CN116710094A - 包含kras g12c抑制剂的药物组合以及kras g12c抑制剂用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物组合，该药物组合包含KRAS G12C抑制剂，特别是1‑{6‑[(4M)‑4‑(5‑氯‑6‑甲基‑1H‑吲唑‑4‑基)‑5‑甲基‑3‑(1‑甲基‑1H‑吲唑‑5‑基)‑1H‑吡唑‑1‑基]‑2‑氮杂螺[3.3]庚‑2‑基}丙‑2‑烯‑1‑酮(化合物A)，和选自SHP2抑制剂(例如TNO155)和PD‑1抑制剂的一种或多种治疗活性剂；包含该药物组合的药物组合物；以及使用此类组合和组合物在治疗或预防癌症或肿瘤中的方法，特别地其中该癌症或肿瘤是KRAS G12C突变型。

Description

包含KRAS G12C抑制剂的药物组合以及KRAS G12C抑制剂用于 治疗癌症的用途
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子递交的序列表，并且将该序列表通过引用以其全文特此并入。创建于2021年12月7日的所述ASCII副本名称为PAT059013-WO-PCT04_ST25并且大小为49,644字节。
技术领域
本发明涉及KRAS G12C抑制剂及其单独和与一种或两种另外的治疗活性剂的组合在治疗癌症，特别地KRAS G12C突变型癌症(例如，肺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌或实体瘤)中的用途。本发明涉及药物组合，该药物组合包含(i)KRAS G12C抑制剂，如化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，以及第二治疗剂，即SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)，或PD-1抑制剂。本发明还涉及三重组合，该三重组合包含KRAS G12C抑制剂，如化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和第二治疗剂，即SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)，以及PD-1抑制剂。本发明还涉及包含该组合的药物组合物；以及使用此类组合和组合物在治疗或预防癌症或实体瘤，特别地KRAS G12C突变型癌症或KRAS G12C突变型癌症中的方法。
背景技术
尽管靶向疗法和免疫疗法最近取得了成功，但一些癌症，特别是转移性癌症，在很大程度上仍然无法治愈。
KRAS癌蛋白是具有作为细胞内信号传导途径(如MAPK、PI3K和Ral途径)的调节剂的至关重要角色的GTP酶，这些信号传导途径涉及增殖、细胞存活和肿瘤发生。KRAS的致癌基因活化主要通过密码子12的错义突变发生。在大约30％的所有人类癌症中均发现了KRAS功能获得性突变。KRAS G12C(密码子12处的KRAS甘氨酸至半胱氨酸氨基酸取代)突变是特异的亚突变，盛行于大约13％的肺腺癌、4％(3％-5％)的结肠腺癌和更小部分的其他癌症类型。
在正常细胞中，KRAS在无活性GDP束缚态与活性GTP束缚态之间交替。密码子12处KRAS的突变(如G12C)损害GTP酶活化蛋白(GAP)刺激的GTP水解。在这种情况下，因此，KRASG12C从GTP到GDP形式的转化会非常缓慢。结果KRAS G12C转变成活性GTP束缚态，因此驱动致癌基因信号传导。
肺癌仍然是全世界最常见的癌症类型并且是包括美国在内的许多国家癌症死亡的主要原因。NSCLC占所有肺癌诊断的约85％。在大约25％的肺腺癌患者中检测到KRAS突变(Sequist等人2011)。它们最常见于密码子12处，其中KRAS G12C突变在腺癌和鳞状NSCLC中都是最常见的(总体上占40％)(Liu等人2020)。KRAS突变的存在预示着较差的生存期并且与对EGFR TKI治疗的应答性降低有关。
KRAS G12C突变型NSCLC患者的标准护理治疗由基于铂的化学疗法和免疫检查点抑制剂组成。索托拉西布(Sotorasib)最近获得了FDA针对此适应症和接受过至少一次先前全身性疗法的成人患者的加速批准，目前正在进行进一步的验证性试验。使用免疫检查点抑制剂的用于NSCLC的免疫疗法已经表明是有前景的，其中一些NSCLC患者经历了持续数年的持久疾病控制。然而，此类长期非进展是不常见的，并且迫切需要可以增加对疗法应答并实现疗法持久缓解的患者比例的治疗策略。
结直肠癌(CRC)是美国第四大最常被诊断的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。2019年美国新发CRC病例大约为15万例，而2020年欧盟预计有超过30万名患者被诊断为CRC(欧洲癌症信息系统2020)。尽管观察到CRC的总发病率有所改善，但近年来50岁以下患者的发病率增加(Bailey等人2015)，作者估计，到2030年，20-34岁患者结肠和直肠癌的发病率可能分别增加90％和约124％。转移性CRC的全身性疗法包括单独使用或组合使用的各种药剂，包括化学疗法，如5-氟尿嘧啶/亚叶酸、卡培他滨、奥沙利铂和伊立替康；抗血管生成剂，如贝伐单抗和雷莫芦单抗；抗EGFR剂，包括针对野生型KRAS/NRAS癌症的西妥昔单抗和帕尼单抗；以及免疫疗法，包括纳武单抗和派姆单抗。目前播散性转移性结直肠癌的护理标准主要是基于化学疗法方案，包括5-FU/LV或基于卡培他滨、奥沙利铂和/或伊立替康的方案(NCCN Clinical Practice Guidelines www.nccn.org)，而免疫检查点抑制剂在具有高水平微卫星不稳定性(MSI-H)或错配修复缺陷(dMMR)的肿瘤亚组中显示出疗效(Overman等人2018，Overman等人2017)。野生型RAS(KRAS/NRAS)患者的治疗包括EGFR抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗(NCCN Clinical Practice Guidelines www.nccn.org)。
尽管有多种积极疗法，转移性CRC仍然无法治愈。尽管错配修复(MSI高)缺陷型CRC对免疫检查点抑制剂疗法表现出高应答率，但错配修复熟练型CRC却没有表现出高应答率。在大约4％的所有结肠腺癌中普遍存在KRAS G12C突变。KRAS突变型CRC典型地是错配修复熟练型，并且不是抗EGFR疗法的候选者，因此这种CRC亚型尤其需要改善的疗法。
肿瘤特征数据显示，除NSCLC和CRC外，还有一部分实体瘤带有KRAS G12C突变。KRAS G12C存在于大约1％-2％的恶性实体瘤中，包括大约1％的所有胰腺癌(Biernacka等人2016,Zehir等人2017)。在阑尾癌、小肠癌、肝胆癌、膀胱癌、卵巢癌和原发部位不明的癌症中也发现了KRAS G12C突变(Hassar等人,N Engl Med[新英格兰医学]2021384；2 185-187)。
目前有几种靶向疗法正在进行临床测试，旨在通过抑制RAS途径来治疗KRAS突变患者。然而，目前这些疗法对带有KRAS G12C突变的肿瘤的益处仍不确定，因为并非所有患者都有应答，并且在一些情况下，报告的应答持续时间很短，这可能是由于出现了抗性，该抗性至少部分是由破坏抑制剂结合和下游途径的重新激活的RAS基因突变介导的。
用KRAS G12C抑制剂治疗的大多数患者最终都会对单一药剂疗法产生获得性抗性。例如，在阿达格拉西布(adagrasib)研究中纳入的38名患者：27名非小细胞肺癌患者、10名结直肠癌患者和1名阑尾癌患者，在17名患者(占群组的45％)中检测到对阿达格拉西布的推定抗性机制，其中7名(占群组的18％)有多种重合机制。获得性KRAS改变包括G12D/R/V/W、G13D、Q61H、R68S、H95D/Q/R、Y96C和KRASG12C等位基因的高水平扩增。获得性旁路抗性机制包括MET扩增；NRAS、BRAF、MAP2K1、和RET中的激活突变；涉及ALK、RET、BRAF、RAF1、和FGFR3的致癌性融合；以及NF1和PTEN中的功能丧失性突变(Awad等人,AcquiredResistance to KRASG12C Inhibition in Cancer[癌症中对KRASG12C抑制的获得性抗性],N Engl J Med[新英格兰医学杂志]2021；384:2382-93)。Tanaka等人(Cancer Discov[癌症发现]2021；11:1913-22)描述了影响开关-II袋的新型KRAS Y96D突变，阿达格拉西布和其他非活性KRAS G12C抑制剂与该突变结合，干扰了关键的蛋白质-药物相互作用，并在工程化和患者来源的KRASG12C癌症模型中赋予这些抑制剂抗性。
因此，需要提供具有替代性结合模式和有效治疗的另外的KRAS抑制剂，以克服在用KRAS抑制剂(如阿达格拉西布或索托拉西布)治疗期间出现的抗性机制。
附图说明
图1：化合物A(JDQ443)和TNO155的组合在KRAS G12C突变型NSCLC细胞系中具有协同作用。用指定细胞系进行细胞活力测定，将这些细胞系用增加浓度的化合物A或TNO155作为单一药剂及其组合处理7天。矩阵表示与DMSO处理的细胞相比，每个处理的生长抑制百分比。使用经典的协同模型(Loewe、Bliss)对数据进行处理，得出JDQ443/TNO155组合对每个细胞系的协同作用得分：NCI-H2122：16.7；HCC-1171：9.7；NCI-H1373：6.9。
图2：单独的化合物A以及与TNO155的组合在Lu99 KRAS G12C肺癌小鼠异种移植模型中显示出抗肿瘤疗效。将携带LU99肿瘤的裸鼠用TNO155(2周)、化合物A(4周)或其组合(4周)以指定剂量水平和时间表进行口服治疗。将媒介物组治疗9天。在第28天停止所有治疗(图2中的垂直虚线)。肿瘤和体重再监测5天。C.使用Mann-Whitney检验，在治疗的第28天，**p<0.01，在第33天，即治疗停止后5天，*p<0.05。
图3：化合物A与TNO155的组合在连续施用TNO155(图3中缩写为“cont.”)时和施用两周和停药一周TNO时均有效。
图4：化合物A与TNO155的组合在CRC异种移植模型中的疗效。
图5：连续化合物A治疗在小鼠模型中的抗肿瘤活性。将携带MIA PaCa-2(A)和NCI-H2122(B)肿瘤的裸鼠用化合物A以指定剂量水平和时间表口服治疗3周。使用单因素方差分析(Dunnett事后)，相对于媒介物，*p<0.05。
图6：化合物A对KRAS G12C H95Q(在临床试验中介导对阿达格拉西布抗性的双突变体)的有效抑制。
图7：化合物A(JDQ443)、索托拉西布(AMG510)和阿达格拉西布(MRTX-849)对KRASG12C/H95双突变体增殖的影响。用指定的化合物浓度处理表达指定FLAG-KRASG12C单突变体或双突变体的Ba/F3细胞3天，并通过Cell titer glo活力测定评估增殖抑制。y轴显示经处理细胞相对于处理3天的生长％，x轴显示KRASG12C抑制剂的对数浓度(μM)。
图8：ERK磷酸化的蛋白质印迹分析，以评估化合物A(JDQ443)、索托拉西布(AMG510)和阿达格拉西布(MRTX-849)对KRAS G12C/H95双突变体信号传导的影响。用指定的化合物浓度处理表达指定的FLAG-KRASG12C单突变体或双突变体的Ba/F3细胞30min，并通过蛋白质印迹探测细胞裂解物的pERK减少来评估MAPK途径的抑制。
图9A：使用不同给药时间表的携带MIA PaCa-2肿瘤的裸鼠的抗肿瘤活性。将携带MIA PaCa-2、NCI-H2122和LU99肿瘤的裸鼠用化合物A(JDQ443)以指定剂量水平和时间表进行口服治疗。使用单因素方差分析(Dunnett事后)，相对于媒介物，*p<0.05。
图9B：将携带MIA PaCa-2肿瘤的裸鼠用化合物A(JDQ443)以指定剂量水平和时间表进行口服治疗。使用单因素方差分析(Dunnett事后)，相对于媒介物，*p<0.05。发现与每三天(q3d)给予相同剂量或90mg/kg q3d的相同每日总剂量相比，以每日时间表给予30mg/kg剂量导致更好的肿瘤生长抑制。
图10A-图10F：化合物A与TNO155的组合改善了化合物A的单一药剂活性，而用较低剂量的任一药物均可维持疗效。
图11：疗效与目标占有率相关。JDQ443显示持续的体内目标占有率，并且在携带KRAS G12C突变型肿瘤异种移植的小鼠中具有剂量依赖性的抗肿瘤活性。将TNO155添加至化合物A中，以化合物A单一药剂的三分之一的量达到类似的目标占有率。
图12：化合物A利用与KRASG12C蛋白的独特相互作用以新颖的结合模式在开关II环下结合。
发明内容
本发明为患有癌症(包括晚期和/或转移性癌症)的患者提供了新的治疗选择。本文提供了化合物和化合物的组合，及其在治疗癌症(尤其是当癌症或实体瘤带有KRAS G12C突变时)的方法中的用途，该癌症包括肺癌(包括NSCLC)、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。本发明还提供了用于不治之症，特别是患有KRAS G12C突变型肿瘤的患者的潜在有益的新颖研究性疗法，这些患者已经针对其适应症接受了标准护理疗法但失败了，或者对于批准的疗法不能耐受或不适合，并且因此具有有限的治疗选择。另外，本发明还提供了单独的化合物A或与一种或多种另外的治疗剂的组合，其用于在治疗对其他疗法产生抗性的癌症患者的方法中使用，这些其他疗法如先前用其他KRAS抑制剂(如阿达格拉西布和索托拉西布)治疗；更优选地先前用索托拉西布治疗。
化合物A是KRAS G12C的选择性共价不可逆抑制剂，利用与KRASG12C的独特相互作用表现出新颖的结合模式。化合物A在临床前模型中显示出有效的抗肿瘤活性和有利的药代动力学特性。化合物A是口服生物可利用的，在预测以赋予抗肿瘤活性的范围内实现了暴露，并且耐受性良好。还发现化合物A有效抑制KRAS G12C H95Q(在临床试验中介导对阿达格拉西布抗性的双突变体)。
本文的数据和实例表明，单独的化合物A以及与另一种治疗活性剂(选自SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)、PD-1抑制剂及其组合)的组合可用于治疗癌症，例如，由KRAS G12C突变驱动的癌症。通过化合物A对KRAS G12C靶向抑制可能会导致强大的抗肿瘤应答。另外，化合物A可通过重新激活绕过KRAS G12C以通过野生型(WT)KRAS发出信号的RTK-MAPK通路，来为例如对KRAS G12C抑制剂具有获得性抗性的患者提供组合益处。化合物A与SHP2抑制剂的组合进一步增加了体内KRAS G12C目标占有率，增强了临床前的抗肿瘤活性，并延迟了异种移植中抗性的出现。
在KRAS G12C NSCLC细胞系中，化合物A与SHP2抑制剂TNO155的组合导致比单独使用化合物A更持续的RAS途径抑制。另外，该组合导致几种细胞系中改善的肿瘤细胞生长抑制。本文还显示，化合物A与TNO155的组合显著改善了化合物A作为单一药剂和TNO155作为单一药剂所见的应答可持续性和复发时间。
在食道癌的KRAS G12C异种移植模型中，化合物A与SHP2抑制剂TNO155的组合足以使几乎没有应答的模型转化为良好的应答者。
化合物A可诱导促炎性微环境，其增强了抗PD-1疗法(如斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的疗效。因此，化合物A与抗PD-1抑制剂(例如斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的组合与任一单一药剂相比，可能导致改善的抗肿瘤活性。改善的抗肿瘤活性可以是例如增加的疗效和/或更持久的应答。
将SHP2抑制剂(如TNO155)添加至化合物A加斯巴达珠单抗或至化合物A加替雷利珠单抗中，与单一药剂治疗或双重组合相比，可进一步降低细胞内PD-1信号传导并导致抑制性减弱的肿瘤微环境，该肿瘤微环境允许改善的免疫应答和更好的抗肿瘤活性。改善的抗肿瘤活性可以是例如增加的疗效和/或更持久的应答
因此，本发明提供了KRAS G12C抑制剂，即1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐，其用于在治疗如本文所述的癌症中使用。
因此，本发明还提供了药物组合，该药物组合包含KRAS G12C抑制剂，如化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和选自SHP2抑制剂(如TNO155，或其药学上可接受的盐)的第二治疗活性剂，以及PD-1抑制剂。除了这些组合，本发明还提供了三重组合，该三重组合由以下组成：化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)，以及PD-1抑制剂。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮，其具有结构
或其药学上可接受的盐，
以及
(ii)(3S,4S)-8-(6-氨基-5-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫代)吡嗪-2-基)-3-甲基-2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-4-胺(TNO155)，其具有结构：
或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含：
1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐以及
(ii)PD-1抑制剂。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含：
1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐以及
(ii)斯巴达珠单抗替雷利珠单抗。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含：
1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐以及
(ii)替雷利珠单抗。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐，
(ii)TNO155或其药学上可接受的盐，
以及
(iii)PD-1抑制剂。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐，
(ii)TNO155或其药学上可接受的盐，
以及
(iii)斯巴达珠单抗。
本发明还提供了药物组合，该药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐，
(ii)TNO155或其药学上可接受的盐，
以及
(iii)替雷利珠单抗。
应当理解，本文提到的“本发明的组合”或“本发明的一种或多种组合”旨在单独地包括这些药物组合中的每一种还旨在包括这些组合中的所有作为一组。
本发明提供了本发明的组合，其用于在治疗如本文所述的癌症中使用。
本发明提供了这些药物组合，其用于在治疗如本文所述的癌症中使用。
在本发明的实施例中，PD-1抑制剂选自PDR001(斯巴达珠单抗；诺华公司(Novartis))、纳武单抗(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))、派姆单抗(默克公司(Merck&Co))、匹地利珠单抗(医好科技公司(CureTech))、MEDI0680(英商梅迪缪思公司(Medimmune))、REGN2810(再生元公司(Regeneron))、TSR-042(泰萨罗公司(Tesaro))、PF-06801591(辉瑞公司(Pfizer))、替雷利珠单抗(BGB-A317；百济神州公司(Beigene))、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司(Incyte))、或AMP-224(安普利公司(Amplimmune))。
在本发明的实施例中，PD-1抑制剂是PDR001(斯巴达珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约300-400mg的剂量施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。
在本发明的实施例中，每3周一次或每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约300mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约400mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。
在本发明的实施例中，PD-1抑制剂是替雷利珠单抗。
在本发明的实施例中，以约100-300mg、或约200-300mg的剂量施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，每3周一次或每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约100-300mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约100-300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约200-300mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约200-300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。在本发明的实施例中，以约200mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的组合的另一个实施例中，化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，SHP2抑制剂(例如TNO155)或其药学上可接受的盐和PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)在分开的配制品中。
在另一个实施例中，本发明的组合用于同时或依序(以任何顺序)施用。
在另一个实施例中是用于治疗或预防有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的组合。
在本发明的实施例中，待治疗的癌症或肿瘤选自由以下组成的组：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，特别地当该癌症或肿瘤带有KRAS G12C突变时。原发部位不明但示出KRAS G12C突变的癌症也可以得益于用本发明的方法的治疗。
适当地，待治疗的癌症是肺癌、结直肠癌或食道癌。
在本发明的方法的实施例中，癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。
在方法的另外的实施例中，癌症是非小细胞肺癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是小细胞肺癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)。
在方法的另外的实施例中，癌症是胰腺癌(包括胰腺腺癌)。
在方法的另外的实施例中，癌症是子宫癌(包括子宫内膜癌)。
在方法的另外的实施例中，癌症是直肠癌(包括直肠腺癌)。
在方法的另外的实施例中，癌症是阑尾癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是小肠癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是食道癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)。
在方法的另外的实施例中，癌症是膀胱癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是卵巢癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是实体瘤
在方法的另外的实施例中，癌症是胃癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是鼻咽癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是肝细胞癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是尿路上皮膀胱癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。
