CN116718701B - 一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于药物检测技术领域，公开了一种Inclisiran药物中间体正义链和反义链纯度的检测方法。本申请通过采用反相离子对高效液相色谱法，可同时分离正义链和反义链中包括缩短序列杂质(5’n‑1、5’n‑2)，硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质和增长序列杂质(5’n+Af、5’n+Gm)在内的12种杂质，其中，正义链中硫代不完全杂质分离度，具有显著的提高；其余11种杂质与主峰之间分离度良好，便于对Inclisiran药物中间体质量的检测与控制。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种检测Inclisiran药物中间体中缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质和增长序列杂质的方法。
背景技术
人工合成的小干扰RNA(siRNA)药物通过碱基互补配对实现对靶点的限制性选择并直接靶向特定基因，具有较高的特异性，将药物靶点扩大至功能性蛋白质的上游，从转录后水平调控靶基因的表达。相较于抗体药物和小分子药物，siRNA药物具有靶点丰富、合成方便、临床前研发周期短、不良反应可控等优点，已迅速成为分子生物学中分析蛋白质功能和确定新的治疗靶点的重要工具。目前，各种siRNA分子在临床研究中治疗包括癌症、病毒感染和眼部疾病，具有很好的药学应用前景[siRNA药物研究进展[J].中国新药杂志,2022,31(05):427-434.]。
Inclisiran是一种双链小siRNA分子，可抑制PCSK-9的转录，用于高脂血症和心血管疾病(CVD)研究。Inclisiran作用机理与此前上市的PCSK9抗体不同，PCSK9抗体通过与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，提高肝脏清除LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)的能力，而Inclisiran从源头上关闭PCSK9的生成，从而降低LDL-C水平，并有助于改善动脉粥样硬化患者的预后心血管疾病[新型siRNA药物：Inclisiran在降脂治疗中的研究进展[J].中国医药导刊,2023,25(02):140-145.]。
Inclisiran的合成工艺杂质包括：①正义链：杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)，②反义链：杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)，由于上述杂质与主成分结构极为相似，因此，很难实现多种杂质的分离。特别是，单氧代杂质和硫代不完全杂质等与主成分相近结构的杂质分离更加困难。例如，硫代不完全杂质和主成分结构仅差一个硫代磷酸二酯键，导致分离愈发困难。目前并未检索到Inclisiran中杂质的分析方法相关专利文件，因此，就以下关于硫代寡核苷酸的杂质分析的国内外文献及专利分析发现：
文献1：“贾巧云,邓新秀,高婵,鲁丹丹,游松,王升启.反相离子对高效液相色谱法分析硫代反义寡核苷酸CT102相关杂质,药物分析杂志,2013,33(07):1157-1162+1167.”建立硫代反义寡核苷酸CT102及其相关杂质的反相离子对高效液相色谱(IP-RP-HPLC)分析方法。但是其中，仅检测了其中可能存在的缩短序列杂质(3’n-1、5’n-1)、不完全硫代序列杂质(5’(P＝S/O))与CT102的分离情况；但是无法实现其与全氧代序列杂质和增长序列杂质的分离和检测。
文献2：离子对反相液相色谱法分析硫代寡核苷酸药物流感泰得的有关物质[J].分析化学,2011,39(12):1811-1816建立了离子对反相液相色谱(IP-RPLC)分析流感泰得(Flutide)有关物质的方法，Flutide与缩短序列杂质(5’n-1和3’n-1)可实现基线分离，但是，其单氧代序列5’(P＝O)1之间的分离度仅为0.94；并且其中也没有记载全氧代序列杂质以及增长序列杂质的分离和检测。
文献3：Assay,Purity,and Impurity Profile of PhosphorothioateOligonucleotide Therapeutics by Ion Pair–HPLC–MS[J].Nucleic acidtherapeutics,2022,32(3):206-220建立了液质连用的方法分析不同硫代寡核苷酸药物有关物质，不完全硫代序列杂质(P＝O)1未分离，只能通过EIC提取离子流进行监控。
因此，本领域存在开发出一种重现性好、能够同时、稳定监控Inclisiran药物中间体正义链：杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)方法的需求。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷和不足，本申请提供了一种Inclisiran药物中间体正义链和/或反义链的缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质和增长序列杂质的检测方法。
所述方法可同时分离并检测Inclisiran中间体中的正义链：杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)，重现性良好，可用于Inclisiran中间体的质量控制。
本发明提供一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法，其包括以下步骤：
溶液配制：用稀释剂配制Inclisiran药物中间体的供试品溶液；
所述供试品溶液包括Inclisiran药物中间体的正义链和对应杂质，和/或反义链和对应杂质；
采用液相色谱仪对供试品溶液进行检测，液相色谱条件如下：
色谱柱：固定相采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为100～400mmol/L；二丁胺的浓度为5～25mmol/L；
