CN116699133A - 一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系及其诊断试剂盒 - Google Patents
一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系及其诊断试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,所述外泌体蛋白为Survivin。所述外泌体蛋白标志物体系还包括由捕获抗体和检测抗体、混合融合蛋白校准品组成的夹心检测试剂。本发明通过检测血液样本中Survivin阳性外泌体的CD9、CD63、CD81任意一个、两个、三个的蛋白表达量,实现乳腺癌的辅助诊断。本发明可完成血浆外泌体中表达Survivin蛋白的CD9/CD63/CD81总外泌体亚群的检测,可以显著区分乳腺癌患者与健康人,并在一定程度上区别乳腺癌与其他癌种,对乳腺癌患者的用药指导具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学诊断领域,具体涉及一种应用在乳腺癌诊断中的外泌体蛋白标志物体系及其试剂盒。
背景技术
世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)2021年1月发布的“2020年全球最新癌症负担数据”显示,乳腺癌取代肺癌,成为全球第一大癌。
乳腺癌在全球范围内的高发病率高死亡率对女性健康构成极大威胁,提高早期乳腺癌的检出率并进行及时有效的治疗可以极大降低乳腺癌死亡率。如早期原位癌(如原位导管癌)检出患者5年生存率接近100%,而晚期患者存活率只有27%。尽管乳腺癌的临床治疗方法有了很大的突破,但是早期检出仍然是较好预后的关键因素。
目前,乳腺癌(breast cancer,BC)诊断主要依靠影像学技术和组织病理学检查。但是影像学检查存在临床局限性,它对肿瘤体积检查要求较高,存在检测下限;而组织病理学检查需要进行手术活体取样,容易对患者造成生理痛苦。还有一种就是生物靶标的检测,血清乳腺癌检测标志物主要为CA15-3,乳腺癌中后期患者检测结果显示CA15-3表达显著上升,对于患者的复发风险评估和预后监控具有重要意义。但早期或局部乳腺癌患者中的血清CA15-3指标变化程度不明显,无法与健康女性或患有良性乳腺疾病的女性的血清CA15-3水平区分开。
目前,乳腺癌的早筛或早诊暂无FDA或NMPA批准的液体活检产品,影响因子较高的文章报道也主要聚焦于乳腺癌的预后或者晚期患者的病程监控与管理。现在乳腺癌的早筛早诊亟需一种经济、操作简单、无创、结果客观的液体活检产品。
外泌体是体内活细胞分泌的30-150nm的具有脂质双层膜结构的多囊泡体,广泛分布于外周血、唾液、尿液、母乳、脑脊液等体液中,半衰期较长,具有改变细胞外微环境、呈递抗原、刺激T细胞增殖、诱导机体免疫反应等功能。肿瘤来源的外泌体在肿瘤生长和转移过程中发挥多种作用,可能通过影响免疫逃逸、组织侵袭和血管生成来发挥其功能。肿瘤细胞分泌的外泌体囊泡包含了肿瘤细胞的多种蛋白质、脂质和遗传物质等,并且每毫升血液里外泌体数量远多于循环肿瘤细胞(CTC),在液态活检领域扮演重要角色。外泌体检测可作为一种无创或微创的非侵入诊断手段,一定条件下有望替代部分组织活检减轻患者的痛苦,提高疾病早期检出率。
Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员之一,由BIRC5基因编码,在前列腺、胰腺、肺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤中过表达。虽然survivin最初被定义为一种细胞内蛋白,但近年来研究表明,Survivin可以通过外泌体从癌细胞释放到肿瘤微环境中。外泌体Survivin与高危前列腺癌以及对化疗产生耐药性的病例有很强的相关性。研究显示外泌体Survivin在乳腺癌患者中普遍高表达,Survivin蛋白可以作为乳腺癌的早期诊断或预后标志物进行进一步研究。
现在有关Survivin蛋白的检测,大多数是利用组织免疫染色对其表达量进行分析,还有就是单独对蛋白本身进行检测,还未有报道在外泌体层面将Survivin与其外泌体标志蛋白(如CD9、CD63等)构建检测体系。
发明内容
为解决以上问题,本发明构建了外泌体蛋白Survivin标志物及外泌体 Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测体系,以Survivin和外泌体标志蛋白 (CD9、CD63、CD81)构建夹心体系进行外泌体检测,实现乳腺疾病的检测。该体系具有更高的灵敏度和特异性,可以反映血浆外泌体上表达Survivin蛋白的CD9/CD63/CD81总外泌体亚群的表达情况,能够更好地鉴别、诊断乳腺癌。
本发明的技术方案是,一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,所述外泌体蛋白为Survivin。
其中,所述标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体。