在另外的实施例中，本发明提供了用于在制造用于治疗选自以下的癌症的药物中使用的本发明的组合：非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤，任选地其中该癌症或实体瘤是KRAS G12C突变型。在另一个实施例中是药物组合物，该药物组合物包含本发明的组合。
在另外的实施例中，药物组合物进一步包含如本文所述的一种或多种药学上可接受的赋形剂。
具体实施方式
KRAS G12C抑制剂化合物A
化合物A是1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮。化合物A还被称作“a(R)-1-(6-(4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)丙-2-烯-1-酮”。
化合物A及其结晶形式的合成如以下实例中所述。化合物A的结晶形式(例如，如实例中所述)也特别地可用于本发明的方法和用途中。
化合物A的结构如下：
可替代地，化合物A的结构可如下绘制：
化合物A也称为“JDQ443”或“NVP-JDQ443”并且描述于2021年6月24日公开的PCT申请WO 2021/124222的实例1中。WO 2021/124222(将其通过引用以其全文并入)还描述了可用于本发明的组合、用途和方法中的结晶形式(例如，变型HA)。
与索托拉西布和阿达格拉西布相比，化合物A利用与KRASG12C蛋白的独特相互作用以新颖的结合模式在KRAS的开关II环下结合。化合物A通过在位置12处与半胱氨酸形成共价键从而不可逆地诱捕KRASG12C的GDP束缚态，来以突变的选择性方式有效抑制KRASG12C细胞信号传导和增殖。
化合物A显示持续的体内目标占有率(TO)(在MiaPaCa2模型中KRASG12C TO t1/2为约66h)(尽管血液半衰期为约2小时)，并表现出线性PK/PD(药代动力学/药效动力学建模)关系。化合物A在携带KRAS G12C突变型肿瘤异种移植的小鼠中具有与索托拉西布和阿达格拉西布相当的剂量依赖性抗肿瘤活性(图5)。在小鼠、大鼠、和狗中，化合物A是口服生物可利用的，在预测以赋予抗肿瘤活性的范围内实现了暴露，并且耐受性良好。使用微型泵施用的化合物A的连续递送表明，曲线下面积(AUC)而非最大浓度(Cmax)是疗效的驱动因素。
可用于本发明的组合和方法的其他KRAS G12C抑制剂包括选自以下的化合物：1-(4-(6-氯-8-氟-7-(3-羟基-5-乙烯基苯基)喹唑啉-4-基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮-,-甲烷(1/2)；(S)-1-(4-(6-氯-8-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)喹唑啉-4-基)哌嗪-1-基)丙-2-烯-1-酮；和2-((S)-1-丙烯酰基-4-(2-(((S)-1-甲基吡咯烷-2-基)甲氧基)-7-(萘-1-基)-5,6,7,8-四氢吡啶并[3,4-d]嘧啶-4-基)哌嗪-2-基)乙腈以及以下文献中详述的化合物：WO2013/155223、WO 2014/143659、WO 2014/152588、WO 2014/160200、WO 2015/054572、WO2016/044772、WO 2016/049524、WO 2016164675、WO 2016168540、WO2017/058805、WO2017015562、WO 2017058728、WO 2017058768、WO 2017058792、WO 2017058805、WO2017058807、WO 2017058902、WO 2017058915、WO 2017087528、WO 2017100546、WO 2017/201161、WO 2018/064510、WO 2018/068017、WO 2018/119183、WO 2018/217651、WO 2018/140512、WO 2018/140513、WO 2018/140514、WO 2018/140598、WO 2018/140599、WO 2018/140600、WO 2018/143315、WO 2018/206539、WO 2018/218069、WO 2018/218070、WO 2018/218071、WO 2019/051291、WO 2019/099524、WO 2019/110751、WO 2019/141250、WO 2019/150305、WO 2019/155399、WO 2019/213516、WO 2019/213526、WO 2019/215203、WO 2019/217307和WO 2019/217691、WO 2019/232419、WO 2020/028706、WO 2020/047192、EP3628664、WO 2020081282、WO 2020085504、WO 2020/085493、WO 2020/097537、WO 2020/106640、WO 2020/113071、WO 2020/146613、WO 2020/156285、WO 2020/181110、WO 2020/178282、WO 2020/216190、WO 2020/236940、WO 2020/233592、WO 2020/238791、WO 2020/239077、WO 2020/239123,WO 2020/259513、WO 2020/259573、WO 2020/259432、WO 2021/000885、WO 2021/023154、WO 2021/027943、WO 2021/027911、CN 112390796、WO 2021/037018、CN 112430234、CN 112442029、WO 2021/043322、WO 2021/055728。
SHP2抑制剂
可用于本发明的组合和方法的SHP2抑制剂的实例包括TNO155、JAB3068(加科思公司(Jacobio))、JAB3312(加科思公司)、RLY1971(罗氏公司(Roche))、SAR442720(赛诺菲公司(Sanofi))、RMC4450(革命药物公司(Revolution Medicines))、BBP398(Navire公司)、BR790(上海蓝光公司(Shanghai Blueray))、SH3809(南京圣和公司(Nanjing Sanhome))、PF0724982(辉瑞公司)、ERAS601(Erasca公司)、RX-SHP2(Redx制药公司)、ICP189(诺诚健华(InnoCare))、HBI2376(沪亚生物(HUYA Bioscience))、ETS001(上海ETERN生物制药公司(Shanghai ETERN Biopharma))、TAS-ASTX(大鹏制药肿瘤学公司(Taiho Oncology))和X-37-SHP2(X-37)。
根据本发明所使用的特别优选的SHP2抑制剂是(3S,4S)-8-(6-氨基-5-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫代)吡嗪-2-基)-3-甲基-2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-4-胺(TNO155)或其药学上可接受的盐。根据WO 2015/107495的实例69合成TNO155，将该文献通过引用以其全文并入。TNO155的优选的盐是琥珀酸盐。
另外，SHP2抑制剂包括以下中描述的化合物：WO 2015/107493、WO 2015/107494、WO 2015/107495、WO 2016/203406、WO 2016/203404、WO 2016/203405、WO 2017/216706、WO2017/156397、WO 2020/063760、WO 2018/172984、WO 2017/211303、WO 21/061706、WO2019/183367、WO 2019/183364、WO 2019/165073、WO 2019/067843、WO 2018/218133、WO2018/081091、WO 2018/057884、WO 2020/247643、WO 2020/076723、WO 2019/199792、WO2019/118909、WO 2019/075265、WO 2019/051084、WO 2018/136265、WO 2018/136264、WO2018/013597、WO 2020/033828、WO 2019/213318、WO 2019/158019、WO 2021/088945、WO2020/081848、WO 21/018287、WO 2020/094018、WO 2021/033153、WO 2020/022323、WO2020/177653、WO 2021/073439、WO 2020/156243、WO 2020/156242、WO 2020/249079、WO2020/033286、WO 2021/061515、WO 2019/182960、WO 2020/094104、WO 2020/210384、WO2020/181283、WO 2021/043077、WO 2021/028362、WO 2020/259679、WO 2020/108590以及WO2019/051469。
TNO155是含有蛋白酪氨酸磷酸酶-2(SHP2，由PTPN11基因编码)的口服生物可利用的Src同源-2结构域变构抑制剂，该蛋白酪氨酸磷酸酶-2将来自激活的受体酪氨酸激酶(RTK)的信号转导到下游途径(包括丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)途径)。SHP2还涉及免疫检查点和细胞因子受体信号传导。TNO155已在多种RTK依赖性人癌细胞系和体内肿瘤异种移植物中显示出疗效。
PD1-抑制剂
程序性死亡1(PD-1)蛋白是T细胞调节子的扩展的CD28/CTLA-4家族的抑制性成员。已经鉴定出PD-1的两种配体PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，已经证实两者在结合PD-1时下调T细胞活化。PD-L1在多种人癌症中大量存在。
PD-1被认为是负调节TCR信号的免疫抑制性蛋白。PD-1和PD-L1之间的相互作用可以充当免疫检查点，所述相互作用可以导致例如肿瘤浸润性淋巴细胞的减少、T细胞受体介导的增殖的减少和/或癌细胞的免疫逃避。通过抑制PD-1与PD-L1或PD-L2的局部相互作用可以逆转免疫抑制；当PD-1与PD-L2的相互作用被阻断时，效果也是累加的。
本发明的包含PD1-抑制剂(例如，斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的药物组合特别地可用于本发明的方法中，因为KRAS G12C与更高的PD-L1表达率相关。
在某些实施例中，化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物进一步与PD-1抑制剂组合施用。在某些实施例中，化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和SHP2抑制剂(例如TNO155或其药学上可接受的盐)进一步与PD-1抑制剂组合施用。在一些实施例中，PD-1抑制剂选自斯巴达珠单抗(PDR001，诺华公司)、纳武单抗(百时美施贵宝公司)、派姆单抗(默克公司)、匹地利珠单抗(医好科技公司)、MEDI0680(英商梅迪缪思公司)、塞米普利单抗(REGN2810)(再生元公司)、TSR-042(泰萨罗公司)、PF-06801591(辉瑞公司)、替雷利珠单抗(BGD-A317，百济神州公司)、BGB-108(百济神州公司)、INCSHR1210(因赛特公司)、或AMP-224(安普利公司)。根据本发明所使用的特别优选的PD-1抑制剂是斯巴达珠单抗。根据本发明所使用的另一种特别优选的PD-1抑制剂是替雷利珠单抗。
PDR001也称为斯巴达珠单抗(抗PD-1抗体分子)，如题为“Antibody Molecules toPD-1and Uses Thereof[PD-1的抗体分子及其用途]”的2015年7月30日公布的US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的。
替雷利珠单抗也称为BGB-A317，一种抗PD-1抗体，描述于2015年3月19日公布的WO2015035606中，将该文献通过引用以其全文并入。
另外的抗PD-1抗体分子包括以下：
纳武单抗(百时美施贵宝公司)，也称为MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538、BMS-936558或纳武单抗(克隆5C4)和其他抗PD-1抗体披露于US 8,008,449和WO2006/121168(将其通过引用以其全文并入)中；
派姆单抗(默克公司)，也称为帕博利珠单抗(Lambrolizumab)、MK-3475、MK03475、SCH-900475或派姆单抗和其他抗PD-1抗体披露于Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine[新英格兰医学期刊]369(2):134–44，US 8,354,509和WO 2009/114335(将其通过引用以其全文并入)中；
匹地利珠单抗(医好科技公司)，也称为CT-011。匹地利珠单抗和其他抗PD-1抗体披露于Rosenblatt,J.等人,(2011)J Immunotherapy[免疫疗法杂志]34(5):409-18，US 7,695,715，US 7,332,582和US 8,686,119(将其通过引用以其全文并入)中；
MEDI0680(英商梅迪缪思公司)，也称为AMP-514。MEDI0680和其他抗PD-1抗体披露于US 9,205,148和WO 2012/145493(将其通过引用以其全文并入)中；
AMP-224(B7-DCIg(安普利穆尼公司))，例如，披露于WO 2010/027827和WO 2011/066342(将其通过引用以其全文并入)中；
REGN2810(再生元公司)；PF-06801591(辉瑞公司)；BGB-A317或BGB-108(百济神州公司)；INCSHR1210(因赛特公司)也称为INCSHR01210或SHR-1210；TSR-042(泰萨罗公司)，也称为ANB011；以及其他已知的抗PD-1抗体，包括描述于例如以下中的那些：WO 2015/112800、WO 2016/092419、WO 2015/085847、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2014/209804、WO 2015/200119、US 8,735,553、US 7,488,802、US 8,927,697、US 8,993,731、和US 9,102,727(将其通过引用以其全文并入)。
示例性PD-1抑制剂
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD-1抗体分子，如题为“PD-1的抗体分子及其用途”的2015年7月30日公布的US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中所述的。在一个实施例中，抗PD-1抑制剂是斯巴达珠单抗，也称为PDR001。在一些实施例中，抗PD-1抗体分子是BAP049-克隆E或BAP049-克隆B。在其他实施例中，抗PD1抗体分子是替雷利珠单抗，也称为BGB-A317。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含来自重链和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个互补决定区(CDR)(或总体上全部CDR)，该重链和轻链可变区包含表1(例如，来自表1中披露的BAP049-克隆-E或BAP049-克隆-B的重链和轻链可变区序列)中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中，CDR根据卡巴特(Kabat)定义(例如，如表1中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据乔西亚(Chothia)定义(例如，如表1中所列出的)。在一些实施例中，CDR根据卡巴特和乔西亚二者的组合CDR定义(例如，如表1中所列出的)。在一个实施例中，VH CDR1的卡巴特和乔西亚CDR的组合包含氨基酸序列GYTFTTYWMH(SEQ ID NO:541)。在一个实施例中，相对于表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，CDR中的一个或多个(或总体上全部CDR)具有一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个变化，例如氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)或缺失。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:501的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:502的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:503的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:510的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:511的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:512的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表1中。
在本发明的实施例中，抗体分子包含：含有由SEQ ID NO:524的核苷酸序列编码的VHCDR1、由SEQ ID NO:525的核苷酸序列编码的VHCDR2、和由SEQ ID NO:526的核苷酸序列编码的VHCDR3的VH；以及含有由SEQ ID NO:529的核苷酸序列编码的VLCDR1、由SEQ ID NO:530的核苷酸序列编码的VLCDR2、和由SEQ ID NO:531的核苷酸序列编码的VLCDR3的VL，各自披露于表1中。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:547的VHCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:548的VHCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:549的VHCDR3氨基酸序列的重链可变区(VH)；以及含有SEQ ID NO:542的VLCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:543的VLCDR2氨基酸序列、和SEQ ID NO:544的VLCDR3氨基酸序列的轻链可变区(VL)，各自披露于表1中。在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:550的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:550具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:545的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:545具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:551的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:551具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:546的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:546具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:506的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:506具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VH。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:520的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:520具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:516的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:516具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的VL。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:506的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:520的氨基酸序列的VL。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:506的氨基酸序列的VH和含有SEQ ID NO:516的氨基酸序列的VL。
在本发明的实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:507的核苷酸序列，或与SEQID NO:507具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的VH。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:521或517的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:521或517具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的VL。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:507的核苷酸序列编码的VH和由SEQ ID NO:521或517的核苷酸序列编码的VL。
在本发明的实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:508的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:508具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的重链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:522的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:522具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:518的氨基酸序列、或与SEQ ID NO:518具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:508的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:522的氨基酸序列的轻链。在一个实施例中，抗PD-1抗体分子包含：含有SEQ ID NO:508的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:518的氨基酸序列的轻链。
在本发明的实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:509的核苷酸序列，或与SEQID NO:509具有至少85％、90％、95％、或99％、或更高同一性的核苷酸序列编码的重链。在一个实施例中，抗体分子包含：由SEQ ID NO:523或519的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:523或519具有至少85％、90％、95％、或99％或更高同一性的核苷酸序列编码的轻链。在一个实施例中，抗体分子包含由SEQ ID NO:509的核苷酸序列编码的重链和由SEQ ID NO:523或519的核苷酸序列编码的轻链。
本文所述的抗体分子可以通过运载体、宿主细胞、和在US 2015/0210769(将其通过引用以其全文并入)中描述的方法制得。