流动相B：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的甲醇水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为100～400mmol/L；二丁胺的浓度为5～25mmol/L。
在一些优选地实施方案中，所述液相色谱条件中，洗脱梯度为：
在一些更优选地实施方案中，所述流动相A中：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L。
在一些更优选地实施方案中，所述流动相A中：二丁胺的浓度为20mmol/L。
在一些更优选地实施方案中，所述流动相B中：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L。
在一些更优选地实施方案中，所述流动相B中：二丁胺的浓度为20mmol/L。
在一些优选地实施方案中，所述流动相B中，甲醇和水的体积比为甲醇：水＝4:1。
在一些优选地实施方案中，所述杂质选自以下中的任意一种或多种：Inclisiran药物中间体的正义链和/或反义链的缩短序列杂质、硫代不完全序列杂质、全氧代序列杂质、增长序列杂质。
在一些优选地实施方案中，所述缩短序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上缺失1个或多个碱基；
所述硫代不完全序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上其中一个目标碱基没有被硫代修饰；优选地，在正义链的序列上2个目标碱基中其中一个没有被硫代修饰；在反义链的序列上4个目标碱基中至少一个没有被硫代修饰；
所述全氧代序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上4个目标碱基均未被硫代修饰；
所述增长序列杂质包括在正义链和/或反义链的序列上增加1个或多个碱基。
在一些更优选地实施方案中，所述正义链的序列为SEQ ID NO:13；
在正义链中，所述缩短序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2；
所述全氧代序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
所述硫代不完全序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；
所述增长序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6；
所述反义链的序列为SEQ ID NO:14；
在反义链中，所述缩短序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8；
所述全氧代序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:9；
所述硫代不完全序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:10；
所述增长序列杂质的核苷酸序列为SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12。
在一些更优选地实施方案中，各杂质和主成分的保留时间如下：
其中，保留时间的相对偏差RD小于1％。
在一些优选地实施方案中，所述色谱柱的填充剂粒径为1.7～2.7μm，优选为1.7μm。
在一些优选地实施方案中，所述色谱柱的规格为2.1～4.6mm×50～150mm，优选为2.1mm×150mm。
在一些优选地实施方案中，所述供试品溶液的浓度为0.1～1.0mg/mL，优选为0.5mg/mL。
在一些优选地实施方案中，所述液相色谱条件的柱温：55～65℃，优选为60℃；流速：0.15～0.25mL/min，优选为0.2mL/min；检测波长：256～264nm，优选为260nm。
在一些优选地实施方案中，所述稀释剂为水或10％甲醇溶液，优选为水。
在一些优选地实施方案中，所述液相色谱条件的进样量为1～5μL，优选为2μL。
本发明还提供了Inclisiran药物中间体的杂质检测方法。
本发明还提供了Inclisiran药物中间体的正义链的杂质检测方法。
本发明还提供了Inclisiran药物中间体的反义链的杂质检测方法。
其中，正义链、反义链和杂质的序列如下：
正义链的序列(SEQ ID NO:13)为5’-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
在正义链中，
杂质1(SEQ ID NO:1)缩短序列杂质5’n-2的核苷酸序列为5’-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
杂质2(SEQ ID NO:2)缩短序列杂质5’n-1的核苷酸序列为5’-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’的缩短序列杂质5’n-1；
杂质3(SEQ ID NO:3)全氧代序列杂质的核苷酸序列为5’-Cm-Um-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
杂质4(SEQ ID NO:4)硫代不完全杂质的核苷酸序列为5’-Cms-Um-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
所述增长序列杂质包括：
杂质5(SEQ ID NO:5)增长序列杂质5’n+Gm的核苷酸序列为5’-Gm-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
杂质6(SEQ ID NO:6)增长序列杂质5’n+Af的核苷酸序列为5’-Af-Cms-Ums-Am-Gm-Am-Cm-Cf-Um-Gf-Um-dT-Um-Um-Gm-Cm-Um-Um-Um-Um-Gm-Um-L96-3’；
