54×107CFU/mL的无乳链球菌溶液(LD50＝2.54×106CFU/mL)，保持水温29℃，持续培养14天，各组饲喂对应的饲料，并且每日记录罗非鱼生存状态和死亡数目，绘制罗非鱼生存曲线图。
2、实验结果
无论是LD50浓度下的无乳链球菌或者10倍LD50浓度下的无乳链球菌感染的罗非鱼，均表现出腹部水肿、肝脾肿大、肠内积液、眼球突出伴白膜、来回游动以及神经功能障碍，符合罗非鱼感染后典型性状。
无乳链球菌在LD50浓度下罗非鱼的生存曲线图如图1A所示，结果显示：SP5-M组的罗非鱼累积死亡率为0.67％，相较于对照组CK-M组(46.67％)显著降低(P＜0.01)；SP15-M的死亡率为33.33％，也显著低于对照组CK-M组的死亡率。
无乳链球菌在10倍在LD50浓度下罗非鱼的生存曲线图如图1B所示，结果显示：SP5-H组的罗非鱼中位生存时间相较于CK-H组显著延长了一天(P＜0.05)；与CK-H组的累积死亡率(95％)相比，SP15-H组的累积死亡率(45％)显著较低。
结果说明：罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2能够显著降低罗非鱼感染无乳链球菌后的死亡率，提高罗非鱼抗无乳链球菌感染的能力。
实施例3罗非鱼饲料对罗非鱼抗氧化能力的影响
1、实验方法
按照实施例1步骤1(2)所述方法饲喂罗非鱼，得到CK组(饲喂鱼类基础饲料)、PO5组(饲喂罗非鱼饲料1)和PO15组(饲喂罗非鱼饲料2)。
饲喂28天后，进行攻毒实验，以CK组为例，具体如下：
随机挑选44尾CK组的罗非鱼，平均分为2组，记为CK1组(阴性对照组)和CK2组(阳性对照组)，其中CK1组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL的PBS溶液；CK2组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)。
将CK1组罗非鱼养于400L水箱中，水箱中水温维持在29～29.5℃，pH控制在7.0～7.5，溶氧量保持＞5mg/L，在培养12h和60h后分别选取9尾罗非鱼麻醉，并采集相应的培养12h罗非鱼肠组织1和培养60h罗非鱼肠组织1。
将CK2组罗非鱼养于400L水箱中，水箱中水温维持在29～29.5℃，pH控制在7.0～7.5，溶氧量保持＞5mg/L，在培养12h和60h后分别选取9尾罗非鱼麻醉，并采集相应的培养12h罗非鱼肠组织2和培养60h罗非鱼肠组织2。
采用丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法，A003-1-2)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法，A001-1-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(A005-1-2)，按照试剂盒说明书测定罗非鱼肠组织的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。
随机挑选44尾PO5组的罗非鱼，麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)在400L水箱中，水温维持在29～29.5℃，pH控制在7.0～7.5，溶氧量保持＞5mg/L，培养12h和60h后分别选取9尾罗非鱼麻醉，并采集相应的培养12h罗非鱼肠组织3和培养60h罗非鱼肠组织3，并检测罗非鱼肠组织中的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。
随机挑选44尾PO15组的罗非鱼，麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)在400L水箱中，水温维持在29～29.5℃，pH控制在7.0～7.5，溶氧量保持＞5mg/L，培养12h和60h后分别选取9尾罗非鱼麻醉，并采集相应的培养12h罗非鱼肠组织4和培养60h罗非鱼肠组织4，并检测罗非鱼肠组织中的丙二醛(MDA)含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)含量。
2、实验结果
抗氧化能力的测试结果如图2和图3所示，其中图2为培养12h的罗非鱼肠组织的检测结果，图3为培养60h的罗非鱼肠组织的检测结果。
结果显示：无论是在培养12h还是60h的罗非鱼肠组织中，与阴性对照组(CK1)相比，阳性对照组(CK2)的罗非鱼肠组织中的MDA、T-SOD和GSH-PX水平均有所上升；在培养60h的罗非鱼肠组织中，PO5组和PO15组的罗非鱼肠组织中的MDA、T-SOD和GSH-PX相较于阳性对照组菌显著降低，说明饲喂实施例1制备得到的罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2能够降低罗非鱼肠组织氧化应激状态，从而保护机体免受大量氧自由基损伤，进而发挥抗无乳链球菌的作用。
实施例4罗非鱼饲料对罗非鱼肠组织的影响
1、实验方法
以实施例2得到的12h罗非鱼肠组织2为例，进行病理组织切片检测：
将12h罗非鱼肠组织2在波恩氏固定液中固定24h后，经过固定、修理、脱水、包埋、切片(5～10μm)、去蜡及HE染色(苏木精和伊红)后制作成肠道组织切片，在光学显微镜下观察12h罗非鱼肠组织2的病理结构。
对实施例2得到的60h罗非鱼肠组织2、12h罗非鱼肠组织3、60h罗非鱼肠组织3、12h罗非鱼肠组织4和60h罗非鱼肠组织4进行同等检测，观察病理结构。
2、实验结果
罗非鱼肠组织病理结构切片如图4所示，结果显示：CK组对应的12h罗非鱼肠组织2的小肠绒毛出现破裂趋势，60h罗非鱼肠组织2的小肠绒毛出现严重的破裂趋势；而PO5组和PO15组的罗非鱼肠组织的小肠绒毛较为健康。