本文所述的抗体分子可如WO 2015035606中描述的制得，该文献公布于2015年3月19日，将其通过引用以其全文并入。
在某些实施例中，将检查点抑制剂(例如，本文描述的TIM-3的抑制剂)与TGF-β抑制剂的组合抑制进一步与PD-1抑制剂组合，并用于治疗癌症(例如，骨髓纤维化)。
在一些实施例中，以介于以下的剂量施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)：约100mg至约600mg，例如，约100mg至约500mg、约100mg至约400mg、约100mg至约300mg、约100mg至约200mg、约200mg至约600mg、约200mg至约500mg、约200mg至约400mg、约200mg至约300mg、约300mg至约600mg、约300mg至约500mg、约300mg至约400mg、约400mg至约600mg、约400mg至约500mg、或约500mg至约600mg。在一些实施例中，以约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、或约600mg的剂量施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。在一些实施例中，每四周一次施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。在一些实施例中，每三周一次施用(例如，斯巴达珠单抗)。在一些实施例中，静脉内施用(例如，斯巴达珠单抗)。在一些实施例中，经约20分钟至40分钟(例如，约30分钟)的时间段施用(例如，斯巴达珠单抗)。
在一些实施例中，以介于约300mg至约500mg(例如，约400mg)的剂量，经约20分钟至约40分钟(例如，约30分钟)的时间段，每两周一次，静脉内施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。在一些实施例中，以介于约200mg至约400mg(例如，约300mg)的剂量，经约20分钟至约40分钟(例如，约30分钟)的时间段，每三周一次，静脉内施用PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)。
在一些实施例中，将PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗)与TIM-3抑制剂(例如，抗TIM3抗体)和TGF-β抑制剂(例如，NIS793)组合施用。
在本发明的实施例中，每3周一次或每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约100-300mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约100-300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约200-300mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约200-300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约200mg的剂量每3周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
在本发明的实施例中，以约300mg的剂量每4周一次施用PD-1抑制剂(例如，替雷利珠单抗)。
表1.示例性抗PD-1抗体分子的氨基酸和核苷酸序列
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在本发明的组合和方法中，每种治疗活性剂可以分开地、同时地或依序地(以任何顺序)施用。
在本发明的组合和方法中，以口服剂型施用化合物A和/或TNO155。
在本发明的组合和方法中，静脉内施用替雷利珠单抗。
在另一个实施例中，提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的药物组合和至少一种药学上可接受的载体。
KRAS G12C抑制剂
本发明的方法和组合可以特别地用于治疗对用另一种KRAS G12C抑制剂的先前治疗具有抗性的癌症或肿瘤。
此类KRAS G12C抑制剂的实例包括索托拉西布(美商安进公司(Amgen))、阿达格拉西布(Mirati公司)、D-1553(益方生物(InventisBio))、BI1701963(勃林格公司(Boehringer))、GDC6036(罗氏公司)、JNJ74699157(J&J公司)、X-Chem KRAS(X-Chem公司)、LY3537982(礼来公司(Lilly))、BI1823911(勃林格公司)、AS KRAS G12C(亚盛药业公司(Ascentage Pharma))、SF KRAS G12C(赛诺菲公司)、RMC032(革命药物公司)、JAB-21822(加科思制药公司(Jacobio Pharmaceuticals))、AST-KRAS G12C(艾力斯制药公司(AllistPharmaceuticals))、AZ KRAS G12C(阿斯利康公司(Astra Zeneca))、NYU-12VC1(纽约大学(New York University))、和RMC6291(革命药物公司)。
在一个实施例中，待治疗的癌症或肿瘤对用索托拉西布或阿达格拉西布的先前治疗具有抗性或有进展。
在一个实施例中，癌症(例如NSCLC)先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、D-1553、和GDC6036)治疗。
预期涉及化合物A与(i)SHP2抑制剂或(ii)PD-1抑制剂，或涉及化合物A与SHP2抑制剂和PD-1抑制剂两者的组合疗法将特别地可用于克服这种抗性。
待治疗的癌症
化合物A是KRAS G12C的强有力且选择性的共价抑制剂，化合物A与KRAS G12C结合并且将其诱捕至无活性的鸟苷二磷酸(GDP)束缚态。通过抑制肿瘤细胞中的KRAS G12C并阻止下游信号传导，化合物A有可能降低患有KRAS G12C突变型癌症或肿瘤的患者的肿瘤生长。
由于化合物A以替代性结合模式与KRAS G12结合并对双突变体(其在临床试验中被确定为介导对阿达格拉西布的抗性(参见Tanaka2021))显示出活性，因此化合物A可以单独以及与选自SHP2抑制剂(例如，TNO 155)和PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的一种或两种药剂组合提供有效的治疗，以克服在用KRAS抑制剂(如阿达格拉西布或索托拉西布)治疗期间出现的抗性机制。
因此，化合物A和包含化合物A的组合可用于治疗癌症和KRAS G12C突变的癌症或肿瘤。本发明的化合物A和组合可用于治疗选自由以下组成的组的癌症或肿瘤：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，特别地当该癌症或肿瘤带有KRAS G12C突变时。原发部位不明但示出KRAS G12C突变的癌症也可以得益于用本发明的方法的治疗。
待通过本发明的化合物、组合和方法治疗的其他癌症包括胃癌、鼻咽癌、肝细胞癌、和霍奇金淋巴瘤，特别地当该癌症带有KRAS G12C突变时。
特别地，本发明提供了治疗方法和用于在治疗选自由以下组成的组的癌症中使用的组合：肺癌(如肺腺癌和非小细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)和实体瘤，特别地当该癌症或肿瘤带有KRAS G12C突变时。
癌症可以处于早期、中期、晚期或可以是转移性癌症。
在一些实施例中，癌症是晚期癌症。在一些实施例中，癌症是转移性癌症。在一些实施例中，癌症是复发性癌症。在一些实施例中，癌症是难治性癌症。在一些实施例中，癌症是反复发作性癌症。在一些实施例中，癌症是不可切除性癌症。
癌症可以处于早期、中期、晚期或是转移性癌症。
本发明的化合物A和组合还可用于治疗以RAS突变为特征的实体恶性肿瘤。
本发明的化合物A和组合还可用于治疗以KRAS的一种或多种突变，特别是KRAS中的G12C突变为特征的实体恶性肿瘤。
本发明提供了本发明的化合物A和组合，其用于在治疗以获得性KRAS改变(选自G12D/R/V/W、G13D、Q61H、R68S、H95D/Q/R、Y96C、Y96 D和KRASG12C等位基因的高水平扩增)为特征或以获得性旁路抗性机制为特征的癌症或实体瘤中使用，这些旁路抗性机制包括MET扩增；NRAS、BRAF、MAP2K1、和RET中的激活突变；涉及ALK、RET、BRAF、RAF1、和FGFR3的致癌性融合；以及NF1和PTEN中的功能丧失性突变。
因此，作为另外的实施例，本发明提供了化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，其单独或与第二治疗剂组合用于在疗法中使用，该第二治疗剂选自SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)、和PD-1抑制剂。本发明还提供了由以下组成的三重组合：化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)，以及PD-1抑制剂。作为另外的实施例，本发明提供了本发明的组合，其用于在疗法中使用。在优选的实施例中，疗法或药物有用的疗法对选自可以通过抑制RAS突变型蛋白，特别地KRAS、HRAS或NRAS G12C突变型蛋白来治疗的疾病是有用的。在另一个实施例中，本发明提供了治疗有需要的受试者的疾病的方法，该疾病通过抑制RAS突变型蛋白，特别地KRAS、HRAS或NRAS蛋白的G12C突变型进行治疗，其中该方法包括向该受试者施用治疗有效量的本发明的化合物、或本发明的组合。
在更优选的实施例中，疾病选自上述列表，适当地是非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌。
在优选的实施例中，疗法用于疾病，该疾病可以通过抑制RAS突变型蛋白，特别地KRAS、HRAS或NRAS蛋白的G12C突变型来治疗。在更优选的实施例中，疾病选自上述列表，适当地是非小细胞肺癌、结直肠癌和胰腺癌，其特征在于KRAS、HRAS或NRAS中的G12C突变。
在另一个实施例中是治疗(例如，减轻、抑制或延迟进展中的一项或多项)受试者的癌症或肿瘤的方法，该方法包括向有需要的受试者施用包含化合物A或其药学上可接受的盐与如本文所述的第二治疗剂的组合的药物组合物。
因此，本发明提供了治疗(例如，减轻、抑制或延迟进展中的一项或多项)有需要的患者的癌症或肿瘤的方法，其中该方法包括向该有需要的患者施用作为单一药剂或作为与治疗活性量的一种或两种治疗活性剂的组合疗法的治疗活性量的化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，这些治疗活性剂选自SHP2抑制剂(例如，TNO155或其药学上可接受的盐)、和PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)，其中该癌症是肺癌(包括肺腺癌和非小细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)和实体瘤，任选地其中该癌症是KRAS-、NRAS-或HRAS-G12C突变型。
在本发明的实施例中，待治疗的癌症或肿瘤选自由以下组成的组：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，特别地当该癌症或肿瘤带有KRAS G12C突变时。原发部位不明但示出KRAS G12C突变的癌症也可以得益于用本发明的方法的治疗。
在本发明的方法的实施例中，癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。
在方法的另外的实施例中，癌症是结直肠癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是胃癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是鼻咽癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是非小细胞肺癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是小细胞肺癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是胰腺癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是实体瘤。
在方法的另外的实施例中，癌症是阑尾癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是小肠癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是食道癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是肝胆癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是肝细胞癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是膀胱癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是尿路上皮膀胱癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是卵巢癌。
在方法的另外的实施例中，癌症是霍奇金淋巴瘤。
本发明的化合物A和方法以及组合可用作一线疗法。
本发明的化合物A和方法以及组合还可用作一线疗法。
本发明的方法和组合可用作二线疗法或更晚线疗法。在此方面，例如与其他KRASG12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)相比，化合物A与突变型KRAS G12C的独特相互作用将可用于靶向抗性突变，这些抗性突变可能在用其他KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)治疗后产生。
单独的化合物A或与如本文所述的一种或多种治疗剂的组合，可用于治疗如本文所述的癌症或肿瘤，其中患者可能是治疗不可知的患者或在先前疗法中有进展和/或复发的患者。
先前疗法包括：
放射疗法；
手术；
标准护理疗法，如基于氟嘧啶、奥沙利铂、和/或伊立替康的化学疗法；
化学疗法，如培美曲塞、或基于铂的化学疗法；
免疫检查点抑制剂疗法，如抗PD-1免疫疗法(例如，派姆单抗、斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗或纳武单抗)或抗PD-L1免疫疗法(例如阿特利珠单抗或德瓦鲁单抗)；
用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036、或D-1553，适当地索托拉西布或阿达格拉西布；更特别地索托拉西布)的疗法。
先前疗法还包括单独的派姆单抗或与化学疗法的组合。例如，待通过本发明的方法和组合治疗的患者或受试者包括患有癌症(例如KRAS G12C突变型NSCLC(包括晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC))的患者，任选地其中该患者已经接受了先前疗法并且有进展。
在本发明的实施例中，包括用作为单一疗法和在如本文所述的组合中的化合物A治疗的方法，待治疗的受试者或患者选自：
-患有KRAS G12C突变型实体瘤(例如晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型实体瘤)的患者，任选地其中该患者已经接受了标准护理疗法但失败了，或者对先前的研究性疗法和/或批准的疗法不耐受或不适合或具有难治性；
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中该患者已经接受了组合或顺序进行的基于铂的化学疗法方案和免疫检查点抑制剂疗法但失败了；
-患有KRAS G12C突变型CRC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型CRC)的患者，任选地其中该患者已经接受了标准护理疗法但失败了，所述标准护理疗法包括基于氟嘧啶、奥沙利铂、和/或伊立替康的化学疗法；以及
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中该患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中该患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中该患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗，并且该患者患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中该患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤；
-患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中该患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤；
-患有带有KRASG12C突变的局部晚期或转移性NSCLC的未进行治疗的患者。
在一个实施例中，提供了化合物A或其药学上可接受的盐，其用于在治疗患者的KRAS G12C突变型NSCLC中使用，该患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)治疗。
在一个实施例中，提供了包含化合物A或其药学上可接受的盐、和TNO或其药学上可接受的盐的药物组合，其用于在治疗患者的KRAS G12C突变型NSCLC中使用，该患者先前已用KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)治疗。
在一个实施例中，提供了化合物A或其药学上可接受的盐，其用于在治疗患者的KRAS G12C突变型NSCLC中使用，该患者先前已接受了化学疗法和/或免疫疗法，随后接受了KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)。
在一个实施例中，提供了包含化合物A或其药学上可接受的盐、和TNO或其药学上可接受的盐的药物组合，其用于在治疗患者的KRAS G12C突变型NSCLC中使用，该患者先前已接受了化学疗法和/或免疫疗法，随后接受了KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)。
在另外的实施例中，以有效治疗癌症的量向有需要的受试者施用化合物A或其药学上可接受的盐。
在本发明的实施例中，以有效治疗癌症的量向有需要的受试者施用化合物A或其药学上可接受的盐、以及第二治疗剂和第三治疗剂(如果存在)的量。
在另外的实施例中，第二治疗剂或第三治疗剂是TNO155或其药学上可接受的盐。
在另外的实施例中，第二治疗剂或第三治疗剂是免疫调节剂，如PD-1抑制剂。
在另外的实施例中，PD-1抑制剂选自PDR001、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、BGB-A317、BGB-108、INCSHR1210或AMP-224。
在另外的实施例中，PD-1抑制剂是PDR001(斯巴达珠单抗)。
在另外的实施例中，PD-1抑制剂是BGB-A317(替雷利珠单抗)。
剂量和给药方案
利用临床前模型预测化合物A的有效暴露。当根据本发明单独或以组合疗法使用时，化合物A的剂量被设计为具有药理活性并产生抗肿瘤应答。
SHP2抑制剂和/或PD-1抑制剂的剂量选择同样受药代动力学(PK)、药效学、安全性、和疗效数据的混合的指导。
在本发明的实施例中，以范围从50至1600mg/天，例如从200至1600mg/天，或从400至1600mg/天的治疗有效剂量施用化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。化合物A的每日总剂量可选自50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200和1600mg。例如，化合物A的每日总剂量可选自200、300、400、600、800、1000、1200和1600mg。
在本发明的优选实施例中，以范围从100至400mg/天，例如从200至400mg/天的治疗有效剂量施用化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。例如，化合物A的每日总剂量可选自100mg、200mg、400mg和600mg；更优选地选自100mg、200mg、和400mg。
化合物A的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)方案连续施用。
例如，可以以200mg BID(每日总剂量为400mg)、400mg QD(每日总剂量为400mg)的剂量施用化合物A。可以以100mg BID(每日总剂量为200mg)、200mg QD(每日总剂量为200mg)的剂量施用化合物A。还可以以每日600mg的每日总剂量，优选地每日两次(即300mgBID)施用化合物A。
结合PK患者数据的临床前目标占有率模型预测BID计划可能会导致更多数量的患者的应答增加。适当地，可以以100mg BID的剂量或200mg BID的剂量或300mg BID的剂量施用化合物A。典型地，可以以100mg的剂量每日两次施用(每日总剂量为200mg)或以200mg的剂量每日两次施用(每日总剂量为400mg)施用化合物A。
本发明的组合中的TNO 155的剂量被设计为具有药理活性，并具有协同抗肿瘤作用的潜力，同时最小化由于两种药剂对MAPK途径信号传导的抑制活性而产生的不可接受的毒性的可能性。可以连续或间歇施用TNO(例如2周施用/1周停用时间表)以维持临床疗效并最小化临床不良反应。
因此，可以以范围从10至80mg、或从10至60mg的每日总剂量施用TNO155。例如，TNO155的每日总剂量可选自10、15、20、30、40、60和80mg。TNO155的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)，2周施用/1周停用时间表QD或BID连续施用。TNO155的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)，连续(即无药物假期)QD或BID连续施用。
在本发明的组合中，以范围从50至1600mg/天(例如，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200或1600mg)或从200至1600mg/天(例如，200、300、400、600、800、1000、1200或1600mg)的剂量施用化合物A，并且以范围从10至80mg/天(0、15、20、30、40、60或80mg)的剂量施用TNO155，其中化合物A按连续时间表施用，并且TNO按两周施用/一周停用时间表或连续时间表施用。
在本发明的组合中，以约300mg的剂量每3周一次、或约400mg的剂量每4周一次施用斯巴达珠单抗。更优选地，通过注射(例如，皮下或静脉内)，以约300mg的剂量每3周一次(Q3W)施用斯巴达珠单抗。
在本发明的组合中，按连续时间表以范围从50至1600mg/天(例如，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200或1600mg)或从200至1600mg/天(例如，200、300、400、600、800、1000、1200或1600mg)的剂量施用化合物A，并且以约300mg的剂量每3周一次、或约400mg的剂量每4周一次施用斯巴达珠单抗。
在本发明的组合中，按连续时间表以范围从50至1600mg/天(例如，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200或1600mg)或从200至1600mg/天(例如，200、300、400、600、800、1000、1200或1600mg)的剂量施用化合物A，按两周施用/一周停用时间表或连续时间表以从10至80mg(0、15、20、30、40、60或80mg)的范围的剂量施用TNO155，并且以约300mg的剂量每3周一次、或约400mg的剂量每4周一次施用斯巴达珠单抗。
在本发明的组合中，以约200mg的剂量每3周一次、或约300mg的剂量每4周一次施用替雷利珠单抗。可以通过注射(例如，皮下或静脉内)施用替雷利珠单抗。