所述反义链的序列(SEQ ID NO:14)为5’-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’；
在反义链中，
杂质7(SEQ ID NO:7)缩短序列杂质5’n-2的核苷酸序列为5’-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’；
杂质8(SEQ ID NO:8)缩短序列杂质5’n-1的核苷酸序列为5’-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’；
杂质9(SEQ ID NO:9)全氧代序列杂质的核苷酸序列为5’-Am-Cf-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gm-Am-Am-3’；
杂质10(SEQ ID NO:10)硫代不完全序列杂质的核苷酸序列为5’-Ams-Cf-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gm-Am-Am-3’硫；
杂质11(SEQ ID NO:11)增长序列杂质5’n+Gm核的苷酸序列为5’-Gm-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’；
杂质12(SEQ ID NO:12)增长序列杂质5’n+Af的核苷酸序列为5’-Af-Ams-Cfs-Am-Af-Af-Af-Gm-Cf-Am-Af-Am-Af-Cm-Af-Gm-Gf-Um-Cf-Um-Am-Gms-Ams-Am-3’。
本发明所取得的有益效果：
本申请提供了一种可同时分离并检测Inclisiran中间体正义链：杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)的方法。
其中，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高；其余5种已知杂质，包括杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度均＞2.33，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，能实现正义链主峰与5种杂质的分离，分离度良好。
反义链中杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度分布在1.67～7.7，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形尖锐对称，无其他干扰峰，基线平稳，能实现反义链主峰与6种杂质的分离，分离度良好；可用于Inclisiran中间体的质量控制。
附图说明
图1为正义链混合杂质对照品溶液进行测定的色谱图；
图2为反义链混合杂质对照品溶液进行测定的色谱图。
具体实施方式
实施例1：专属性试验
1-1.溶液配制：
稀释剂：超纯水；
流动相A：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L；二丁胺的浓度为20mmol/L；
流动相B：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的甲醇水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L；二丁胺的浓度为20mmol/L；
空白溶剂：与稀释剂相同；
供试品溶液1：取已知浓度为15mg/mL的正义链溶液10μL，至于2mL EP管中，加入290μL水，混匀，制成每1mL含0.5mg正义链的溶液，作为供试品溶液1；
供试品溶液2：取已知浓度为15mg/mL的反义链溶液10μL，至于2mLEP管中，加入290μL水，混匀，制成每1mL含0.5mg反义链的溶液，作为供试品溶液2；
杂质储备液：取已知浓度为3mg/mL的正义链杂质1(缩短序列5’n-2)10μL，加入30μL超纯水制成每1mL含0.75mg杂质的溶液，杂质储备液1。采用相同方法，分别配制相同浓度以下不同杂质种类的杂质储备液2～12。
杂质定位溶液：精密量取杂质储备液1适量，以稀释剂稀释成每1mL含0.125mg的溶液，即得杂质1(正义链缩短序列5’n-2)定位溶液。采用相同方法，分别配制相同浓度以下不同杂质种类的杂质2～12定位溶液。
以下为各杂质编号：
正义链杂质：杂质1(缩短序列5’n-2)、杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列)、杂质4(硫代不完全序列)、杂质5(增长序列5’n+Gm)和杂质6(增长序列5’n+Af)。
反义链杂质：杂质7(缩短序列5’n-2)、杂质8(缩短序列5’n-1)、杂质9(全氧代序列)、杂质10(硫代不完全序列)、杂质11(增长序列5’n+Gm)、杂质12(增长序列5’n+Af)。
混合杂质对照品溶液1：取杂质储备液1至6和供试品溶液1各10μL置于同一2mL EP管内，混匀，即得每1mL含0.125mg的混合杂质对照品溶液1。
混合杂质对照品溶液2：取杂质储备液7至12和供试品溶液2各10μL置于同一2mLEP管内，混匀，即得每1mL含0.125mg的混合杂质对照品溶液2。
1-2.测试条件：
仪器：高效液相色谱仪；
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择色谱柱规格为：Waters ACQUITYTM Premier Oligonucleotide BEH C18，2.1mm×150mm，1.7μm的色谱柱；
流动相：
流动相A：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的水溶液，其中，1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度为200mmol/L；二丁胺浓度为20mmol/L；