其中,所述夹心检测试剂包括与Survivin蛋白结合的抗体。
其中,所述夹心检测试剂包括与外泌体通用蛋白结合的抗体。
其中,所述与外泌体通用蛋白结合的抗体包括但不限于Survivin外泌体标志蛋白CD9、CD63、CD81中的一种或几种。
其中,所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段。是能够与Survivin蛋白发生免疫反应的单克隆或多克隆抗体。
其中,所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。即:检测抗体是至少包含一种免疫原分别为CD9(UniProt:P21926)、CD63(UniProt:P08962)、CD81 (UniProt:P60033)的部分或全长重组蛋白或多肽片段;是能够与CD9、 CD63、CD81中的一个或多个发生蛋白免疫反应的单个抗体或多个抗体的混合物。
其中,所述标志物体系还包括混合融合蛋白校准品;所述混合融合蛋白校准品是哺乳动物细胞表达的重组蛋白Survivin+CD9、Survivin+CD63 和Survivin+CD81的混合物。
其中,所述混合融合蛋白校准品由以下方法得到:合成序列分别为 SEQ1+SEQ2、SEQ1+SEQ3、SEQ1+SEQ4的三组序列,每组两个基因序列之间均以SEQ5序列相连,并分别在每组前一基因前添加SEQ6,每组后一个基因后接上SEQ7,然后每组整体分别连接到pVAX1载体上;将获得的3个人重组质粒pVAX1-Survivin+CD9-His、 pVAX1-Survivin+CD63-His和pVAX1-Survivin+CD81-His分别转入真核哺乳动物细胞293F中;转染、收集、过滤,保留上清液进行蛋白纯化,得到混合融合蛋白校准品。
本发明还公开了所述外泌体蛋白标志物体系在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。所述外泌体蛋白标志物体系应用在乳腺癌诊断试剂盒的制备中。
其中,所述外泌体蛋白为Survivin。
其中,所述标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体;所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段;所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81 中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。
本发明还公开了一种乳腺癌诊断试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1 所述的外泌体蛋白为Survivin的外泌体蛋白标志物体系。
其中,所述试剂盒中的外泌体蛋白标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体;所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段;所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。
所述试剂盒中的标志物体系还包括混合融合蛋白校准品;所述混合融合蛋白校准品是哺乳动物细胞表达的重组蛋白Survivin+CD9、 Survivin+CD63和Survivin+CD81的混合物。
根据样本检测结果,所述试剂盒中的外泌体蛋白标志物体系相对更适用于实现健康人和乳腺癌区分的组合是:Survivin-CD9、Survivin-81、 Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺结节和乳腺癌区分的组合是: Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺癌和其他癌区分的组合是: Survivin-CD9+CD63+CD81。
本发明的整体技术方案是:通过检测血液样本中Survivin阳性外泌体的CD9、CD63、CD81任意一个、两个、三个的蛋白表达量,实现乳腺癌的辅助诊断。具体技术方案是:先富集血浆外泌体,采用包被或偶联Survivin抗体的载体(捕获抗体)与血浆外泌体接触,捕获样本中的Survivin阳性外泌体,形成“载体-Survivin阳性外泌体”复合物,加入 CD9、CD63、CD81检测抗体单一物质或混合物(检测抗体),与复合物接触,实现CD9、CD63、CD81一种或多种外泌体标志蛋白的同时检测,实现乳腺癌和乳腺良性疾病、健康人等对照样本的区分。
本发明的有益效果为:
1.可以完成血浆外泌体中表达Survivin蛋白的CD9/CD63/CD81总外泌体亚群的检测。
2.该检测体系可以显著区分乳腺癌患者与健康人,AUC=0.92,灵敏度为87.5%,特异性为90%,。
3.该检测体系可以在一定程度上区别乳腺癌与其他癌种,对乳腺癌患者的用药指导具有重要意义。
附图说明