在本发明的组合中，按连续时间表以范围从50至1600mg/天(例如，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200或1600mg)的剂量施用化合物A，并且以约200mg的剂量每3周一次、或约300mg的剂量每4周一次施用替雷利珠单抗。
在本发明的组合中，按连续时间表以范围从50至1600mg/天(例如，50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、800、1000、1200或1600mg)的剂量施用化合物A，按两周施用/一周停用时间表或连续时间表以范围从10至80mg(0、15、20、30、40、60或80mg)的剂量施用TNO155，并且以约200mg的剂量每3周一次、或约300mg的剂量每4周一次施用替雷利珠单抗。
组合的示例性剂量和给药如下。
表：
化合物A-连续时间表* TNO155给药，2周施用/1周停用
50mg BID 10mg或20mg
100mg QD 10mg或20mg
100mg BID 10mg或20mg
200mg QD 10mg或20mg
200mg BID 10mg或20mg
400mg QD 10mg或20mg
300mg BID 10mg或20mg
*：当替雷利珠单抗与化合物A组合使用，或与化合物A和TNO155组合使用时，优选以约200mg的剂量每3周一次施用替雷利珠单抗。
或如下：
化合物A-连续时间表* TNO155给药，连续时间表
50mg BID 10mg或20mg
100mg QD 10mg或20mg
100mg BID 10mg或20mg
200mg QD 10mg或20mg
200mg BID 10mg或20mg
400mg QD 10mg或20mg
300mg BID 10mg或20mg
*：当替雷利珠单抗与化合物A组合使用，或与化合物A和TNO155组合使用时，优选以约200mg的剂量每3周一次施用替雷利珠单抗。
在本发明的组合中，以约200mg的剂量每3周一次施用替雷利珠单抗，并且以10mg至60mg的每日总剂量，每日一次或每日两次施用(优选地按两周施用/一周停用时间表)来施用TNO。适当地，可以以100mg-300mg BID，优选地100-200mg BID，例如100mg BID的剂量，或以200mg BID的剂量或300mg BID的剂量施用化合物A。
药物组合物
化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物可以与一种或多种(例如，一种或两种)其他治疗剂同时施用、或在其之前或之后施用。化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物可以通过与其他药剂相同或不同的施用途径分开施用，或与其他药剂在相同的药物组合物中一起施用。
在另一个方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，这些药学上可接受的组合物包含治疗有效量的选自化合物A、TNO155和PD-1抑制剂的一种或多种(例如，一种或两种)治疗剂，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含KRAS G12C抑制剂(如化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和一种或多种(例如，一种或两种)治疗活性剂，这些治疗活性剂选自SHP2抑制剂(如TNO155，或其药学上可接受的盐)和PD-1抑制剂。在另外的实施例中，组合物包含至少两种药学上可接受的载体，如本文所述的那些。出于本发明的目的，除非另有指定，否则溶剂化物和水合物通常被认为是组合物。优选地，药学上可接受的载体是无菌的。可以将药物组合物配制成用于特定的施用途径，如口服施用、肠胃外施用和直肠施用等。另外，本发明的药物组合物可以固体形式(包括但不限于胶囊、片剂、丸剂、颗粒、粉末或栓剂)、或以液体形式(包括但不限于溶液、悬浮液或乳液)制成。可以对药物组合物进行常规的制药操作，如灭菌和/或可以使其含有常规的惰性稀释剂、润滑剂或缓冲剂，以及辅助剂(如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂和缓冲液等)。
典型地，药物组合物是包含活性成分及以下中的一种或多种的片剂或明胶胶囊：
a)稀释剂，例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸；
b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石、硬酯酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；
c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；
d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或泡腾混合物；以及
e)吸附剂、着色剂、风味剂和甜味剂。
在实施例中，药物组合物是仅包含活性成分的胶囊。
片剂可以根据本领域已知的方法进行薄膜包衣或肠溶包衣。
用于口服施用的合适的组合物包括有效量的呈片剂、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂、溶液或固体分散体形式的本发明的化合物。将旨在用于口服使用的组合物根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且为了提供药学上精致的并且适口的制剂，此类组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的药剂：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。片剂可含有与适用于制造片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分。这些赋形剂是，例如，惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂及崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；粘合剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂是未包衣的，或者通过已知技术进行包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在较长的时间段内提供持久的作用。例如，可以采用时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于口服用途的配制品可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分是与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或呈现为软明胶胶囊，其中活性成分是与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
某些可注射组合物是水性等渗溶液或悬浮液，并且栓剂有利地由脂肪乳液或悬浮液制备。所述组合物可以是灭菌的和/或含有辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液)。另外，它们还可以含有其他有治疗价值的物质。所述组合物分别根据常规的混合、制粒或包衣方法制备，并含有约0.1％-75％，或含有约1％-50％的活性成分。
适用于透皮应用的适合的组合物包括有效量的本发明的化合物和适合的载体。适于透皮递送的载体包括帮助通过宿主皮肤的可吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮装置呈绷带的形式，该绷带包含衬件、含有化合物并任选地含有载体的贮库、任选地在延长的一段时间内以受控且预定的速率将化合物递送至宿主皮肤的控速屏障、以及将该装置固定至皮肤的器具。
适用于局部施用(例如，施用至皮肤及眼睛)的组合物包括水溶液、悬浮液、软膏剂、霜剂、凝胶或可喷雾配制品，例如，用于借由气溶胶或类似物递送。这些局部递送系统将具体地适用于真皮施用，例如，用于治疗皮肤癌，例如，用于防晒霜、洗剂、喷雾及类似物中的预防用途。因此它尤其适用于局部中的用途，包括本领域中熟知的化妆品、配制品。此类系统可含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。
如本文所用，局部施用也可以涉及吸入或鼻内施用。它们可以在使用或不使用合适的推进剂的情况下自干燥粉末吸入器以干燥粉末的形式(单独的作为混合物，例如与乳糖的干燥掺混物，或经混合的组分颗粒，例如与磷脂混合的组分颗粒)或自加压容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器以气溶胶喷雾形式便利地递送。
在一个实施例中，本发明提供了产品，该产品包含化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和至少一种其他治疗剂，该产品作为组合制剂用于在疗法中同时、分开或顺序使用。在一个实施例中，疗法是治疗特征在于KRAS、HRAS或NRAS G12C突变的疾病或病症。提供的作为组合制剂的产品包括组合物，该组合物在同一药物组合物中共同包含本发明的化合物和一种或多种(例如，一种或两种)治疗活性剂(选自SHP2抑制剂(如TNO155或其药学上可接受的盐)和PD-1抑制剂)，或以单独的形式(例如以试剂盒的形式)包含化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和一种或多种其他治疗剂。
在一个实施例中，本发明提供了药物组合物，该药物组合物包含本发明的化合物和另一种或多种治疗剂。任选地，药物组合物可以包含如上所述的药学上可接受的载体。
在一个实施例中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包括两种或更多种分开的药物组合物，其中至少一种含有化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物；TNO155或其药学上可接受的盐，和PD-1抑制剂(例如，斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)。在一个实施例中，试剂盒包含用于单独地保留所述组合物的装置，如容器、分开的瓶、或分开的箔袋。此类试剂盒的实例是泡罩包装，如典型地用于包装片剂、胶囊等。
本发明试剂盒可以用于施用不同剂型(例如，口服和肠胃外)，用于以不同剂量间隔施用单独的组合物，或用于相对彼此滴定单独的组合物。为了有助于依从性，本发明试剂盒典型地包括施用指导。
在本发明的组合疗法中，本发明的化合物和其他治疗剂可以由相同或不同的制造商生产和/或配制。此外，可以将本发明的化合物和其他治疗剂一起形成组合疗法：(i)在将组合产品发布给医师之前(例如，在包含本发明的化合物和其他治疗剂的试剂盒的情况下)；(ii)在施用前不久，由医师自己(或在医师的指导下)进行；(iii)在患者自身中，例如在顺序施用本发明的化合物和其他治疗剂期间。本发明化合物可以与一种或多种其他的治疗剂同时施用、或在其之前或之后施用。本发明化合物可以通过与其他药剂相同或不同的施用途径分开施用，或在相同的药物组合物中一起施用。
通常，本发明的组合的合适日剂量将是每种化合物有效产生治疗效果的最低剂量的量。
在另一个方面，本发明提供了药学上可接受的组合物，这些药学上可接受的组合物包含治疗有效量的一种或多种上述主题化合物，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂配制在一起。
定义
除非另外说明，否则上文和下文中使用的通用术语优选在本披露的上下文中具有以下含义，其中无论在什么情况下使用的更通用的术语可以彼此独立地由更具体的定义代替或保留，从而定义本发明的更详细实施例。
术语“KRAS G12C突变型(mutated)癌症”应理解为等同于术语“KRAS G12C突变型(mutant)癌症”。术语“KRAS G12C突变型NSCLC”等应相应地进行解释。癌症是否为KRASG12C突变型可以通过本领域已知的测试来确定，例如通过FDA批准的测试。
当剂量被提及为‘约’特定值，或被提及为特定值(即该特定值前无术语“约”)时，其旨在包括在指定值±10％或±5％附近的范围。按照本领域的惯例，剂量是指游离形式的治疗剂的量。例如，当提及20mg的TNO155的剂量，并且TNO155以其琥珀酸盐使用时，所用治疗剂的量相当于20mg游离形式的TNO155。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”旨在包括易于患有癌症或任何障碍(直接或间接涉及癌症)或受其折磨的动物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、猿、猴、狗、乳牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在实施例中，受试者是人，例如患有癌症、具有患癌症的风险或可能易于患有癌症的人。
如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”包括解除、减轻或缓解受试者的至少一种症状或者实现疾病进展延迟的治疗。例如，治疗可以是减少一种或几种障碍的症状，或者部分或完全根除障碍(如癌症)。在本披露的含义范围内，术语“治疗”还表示阻止、延迟发作(即在疾病的临床表现之前的时间段)和/或降低疾病发展或疾病恶化的风险。
除非另外指明，否则术语“包含”和“包括”在本文中以其开放式和非限制性的含义使用。
除非本文另外指明或明显与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求的上下文中)，术语“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”和“所述(the)”以及类似的指示词应当被解释为涵盖单数和复数这两者。当将复数形式用于化合物、盐等时，这也意指单一化合物、盐等。
术语“组合疗法”或“与……组合”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗在本披露中描述的病症或障碍(例如癌症)。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，如以具有固定比率的活性成分的单个胶囊施用。可替代地，这种施用涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以在施用之前将粉末和/或液体重构或稀释至所需剂量。另外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以依序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病症或障碍方面提供药物组合的有益效果。
组合疗法可以提供“协同”并且证明是“协同的”，即，当活性成分一起使用时所实现的效应大于由分别使用这些化合物所产生的效应的总和。当将活性成分为下述情形时可以获得协同效应：(1)共同配制并以组合的单位剂量配制品的形式同时施用或递送；(2)以分开的配制品的形式交替或平行递送；或(3)通过一些其他方案进行。当以交替疗法递送时，可以在依序(例如通过在单独注射器中不同的注射)施用或递送化合物时获得协同效应。通常，在交替疗法期间，将有效剂量的每种活性成分依序地即顺次地施用，而在组合疗法中，将有效剂量的两种或更多种活性成分一起施用。如本文所用，协同效应是指两种治疗剂(如，例如作为SHP2抑制剂的化合物TNO155和化合物A)的作用，该作用产生例如减缓增殖性疾病(特别是癌症)或其症状的症状进展的效果，这比单独施用每种药物的效果的简单加和要大。可以例如使用合适的方法计算协同效应，这些合适的方法如Sigmoid-Emax方程(Holford,N.H.G.和Scheiner,L.B.,Clin.Pharmacokinet.[临床药代动力学]6:429-453(1981))、Loewe可加性方程(Loewe,S.和Muischnek,H.,Arch.Exp.Pathol Pharmacol.[实验病理学与药理学档案]114:313-326(1926))以及中效方程(Chou,T.C.和Talalay,P.,Adv.Enzyme Regul.[酶调控研究进展]22:27-55(1984))。上面所指的每个方程式都可以应用于实验数据以生成相应的图以帮助评估药物组合的效果。与上文提到的方程相关的相应的图分别是浓度-效果曲线、等效线图曲线和组合指数曲线。
如本文所用，术语“药物组合”是指在一个剂量单位形式中的固定组合、或用于组合施用的非固定组合或套装盒，其中两种或更多种治疗剂可以在同一时间独立地施用或在时间间隔内分别施用，特别地其中这些时间间隔允许组合配偶体显示合作性例如协同效应。
如本文所用，短语“治疗有效量”是指包含本发明化合物的化合物、材料或组合物的量，其对于在动物中的至少一个细胞亚群中以适用于任何医学治疗的合理的受益/风险比产生一些所期望的治疗效果是有效的。
本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断的范围，适合用于与人和动物的组织接触而不产生过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。
如上文所述，本发明化合物的某些实施例可含有碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，并且由此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过使纯化的游离碱形式的本发明化合物与合适的有机或无机酸分别反应，并在随后的纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘酸盐(napthylate)、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖醛酸盐和月桂基磺酸盐等。(参见例如Berge等人(1977)“Pharmaceutical Salts[药用盐]”,J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]66:1-19)。
主题化合物的药学上可接受的盐包括化合物的常规的无毒盐或季铵盐，例如来自无毒的有机酸或无机酸。例如，此类常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些，该无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、胺磺酸、磷酸、硝酸等；以及从有机酸制备的盐，该有机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、异硫磺酸等。例如，TNO155的药学上可接受的盐是琥珀酸盐。
在本发明的组合中，化合物A、TNO155和PD-1抑制剂还旨在表示未经标记的形式以及化合物的同位素标记形式。同位素标记的化合物的一个或多个原子被具有选定原子质量或质量数的原子取代。可掺入TNO155和PD-1抑制剂的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧和氯的同位素(在可能的情况下)，例如2H、3H、11C、13C、14C、15N、35S、36Cl。本发明包括同位素标记的TNO155和PD-1抑制剂，例如其中存在放射性同位素(如3H和14C)或非放射性同位素(如2H和13C)。同位素标记的TNO155和PD-1抑制剂可用于代谢研究(用14C)、反应动力学研究(例如用2H或3H)、检测或成像技术，如正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)，包括药物或底物组织分布测定，或用于患者的放射治疗。本发明的同位素标记的化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或与在使用适当的同位素标记的试剂的所附实例中所述的那些类似的方法来制备。
此外，用较重的同位素，特别是氘(即，2H或D)取代可以提供来源于更大的代谢稳定性(例如，体内半衰期延长或剂量需求减少或治疗指数改进)的某些治疗优点。应当理解，在此上下文中，氘可以被认为是化合物A、TNO155或PD-1抑制剂的取代基。这种较重的同位素(特别是氘)的浓度可以由同位素富集因子来定义。如本文所用，术语“同位素富集因子”意指指定同位素的同位素丰度与天然丰度之间的比率。如果TNO155或PD-1抑制剂中的取代基指示氘，这种化合物具有针对每个指定的氘原子的同位素富集因子为至少3500(在每个指定的氘原子上52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)、或至少6633.3(99.5％氘掺入)。
在化合物A中，例如吲唑基环上的甲基基团，可以是氘化或全氘化的。
实例
实例1：1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲 唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)的制备
1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)的合成如下所述。
化合物A还被称作“a(R)-1-(6-(4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)丙-2-烯-1-酮”。
一般方法和条件：
温度以摄氏度给出。如果没有另外提及，则所有蒸发都在减压下进行，典型地在约15mm Hg与100mm Hg(＝20-133毫巴)之间进行。
使用的缩写是本领域常规的那些缩写。
使用电喷雾方法、化学方法和电子轰击离子化方法在LC-MS、SFC-MS或GC-MS系统上使用一系列以下配置的仪器获取质谱：使用ESI方法在LCMS系统上使用一系列以下配置的仪器获取具有沃特世(Waters)SQ检测器的沃特世Acquity UPLC或质谱：具有PDA检测器的沃特世Acquity LCMS。[M+H]+是指化学物种的质子化分子离子。
NMR光谱使用Bruker UltrashieldTM400(400MHz)、Bruker UltrashieldTM600(600MHz)和AscendTM400(400MHz)光谱仪运行，均以或不以四甲基硅烷作为内标。将化学位移(δ值)以四甲基硅烷的低场ppm报告，光谱分裂模式被指定为单信号(s)、双信号(d)、三重信号(t)、四重信号(q)、多重信号、未解析的或更多重叠信号(m)、宽信号(br)。溶剂在括号中给出。仅报告观察到且与溶剂峰不重叠的质子信号。
Celite：CeliteR(Celite公司)＝基于硅藻土的助滤剂
相分离器：Biotage-溶质相分离器-(部件号：120-1908-F，70mL，以及部件号：120-1909-J，150mL)
Thiol：SiliCYCLE硫醇金属净化剂-(R51030B，粒径：40-63μm)。
使用在反射几何中的Bruker Advance D8获得本文所述的X-射线粉末衍射(XRPD)图。使用零背景Si平板样品架分析粉末样品。辐射为Cu Kα在2°与40°2θ之间测量图谱。
样品量：5-10mg
样品架：零背景Si平板样品架
XRPD参数：
仪器法
微波：除非另有说明，否则所有微波反应均在Biotage引发器中进行，以0-400W从磁控管在2.45GHz在Robot Eight/Robot Sixty的处理能力情况下进行辐照。
UPLC-MS和MS分析方法：使用带沃特世SQ检测器的沃特世Acquity UPLC。
UPLC-MS-1：Acquity HSS T3；粒径：1.8μm；柱尺寸：2.1x 50mm；洗脱液A：H2O+0.05％ HCOOH+3.75mM乙酸铵；洗脱液B：CH3CN+0.04％ HCOOH；梯度：在1.40min内5％至98％ B，然后98％ B持续0.40min；流速：1mL/min；柱温：60℃。
UPLC-MS-3：Acquity BEH C18；粒径：1.7μm；柱尺寸：2.1x 50mm；洗脱液A：H2O+4.76％异丙醇+0.05％ HCOOH+3.75mM乙酸铵；洗脱液B：异丙醇+0.05％ HCOOH；梯度：在1.7min内1％至98％ B，然后98％ B持续0.1min；流速：0.6mL/min；柱温：80℃。
UPLC-MS-4：Acquity BEH C18；粒径：1.7μm；柱尺寸：2.1x 100mm；洗脱液A：H2O+4.76％异丙醇+0.05％ HCOOH+3.75mM乙酸铵；洗脱液B：异丙醇+0.05％ HCOOH；梯度：在8.4min内1％至60％ B，然后在1min内60％至98％ B；流速：0.4mL/min；柱温：80℃。