流动相B：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的甲醇水溶液，其中，1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度为200mmol/L；二丁胺浓度为20mmol/L；甲醇：水(V/V)＝4:1；
柱温：60℃；
进样量：2μL；
检测器：紫外检测器；
检测波长：260nm；
流速：0.2mL/min；
洗脱方式：梯度洗脱；
表1洗脱梯度
洗脱时间：39min。
1-3.实验步骤及结论：
精密量取上述配制空白溶剂、供试品溶液1、供试品溶液2、杂质1～12定位溶液、混合杂质对照品溶液1和混合杂质对照品溶液2各2μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图和结果，结果见下表。
表2正义链系统适用性试验结果
表3反义链系统适用性试验结果
注：保留时间的相对偏差RD＜0.5％，即认定为同一物质的特征峰。其中，A为定位溶液保留时间，B为系统适用性试验结果中的保留时间。
结论：
采用高效液相色谱仪对上述样品进行分离检测，由试验结果可知：
表2中采用空白溶剂进行专属性定位试验，空白溶剂中色谱图中没有产生多余特征峰，表明空白溶剂不干扰主峰及各杂质测定；并且由供试品溶液的谱图可知，正义链和反义链特征峰的保留时间分别为24.413和24.646min、28.475min。
采用面积归一化法，报告正义链和反义链特征峰面积百分比为纯度，正义链纯度为91.99％，反义链纯度为91.20％，计算公式如下：
表3和表4为采用杂质定位溶液对各已知杂质进行定位的检测结果，结合混合杂质对照品溶液1(图1)和混合杂质对照品溶液2(图2)可知，正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)保留时间依次为：21.346min、23.042min、23.838min、24.108和24.292min、25.425min、25.938min。反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)保留时间依次为：25.500min、26.838min、27.163min、27.638min、29.267min、29.679min。
采用混合杂质对照品溶液进行系统适用性试验(图1和图2)，结果发现：正义链中除了杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高；其余正义链中杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度均＞2.33，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，能实现正义链主峰与5种杂质的分离，分离度良好。
反义链中杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度分布在1.67～7.7，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形尖锐，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现反义链主峰与6种杂质的分离，分离度良好。
实施例2：色谱柱的选择
在实施例1的基础上，改变色谱柱的种类，其他色谱条件保持不变，对Inclisiran药物中间体中12种已知杂质进行检测。
精密量取2μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
表4
结论：
1、采用实施例1中Waters ACQUITY TM Premier Oligonucleotide BEH C18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
其余杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)、杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好。
2、采用实施例2方法1中Waters XBridge Premier Oligonucleotide BEH C18(4.6mm×150mm，2.5μm)色谱柱、实施例2方法2中Waters ACQUITY TM PremierOligonucleotide BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱、或实施例2方法3中AglientAdvanceBio Oligonucleotide HPH C18(2.1mm×150mm，2.7μm)色谱柱，其中，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.31～0.43，虽然略低于实施例1，但是相较于现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，也具有显著的提高。
其余11种杂质与主峰之间分离度＞1.2～1.5，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，也能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好。
3、采用实施例2方法4中Agilent Zorbax C8(4.6×150mm，2.5μm)色谱柱，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰的特征峰重合；组分共流出，无法分离。并且反义链中杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)的特征峰重合，组分共流出，也无法分离，分离度显著降低，无法实现主峰与11种杂质的分离。
小结：
由上述对比可知，采用本发明以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(例如，实施例1、实施例2方法1～3)，能实现正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的显著提高，并且，其余包括杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)、杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)在内的11种杂质与主峰完全分离。