图1为Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测体系标准曲线。其中,A: Survivin-CD9体系;B:Survivin-CD63体系:C:Survivin-CD81体系; D:Survivin-CD9/CD63/CD81体系。
图2为Survivin-CD9/CD63/CD81体系乳腺癌与健康人检出值散点图。
图3为Survivin-CD9/CD63/CD81体系检测乳腺癌与健康人的ROC 分析。
图4为Survivin-CD9/CD63/CD81体系检测乳腺癌与良性乳腺结节患者检出值散点图。
图5为Survivin-CD9/CD63/CD81体系检测乳腺癌与其他癌症患者检出值散点图。
具体实施方式
为更好理解本发明,下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述,但本发明并不限于这些实施例。
实施例1混合融合蛋白校准品表达及纯化鉴定
1.1蛋白表达:NCBI搜索人源Survivin(SEQ1)、CD9(SEQ2)、 CD63(SEQ3)、CD81(SEQ4)对应的胞外片段对应的蛋白编码序列,合成Survivin+CD9、Survivin+CD63、Survivin+CD81三组序列,每组两个基因序列之间均以linker(SEQ5)序列相连,并分别在前一基因前添加序列6(SEQ6),后一个基因接上序列7(SEQ7),然后每组整体分别连接到pVAX1载体上。将获得的3个人重组质粒 pVAX1-Survivin+CD9-His、pVAX1-Survivin+CD63-His和pVAX1-Survivin+CD81-His分别转入真核哺乳动物细胞293F中。转染 18-22h添加转染增强剂,5-7天收集细胞上,利用0.22μm滤膜过滤上清液,保留上清液进行后续的蛋白纯化。
平衡(清洗)缓冲液:20mM咪唑、250mM NaCl、20mM磷酸盐缓冲液,pH7.4。
洗脱缓冲液:100mM咪唑、250mM NaCl、20mM磷酸盐缓冲液, pH7.4。
将所得滤液与Ni柱中的填料在4℃下旋转孵育2-3h,使蛋白与Ni 柱的填料结合,然后将样品/填料混合物转移到柱上,使滤液自然流出。用平衡缓冲液洗20mL左右后,用清洗洗约20ml,洗去杂蛋白。最后用洗脱缓冲液洗脱20-30ml,收集洗脱液。利用10kD超滤管浓缩蛋白溶液,将蛋白保存于pH7.450mM PBS中,-80℃保存,将获得的蛋白使用 SDS-PAGE电泳进行蛋白大小和纯度鉴定获得可用于后续实验的目的蛋白。
SEQ1:
ATGGGTGCCCCGACGTTGCCCCCTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAAGG ACCACCGCATCTCTACATTCAAGAACTGGCCCTTCTTGGAGGGCTGC GCCTGCACCCCGGAGCGGATGGCCGAGGCTGGCTTCATCCACTGCC CCACTGAGAACGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTCTTCTGCTTCAA GGAGCTGGAAGGCTGGGAGCCAGATGACGACCCCATAGAGGAACA TAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTTTCCTTTCTGTCAAGAAGCAGT TTGAAGAATTAACCCTTGGTGAATTTTTGAAACTGGACAGAGAAAG AGCCAAGAACAAAATTGCAAAGGAAACCAACAATAAGAAGAAAGA ATTTGAGGAAACTGCGGAGAAAGTGCGCCGTGCCATCGAGCAGCT GGCTGCCATGGATTGA
SEQ2:
TCCCACAAGGATGAGGTGATTAAGGAAGTCCAGGAGTTTTACAAGG ACACCTACAACAAGCTGAAAACCAAGGATGAGCCCCAGCGGGAAA CGCTGAAAGCCATCCACTATGCGTTGAACTGCTGTGGTTTGGCTGG GGGCGTGGAACAGTTTATCTCAGACATCTGCCCCAAGAAGGACGTA CTCGAAACCTTCACCGTGAAGTCCTGTCCTGATGCCATCAAAGAGG TCTTCGACAATAAATTCCACATC
SEQ3:
GCTGGCTATGTGTTTAGAGATAAGGTGATGTCAGAGTTTAATAACAA CTTCCGGCAGCAGATGGAGAATTACCCGAAAAACAACCACACTGCT TCGATCCTGGACAGGATGCAGGCAGATTTTAAGTGCTGTGGGGCTG CTAACTACACAGATTGGGAGAAAATCCCTTCCATGTCGAAGAACCG AGTCCCCGACTCCTGCTGCATTAATGTTACTGTGGGCTGTGGGATTA ATTTCAACGAGAAGGCGATCCATAAGGAGGGCTGTGTGGAGAAGATTGGGGGCTGGCTGAGGAAAAATGTG
SEQ4:
AAGGACCAGATCGCCAAGGATGTGAAGCAGTTCTATGACCAGGCCC TACAGCAGGCCGTGGTGGATGATGACGCCAACAACGCCAAGGCTGT GGTGAAGACCTTCCACGAGACGCTTGACTGCTGTGGCTCCAGCACA CTGACTGCTTTGACCACCTCAGTGCTCAAGAACAATTTGTGTCCCTC GGGCAGCAACATCATCAGCAACCTCTTCAAGGAGGACTGCCACCAG AAGATCGATGACCTCTTCTCCGGGAAG
SEQ5:
GGCGGTGGTAGCGGCGGTGGCAGCGGCGGTGGTAGCGGCGGTGGC AGC
SEQ6:
AAGCTTGCCACCATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACGAATTCG
SEQ7:
CATCACCATCACCACCATCATCACCATCACTAACTCGAG
1.2融合蛋白活性鉴定:将融合蛋白分别用包被缓冲液(pH9.6)梯度稀释后加入微孔板,每孔100μL,4℃包被过夜,拍干的微孔板中包被抗体并加入200μL酶标板稳定剂,37℃孵育2小时。弃去封闭液并拍干, 37℃干燥30min;稀释检测抗体至250ng/ml,37℃孵育1小时,洗涤后加入TMB底物显色液显色。检测发现这3个融合蛋白的包板浓度在6.25ng/mL时,检测的OD值大于1.0,蛋白的反应活性较好,满足要求,如表1所示。
表1真核表达融合蛋白活性鉴定
实施例2 Survivin-CD9/CD63/CD81检测体系的抗体配对
采用2μg/mL捕获抗体包被酶标板,将上述三个融合蛋白等比例混合并测浓度,然后梯度稀释融合蛋白混合校准品(5-320pg/mL),37℃孵育1小时,洗涤后加入100μL浓度为250ng/mL的HPR标记的检测抗体 (Survivin-CD9/CD63/CD81体系中将CD9/CD63/CD81这三款检测抗体等比例混合加入酶标板中),并于37℃孵育1小时,洗涤后加入底物显色液并测定OD450nm。从结果上看,捕获抗体(Survivin:Santa Cruz; sc-17779)和检测抗体(CD9:CUSABIO;CSB-PA004969LB01HU,CD63: SinoBiological;11271-R142,CD81:CUSABIO;CSB-PA004960DB01MO) 配对良好,可用于夹心检测体系构建,如表2所示。
表2 Survivin-CD9/CD63/CD81检测体系的抗体配对
实施例3 Survivin-CD9/CD63/CD81检测体系的校准曲线绘制
Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测试剂体系包括前述捕获抗体、检测抗体和混合融合蛋白校准品。首先将捕获抗体用包被缓冲液(pH9.6) 稀释至2μg/mL,按每孔100μL加入酶标板中,4℃孵育过夜;将校准品蛋白用蛋白质稳定剂稀释分别稀释至0pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、 20pg/mL、40pg/mL、80pg/mL、160pg/mL、320pg/mL,并按照顺序将校准品加入预包被酶标板中,每孔100μL,37℃孵育1.5小时;用洗涤液清洗3次,加入HRP标记的检测抗体,浓度250ng/mL,每孔100μL,37℃孵育1小时;再用洗涤液清洗3次,加入底物显色液并测定各孔OD450nm值。以标准品含量自变量(X),以其相对应的吸光值作因变量(Y),以logistic四参数法拟合得到回归方程将待测样本测得的发光值代入回归方程,求得相对应的抗原含量。校准曲线线性范围5-320pg/mL,如图1 所示为Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测试剂体系标准曲线,最低检测限可达5pg/mL。
实施例4 Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测试剂体系临床性能验证1
本实施例检测样本类型为:血浆外泌体,共入组60例样本。其中40 例乳腺癌(8例导管原位癌、12例浸润性导管癌、11例小叶原位癌,9 例浸润性小叶癌)和20例健康人。
血浆外泌体的处理方式如下:取1ml血浆加入含有Capto Core 700 填料的SEC吸附柱中,收集流出液。继续加入1.5ml PBS并收集流出液。
最后共得到2.5ml流出液即为血浆外泌体。使用前述 Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测试剂体系对样本血浆外泌体进行检测,样本含量散点图如图2所示,Survivin-CD9/CD63/CD81体系对乳腺癌和健康人检测结果的区分度最好,统计学上具有极显著差异,Survivin-CD9和Survivin-CD81检测结果的差异性也呈极显著,但是 Survivin-CD63体系在乳腺癌和健康人之间的检测结果差异没有显著性。 ROC曲线统计结果如图3所示,Survivin-CD9/CD63/CD81检测效果最好,曲线下面积为0.92,以109.5pg/mL作为检测参考值, Survivin-CD9/CD63/CD81体系灵敏度为87.5%,特异性为90%,Survivin-CD9(切值:85.5pg/ml;灵敏度:85%;特异性:80%)、 Survivin-CD81(切值:85.5pg/ml;灵敏度:75%;特异性:90%)、Survivin -CD63(切值:80pg/m;灵敏度:67.5%;特异性:85%)。