UPLC-MS-6：Acquity BEH C18；粒径：1.7μm；柱尺寸：2.1x 50mm；洗脱液A：H2O+0.05％ HCOOH+3.75mM乙酸铵；洗脱液B：异丙醇+0.05％ HCOOH；梯度：在1.7min内5％至98％ B，然后98％ B持续0.1min；流速：0.6mL/min；柱温：80℃。
制备型方法：
手性SFC方法：
C-SFC-1:柱：直链淀粉-C NEO 5μm；250x 30mm；流动相；流速：80mL/min；柱温：40℃；背压：120巴。
C-SFC-3:柱：Chiralpak AD-H 5μm；100x 4.6mm；流动相；流速：3mL/min；柱温：40℃；背压：1800psi。
缩写：
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用于制备本发明化合物的所有起始材料、结构单元、试剂、酸、碱、脱水剂、溶剂和催化剂是可商购获得的或可通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产。此外，本发明的化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机合成方法生产，如以下实例所示。
所有终产物、中间体和起始材料的结构通过标准分析光谱特征(例如，MS、IR、NMR)来确认。优选的(最具活性的)阻转异构体的代表性实例的绝对立体化学已经通过复合物的X射线晶体结构的分析确定，在这些复合物中，各个化合物与KRAS G12C突变型结合。在X射线结构不可得到的所有其他情况下，都以类似方式指定了立体化学，假设对于每一对，在共价竞争测定中表现出最高活性的阻转异构体具有与X射线晶体学观察到上述代表性实例的相同构型。绝对立体化学是根据卡恩-英格尔-普雷洛格(Cahn-lngold-Prelog)规则来指定的。
中间体C1的合成：叔丁基6-(3-溴-4-(5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H- 吲唑-4-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯
步骤C.1：叔丁基6-(甲苯磺酰基氧基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C2)
在20℃-25℃下，向叔丁基6-羟基-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯[1147557-97-8](2.92kg，12.94mmol)在DCM(16.5L)中的溶液中添加DMAP(316.12g，2.59mol)和TsCl(2.96kg，15.52mol)。在10℃-20℃下，向反应混合物中逐滴添加Et3N(2.62kg，25.88mol)。将反应混合物在5℃-15℃下搅拌0.5h，并且然后在18℃-28℃下搅拌1.5h。反应完成后，将反应混合物在真空下浓缩。向残余物中添加NaCl(在水中5％，23L)随后用EtOAc(23L)萃取。将合并的水层用EtOAc(10L x2)萃取。将合并的有机层用NaHCO3(在水中3％，10L x 2)洗涤并在真空下浓缩以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81-7.70(m,2H),7.53-7.36(m,2H),4.79-4.62(m,1H),3.84-3.68(m,4H),2.46-2.38(m,5H),2.26-2.16(m,2H),1.33(s,9H)。UPLC-MS-1：Rt＝1.18min；MS m/z[M+H]+；368.2。
步骤C.2：3,5-二溴-1H-吡唑
在-78℃下，经20分钟向3,4,5-三溴-1H-吡唑[17635-44-8](55.0g，182.2mmol)在无水THF(550mL)中的溶液中逐滴添加n-BuLi(145.8mL，364.5mmol)，保持内部温度在-78℃/-60℃。将RM在该温度下搅拌45min。然后将反应混合物用MeOH(109mL)在-78℃下小心淬灭并在该温度下搅拌30min。允许混合物达到0℃并搅拌1h。然后，将混合物用EtOAc(750mL)稀释并添加HCl(0.5N，300mL)。在真空下浓缩各层。将粗残余物溶解于DCM(100mL)中，冷却至-50℃并添加石油醚(400mL)。过滤沉淀的固体并用正己烷(250mL x2)洗涤并在真空下干燥以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.5(br s,1H),6.58(s,1H)。
步骤C.3：叔丁基6-(3,5-二溴-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯
在15℃下，向叔丁基6-(甲苯磺酰基氧基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C2)(步骤C.1，900g，2.40mol)在DMF(10.8L)中的溶液中添加Cs2CO3(1988g，6.10mol)和3,5-二溴-1H-吡唑(步骤C.2，606g，2.68mol)。将反应混合物在90℃下搅拌16h。将反应混合物倒入冰-水/盐水(80L)中并用EtOAc(20L)萃取。将水层用EtOAc(10L x 2)再萃取。将合并的有机层用盐水(10L)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空下浓缩。将残余物与二噁烷(1.8L)一起研磨，并在60℃下溶解。向浅黄色溶液中缓慢添加水(2.2L)，并在添加900mL水后开始重结晶。将所得悬浮液冷却至0℃，过滤，并用冷水洗涤。将滤饼与正庚烷一起研磨，过滤，然后在真空下在40℃下干燥以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.66(s,1H),4.86-4.82(m,1H),3.96-3.85(m,4H),2.69-2.62(m,4H),1.37(s,9H)；UPLC-MS-3：Rt＝1.19min；MS m/z[M+H]+；420.0/422.0/424.0。
步骤C.4：叔丁基6-(3-溴-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯 (中间体C3)
在惰性气氛下，在-80℃下，向叔丁基6-(3,5-二溴-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(步骤C.3，960g，2.3mol)在THF(9.6L)中的溶液中逐滴添加n-BuLi(1.2L，2.5mol)。将反应混合物在-80℃下搅拌10min。然后在-80℃下，向反应混合物中逐滴添加碘甲烷(1633g，11.5mol)。在-80℃下搅拌5min后，允许反应混合物温热至18℃。将反应混合物倒入饱和NH4Cl水溶液(4L)中并用DCM(10L)萃取。将分离的水层用DCM(5L)再萃取，并将合并的有机层在真空下浓缩。将粗产物在60℃下溶解于1,4-二噁烷(4.8L)中，然后逐滴缓慢添加水(8.00L)。将所得悬浮液冷却至17℃并搅拌30min。将固体过滤，用水洗涤，并在真空下干燥以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.14(s,1H),4.74-4.66(m,1H),3.95-3.84(m,4H),2.61-
2.58(m,4H),2.20(s,3H),1.37(s,9H)；UPLC-MS-1：Rt＝1.18min；MS m/z[M+H]+；356.1/358.1。
步骤C.5：叔丁基6-(3-溴-4-碘-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2- 甲酸酯(中间体C4)
在15℃下，向叔丁基6-(3-溴-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C3)(步骤C.4，350g，0.980mol)在乙腈(3.5L)中的溶液中添加NIS(332g，1.47mol)。将反应混合物在40℃下搅拌6h。反应完成后，将反应混合物用EtOAc(3L)稀释并用水(5Lx 2)洗涤。将有机层用Na2SO3(在水中10％，2L)、用盐水(2L)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空下浓缩以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.81-4.77(m,1H),3.94-3.83(m,4H),2.61-5.59(m,4H),2.26(s,3H),1.37(s,9H)；UPLC-MS-1：Rt＝1.31min；MS m/z[M+H]+；482.0/484.0。
步骤C.6：叔丁基6-(3-溴-4-(5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-4- 基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C1)
向叔丁基6-(3-溴-4-碘-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C4)(步骤C.5，136g，282mmol)和5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吲唑(中间体D1，116g，310mmol)在1,4-二噁烷(680mL)中的搅拌悬浮液中添加水性K3PO4(2M，467mL，934mmol)随后添加RuPhos(13.1g，28.2mmol)和RuPhos-Pd-G3(14.1g，16.9mmol)。在惰性气氛下，将反应混合物在80℃下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物倒入1MNaHCO3水溶液(1L)中并用EtOAc(1L x 3)萃取。将合并的有机层用盐水(1L x3)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空下浓缩。将粗残余物通过正相色谱法(洗脱液：石油醚/EtOAc从1/0至0/1)纯化以给出黄色油状物。将该油状物溶解于石油醚(1L)和MTBE(500mL)中，然后在真空中浓缩，以给出标题化合物。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.81(s,1H),7.66(s,1H),5.94-5.81(m,1H),4.90-4.78(m,1H),3.99(br s,2H),3.93-3.84(m,3H),3.81-3.70(m,1H),2.81-2.64(m,4H),2.52(s,3H),2.46-2.31(m,1H),2.11-1.92(m,5H),1.82-1.67(m,1H),1.64-1.52(m,2H),1.38(s,9H)；UPLC-MS-3：Rt＝1.30min；MS m/z[M+H]+；604.1/606.1。
合成中间体D1：5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3, 2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吲唑
步骤D.1：1-氯-2,5-二甲基-4-硝基苯
向2-氯-1,4-二甲基苯(3.40kg，24.2mol)在AcOH(20.0L)中的冰冷的溶液中添加H2SO4(4.74kg，48.4.mol，2.58L)随后逐滴添加(滴液漏斗)HNO3(3.41kg，36.3mol，2.44L，67.0％纯度)在H2SO4(19.0kg，193.mol，10.3L)中的冷溶液。然后允许反应混合物在0℃-5℃下搅拌0.5h。将反应混合物缓慢倒入碎冰(35.0L)中并沉淀出黄色固体。将悬浮液过滤并将滤饼用水(5.00L x 5)洗涤以给出黄色固体，将该黄色固体悬浮于MTBE(2.00L)中持续1h，过滤，并干燥以给出呈黄色固体的标题化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(s,1H),7.34(s,1H),2.57(s,3H),2.42(s,3H)。
步骤D.2：3-溴-2-氯-1,4-二甲基-5-硝基苯
向1-氯-2,5-二甲基-4-硝基苯(步骤D.1，2.00kg，10.8mol)在TFA(10.5L)中的冷却溶液中缓慢添加浓H2SO4(4.23kg，43.1mol，2.30L)并将反应混合物在20℃下搅拌。少量分批添加NBS(1.92kg，10.8mol)并将反应混合物在55℃下加热2h。将反应混合物冷却至25℃，然后倒入碎冰溶液以获得浅白色沉淀，将该白色沉淀经真空过滤，用冷水洗涤并在真空下干燥以给出呈黄色固体的标题化合物，将该标题化合物不经进一步纯化用于下一步骤。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.65(s,1H),2.60(s,3H),2.49(s,3H)。
步骤D.3：3-溴-4-氯-2,5-二甲基苯胺
向3-溴-2-氯-1,4-二甲基-5-硝基苯(步骤D.2，2.75kg，10.4mol)在THF(27.5L)中冰冷的溶液中添加HCl(4M，15.6L)然后少量分批添加Zn(2.72kg，41.6mol)。允许反应混合物在25℃下搅拌2h。通过添加饱和NaHCO3水溶液将反应混合物碱化(直至pH＝8)。将混合物用EtOAc(2.50L)稀释并剧烈搅拌10min并且然后通过硅藻土垫过滤。分离有机层并将水层用EtOAc(3.00L x 4)再萃取。将合并的有机层用盐水(10.0L)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩以给出呈黄色固体的标题化合物，将该标题化合物不经进一步纯化用于下一步骤。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ6.59(s,1H),5.23(s,2H),2.22(s,3H),2.18(s,3H)。
步骤D.4：3-溴-4-氯-2,5-二甲基苯重氮四氟硼酸盐
将BF3.Et2O(2.00kg，14.1mol，1.74L)溶解于DCM(20.0L)中并在氮气氛下冷却至-5℃至-10℃。将3-溴-4-氯-2,5-二甲基苯胺(步骤D.3，2.20kg，9.38mol)在DCM(5.00L)中的溶液添加至上述反应混合物中并搅拌0.5h。逐滴添加亚硝酸叔丁酯(1.16kg，11.3mol，1.34L)并将反应混合物在相同温度下搅拌1.5h。TLC(石油醚:EtOAc＝5:1)显示起始材料(Rf＝0.45)被完全消耗。将MTBE(3.00L)添加至反应混合物中以给出黄色沉淀，将该黄色沉淀通过真空过滤并用冷MTBE(1.50L x 2)洗涤以给出呈黄色固体的标题化合物，将该标题化合物不经进一步纯化用于下一步骤。
步骤D.5：4-溴-5-氯-6-甲基-1H-吲唑
向在氯仿(20.0L)中的18-冠-6醚(744g，2.82mol)中添加KOAc(1.29kg，13.2mol)并将反应混合物冷却至20℃。然后缓慢添加3-溴-4-氯-2,5-二甲基苯重氮四氟硼酸盐(步骤D.4，3.13kg，9.39mol)。然后允许反应混合物在25℃下搅拌5h。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷的水(10.0L)中，并将水层用DCM(5.00L x 3)萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液(5.00L)、盐水(5.00L)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并在真空下浓缩以给出呈黄色固体的标题化合物。1HNMR(600MHz,CDCl3)δ10.42(br s,1H),8.04(s,1H),7.35(s,1H),2.58(s,3H)。UPLC-MS-1：Rt＝1.02min；MS m/z[M+H]+；243/245/247。
步骤D.6：4-溴-5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑
25℃下，向PTSA(89.8g，521mmol)和4-溴-5-氯-6-甲基-1H-吲唑(步骤D.5，1.28kg，5.21mol)在DCM(12.0L)中的溶液中逐滴添加DHP(658g，7.82mol，715mL)。将混合物在25℃下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物用水(5.00L)稀释并分离有机层。将水层用DCM(2.00L)再萃取。将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液(1.50L)、盐水(1.50L)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。将粗残余物通过正相色谱法(洗脱液：石油醚/EtOAc从100/1至10/1)纯化以给出呈黄色固体的标题化合物。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.04(s,1H),7.81(s,1H),5.88-5.79(m,1H),3.92-3.83(m,1H),3.80-3.68(m,1H),2.53(s,3H),2.40-2.32(m,1H),2.06-1.99(m,1H),1.99-1.93(m,1H),1.77-1.69(m,1H),1.60-1.56(m,2H)。UPLC-MS-6：Rt＝1.32min；MS m/z[M+H]+；329.0/331.0/333.0
步骤D.7：5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二 氧杂环戊硼烷-2-基)-1H-吲唑(中间体D.1)
将4-溴-5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑(步骤D.6，450g，1.37mol)、KOAc(401g，4.10mol)和B2Pin2(520g，2.05mol)在1,4-二噁烷(3.60L)中的悬浮液用氮气脱气0.5h。添加Pd(dppf)Cl2.CH2Cl2(55.7g，68.3mmol)并将反应混合物在90℃下搅拌6h。将反应混合物通过硅藻土过滤并将滤饼用EtOAc(1.50L x 3)洗涤。将混合物在真空下浓缩以给出黑色油状物，将该黑色油状物通过正相色谱法(洗脱液：石油醚/EtOAc从100/1至10/1)纯化以给出呈棕色油状物的所希望的产物。将残余物悬浮于石油醚(250mL)中1h以获得白色沉淀。将悬浮液过滤，在真空下干燥以给出呈白色固体的标题化合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(d,1H),7.52(s,1H),5.69-5.66(m,1H),3.99-3.96(m,1H),3.75-3.70(m,1H),2.51(d,4H),2.21-2.10(m,1H),2.09-1.99(m,1H),1.84-1.61(m,3H),1.44(s,12H)；UPLC-MS-6：Rt＝1.29min；MS m/z[M+H]+；377.1/379。
化合物A的合成
步骤1：叔丁基6-(4-(5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-4-基)-5- 甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯
在500mL烧瓶中，在氩气下，将叔丁基6-(3-溴-4-(5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(中间体C1，10g，16.5mmol)、(1-甲基-1H-吲唑-5-基)硼酸(6.12g，33.1mmol)、RuPhos(1.16g，2.48mmol)和RuPhos-Pd-G3(1.66g，1.98mmol)悬浮于甲苯(165mL)中。添加K3PO4(2M，24.8mL，49.6mmol)并将反应混合物置于预热油浴(95℃)中并搅拌45min。将反应混合物倒入饱和NH4Cl水溶液并用EtOAc萃取(x3)。将合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液洗涤，干燥(相分离器)并在减压下浓缩。将粗残余物用THF(50mL)稀释，添加硫醇(15.9mmol)并将混合物在40℃下涡旋1h。将混合物过滤，将滤液浓缩并将粗残余物通过正相色谱法(洗脱液：在CH2Cl2中的MeOH从0％至2％)纯化，将纯化的级分再次通过正相色谱法(洗脱液：在CH2Cl2中的MeOH从0％至2％)纯化以给出呈米黄色泡沫的标题化合物。UPLC-MS-3：Rt＝1.23min；MS m/z[M+H]+；656.3/658.3。
步骤2：5-氯-6-甲基-4-(5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1-(2-氮杂螺[3.3] 庚-6-基)-1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑
将TFA(19.4mL，251mmol)添加至叔丁基6-(4-(5-氯-6-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-甲酸酯(步骤1，7.17g，10.0mmol)在CH2Cl2(33mL)中的溶液中。将反应混合物在RT下在氮气下搅拌1.5h。将RM在减压下浓缩以给出呈三氟乙酸盐的标题化合物，将该标题化合物不经纯化用于下一步骤。UPLC-MS-3：Rt＝0.74min；MS m/z[M+H]+；472.3/474.3。
步骤3：1-(6-(4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5- 基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)丙-2-烯-1-酮
将丙烯酸(0.69mL，10.1mmol)、丙基膦酸酐(在EtOAc中50％，5.94mL，7.53mmol)和DIPEA(21.6mL，126mmol)在CH2Cl2(80mL)中的混合物在RT下搅拌20min，然后添加(滴液漏斗)至5-氯-6-甲基-4-(5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1-(2-氮杂螺[3.3]庚-6-基)-1H-吡唑-4-基)-1H-吲唑三氟乙酸酯(步骤2，6.30mmol)在CH2Cl2(40mL)中的冰冷的溶液中。将反应混合物在RT下在氮气下搅拌15min。将RM倒入饱和NaHCO3水溶液中并用CH2Cl2(x3)萃取。将合并的有机层干燥(相分离器)并浓缩。将粗残余物用THF(60mL)稀释并添加LiOH(2N，15.7mL，31.5mmol)。将混合物在RT下搅拌30min直到由丙烯酰氯与吲唑的游离NH基团反应产生的副产物消失(UPLC)，然后倒入饱和NaHCO3水溶液中并用CH2Cl2(3x)萃取。将合并的有机层干燥(相分离器)并浓缩。将粗残余物通过正相色谱法(洗脱液：在CH2Cl2中的MeOH从0％至5％)纯化以给出标题化合物。将异构体通过手性SFC(C-SFC-1；流动相：CO2/[IPA+0.1％Et3N]:69/31)分离，以给出作为第二洗脱峰的化合物A，即a(R)-1-(6-(4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)丙-2-烯-1-酮(白色粉末)：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.1(s,1H),7.89(s,1H),7.59(s,1H),7.55(s,1H),7.42(m,2H),7.30(d,1H),6.33(m,1H),6.12(m,1H),5.68(m,1H),4.91(m,1H),4.40(s,1H),4.33(s,1H),4.11(s,1H),4.04(s,1H),3.95(s,3H),2.96-2.86(m,2H),2.83-2.78(m,2H),2.49(s,3H),2.04(s,3H)；UPLC-MS-4：Rt＝4.22min；MS m/z[M+H]+526.3/528.3；C-SFC-3(流动相：CO2/[IPA+0.1％ Et3N]:67/33)：Rt＝2.23min。实例1的化合物又称为“化合物A”。