其中，采用Waters ACQUITY TM Premier Oligonucleotide BEH C18(2.1mm×150mm，1.7μm)色谱柱时，分离效果最优。
反之，采用其他填充剂的色谱柱(例如，实施例2方法4的C8)进行分离，其，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)特征峰重合，无法实现12种杂质的同时分离。
实施例3：流动相溶剂的选择
在实施例1的基础上，改变流动相溶剂，其他色谱条件保持不变，对Inclisiran药物中间体中12种已知杂质进行检测。
其他测试条件与实施例1相同，精密量取2μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
表5
结论：
通过上述两种不同溶剂的流动相对Inclisiran药物中间体的12种杂质的分离检测进行高效液相色谱分析，发现：
1、采用实施例1的流动相，得到的谱图中主峰和12种杂质均有出峰响应，并且，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)、杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体的12种已知杂质的分离检测。
2、采用其他流动相得到的谱图中，主峰和12种杂质的特征峰均在1min左右同时出现，导致各特征峰重叠；特征峰均未有效保留，无法实现主峰和12种杂质的分离检测。
小结：
由上述对比可知，采用本发明流动相(例如，实施例1)，能实现正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的显著提高，并且，其余包括杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)、杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)在内的11种杂质与主峰之间完全分离。
反之，采用其他流动相(例如，实施例3)进行分离，其，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)特征峰重合，主峰和12种杂质无法分离。
实施例4：流动相离子对试剂种类的选择
在实施例1的基础上，改变流动相离子对试剂，其他色谱条件保持不变，对Inclisiran药物中间体中12种已知杂质进行检测。
其他测试条件与实施例1相同，精密量取2μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
表6
结论：
通过上述三种不同离子对试剂的流动相对Inclisiran药物中间体的12种杂质的分离检测进行高效液相色谱分析，发现：
1、采用实施例1的流动相离子对试剂，得到的谱图中主峰和12种杂质均有出峰响应，并且，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体的12种已知杂质的分离检测。
2、实施例4方法1的流动相离子对试剂采用三乙胺时，导致正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与正义链特征峰重合，未分开。反义链杂质8(缩短序列杂质5’n-1)和杂质9(全氧代序列杂质)分离度仅仅为0.32，显著低于限度标准(＞1.5)，较实施例1主峰和11种杂质的分离度，呈现显著下降，分离度差。
3、实施例4方法2的流动相离子对试剂采用二己胺时，流动相所使用的离子对试剂保留太强无法洗脱，导致主峰与12种杂质均未出峰，无法实现分离。
小结：
通过上述不同离子对试剂流动相的实验结果证明，采用实施例1的流动相(例如，实施例1)，能实现正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的显著提高，并且，其余包括正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)在内的11种杂质与主峰之间完全分离。
反之，采用其他流动相种类(例如，实施例4方法1～2)进行分离，其特征峰重合或无法出峰，均无法实现分离。
实施例5：流动相离子对试剂浓度的选择
在实施例1的基础上，改变流动相离子对试剂浓度，其他色谱条件保持不变，对Inclisiran药物中间体中12种已知杂质进行检测。其他测试条件与实施例1相同，精密量取2μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
表7
结论：
通过上述三种不同浓度的流动相离子对试剂的流动相对Inclisiran药物中间体的12种杂质的分离检测进行高效液相色谱分析，发现：
1、流动相采用实施例1的离子对试剂浓度(1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度200mmol/L，二丁胺浓度为20mmol/L)，得到的谱图中主峰和杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)均有出峰响应，并且，正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
其余11种杂质与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体的12种已知杂质的分离检测。
2、采用实施例5方法1～2的离子对试剂浓度(方法1中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度100mmol/L，二丁胺浓度为5mmol/L；方法2中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度400mmol/L，二丁胺浓度为25mmol/L)，正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度分别为0.29和0.34，虽然较实施例1略有减小，但是较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，也具有显著的提高。