结果说明：饲喂实施例1制备得到的罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2能够显著降低无乳链球菌感染的罗非鱼的病理损伤。
实施例5罗非鱼饲料对罗非鱼免疫相关基因的影响
1、实验方法
按照实施例1步骤1(2)所述方法饲喂罗非鱼，得到CK组(饲喂鱼类基础饲料)、PO5组(饲喂罗非鱼饲料1)和PO15组(饲喂罗非鱼饲料2)。
饲喂28天后，进行攻毒实验，以CK组为例，具体如下：
随机挑选44尾CK组的罗非鱼，平均分为2组，记为NC组(阴性对照组)和PC组(阳性对照组)，其中NC组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL的PBS溶液；PC组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)。
随机挑选44尾PO5组的罗非鱼，平均分为2组，记为NP-5组(PO5对照组)和PO-5组(PO5实验组)，其中NP-5组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL的PBS溶液；PO-5组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)。
随机挑选44尾PO15组的罗非鱼，平均分为2组，记为NP-15组(PO15对照组)和PO-15组(PO15实验组)，其中NP-15组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL的PBS溶液；PO-15组罗非鱼麻醉后腹腔注射100μL无乳链球菌(2.7×104CFU/mL)。
共产生6个组别的罗非鱼样品，以NC组为例，进行检测免疫基因表达情况，具体如下：
随机取NC组内9尾罗非鱼的脾组织，每3尾罗非鱼的脾组织混合得到混合脾组织样品，共得到3个混合脾组织样品。
以其中1个混合脾组织样品为例，进行检测：
(1)RNA提取及转录组测序
将50～100mg混合肠组织样品、4颗磁珠和1mL的TRIZOL(Invitrogen，UK)混合，在匀浆机匀浆2min后，静置5min，接着加入200μL氯仿，颠倒混合10次后，静置3min，在4℃、12000×g的离心速度下离心15min，离心结束后取500μL上清液和500μL异丙醇充分混匀，静置10min，接着在4℃、12000×g的离心速度下离心10min，弃去上清液得到RNA沉淀。
利用1mL乙醇(75％)在EP管重悬RNA沉淀，在4℃、7500×g的离心速度下离心5min，弃上清，将沉淀用1mL乙醇(75％)重悬，在4℃、7500×g的离心速度下离心5min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，静置10min，去除管壁上多余液体，加入40μL的DEPC水溶解，得到RNA样品。
取1.5μL的RNA样品，在90V的电压下利用1.5％(w/w)的琼脂糖凝胶电泳进行电泳20min，并用Nanodrop-2000(Thermo Scientific，USA)检测RNA浓度和纯度。
利用Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)检测RNA样品的完整度，并用Illumina HiSeq2500对RNA样品进行2×150bp双端测序，得到测序文件。
(2)差异表达基因的鉴定
从Ensembl数据库上下载罗非鱼的参考基因组文件(Oreochromis_niloticus.Orenil1.0.dna.toplevel.fa)，采用Fastq对步骤(1)得到的测序文件进行质控，利用Hisat2软件将测序文件比对到罗非鱼的参考基因组文件上，使用FeaureCounts样品内的差异表达基因并进行计数，获得差异基因表达的rowcounts，并在R中使用DEseq2包筛选出差异表达DEGS，筛选参数为：|log2FoldChange|≥1，pvalue＜0.05。
(3)cDNA的合成
使用反转录试剂盒(TOYOBO，ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNARemover)，以步骤(1)中得到的RNA样品作为模板，合成cDNA，具体如下：
将步骤(1)得到的RNA样品在65℃下变性5min后，立即置于冰上冷却，作为RNA模板，按照表2所示组分冰上配制反应液。
表2反应液组分
配制完成后搅拌均匀，37℃温育5min。
将16μL的反应液和4μL的5×RT Master Mix II充分混合，按照表3所述反应程序进行反应，得到cDNA原液。
表3反应程序
温度(℃) 时间(min)
37 15
50 5
98 5
4 保持
取5μL的cDNA原液和45μL的RNAase-free ddH2O充分混合，得到稀释10倍的cDNA原液，作为cDNA模板。
(4)引物设计及qRT-PCR鉴定
针对罗非鱼的IL11a(XM_003450684.5、XM_013274585.3)、tnfaip6(XM_003456260.4)和tp53i3(XM_003442981.5)基因的CDS序列，利用Primer5设计引物，在NCBI的Primer-BLAST进行引物比对，筛选出特异性唯一的引物，具体如表4所示；其中：IL11a基因的上下游引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，tnfaip6基因的上下游引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，tp53i3基因的上下游引物序列如SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示。
表4特异性引物
以步骤(3)得到的cDNA模板作为模板，利用表4中所示特异性引物，分别对IL11a(XM_003450684.5、XM_013274585.3)、tnfaip6(XM_003456260.4)和tp53i3(XM_003442981.5)基因进行特异性荧光定量PCR。