获得作为第一洗脱峰的化合物A的阻转异构体，a(S)-1-(6-(4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基)-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基)丙-2-烯-1-酮：C-SFC-3(流动相：CO2/[IPA+0.1％ Et3N]:67/33)：Rt＝1.55min。
实例2：化合物A结晶形式的合成。
化合物A的结晶形式(如以下中所述的那些)也特别地适用于本发明的方法和用途中。
实例2a：化合物A的结晶异丙醇(IPA)溶剂化物和化合物A的结晶水合物(变型HA) 形式。
将25mg的化合物A(从以上实例1中获得)添加至0.1mL的2-丙醇中。将所得的澄清溶液在25℃下搅拌3天，然后沉淀出结晶固体。通过离心过滤收集固体，并在环境条件下干燥过夜。湿饼表征为化合物A的结晶异丙基(IPA)溶剂化物。将湿饼在环境条件下干燥过夜，提供了结晶水合物(变型HA)形式。
通过XRPD分析化合物A的结晶水合物(变型HA)形式，并且下表中示出了最具特征的峰。
特别地，结晶水合物(变型HA)形式的XRPD图的最具特征的峰可以选自以下：具有选自下组的折射2θ值(CuKα)的角的一个、两个、三个或四个峰，该组由以下组成：8.2°、11.6°、12.9°和18.8°。/>
通过XRPD分析化合物A的结晶IPA溶剂化物形式，并且下表中示出了最具特征的峰。
特别地，结晶IPA溶剂化物形式的XRPD图的最具特征的峰可以选自以下：具有选自下组的折射2θ值(CuKα)的角的一个、两个、或三个峰，该组由以下组成：7.5°、12.5°和17.6°。
实例2b：化合物A的结晶乙醇(EtOH)溶剂化物和化合物A的结晶水合物(变型HA)形 式
将25mg的化合物A(从以上实例1中获得)添加至0.1mL的乙醇中。将所得澄清溶液在25℃下搅拌3天。将实例1中获得的化合物A的结晶水合物(变型HA)形式作为种子添加到所得的溶液中。将所得悬浮液再平衡1天，然后沉淀出固体。通过离心过滤收集固体，并在环境条件下干燥过夜。湿饼表征为结晶乙醇溶剂化物，其在环境条件下干燥过夜后，产生结晶水合物(变型HA)。
替代性地，将3.1g的化合物A添加至20mL的乙醇中，将所得澄清溶液在25℃下搅拌20min。添加约50mg结晶水合物(变型HA)(以上获得)作为种子，并将所得的混合物在25℃下平衡6小时。将所得悬浮液过滤，并将湿饼表征为结晶乙醇溶剂化物。然后将固体在环境条件(25℃，60％-70％相对湿度)下干燥3天，获得2.8g的化合物A水合物变型HA，产率为90％。
通过XRPD分析化合物A的结晶乙醇溶剂化物形式，并且下表中示出了最具特征的峰。
特别地，结晶乙醇溶剂化物形式的XRPD图的最具特征的峰可以选自以下：具有选自下组的折射2θ值(CuKα)的角的一个、两个、或三个或四个峰，该组由以下组成：7.9°、12.7°、18.2°和23.1°。
实例2c：结晶水合物(变型HA)制剂的替代性制备
将25mg的化合物A(从以上实例1中获得)添加至0.1mL的甲醇中。将所得澄清溶液在25℃下搅拌3天。将实例1中获得的结晶水合物(变型HA)作为种子添加到所得的溶液中。将所得悬浮液再平衡1天，然后沉淀出固体。通过离心过滤收集固体，并在环境条件下干燥过夜。在环境条件下干燥过夜后，湿饼产生结晶水合物(变型HA)。
实例2d：结晶丙二醇溶剂化物制剂和水合物(变型HA)制剂
将25mg的化合物A(从以上实例1中获得)添加至0.1mL的丙二醇中。将所得悬浮液在50℃下搅拌1周。通过离心过滤收集固体。过滤后获得的湿饼表征为结晶丙二醇溶剂化物。在环境条件下将滤饼干燥1周后，获得结晶水合物(变型HA)。
通过XRPD分析化合物A的结晶丙二醇溶剂化物形式，并且下表中示出了最具特征的峰。
特别地，结晶丙二醇溶剂化物形式的XRPD图的最具特征的峰可以选自以下：具有选自下组的折射2θ值(CuKα)的角的一个、两个、或三个或四个峰，该组由以下组成：7.3°、13.2°、18.0°和25.5°。/>
实例3：化合物A利用与KRAS G12C独特相互作用在KRAS G12C的开关II环下结合，并且有效和选择性地抑制KRASG12C细胞信号传导和增殖
与其他KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布和阿达格拉西布)相比，化合物A利用与KRAS G12C独特相互作用在KRAS G12C的开关II环下结合。例如，化合物A的甲基吲唑基部分与Tyr64和Glu63主链形成堆积相互作用，并与Gln99的侧链相互作用。因此，甲基吲唑基部分夹在开关II和Gln99主链之间，稳定了该开关II构象。向C12部分生长的44螺接头连接到吡唑环上；这导致以不同方式占据结合点，并优化丙烯酰胺位置以与Lys16和C12部分相互作用。另外，开关II构象与针对其他KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布和阿达格拉西布)的公开的结合模式披露的开关II构象不同。(图12)
因此，化合物A可用于治疗患有癌症(特别是如本文所述的癌症)的患者，该癌症已对另一种KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布或阿达格拉西布)的治疗产生抗性或难治性。
在细胞测定中，化合物A显示出有效和选择性的目标占有率。化合物A选择性地抑制下游效应蛋白对KRAS G12C(而不是对任何其他RAS野生型同种型)的募集。化合物A特别地在KRAS G12C突变型细胞系中抑制了KRAS驱动的致癌信号传导和增殖，但在KRAS WT或MEK Q56P突变型细胞系中没有抑制。
表：化合物A有效和选择性地抑制KRASG12C细胞信号传导和增殖
在临床前研究中，化合物A在KRAS G12C突变型异种移植模型中表现出深度和持续的目标占有率，从而导致高效性。在小鼠的KRAS G12C突变型异种移植模型中，药效学(PD)应答与血液中化合物A暴露相关。经化合物A治疗后，游离肿瘤KRAS G12C水平以剂量依赖性方式有力地降低，并与MAPK途径靶基因DUSP-6的肿瘤表达的抑制相关。
此外，每日口服化合物A治疗导致对小鼠KRASG12C异种移植模型(MIA PaCa(KRASG12C胰腺)和NCI-H2122(KRASG12C肺))异种移植模型产生剂量依赖性抗肿瘤活性。在MIA PaCa-2中，化合物A在3mg/kg下产生肿瘤停滞，在10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg下产生肿瘤消退。在NCI-H2122中，化合物A在10mg/kg下产生微弱的肿瘤生长抑制，在30mg/kg下产生中等的肿瘤生长抑制，并且在100mg/kg下产生近似的肿瘤停滞。同样，每日两次用50mg/kg的化合物A口服治疗也在NCI-H2122中实现了近似的肿瘤停滞，表明AUC是疗效的驱动力。
总体而言，在为期4周的大鼠和狗毒性研究中，化合物A的耐受性良好。
实例4：·在KRASG12C突变型异种移植中，化合物A的QD或BID时间表在相同的每日 剂量下显示出相同的抗肿瘤活性
在具有不同适应症的一组KRAS G12C突变型异种移植模型中，对化合物A作为单一药剂的抗肿瘤活性进行了研究：MIA PaCa-2(PDAC)；NCI-H2122，LU99，HCC-44，NCI-H2030(NSCLC)；KYSE410(食道)。基于PK曲线和PK/PD关系，选择每日口服时间表中10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg的化合物A的剂量。化合物A以剂量依赖性方式抑制所有异种移植模型的生长。因此，在不同的异种移植模型中观察到剂量应答的动态范围与最大应答模式(范围从消退(MIA-PaCa-2，LU99)经停滞样(HCC44，NCI-H2122)到中度肿瘤生长抑制(NCI-H2030，KYSE410))的差异，反映各模型对KRASG12C抑制的敏感性差异。
每日用30mg/kg(qd)化合物A口服治疗在MIA PaCa-2异种移植中诱导与每日两次以15mg/kg治疗相同的肿瘤消退(图9)。同样，每日两次以5mg/kg治疗取得了与每日以10mg/kg口服治疗相当的消退。在NCI-H2122和Lu99异种移植中也获得了此结果(图9中的“H2122”和“LU99”)。发现与每三天(q3d)给予相同剂量或90mg/kg q3d的相同每日总剂量相比，以每日时间表给予30mg/kg剂量导致更好的肿瘤生长抑制(图9B)。疗效与血液中的总药物浓度密切相关。这些数据表明了AUC驱动的PD/疗效关系。
在MIA PaCa-2和NCI-H2122异种移植中，与以评估的临床相关剂量给予的索托拉西布和阿达格拉西布相比，每日口服施用化合物A引起非常相似的抗肿瘤活性。在MIAPaCa-2中，以10mg/kg和30mg/kg给予的化合物A和索托拉西布，都实现了肿瘤消退，其中治疗组之间没有统计上显著的差异。在敏感性较低的NCI-H2122模型中，与媒介物组相比，每日给药100mg/kg的化合物A、索托拉西布和阿达格拉西布诱导肿瘤停滞，30mg/kg的化合物A和索托拉西布导致略低的肿瘤停滞，并且30mg/kg的阿达格拉西布对肿瘤生长没有影响
实例5：KRAS G12C突变型NSCLC细胞系中的化合物A与TNO155的体外组合
将试验化合物的10mM储备溶液溶解于100％ DMSO中，并将其以小等分试样储存于-20℃下。
十种KRAS G12C突变型非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系：NCI-H2030、NCI-H358、NCI-H1792、HCC-44、NCI-H1373、Calu-1、NCI-H23、Lu99、NCI-H2122和HCC-1171来自商业来源，并将其在37℃5％CO2下在供应商推荐的培养基条件下培养。
将指定的KRAS G12C突变型人NSCLC细胞系分配到384孔组织培养板中。用以下一式三份地处理细胞连续7天：DMSO、化合物A的剂量范围(X轴；2nM至1.6μM)、TNO155的剂量范围(Y轴；19nM至4.5μM)和两种药剂的成对组合。七十二小时后，通过每孔补充相同体积的含有相应化合物或DMSO的培养基来更新培养基。在七天处理期后，使用CellTiter-(普洛麦格公司(Promega))确定细胞生长。在处理前(＝第1天)对一个板计数。图1中的矩阵报告了与DMSO处理的细胞相比，每种处理的生长抑制(GI)百分比，其中颜色越深表示细胞生长抑制和/或细胞杀伤越大。使用经典的协同模型(Loewe、Bliss)对数据进行处理。化合物A/TNO155组合对于以下细胞系的协同作用得分如下。NCI-H2122：16.7；HCC-1171：9.7；NCI-H1373：6.9。协同作用得分超过2分表示有协同效应。
在NCI-H2122和HCC-1171中出现了协同细胞杀伤，而在NCI-1373和CALU-1中则实现了协同细胞生长抑制(参见图1)。在NCI-H23和HCC-44细胞系中获得了较低的协同作用得分。在本实验中，Lu99细胞系(图1中的LU99)没有显示出协同作用，可能是由于化合物A与TNO155的组合在体内Lu99模型中显示出明显的有益效果而产生的体外效应。
实例6：单独的化合物A以及与TNO155的组合在Lu99 KRAS G12C肺癌小鼠异种移植 模型中的抗肿瘤疗效
将名为Lu99的杂合性KRAS G12C肺癌异种移植模型用于小鼠的疗效研究，以研究化合物A、TNO155作为单一药剂以及组合的疗效和耐受性。
Lu99人细胞系来源于一名63岁男性患者的肺巨细胞癌[Yamada等人,1985]。它携带等位基因NM_033360.4(KRAS):c.34G>T，并且因此是杂合KRAS Gly12Cys突变。使Lu99细胞在具有5％ CO2的37℃培育箱中在无菌条件下生长两周。将细胞保持在补充有10％ FCS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES的RPMI培养基中，并以1:6每3天分离。2012年细胞测试为支原体和鼠病毒检测阴性(Radil案例号：8270-2012)。在注射当天，共传代8次(包括来自供应商的传代)后收获细胞。将细胞以10.106个细胞/ml的最终浓度重悬于50％HBSS和50％基质胶(Matrigel)中。
用雌性裸鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)，对照：NU(NCr)-Foxn1nu-纯合)进行实验。将动物安置在12h光照/黑暗周期的设施中，并且可以自由地随意取用Figure无菌食物和水。允许动物适应至少7天。
向小鼠皮下注射Lu99人NSCLC细胞以诱导异种移植肿瘤，并且当平均肿瘤体积达到约250mm3时，随机分配至治疗组。然后用媒介物、化合物A(100mg/kg，每日一次)、TNO155(10mg/kg，每日两次)、或化合物A(100mg/kg，每日一次)与TNO155(10mg/kg，每日两次)的组合对小鼠进行口服治疗。
将化合物A和TNO155分别配制成在0.1％ Tween 80(飞世尔科技公司(FisherScientific AG)#BP338-500)和0.5％甲基纤维素水溶液中的悬浮液。对照组接受0.1％Tween 80(飞世尔科技公司#BP338-500)和0.5％甲基纤维素在水中的溶液。
治疗期为9至28天，具体取决于各组。当肿瘤体积(TV)达到授权限度时，在第9天终止用媒介物治疗的动物，在第14天终止用TNO155治疗的动物。将用化合物A或化合物A与TNO155的组合治疗的动物治疗28天，然后在不进行任何治疗下再保持5天。
细胞接种后定期监测肿瘤生长并且当TV达到适当体积时，将动物随机分配至治疗组(n＝6)。在治疗期间，每周用卡尺手动测量异种移植肿瘤大小约2-3次，并使用以下公式以mm3为单位估算TV：长度x宽度2/2。结果如图2所示。
虽然与媒介物组相比，单一药剂TNO155的抗肿瘤应答中等，但在治疗仍在进行的三周内，化合物A治疗导致了Lu99肿瘤消退。在治疗的前三周，这两种药剂的组合显著改善了化合物A作为单一药剂所见的应答的可持续性和复发时间，导致肿瘤应答与单独使用化合物A相似。肿瘤在治疗下没有重新生长，这与单独使用化合物A治疗时观察到的情况不同。尽管如此，当治疗结束时，肺癌生长恢复。在整个治疗期间，研究中的所有动物体重都增加了。所有的治疗方案都是可以接受的，并且当单独或组合施用时，两种化合物的血液暴露在相似的范围内。
实例7：单独的化合物A以及与不同时间表的TNO155的组合在Lu99 KRAS G12C肺癌 小鼠异种移植模型中的抗肿瘤疗效
在雌性裸鼠的KRAS G12C突变型Lu99异种移植模型中，进行了化合物A与不同时间表的TNO155的体内组合研究。向小鼠皮下注射Lu99人NSCLC细胞以诱导异种移植肿瘤，并且当平均肿瘤体积达到约200mm3时，随机分配至治疗组。按连续时间表或两周施用、一周停用时间表用媒介物、化合物A(100mg/kg，每日一次)、TNO155(10mg/kg，每日两次连续)或化合物A(100mg/kg，每日一次)与TNO155(10mg/kg，每日两次)的组合对小鼠进行口服治疗。治疗期为14至35天，具体取决于各组。在第14天终止用媒介物治疗的动物。在第21天终止TNO155和化合物A治疗的动物。用化合物A和TNO155组合治疗的动物治疗35天。记录肿瘤体积，并以每组的平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。治疗组相对于媒介物组的抗肿瘤应答在第14天以％T/C或％消退计算。以100mg/kg每日给药化合物A诱导肿瘤消退大约两周，随后在治疗仍在进行时，肿瘤复发。与媒介物组相比，以10mg/kg每日两次连续给予TNO155，导致了轻微的肿瘤生长延迟。如图3显示，化合物A与TNO155的组合显著改善了化合物A作为单一药剂所见的应答的可持续性和复发时间。因此，无论TNO155是按连续时间表给予还是按两周施用、一周停用的时间表给予，其组合效果都是一样的。这意味着TNO155可能只需要按间歇性时间表施用，以维持临床疗效，或者由于临床不良反应而中断剂量可能不会对临床应答造成损害。
实例8：化合物A显示持续的体内目标占有率，并且在携带KRAS G12C突变型肿瘤异 种移植的小鼠中具有剂量依赖性的抗肿瘤活性。将TNO155添加至化合物A中，以化合物A单 一药剂的三分之一的量达到类似的目标占有率
可以通过测量游离的KRASG12C水平(目标占有率)和MAPK信号传导途径中的其他生物标志物，如磷酸化ERK1/2(pERK)的水平下降和DUSP6 mRNA转录物的下调来评估KRASG12C抑制。在H358癌细胞中，抑制KRAS G12C(目标占有率)和pERK的体外IC50分别为20nM，并且抗增殖GI50为30nM。在体内，口服施用化合物A(30mg/kg QD)在MIA PaCa-2异种移植中实现了大约90％的KRASG12C抑制和DUSP6 mRNA转录物的75％下降，导致肿瘤消退。在敏感性较低的NCI-H2122异种移植中，口服施用JDQ443(100mg/kg QD)实现了大约80％的KRASG12C抑制和DUSP6 mRNA转录物的90％下降，导致停滞，这是该模型中对MAPK途径抑制的最大应答。
在相应的研究中，用单一药剂化合物A(100mg/kg qd)或化合物A(30mg/kg)与TNO155(7.5mg/kg bid)的组合治疗LU99异种移植5天后，评估了KRASG12C目标占有率。如图11所示，两种方案同等降低了肿瘤中的游离KRASG12C。因此，添加SHP2抑制剂可以增强化合物A的抗肿瘤应答，由此以单独使用KRAS G12C抑制剂的三分之一的剂量达到相同的目标占有率。
化合物A取得了与MIA PaCa2和NCI-H2122中的竞争化合物索托拉西布以及NCI-H2122中的阿达格拉西布相当的抗肿瘤效果。在剂量计划研究中，以相同的每日剂量按BID或QD时间表给予的化合物A取得了相同的应答，这表明AUC驱动的PD/疗效关系。除了在作为单一药剂施用时取得明显疗效外，化合物A还有可能与TNO155(磷酸酶SHP2的抑制剂)协同作用。在体外，JDQ443与TNO155的组合在NCI-H2122、HCC-1171和NCI-H1373 NSCLC细胞系中具有协同作用，并且与单独使用JDQ443相比，导致显著更大的细胞生长抑制。在体内，JDQ443与TNO155的组合显著改善了JDQ443作为单一药剂在Lu99 NSCLC异种移植中所见的应答的可持续性和复发时间。
实例9：单独的化合物A以及与TNO155的组合在Lu99 KRAS G12C结直肠小鼠异种移 植模型中的抗肿瘤疗效
在一组KRAS G12C突变型人结直肠癌患者源性异种移植(PDX)模型中，进行了化合物A与TNO155的体内组合研究。向雌性裸鼠皮下植入来自每个PDX模型的肿瘤片段。一旦单个小鼠的肿瘤体积达到200-250mm3，就将其分配到治疗组进行给药。将每个PDX模型的一只动物分配到每个治疗组。将小鼠不作任何处理(对照)，或用化合物A(每日100mg/kg)或化合物A(每日100mg/kg)与TNO155(10mg/kg每日两次)的组合口服治疗。每个模型的研究结束被定义为最少28天的治疗，或未经治疗的肿瘤达到1500mm3的持续时间，或未经治疗的肿瘤翻两番的持续时间，以较慢者为准。记录肿瘤体积，并以每组的肿瘤体积变化％±SEM表示。每日给药化合物A导致一个PDX模型的消退，并导致一些PDX模型中轻微到中等的肿瘤生长延迟。化合物A与TNO155的组合改善了在所有PDX模型中的应答，范围从强烈的肿瘤生长抑制到肿瘤消退(参见图4)。
实例10：化合物A与TNO155的组合提高了化合物A的单一药剂活性，并且在保持疗 效的同时可减少化合物A
使用不同剂量方案进一步研究了化合物A与SHP2抑制剂TNO155的组合所产生的改善的抗肿瘤效果。在体内三个KRAS G12C突变型肿瘤模型(LU99、NCI-H2030和KYSE410)中进行了化合物A(100mg/kg QD)与TNO155(7.5mg/kg BID)的组合研究。在LU99模型中，该组合与单一药剂相比延迟了肿瘤复发的时间(图10“A”)，并在H2030和KYSE410模型中显示出更大的抗肿瘤疗效(图10“B”、“C”、“F”)。还测试了TNO155与化合物A的组合在这三种异种移植模型中减少暴露的效果。如图10“A-C”所示，TNO155(7.5mg/kg，每日两次时间表)不需要与化合物A(100mg/kg qd)组合，并且每日一次时间表足以维持在LU99和KYSE410异种移植中的疗效。在LU99、HCC44和KYSE410异种移植中，剂量减少的化合物A与TNO155的组合的效果。在LU99异种移植模型中(图10“D”)，化合物A(每日30mg/kg剂量)与TNO155(7.5mg/kg bid)的组合取得了与化合物A单一药剂(100mg/kg)相同的应答。疗效与目标占有率密切相关。
在相应的研究(其中用单一药剂化合物A(100mg/kg qd)或与TNO155(7.5mg/kgbid)的组合治疗LU99异种移植5天后，评估了KRASG12C目标占有率)中，两种方案同等降低了肿瘤中的游离KRASG12C(图10“G”)。作为单一药剂，30mg/kg的化合物A实现了比100mg/kg更少的LU99肿瘤中的游离KRASG12C的减少，这与剂量依赖性单一药剂抗肿瘤疗效相关(图10“D”)。同样，在HCC44异种移植模型中(图10E)，化合物A(每日30mg/kg剂量)与TNO155(7.5mg/kg bid)的组合，取得了与化合物A单一药剂(100mg/kg)相同的应答。在KYSE410中(图10“F”)，化合物A(30mg/kg)与TNO155(7.5mg/kg bid)的组合，足以将几乎没有应答的模型转化为良好的应答者，实现停滞。然而，化合物A(每日剂量为100mg/kg)与TNO155(7.5mg/kg bid)组合，进一步提高了疗效并导致肿瘤消退。
这些结果共同表明，SHP2阻断可以通过增强目标占有率建立更全面的KRAS依赖性信号传导阻断来增强KRASG12C抑制剂的抗肿瘤活性，并且两种药物中的一种减少暴露可以维持疗效。
实例11：化合物A有效抑制KRASG12CH95Q(在临床试验中介导对阿达格拉西布抗性 的双突变体)
GFP标记的KRASG12C H95Q、KRASG12C Y96D或KRASG12CR68S双突变通过定点诱变产生(QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(目录号210518)模板：pcDNA3.1(+)EGFP-T2A-FLAG-KRAS G12C)，并通过稳定转染在含有Ba/F3细胞的Cas9中表达。用从10mM的DMSO原液中1/3稀释的10μM开始的剂量应答曲线处理细胞。用指定的化合物处理细胞系72小时，并且用CellTiter-Glo测量细胞的活力。
结果：
与MRTX-849(阿达格拉西布)不同，JDQ443(化合物A)和AMG-510(索托拉西布)有效抑制KRASG12C H95Q双突变体的细胞活力。MRTX-849、AMG-510或JDQ443在指定的浓度和所述环境下(Ba/F3系统，3天增殖测定)不能抑制KRASG12C Y96D或KRASG12C R68S双突变体，并且这些双突变体对所有三种测试的KRASG12C抑制剂产生抗性。(图6；与DMSO对照(即没有KRAS G12C化合物)相比，KRASG12C化合物在体外增殖测定中的y轴影响)。水平的红色虚线代表GI50值。
在图6中，最上面的曲线(绿色)代表用MRTX-849(阿达格拉西布)治疗。中间的曲线(红色)代表用NVP-JDQ443(化合物A)治疗。底部的曲线(蓝色)代表用AMG-510(索托拉西布)治疗。
结论：
在KRASG12C H95Q情况下，化合物A可能克服对阿达格拉西布的抗性。另外，由于化合物A与突变型KRAS G12C有独特的结合相互作用，当与索托拉西布和阿达格拉西布相比时，单独的化合物A或与如本文所述的一种或多种治疗剂的组合，可用于治疗先前用其他KRAS G12C抑制剂(如索托拉西布或阿达格拉西布)治疗的患有癌症的患者，或在初始KRASG12C抑制剂治疗中出现获得性KRAS抗性突变后靶向抗性。
实例12：化合物A有效抑制KRAS G12C双突变体
如下还研究了化合物A和其他KRASG12C抑制剂对所报道的赋予对阿达格拉西布抗性的第二位点突变的影响。
材料与方法：
细胞系和KRASG12C抑制剂：
除非另外说明，否则Ba/F3细胞系是小鼠原B细胞系，并且在补充有10％的胎牛血清(FBS)(生物概念公司(BioConcept)，#2-01F30-I)、2mM丙酮酸钠(生物概念公司，#5-60F00-H)、2mM稳定的谷氨酰胺(生物概念公司，#5-10K50-H)、10mM HEPES(生物概念公司，#5-31F00-H)的RPMI 1640(生物概念公司，#1-41F01-I)中在37℃和5％CO2下培养。将亲代Ba/F3细胞在5ng/ml的重组鼠IL-3(生命技术公司(Life Technologies)，#PMC0035)存在下培养。Ba/F3细胞通常依赖IL-3生存和增殖，然而，通过表达致癌基因，它们能够将其依赖性从IL-3转向所表达的致癌基因(Curr Opin Oncology[肿瘤学当代视点],2007年1月；19(1):55-60.doi:10.1097/CCO.0b013e328011a25f.)