其余11种杂质与主峰之间分离度均＞1.5，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体的12种已知杂质的分离检测。
3、采用实施例5方法3的离子对试剂浓度(1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度400mmol/L，二丁胺浓度为50mmol/L)下，离子对试剂保留太强无法洗脱，导致主峰与12种杂质均未出峰，无法实现分离。
小结：
采用本发明的流动相离子对试剂浓度，即，1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度100～400mmol/L，二丁胺浓度为5～25mmol/L，能实现正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的显著提高，并且，其余正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)与主峰之间完全分离。
其中，采用流动相离子对试剂浓度为，1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇浓度200mmol/L，二丁胺浓度为20mmol/L，正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的提高最显著，并且，其余11种杂质与主峰之间分离度最优。
反之，采用其他流动相离子对试剂浓度(例如，实施例5方法3)进行分离，其特征峰重合或无法出峰，均无法实现分离。
实施例6：洗脱梯度的选择
在实施例1的基础上，改变洗脱梯度，其他色谱条件保持不变，对Inclisiran药物中间体中12种已知杂质进行检测。
其中，实施例1中洗脱梯度如下：
表8
实施例6方法1改变洗脱梯度：
表9
实施例6方法2改变洗脱梯度：
表10
他测试条件与实施例1相同，精密量取2μL实施例1中配制的混合杂质对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录结果。
表11
结论：
通过上述三种不同洗脱梯度对Inclisiran药物中间体的12种杂质的分离检测进行高效液相色谱分析，发现：
1、采用实施例1的洗脱梯度，得到的谱图中主峰和12种杂质均有出峰响应，并且，正义链杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
其余包括正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)在内的11种杂质与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体的12种已知杂质的分离检测。
2、采用实施例6方法1和方法2的洗脱梯度中，正义链杂质4(硫代不完序列全杂质)与正义链特征峰重叠，无法分开；并且其他杂质中，反义链杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)与反义链特征峰分离度显著降低为0.62，分离度显著降低，无法实现有效分离；或者反义链拖尾因子大于1.2(《中国药典》规定峰高法定量时拖尾因子T应该在0.95-1.05之间，低于0.95为前延峰，高于1.05为拖尾峰)，峰型不对称，分离效果差，导致分析精度和灵敏度显著下降。
小结：
采用本发明的洗脱梯度，能实现正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度的显著提高，并且，其余正义链杂质1(缩短序列5’n-2)，杂质2(缩短序列5’n-1)，杂质3(全氧代序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质6(增长序列杂质5’n+Af)以及反义链杂质7(缩短序列杂质5’n-2)，杂质8(缩短序列杂质5’n-1)，杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)、杂质12(增长序列杂质5’n+Af)在内的与主峰之间完全分离。
反之，采用其他洗脱梯度进行分离，其特征峰出现重叠、严重拖尾或分离度显著下降，均无法实现分离效果。
对比例1：
参考“贾巧云,邓新秀,高婵,鲁丹丹,游松,王升启.反相离子对高效液相色谱法分析硫代反义寡核苷酸CT102相关杂质,药物分析杂志,2013,33(07):1157-1162+1167.”建立硫代反义寡核苷酸CT102及其相关杂质的反相离子对高效液相色谱(IP-RP-HPLC)分析方法。对比例1中，对可能存在的缩短序列杂质(3’n-1、5’n-1)、不完全硫代序列(5’(P＝S/O))与CT102全长序列(n)的分离情况进行了考察，但是无法实现与全氧代序列杂质和增长序列杂质的分离。
对比例1与本申请检测杂质种类比对
表12
对比例1使用反相离子对高效液相色谱分析方法的参数如下：
表13
本申请实施例1高效液相色谱分析方法的参数如下：
表14
参照对比例1的条件用于Inclisiran药物中间体正义链和反义链中杂质分离。结果显示：正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与正义链的特征峰重叠，无法实现分离；并且正义链杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)与杂质6(增长序列杂质5’n+Af)也出现特征峰重叠、未分离现象；与此同时，反义链未洗脱出峰，因此无法实现正义链、反义链以及12种杂质的分离检测效果。
而本申请方法得到的谱图中主峰和12种杂质均有出峰响应，并且，正义链中杂质4(硫代不完全序列杂质)与主峰分离度为0.49，较现有技术无法分离硫代不完全杂质(主峰和杂质峰重合，组分共流出，无法分离)相比，具有显著的提高。