以IL11a为例，以Efl-a基因作为内参基因，按照表5所示反应体系配置反应溶液，在表6所述qPCR反应程序进行荧光PCR定量检测。
表5荧光定量PCR反应体系
成分 加样量(μL)
2×SYBR Green qPCR Mix 5
IL11a-F(SEQ ID NO:1) 0.2
IL11a-F(SEQ ID NO:2) 0.2
cDNA模板 2.5
RNAase-free-ddH2O 2.1
总体积 10
表6 qPCR反应程序
收集得到cDNA模板中的IL11a基因荧光信号；将表5中的特异性引物更换为表4所示特异性引物，分别收集tnfaip6和tp53i3基因的荧光信号。
对NC组罗非鱼剩余混合脾组织样品按照上述方法进行检测，并收集相应基因的荧光信号。
将PC组、NP-5组、PO-5组、NP-15和PO-15组罗非鱼分别按照NC组罗非鱼的处理方法进行检测，得到对应的脾组织的基因荧光信号。
收集各组的基因荧光信号后，利用相对定量法2ΔΔCt计算基因表达水平；接着利用SPSS判断各样品数据的反差齐性，方差齐性样品利用Student-T检验计算对照组和实验组之间的差异水平，方差不齐性样品使用Kruskal-Wallis H检验计算对照组和实验组之间的差异水平。
将结果利用GraphPad Prism 8进行绘图，并标记显著差异水平。
2、实验结果
罗非鱼免疫相关基因的检测结果如图5所示。
结果显示：无乳链球菌攻毒后，罗非鱼脾组织中的IL11a相对表达量逐渐增加，而饲喂了罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2的组别(PO-5和PO-15)的IL11a相对表达量更高，说明添加了广藿香挥发油的饲料能够通过上调IL11a基因的表达，进而减轻过度验证并维持免疫稳态。
无乳链球菌攻毒后，罗非鱼脾组织以及肠组织中的TP53I3表达量上升，而饲喂了罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2的组别(PO-5和PO-15)的TP53I3基因的表达量更高，说明广藿香挥发油能够通过上调TP53I3基因的表达，促进细胞凋亡，维持自身免疫系统。
无乳链球菌攻毒后，罗非鱼体内的tnfaip6表达量出现上升趋势，而饲喂了罗非鱼饲料1和罗非鱼饲料2的组别的tnfaip6基因表达量出现显著上升；说明广藿香挥发油能够上调罗非鱼体内的tnfaip6的表达，促进抗炎作用，发挥防治无乳链球菌感染的作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.广藿香挥发油在制备用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鱼类为罗非鱼。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述罗非鱼为吉富罗非鱼。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为鱼类饲料。
5.一种用于防治鱼类无乳链球菌病和/或提高鱼类增重率的功能性饲料，其特征在于，所述功能性饲料包含质量体积比为5～15μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料。
6.根据权利要求5所述的功能性饲料，其特征在于，所述饲料包含质量体积比为5μL：1g的广藿香挥发油和鱼饲料。
7.权利要求5～6任一所述的功能性饲料在提高鱼类增重率中的应用。
8.一种提高鱼类增重率的方法，其特征在于，具体为：利用权利要求5～6任一所述的功能性饲料饲喂鱼类。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，按照鱼类体重1～4％的饲料质量进行饲喂。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述鱼类为罗非鱼。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127038A (zh) * 2012-03-16 2013-06-05 成都华神集团股份有限公司 百秋李醇的新用途
US20200068922A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Ralco Nutrition, Inc. Feed compositions and feed additive compositions for aquaculture species

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103127038A (zh) * 2012-03-16 2013-06-05 成都华神集团股份有限公司 百秋李醇的新用途
US20200068922A1 (en) * 2018-08-28 2020-03-05 Ralco Nutrition, Inc. Feed compositions and feed additive compositions for aquaculture species

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘亮锋；等: "广藿香油及藿香油的研究概况", 《中国中医药信息杂志》, vol. 16, no. 2, 15 February 2009 (2009-02-15), pages 1 - 3 *
方心灵；等: "广藿香油对快大黄羽肉鸡生产性能及血清生化指标的影响", 《广东饲料》, no. 5, 28 May 2021 (2021-05-28), pages 25 *

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