单个质粒诱变和Ba/F3稳定细胞系的产生：
使用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(安捷伦公司(Agilent)；#210519)以在pSG5_Flag-(密码子优化)KRASG12C_puro质粒模板上产生抗性突变，并通过桑格测序(sanger sequencing)确认序列。
将突变型质粒用NEON转染试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，#MPK10025)通过电穿孔转染到Ba/F3 WT细胞中。因此，用NEON系统(英杰公司，#MPK5000)(使用以下条件：电压(V)1635，宽度(ms)20，脉冲1)来用10μg pf质粒电穿孔二百万个Ba/F3细胞。电穿孔72小时后，以1μg/ml进行嘌呤霉素选择，以产生稳定的细胞系。
IL-3退出(withdrawal)
Ba/F3细胞通常依赖IL-3生存和增殖，然而，通过表达致癌基因，它们能够将其依赖性从IL-3转向所表达的致癌基因。为了评估KRASG12C单和双突变体是否能够维持Ba/F3细胞的增殖，在不存在IL-3的情况下培养表达突变构建体的工程化Ba/F3细胞。每三天测量一次细胞数量和活力，并且七天后完成IL-3退出。通过蛋白质印迹(数据未显示，观察到KRASG12C/R68S的上移)确认IL-3退出后突变体的表达。
KRASG12C抑制剂的药物应答曲线和抗性突变的验证：
将1000个Ba/F3细胞/孔接种到96孔板(Greiner Bio-One公司，#655098)中。在同一天用Tecan D300e药物分配器进行处理。在Tecan infinitiy M200 Pro读数器(积分时间1000ms)上，使用CellTiter-Glo发光细胞活力测定(普洛麦格公司，#G7573)，在处理起始板(第0天)的同一天和处理后三天(第3天)检测活力。
为了确定生长情况，将处理后三天(第3天)的读数相对于起始板(第0天)归一化。然后通过将处理过的孔相对于DMSO处理过的对照样品归一化来计算活力百分比。使用XLfit来制作Sigmoidal剂量-应答模型的拟合曲线(四参数曲线)(图7)。水平的红色虚线代表GI50值。表格数据显示如下。
表：化合物A(JDQ443)对KRAS G12C/H95双突变体增殖的影响。(《STDEV》表示增长 值％的标准偏差)
表：索托拉西布(AMG510)对KRAS G12C/H95双突变体增殖的影响(《STDEV》表示增 长值％的标准偏差)
表：阿达格拉西布(MRTX-849)对KRAS G12C/H95双突变体增殖的影响(《STDEV》表 示增长值％的标准偏差)
蛋白质印迹
用不同化合物以指定浓度处理指定的时间后，将细胞收集，沉淀并在-80℃下速冻。向每个样品中添加60μL的裂解缓冲液(50mM Tris HCl、120mM NaCl、25mM NaF、40mMβ-甘油磷酸二钠五水合物、1％NP40、1μM微囊藻毒素、0.1mM Na3VO3、0.1mM PMSF、1mM DTT和1mM苯甲脒，每10mL缓冲液补充有1片蛋白酶抑制剂混合片剂(罗氏公司))。然后将样品涡旋，在冰上孵育10min，再涡旋并在4℃下以14000rpm离心10min。用BCA蛋白质测定试剂盒(皮尔斯公司(Pierce)，23225)确定蛋白质浓度。用裂解缓冲液归一到相同的总体积后，添加NuPAGETMLDS样品缓冲液4X(英杰公司，NP0007)和NuPAGETM样品还原剂10X(英杰公司，NP0009)。将样品在70℃下加热10min，然后加载到NuPAGETMNovexTM4％-12％ Bis-TrisMidi蛋白凝胶，26-孔(英杰公司，WG1403A)上。在NuPAGE MES SDS运行缓冲液(英杰公司，NP0002)中，在200V下跑胶45min(PowerPac HC，伯乐公司(Biorad))。使用Trans-TurboTM系统(伯乐公司)，持续7min将蛋白质以每凝胶135mA转移到Trans-/>TurboTMMidi硝酸纤维素转移包膜(伯乐公司，1704159)上，然后用Ponceau红(西格玛公司(Sigma)，P7170)对膜染色。用含有5％乳的TBST在RT下阻断膜。将抗RAS(艾博抗公司(Abcam)，108602)抗体和抗磷酸化ERK 1/2p44/42MAPK(细胞信号传导公司(CellSignaling)，4370)抗体在4℃下孵育过夜，将抗黏着斑蛋白(西格玛公司，V9131)抗体在RT下孵育1h。将膜用TBST洗涤3次持续5min，并将抗兔(细胞信号传导公司，7074)和抗鼠(细胞信号传导公司，7076)二抗在RT下孵育1h。将所有抗体在TBST中稀释到1/1000，除抗黏着斑蛋白(1/3000)。在Fusion FX(Vilber Lourmat)上使用FusionCapt Advance FX7软件，用针对Ras和黏着斑蛋白的WesternBright ECL(Advansta公司，K-12045-D20)和SuperSignalWest Femto最高灵敏度底物(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer)，34096)进行确定。(图8)。
结果
表：化合物A(JDQ443)抑制KRASG12C/H95双突变体的增殖。用JDQ443(化合物A)、 AMG-510(索托拉西布)和MRTX-849(阿达格拉西布)(从1mM开始进行8点稀释)处理表达指定 FLAG-KRASG12C单突变体或双突变体的Ba/F3细胞3天，并通过Celltiter glo活力测定评估 增殖抑制。显示了4个独立实验的GI50±标准偏差(St DV)的平均值。
GI50±St DV[μM] JDQ443 AMG-510 MRTX-849
G12C 0.115±0.060 0.389±0.235 0.136±0.071
G12C/H95R 0.024±0.006 0.033±0.008 >1
G12C/H95Q 0.284±0.041 0.233±0.022 >1
G12C/H95D 0.612±0.151 0.262±0.088 >1
G12C/R68S >1 >1 0.707±0.165
G12C/Y96C >1 >1 >1
G12C/Y96D >1 >1 >1
生物物理数据
材料与方法：
试剂的制备：
RAS蛋白构建体的克隆、表达和纯化
本研究中使用的大肠杆菌表达构建体基于pET系统，并使用标准的分子克隆技术产生。在可裂解的N-末端his亲和纯化标签后，编码KRAS、NRAS和HRAS的cDNA包含aa 1-169，并通过GeneArt(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))进行密码子优化和合成。用QuikChange Lightning定点诱变试剂盒(安捷伦公司)引入点突变。通过桑格测序对所有最终的表达构建体进行序列验证。
对两升培养基接种用表达质粒新鲜转化的大肠杆菌BL21(DE3)的预培养物，并用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(西格玛公司)在18℃下诱导蛋白表达16小时。将带有avi-标签的蛋白质转化到携带表达生物素连接酶BirA的兼容质粒的大肠杆菌中，并在培养基中补充135μM d-生物素(西格玛公司)。
将细胞沉淀重悬于补充有Turbonuclease(默克公司(Merck))和cOmplete蛋白酶抑制剂片剂(罗氏公司)的缓冲液A(20mM Tris、500mM NaCl、5mM咪唑、2mM TCEP、10％甘油，pH 8.0)中。将细胞通过匀浆器(Avestin公司)在800-1000巴下裂解三次，并通过在40000g下离心40min来澄清裂解物。
将裂解物加载到安装在Pure 25色谱系统(思拓凡公司(Cytiva))上的HisTrap HP 5ml柱(思拓凡公司)上。将污染的蛋白质用缓冲液A洗去，并将结合的蛋白质用线性梯度洗脱到缓冲液B(补充有200mM咪唑的缓冲液A)中。在透析O/N期间，将无标签和avi-标签蛋白质上的N-末端His亲和纯化标签分别通过TEV或HRV3C蛋白酶裂解。将蛋白溶液重新加载到HisTrap柱上，并收集含有靶蛋白的流。
添加5'-二磷酸鸟苷钠盐(GDP，西格玛公司)或GppNHp-四锂盐(Jena生物科学公司)至超过蛋白质24-32倍的摩尔量。添加EDTA(pH调节至8)至最终浓度为25mM。室温下1小时后，在PD-10脱盐柱(思拓凡公司)上，将缓冲液与40mM Tris、200mM(NH4)2SO4、0.1mMZnCl2，pH 8.0进行交换。将GDP(用于KRAS G12C抗性突变体H95Q/D/R、Y96D/C和R68S)或GppNHp添加至洗脱蛋白质中至超过蛋白质24-32倍的摩尔量。将40U虾碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))添加到仅含有样品的GppNHp中。然后将样品在5℃下孵育1小时。最后，添加MgCl2至浓度为约30mM。
然后将蛋白质经HiLoad 16/600Superdex 200pg柱(思拓凡公司)进一步纯化，该柱用20mM HEPES、150mM NaCl、5mM MgCl2、2mM TCEP预平衡，pH 7.5。
通过RP-HPLC确定蛋白质的纯度和浓度，通过LC-MS确认其身份。通过离子对色谱法确定目前的核苷酸[Eberth等人,2009]。
通过RapidFire MS确定共价速率常数
测定和曲线拟合
在384孔板中制备测试化合物的连续稀释液(50μM，1/2稀释液)，并在室温下与1μMKRAS G12C(有/无另外的突变体)在20mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、100μM MgCl2、1％DMSO中孵育。在不同的时间点通过添加1％的甲酸停止反应。使用联接到AgilentRapidFire自动进样器RF360设备的Agilent 6530四极杆飞行时间(QToF)MS系统进行MS测量，得出每个孔的修饰值％。同时，通过比浊法评估化合物溶解度，导致可测浊度的化合物浓度被排除在曲线拟合之外。
绘制修饰％相对于时间的关系图，以提取不同化合物浓度的kobs值。在第二步中，将获得的kobs值相对于化合物浓度作图。从所得曲线的初始线性部分得出速率常数(即kinact/KI)。
MS测量
使用RapidFire自动进样器RF 360进行注射。将溶剂通过Agilent1200泵递送。使用C18固相萃取(SPE)筒用于所有的实验。
从384孔板的每个孔中吸出30μL的体积。在1.5mL/min(H2O，0.1％甲酸)的流速下，样品加载/清洗时间为3000ms；洗脱时间为3000ms(乙腈，0.1％甲酸)；在1.25mL/min(H2O，0.1％甲酸)的流速下，再平衡时间为500ms。
在联接到双电喷雾(AJS)离子源(处于正模式)的Agilent 6530四极杆飞行时间(QToF)MS系统上获得质谱(MS)数据。仪器参数如下：气体温度350℃，干燥气体10L/min，雾化器45psi，保护气体350℃，保护气体流速11L/min，毛细管4000V，喷嘴1000V，碎裂电压250V，撇渣器65V，八极RF 750V。以6个光谱/s的速度获取数据。质量校准在300-3200m/z范围内进行。
使用Agilent MassHunter定性分析、Agilent Rapid-Fire控制软件和Agilent DAReprocessor Offline Utilities的组合进行所有的数据处理。最大熵算法产生每个注射的单独文件中的零电荷光谱。批量处理生成单个文件，将文本格式的所有质谱合并为x，y坐标。将该文件用于计算每个孔中蛋白质修饰的百分比。
结果
使用动力学MS实验对指定的构建体(所有装载GDP的)的修饰的二阶速率常数进行量化，在不同的时间点测量化合物浓度范围内的修饰％。Kinact/KI是由kobs相对于化合物浓度曲线的初始斜率推算出来的。将相对于KRAS G12D:GDP的活性设定为1，并给出了抗性突变体的相对活性。下表给出了KRAS G12C的n＝4次实验、G12C_Y96D的n＝3次、和其他突变体的n＝2次的平均值。
表：抗性突变体相对于KRAS G12C的二阶速率常数(Kinact/KI)的倍数变化
使用动力学MS实验对指定的构建体(所有装载GDP的)的修饰的二阶速率常数进行量化，在不同的时间点测量化合物浓度范围内的修饰％。Kinact/KI是由Kobs相对于化合物浓度曲线的初始斜率推算出来的。给出了KRAS G12C的n＝4次实验、G12C_Y96D的n＝3次、和其他突变体的n＝2次的平均值。
表：化合物A(JDQ443)、索托拉西布和阿达格拉西布相对于抗性突变体的二阶速率 常数(Kinact /KI[mM-1*s-1])
结论
第一代KRAS G12C抑制剂已在临床试验中显示出疗效。然而，破坏抑制剂结合和下游途径的重新激活的突变的出现，限制了应答的持续时间。据报道，在临床试验中，第二位点突变体赋予了对阿达格拉西布的抗性(参考：N Engl J Med.[新英格兰医学杂志]2021年6月24日；384(25):2382-2393.doi:10.1056/NEJMoa2105281.、Cancer Discov.[癌症发现]2021年8月；11(8):1913-1922.doi:10.1158/2159-8290.CD-21-0365.2021年4月6日在线发表PMID:33824136.)，将这些第二位点突变体在Ba/F3细胞中表达，并分析了与KRAS G12C(GI50＝0.115±0.060mM)相比它们对化合物A(JDQ443)的敏感性。如结合模式所预期的，化合物A抑制了KRAS G12C H95双突变体的增殖和信号传导。化合物A有效抑制G12C/H95R和G12C/H95Q的增殖(分别为GI50＝0.024±0.006mM，GI50＝0.284±0.041mM)，而G12C/R68S、G12C/Y96C和G12C/Y96D的表达赋予了对化合物A的抗性(所有的GI50>1mM)。
令人惊讶的是，尽管化合物A不直接与组氨酸95相互作用，但与H95R或Q相比，G12C/H95D的表达导致对化合物A的敏感性降低(GI50＝0.612±0.151mM)。化合物A处理后pERK的蛋白质印迹分析以及生物物理环境中化合物A朝着这些临床观察到的SWII袋突变的速率常数分析(生物物理数据，上文)都与细胞生长抑制数据一致(参见表)。
H95D与H95R或Q之间的差异可能是由于天冬氨酸的负电荷，其能进一步增加KRASG12C表面的负静电电位。这可能影响配体识别并且因此降低化合物A对该突变体的特异反应性和细胞活性。另一个可能的解释是，H95D突变可能影响KRAS的动力学，从而使得允许化合物A结合的构象变得更难获得。
总之，数据显示，在G12C/Q95R或G12C/H95Q情况下，化合物A应克服阿达格拉西布诱导的抗性。化合物A治疗(特别是在本发明的组合中)在其已显示出活性的G12C/H95Q情况下可能仍然有用。
实例13：化合物A在带有KRASG12C突变的晚期实体瘤患者中的研究
进行了一项研究以评估化合物A单一药剂、化合物A与TNO155的组合、化合物A与PD1抑制剂(如斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的组合、以及化合物A与TNO155和PD1抑制剂(如斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗)的组合的安全性和耐受性并确定未来研究的最大耐受剂量和/或推荐剂量和方案。进行该研究也是为了评估研究治疗的抗肿瘤活性，并评估斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗当与化合物A和/或TNO155组合给药时的免疫原性。
该研究在带有KRAS G12C突变的晚期实体瘤成年患者中进行。在扩展阶段，将招募带有KRAS G12C突变且处于二线或三线治疗环境的晚期(转移性或不可切除性)非小细胞肺癌患者。其他具有KRAS G12C突变并且标准护理疗法(即基于氟嘧啶、奥沙利铂和/或伊立替康的化学疗法)失败的晚期结直肠癌患者群体也将被招募进化合物A单一药剂和化合物A加TNO155扩展组中。
化合物A以21天周期，QD或BID连续口服(p.o)施用。在本发明的实施例中，以范围从200至1600mg/天，例如从400至1600m/天的治疗有效剂量施用化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。例如，化合物A的每日总剂量可选自200、300、400、600、800、1000、1200和1600mg。化合物A的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)方案连续施用。
可以以100mg至400mg，例如200至200mg的每日总剂量施用化合物A。特别地，可以以400mg的每日总剂量施用，每日施用一次或每日施用两次。还可以以200mg的每日总剂量施用，每日施用一次或每日施用两次。
还可以以600mg的每日总剂量施用，每日施用一次或每日施用两次。
按2周施用/1周停用时间表或连续地，QD或BID，p.o.施用TNO155。
可以以范围从10至80mg、或从10至60mg的每日总剂量施用TNO155。例如，TNO155的每日总剂量可选自10、15、20、30、40、60和80mg。例如，TNO可以以10、15、20或30mg的每日总剂量给药。
TNO155的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)，2周施用/1周停用时间表QD或BID连续施用。TNO155的每日总剂量可以按QD(每日一次)或BID(每日两次)，连续(即无药物假期)QD或BID连续施用。
例如，可以连续或按药物假期时间表(如2周施用/1周停用时间表)，以20mg的每日总剂量施用TNO155，每日施用一次或每日施用两次。
如果将斯巴达珠单抗用作PD1-抑制剂，则按21天周期，以约300mg的剂量每3周一次、或约400mg的剂量每4周一次静脉内施用。
如果将替雷利珠单抗用作PD1-抑制剂，则按21天周期，以约200mg的剂量每3周一次、或约300mg的剂量每4周一次静脉内施用。
也可以使用说明书中描述的其他剂量和给药方案。
本发明的治疗方法的疗效可通过本领域所熟知的方法确定，例如根据RECISTv.1.1确定最佳总体应答(BOR)、总体应答率(ORR)、应答持续时间(DOR)、疾病控制率(DCR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。
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临床试验在进行中。基于初步数据，化合物A治疗已显示出可接受的安全性和耐受性特征，并已显示出临床疗效的早期迹象。
实例14：化合物A作为单一疗法在患有局部晚期或转移性KRAS G12C突变型非小细 胞肺癌的参与者中的临床研究
进行了一项开放标签研究，该研究被设计为在患有带有KRAS G12C突变的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的参与者中比较作为单一疗法的化合物A与多西他赛，这些参与者先前已用基于铂的化学疗法和免疫检查点抑制剂疗法顺序或组合治疗。
该研究由2个部分组成：
-随机部分将评估与多西他赛相比化合物A作为单一疗法的疗效和安全性。
-扩展部分将在最终无进展生存期(PFS)分析后开放(如果主要终点达到统计学意义)，以允许随机接受多西他赛治疗的参与者交叉接受化合物A治疗。
研究群体包括患有局部晚期或转移性(IIIB/IIIC或IV期)KRAS G12C突变型非小细胞肺癌的成年参与者，这些参与者之前接受过顺序或作为组合疗法施用的基于铂的化学疗法和免疫检查点抑制剂疗法。
根据护理标准和产品标签，按照当地准则用化合物A或多西他赛对参与者进行治疗(多西他赛浓缩溶液用于输注，静脉内施用)
主要结果量度包括：
无进展生存期(PFS)
PFS是从随机化/治疗开始的日期到定义为首次记录的进展或因任何原因死亡的事件的日期的时间。PFS基于中心评估并使用RECIST 1.1标准。
次要结果量度包括：
·总生存期(OS)
·OS被定义为从随机化日期到因任何原因死亡的日期的时间
·总体应答率(ORR)
·ORR被定义为根据RECIST 1.1基于中心和当地研究者的评估，具有完全应答(CR)或部分应答(PR)的最佳总体应答的患者比例。
·疾病控制率(DCR)
·DCR被定义为具有完全应答(CR)、部分应答(PR)、稳定疾病(SD)或非CR/非PD的最佳总体应答(BOR)的参与者比例。
·应答时间(TTR)
·TTR被定义为从随机化的日期到首次记录的应答(CR或PR，必须随后确认)日期的时间
·应答持续时间(DOR)
·DOR计算为从首次记录的应答(完全应答(CR)或部分应答(PR))日期到首次记录的进展或因潜在癌症死亡的日期的时间。
·下一线疗法后的无进展生存期(PFS2)
·PFS2(基于当地研究者评估)被定义为从随机化日期到下一线疗法中首次记录的进展或因任何原因死亡(以先发生者为准)的时间。
·血浆中化合物A及其代谢物的浓度
·表征化合物A及其代谢物HZC320的药代动力学
·东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Group of Oncology Group，ECOG)体能状态确定性恶化的时间
·东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态(PS)的恶化
·根据QLQ-LC13，胸痛、咳嗽和呼吸困难的确定性10分恶化症状评分的时间
·EORTC QLQ LC13是一个13个项目的肺癌专用问卷模块，并且其包括对肺癌相关症状(即咳嗽、咯血、呼吸困难和疼痛)以及常规化学疗法和放射疗法的副作用(即脱发、神经病变、口疮和吞咽困难)的多项目和单项目测量。确定性10分恶化的时间被定义为从随机化日期到事件发生日期的时间，该事件定义为从基线增加至少10分的绝对值(恶化)，以后没有低于阈值的变化或任何原因导致的死亡
·根据QLQ-C30，整体健康状况/QoL确定性恶化、呼吸急促和疼痛的时间
·EORTC QLQ-C30是为评估癌症参与者的健康相关生活质量而开发的问卷。该问卷含有30个项目，并且由多项目量表和单项目测量(基于过去一周的参与者经历)组成。其中包括五个领域(身体、角色、情绪、认知和社会功能)，三个症状量表(疲劳、恶心/呕吐和疼痛)，六个单项(呼吸困难、失眠、食欲不振、便秘、腹泻和财务影响)和一个整体健康状况/HRQoL量表。确定性10点恶化的时间被定义为从随机化日期到事件发生日期的时间，该事件定义为从相应量表评分的基线增加至少10分绝对值(恶化)，以后没有低于阈值的变化或任何原因导致的死亡
·EORTC-QLQ-C30从基线的变化
·EORTC QLQ-C30是为评估癌症参与者的健康相关生活质量而开发的问卷。该问卷含有30个项目，并且由多项目量表和单项目测量(基于过去一周的参与者经历)组成。其中包括五个领域(身体、角色、情绪、认知和社会功能)，三个症状量表(疲劳、恶心/呕吐和疼痛)，六个单项(呼吸困难、失眠、食欲不振、便秘、腹泻和财务影响)和一个整体健康状况/HRQoL量表。分数越高表示症状存在程度越高。
·EORTC-QLQ-LC13从基线的变化
○EORTC QLQ LC13是一个13个项目的肺癌专用问卷模块，并且其包括对肺癌相关症状(即咳嗽、咯血、呼吸困难和疼痛)以及常规化学疗法和放射疗法的副作用(即脱发、神经病变、口疮和吞咽困难)的多项目和单项目测量。分数越高表示症状存在程度越高。
·EORTC-EQ-5D-5L从基线的变化
○EQ-5D-5L是用于描述和评价健康的通用工具。它基于描述系统，该系统从5个维度定义健康：行动能力、自我照顾能力、日常活动、疼痛/不适、和焦虑/抑郁。
·NSCLC-SAQ从基线的变化
○非小细胞肺癌症状评估问卷(NSCLC-SAQ)是一个7个项目的患者报告的结果测量，其评估患者报告的与晚期NSCLC有关的症状。它含有被确定为NSCLC症状的五个领域和伴随项目：咳嗽(1项)、疼痛(2项)、呼吸困难(1项)、疲劳(2项)和食欲(1项)。
·基于血浆中KRAS G12C突变状态的PFS
·基于血浆中KRAS G12C突变状态，比较化合物A相对于多西他赛的临床结果
·基于血浆中KRAS G12C突变状态的OS。
·基于血浆中KRAS G12C突变状态，比较化合物A相对于多西他赛的临床结果
·基于血浆中KRAS G12C突变状态的ORR。
·基于血浆中KRAS G12C突变状态，比较化合物A相对于多西他赛的临床结果
排除标准：
·先前已接受多西他赛、KRAS G12C抑制剂或任何其他全身性疗法(而不是一种基于铂的化学疗法和一种在先的免疫检查点抑制剂)治疗局部晚期或转移性NSCLC的参与者
·通过当地实验室测试发现具有EGFR致敏突变和/或ALK重排的参与者
·参与者患有已知的活动性中枢神经系统(CNS)转移和/或癌变性脑膜炎
·参与者具有间质性肺病或肺炎>1级的病史。
可以应用其他纳入/排除标准。
实例15：使用KRASG12C抑制剂(如化合物A)的临床试验
也可以根据本文所述的方法和如上所述的临床试验对KRASG12C抑制剂(如化合物A)进行研究。
例如，可以用化合物A与PD1抑制剂(如替雷利珠单抗)的组合或用派姆单抗与标准化学疗法的组合治疗患有带有KRASG12C突变的局部晚期或转移性NSCLC的未进行治疗的成人患者。
在另一个实例中，可以用化合物A与PD1抑制剂(如替雷利珠单抗)的组合或派姆单抗与标准化学疗法的组合治疗患有带有KRASG12C突变的局部晚期或转移性NSCLC的未进行治疗的成人患者。
本发明的治疗组合和方法的疗效可通过本领域所熟知的方法确定，例如根据RECIST v.1.1和如本文所述确定最佳总体应答(BOR)、总体应答率(ORR)、应答持续时间(DOR)、疾病控制率(DCR)、无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。
应理解，本文所述的实例和实施例仅用于举例说明目的，其各种修饰或改变对于本领域技术人员将是明了的，并包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（NOVARTIS AG）
<120> 包含KRAS G12C抑制剂的药物组合以及KRAS G12C抑制剂用于治疗癌症的用途
<130> PAT059013-WO-PCT04
<160> 563
<170> PatentIn 3.5版
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 501
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 502
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1 5 10 15
Asn
<210> 503
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 503
Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 504
Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
1 5
<210> 505
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 505
Tyr Pro Gly Thr Gly Gly
1 5
<210> 506
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 506
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
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35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 507
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 507
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60
agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120
accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180
gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300
accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag c 351
<210> 508
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 508
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Gly Ser Asn Phe Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Trp Thr Thr Gly Thr Gly Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 509
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 509
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaagc ccggcgagtc actgagaatt 60
agctgtaaag gttcaggcta caccttcact acctactgga tgcactgggt ccgccaggct 120
accggtcaag gcctcgagtg gatgggtaat atctaccccg gcaccggcgg ctctaacttc 180
gacgagaagt ttaagaatag agtgactatc accgccgata agtctactag caccgcctat 240
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcac taggtggact 300
accggcacag gcgcctactg gggtcaaggc actaccgtga ccgtgtctag cgctagcact 360
aagggcccgt ccgtgttccc cctggcacct tgtagccgga gcactagcga atccaccgct 420