其余11种杂质与主峰之间分离度分布在1.67～11.5，显著优于分离度标准(＞1.5)，峰形明显，无其他干扰峰，基线平稳，能实现主峰与11种杂质的分离，分离度良好，能实现Inclisiran药物中间体正义链：杂质1(缩短序列杂质5’n-2)、杂质2(缩短序列杂质5’n-1)、杂质3(全氧代序列杂质)、杂质4(硫代不完全序列杂质)、杂质5(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质6(增长序列杂质5’n+Af)，反义链：杂质7(缩短序列杂质5’n-2)、杂质8(缩短序列杂质5’n-1)、杂质9(全氧代序列杂质)、杂质10(硫代不完全序列杂质)、杂质11(增长序列杂质5’n+Gm)和杂质12(增长序列杂质5’n+Af)同时分离检测的需求。
Claims (21)
1.一种Inclisiran药物中间体纯度的检测方法，其包括以下步骤：
1)溶液配制：用稀释剂配制Inclisiran药物中间体的供试品溶液；
所述供试品溶液包括Inclisiran药物中间体的正义链和正义链对应杂质，或反义链和反义链对应杂质；
2)采用液相色谱仪对供试品溶液进行检测，液相色谱条件如下：
色谱柱：固定相采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
流动相A：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为100～400mmol/L；
二丁胺的浓度为5～25mmol/L；
流动相B：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇和二丁胺的甲醇水溶液，其中1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为100～400mmol/L；二丁胺的浓度为5～25mmol/L；
所述正义链的序列为SEQ ID NO:13；所述正义链对应杂质包括：核苷酸序列为SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的缩短序列杂质、核苷酸序列为SEQ ID NO:3的全氧代序列杂质、核苷酸序列为SEQ ID NO:4的硫代不完全序列杂质和核苷酸序列为SEQ ID NO:5和/或SEQ IDNO:6的增长序列杂质；
所述反义链的序列为SEQ ID NO:14；所述反义链对应杂质包括：核苷酸序列为SEQ IDNO:7和/或SEQ ID NO:8的缩短序列杂质、核苷酸序列为SEQ ID NO:9的全氧代序列杂质、核苷酸序列为SEQ ID NO:10的硫代不完全序列杂质和核苷酸序列为SEQ ID NO:11和/或SEQID NO:12的增长序列杂质；
所述液相色谱条件中，洗脱梯度为：
所述液相色谱的检测波长为256～264nm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相A中：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述流动相A中：二丁胺的浓度为20mmol/L。
4.根据权利要求1～2任一项所述的检测方法，所述流动相B中：1,1,1,3,3,3-六氟-2-甲基-2-丙醇的浓度为200mmol/L。
5.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，所述流动相B中：二丁胺的浓度为20mmol/L。
6.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述流动相B中，甲醇和水的体积比为甲醇：水＝4:1。
7.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，各杂质和主成分的保留时间如下：
其中，保留时间的相对偏差RD小于0.5％。
8.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述色谱柱的填充剂粒径为1.7～2.7μm。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其中，所述色谱柱的填充剂粒径为1.7μm。
10.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述色谱柱的规格为2.1～4.6mm×50～150mm。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其中，所述色谱柱的规格为2.1mm×150mm。
12.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述供试品溶液的浓度为0.1～1.0mg/mL。
13.根据权利要求12所述的检测方法，其中，所述供试品溶液的浓度为0.5mg/mL。
14.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述液相色谱条件的流速：0.15～0.25mL/min。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其中，所述液相色谱条件的柱温：60℃；流速：0.2mL/min。
16.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述稀释剂为水或10％甲醇溶液。
17.根据权利要求1～2任一项权利要求所述的检测方法，其中，所述液相色谱条件的进样量为1～5μL。
18.根据权利要求17所述的检测方法，其中，所述液相色谱条件的进样量为2μL。
19.一种根据权利要求1～18任一项所述的检测方法中的所述正义链对应杂质或所述反义链对应杂质的检测方法。
20.一种根据权利要求1～18任一项所述的检测方法中的所述正义链对应杂质的检测方法。
21.一种根据权利要求1～18任一项所述的检测方法中的所述反义链对应杂质的检测方法。
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