gccctcggct gcctggtcaa ggattacttc ccggagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggagt gcacaccttc cccgctgtgc tgcagagctc cgggctgtac 540
tcgctgtcgt cggtggtcac ggtgccttca tctagcctgg gtaccaagac ctacacttgc 600
aacgtggacc acaagccttc caacactaag gtggacaagc gcgtcgaatc gaagtacggc 660
ccaccgtgcc cgccttgtcc cgcgccggag ttcctcggcg gtccctcggt ctttctgttc 720
ccaccgaagc ccaaggacac tttgatgatt tcccgcaccc ctgaagtgac atgcgtggtc 780
gtggacgtgt cacaggaaga tccggaggtg cagttcaatt ggtacgtgga tggcgtcgag 840
gtgcacaacg ccaaaaccaa gccgagggag gagcagttca actccactta ccgcgtcgtg 900
tccgtgctga cggtgctgca tcaggactgg ctgaacggga aggagtacaa gtgcaaagtg 960
tccaacaagg gacttcctag ctcaatcgaa aagaccatct cgaaagccaa gggacagccc 1020
cgggaacccc aagtgtatac cctgccaccg agccaggaag aaatgactaa gaaccaagtc 1080
tcattgactt gccttgtgaa gggcttctac ccatcggata tcgccgtgga atgggagtcc 1140
aacggccagc cggaaaacaa ctacaagacc acccctccgg tgctggactc agacggatcc 1200
ttcttcctct actcgcggct gaccgtggat aagagcagat ggcaggaggg aaatgtgttc 1260
agctgttctg tgatgcatga agccctgcac aaccactaca ctcagaagtc cctgtccctc 1320
tccctggga 1329
<210> 510
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 510
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 511
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 511
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 512
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 512
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 513
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 513
Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Gly Asn Gln Lys Asn Phe
1 5 10
<210> 514
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 514
Trp Ala Ser
1
<210> 515
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 515
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr
1 5
<210> 516
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 516
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 517
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 517
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339
<210> 518
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 518
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 519
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 519
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg taaagcccct aagctgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tgcagcccga ggatatcgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360
gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420
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ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660
<210> 520
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 520
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 521
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 521
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
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gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaag 339
<210> 522
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 522
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Phe Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 523
<211> 660
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 523
gagatcgtcc tgactcagtc acccgctacc ctgagcctga gccctggcga gcgggctaca 60
ctgagctgta aatctagtca gtcactgctg gatagcggta atcagaagaa cttcctgacc 120
tggtatcagc agaagcccgg tcaagcccct agactgctga tctactgggc ctctactaga 180
gaatcaggcg tgccctctag gtttagcggt agcggtagtg gcaccgactt caccttcact 240
atctctagcc tggaagccga ggacgccgct acctactact gtcagaacga ctatagctac 300
ccctacacct tcggtcaagg cactaaggtc gagattaagc gtacggtggc cgctcccagc 360
gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc ccgggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg 480
cagagcggca acagccagga gagcgtcacc gagcaggaca gcaaggactc cacctacagc 540
ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc gactacgaga agcataaggt gtacgcctgc 600
gaggtgaccc accagggcct gtccagcccc gtgaccaaga gcttcaacag gggcgagtgc 660
<210> 524
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 524
acctactgga tgcac 15
<210> 525
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 525
aatatctacc ccggcaccgg cggctctaac ttcgacgaga agtttaagaa t 51
<210> 526
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 526
tggactaccg gcacaggcgc ctac 24
<210> 527
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 527
ggctacacct tcactaccta c 21
<210> 528
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 528
taccccggca ccggcggc 18
<210> 529
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 529
aaatctagtc agtcactgct ggatagcggt aatcagaaga acttcctgac c 51
<210> 530
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 530
tgggcctcta ctagagaatc a 21
<210> 531
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 531
cagaacgact atagctaccc ctacacc 27
<210> 532
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 532
agtcagtcac tgctggatag cggtaatcag aagaacttc 39
<210> 533
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 533
tgggcctct 9
<210> 534
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 534
gactatagct acccctac 18
<210> 535
<400> 535
000
<210> 536
<400> 536
000
<210> 537
<400> 537
000
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<400> 538
000
<210> 539
<400> 539
000
<210> 540
<400> 540
000
<210> 541
<400> 541
000
<210> 542
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 542
Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp Val Ala
1 5 10
<210> 543
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 543
Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr
1 5
<210> 544
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 544
His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 545
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 545
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Asn Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 546
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 546
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Glu Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Asn Tyr Ala Phe His Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Ala Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 547
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 547
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His
1 5 10
<210> 548
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 548
Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 549
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 549
Ala Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val
1 5 10
<210> 550
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 550
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 551
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 551
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Ala Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Tyr Gly Asn Tyr Trp Tyr Ile Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
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275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
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420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
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aatctgctcg cgatcatggt ggatatcttc aaatgacttc g 41

Claims (41)

1.一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用单独的治疗有效量的1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物或与至少一种另外的治疗活性剂的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中化合物A与一种另外的治疗活性剂一起施用，所述治疗活性剂是SHP2抑制剂或PD-1抑制剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述另外的治疗活性剂是SHP2抑制剂，所述SHP2抑制剂选自由以下组成的组：TNO155、JAB3068、JAB3312、RLY1971、SAR442720、RMC4450、BBP398、BR790、SH3809、PF0724982、ERAS601、RX-SHP2、ICP189、HBI2376、ETS001、TAS-ASTX和X-37-SHP2，或其药学上可接受的盐。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述另外的治疗活性剂是TNO155或其药学上可接受的盐。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述另外的治疗活性剂是PD-1抑制剂，所述PD-1抑制剂选自由以下组成的组：斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、BGB-108、INCSHR1210和AMP-224。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中所述另外的治疗活性剂是斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物与SHP2抑制剂和PD-1抑制剂的组合。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述SHP2抑制剂选自由以下组成的组：TNO155、JAB3068、JAB3312、RLY1971、SAR442720、RMC4450、BBP398、BR790、SH3809、PF0724982、ERAS601、RX-SHP2、ICP189、HBI2376、ETS001、TAS-ASTX和X-37-SHP2，或其药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述SHP2抑制剂是TNO155或其药学上可接受的盐。
10.如权利要求7或8或9所述的方法，其中所述PD-1抑制剂选自由以下组成的组：斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、BGB-108、INCSHR1210和AMP-224。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述PD1-抑制剂是斯巴达珠单抗。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述PD1-抑制剂是替雷利珠单抗。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是选自由以下组成的组的癌症或肿瘤：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肺癌(如非小细胞肺癌)、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述癌症或肿瘤是KRAS G12C突变型癌症或肿瘤。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中同时、分开或经一段时间施用组合疗法中的治疗剂。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述有需要的受试者施用的每种治疗剂的量对治疗所述癌症或肿瘤是有效的。
18.如权利要求3、4、8、9、10、13至17中任一项所述的方法，其中所述SHP2抑制剂是TNO155或其药学上可接受的盐，并且以范围从10至80mg或从10至60mg的每日总剂量口服施用。
19.如权利要求18所述的方法，其中TNO155的每日剂量按2周用药、随后1周停药的21天周期施用。
20.如权利要求5、6、10、12、13至17中任一项所述的方法，其中所述PD1抑制剂是PDR001，并且以约300mg的剂量每3周一次施用。
21.如权利要求5、6、10、11、13至17中任一项所述的方法，其中所述PD1抑制剂是PDR001，并且以约400mg的剂量每4周一次施用。
22.如权利要求5、6、10、12、13至17中任一项所述的方法，其中所述PD1抑制剂是替雷利珠单抗，并且以约200mg的剂量每3周一次施用。
23.如权利要求5、6、10、12、13至17中任一项所述的方法，其中所述PD1抑制剂是替雷利珠单抗，并且以约300mg的剂量每4周一次施用。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中以范围从50mg至1600mg/天，例如从200至1600mg/天，例如从400至1600mg/天的治疗有效剂量施用化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中以选自50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550和600mg/天的治疗有效剂量施用化合物A或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中化合物A的每日总剂量每日一次或每日两次施用。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中待治疗的所述受试者或患者选自：
-患有KRAS G12C突变型实体瘤(例如晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型实体瘤)的患者，任选地其中所述患者已经接受了标准护理疗法但失败了，或者对先前的研究性疗法和/或批准的疗法不耐受或不适合或具有难治性；
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中所述患者已经接受了组合或顺序进行的基于铂的化学疗法方案和免疫检查点抑制剂疗法但失败了；
-患有KRAS G12C突变型CRC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型CRC)的患者，任选地其中所述患者已经接受了标准护理疗法但失败了，所述标准护理疗法包括基于氟嘧啶、奥沙利铂、和/或伊立替康的化学疗法；以及
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中所述患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中所述患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗，并且所述患者患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤；
-患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤。
28.一种药物组合，所述药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮，其具有结构
或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和SHP2抑制剂，任选地其中所述SHP2抑制剂选自TNO155、JAB3068、JAB3312、RLY1971、SAR442720、RMC4450、BBP398、BR790、SH3809、PF0724982、ERAS601、RX-SHP2、ICP189、HBI2376、ETS001、TAS-ASTX和X-37-SHP2，或其药学上可接受的盐。
29.如权利要求28所述的药物组合，其中所述SHP2抑制剂是(3S,4S)-8-(6-氨基-5-((2-氨基-3-氯吡啶-4-基)硫代)吡嗪-2-基)-3-甲基-2-氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸-4-胺(TNO155)，其具有结构：
或其药学上可接受的盐。
30.一种药物组合，所述药物组合包含：
1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，和
(ii)PD-1抑制剂。
31.如权利要求30所述的药物组合，其中所述PD1-抑制剂是斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗。
32.一种药物组合，所述药物组合包含
(i)1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，
(ii)SHP2抑制剂
以及
(iii)PD-1抑制剂。
33.如权利要求32所述的药物组合，其中所述SHP2抑制剂选自TNO155、JAB3068、JAB3312、RLY1971、SAR442720、RMC4450、BBP398、BR790、SH3809、PF0724982、ERAS601、RX-SHP2、ICP189、HBI2376、ETS001、TAS-ASTX和X-37-SHP2，或其药学上可接受的盐。
34.如权利要求32或33所述的药物组合，其中所述PD-1抑制剂选自斯巴达珠单抗、替雷利珠单抗、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗、MEDI0680、REGN2810、TSR-042、PF-06801591、BGB-108、INCSHR1210和AMP-224(优选地选自斯巴达珠单抗和替雷利珠单抗)。
35.如权利要求28至34中任一项所述的药物组合，用于在治疗癌症或实体瘤的方法中使用，其中所述方法是如权利要求1至27中任一项所述的。
36.一种化合物，即1-{6-[(4M)-4-(5-氯-6-甲基-1H-吲唑-4-基)-5-甲基-3-(1-甲基-1H-吲唑-5-基)-1H-吡唑-1-基]-2-氮杂螺[3.3]庚-2-基}丙-2-烯-1-酮(化合物A)或其药学上可接受的盐、溶剂化物或水合物，其用于在治疗癌症或肿瘤的方法中使用，任选地其中所述癌症选自非小细胞肺癌、结直肠癌、胰腺癌和实体瘤。
37.如权利要求36所述使用的化合物，其中所述化合物与一种或两种另外的治疗活性剂组合施用。
38.如权利要求37所述使用的化合物，其中所述一种或两种另外的治疗活性剂选自TNO155或其药学上可接受的盐，
以及
(iii)PD1-抑制剂，如斯巴达珠单抗或替雷利珠单抗。
39.如权利要求36至38中任一项所述使用的化合物，用于在治疗癌症或实体瘤的方法中使用，其中所述方法是如权利要求1至27中任一项所述的。
40.一种治疗有需要的受试者的癌症或肿瘤的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用单独的治疗有效量的KRASG12C抑制剂或与至少一种另外的治疗活性剂的组合，其中所述待治疗的受试者或患者选自：
-患有KRAS G12C突变型实体瘤(例如晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型实体瘤)的患者，任选地其中所述患者已经接受了标准护理疗法但失败了，或者对先前的研究性疗法和/或批准的疗法不耐受或不适合或具有难治性；
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中所述患者已经接受了组合或顺序进行的基于铂的化学疗法方案和免疫检查点抑制剂疗法但失败了；
-患有KRAS G12C突变型CRC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型CRC)的患者，任选地其中所述患者已经接受了标准护理疗法但失败了，所述标准护理疗法包括基于氟嘧啶、奥沙利铂、和/或伊立替康的化学疗法；以及
-患有KRAS G12C突变型NSCLC(例如，晚期(转移性或不可切除性)KRAS G12C突变型NSCLC)的患者，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中所述患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有KRAS G12C突变型癌症的患者，任选地其中所述患者先前已经用另一种KRASG12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗，并且所述患者患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤；
-患有选自由以下组成的组的KRAS G12C突变型癌症的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤，任选地其中所述患者先前已经用KRAS G12C抑制剂(例如索托拉西布、阿达格拉西布、GDC6036或D-1553)治疗；
-患有以下的患者：肺癌(包括肺腺癌、非小细胞肺癌和鳞状细胞肺癌)、结直肠癌(包括结肠直肠腺癌)、胰腺癌(包括胰腺腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌)、直肠癌(包括直肠腺癌)、阑尾癌、小肠癌、食道癌、肝胆癌(包括肝癌和胆管癌)、膀胱癌、卵巢癌和实体瘤；
-患有带有KRASG12C突变的局部晚期或转移性NSCLC的未进行治疗的患者。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述至少另外的治疗活性剂选自SHP2抑制剂(如TNO 155)和PD1-抑制剂(如替雷利珠单抗)。
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