实施例5 Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测体系临床性能验证2
本实施例检测样本类型为:血浆外泌体,共入组40例样本。其中20 例乳腺癌患者(3例中级别导管原位癌、5例高级别导管原位癌、12例浸润性导管癌、11例小叶原位癌,9例浸润性小叶癌)和20例良性乳腺结节患者。运用前述构建好的Survivin-CD9/CD63/CD81检测体系,检测结果如图4所示,Survivin-CD9/CD63/CD81体系在乳腺癌与良性乳腺增生患者上的检测结果具有统计学上极显著差异,而单一外泌体标志物检测体系的结果在乳腺癌与良性乳腺结节患者间的差异没有显著性。当 Survivin-CD9/CD63/CD81体系切值为102.5pg/ml时,灵敏度为85%;特异性为85%。
实施例6 Survivin-CD9/CD63/CD81夹心检测体系临床性能验证3
本实施例检测样本类型为:血浆外泌体,共入组30例样本。其中15 例乳腺癌患者(5例导管原位癌、2例浸润性导管癌、8例小叶原位癌) 和15其他癌症患者(5例肠癌、6例皮肤癌、4例胃癌),使用前述构建好的Survivin-CD9/CD63/CD81体系检测。从散点图来看(图5), Survivin-CD9/CD63/CD81多外泌体蛋白混合检测能够将乳腺癌与其他癌种区分。当切值为118.5pg/ml时,灵敏度为80%,特异性为66.67%,具有一定的临床指导意义。
以上数据表明:
1.以Survivin阳性血浆外泌体中CD9/CD63/CD81总外泌体亚群含量作为检测指标检乳腺癌与健康人样本,ROC曲线统计结果显示曲线下面积(AUC)为0.92,以109.5pg/mL作为检测参考值, Survivin-CD9/CD63/CD81体系灵敏度为87.5%,特异性为90%。ROC 曲线下面积(AUC)越接近1越具有诊断价值,这表明该检测体系可以高效地将乳腺癌与健康人区分鉴别开来。
2.Survivin-CD9/CD63/CD81体系能够显著区分乳腺癌与良性乳腺结节患者。当Survivin-CD9/CD63/CD81体系切值为102.5pg/ml时,灵敏度为85%;特异性为85%。
3.Survivin-CD9/CD63/CD81体系检测能够将乳腺癌与其他癌种区分。
当切值为118.5pg/ml时,灵敏度为80%,特异性为66.67%,具有一定的临床指导意义。
本发明通过研究发现,通过对血浆外泌体中的表达Survivin蛋白的 CD9/CD63/CD81总外泌体亚群进行检测,能够较好地鉴别、诊断乳腺癌,同时还可以将乳腺癌与良性乳腺结节区分,从而应用于乳腺癌的早期诊断、鉴别诊断,并为疾病术后治疗提供指导意义。
综上可知,本发明提供了一种灵敏度高、特异性好的可用于诊断乳腺癌的检测体系Survivin-CD9/CD63/CD81体系,通过对血浆外泌体表达 Survivin的不同外泌体亚群进行测定,能够很好地鉴别乳腺癌与健康人,从而对乳腺癌的鉴别诊断提供有力依据。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明创造构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司
<120> 一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系及其诊断试剂盒
<130> 0
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(429)
<400> 1
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggattga 429
<210> 2
<211> 252
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(252)
<400> 2
tcccacaagg atgaggtgat taaggaagtc caggagtttt acaaggacac ctacaacaag 60
ctgaaaacca aggatgagcc ccagcgggaa acgctgaaag ccatccacta tgcgttgaac 120
tgctgtggtt tggctggggg cgtggaacag tttatctcag acatctgccc caagaaggac 180
gtactcgaaa ccttcaccgt gaagtcctgt cctgatgcca tcaaagaggt cttcgacaat 240
aaattccaca tc 252
<210> 3
<211> 303
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(303)
<400> 3
gctggctatg tgtttagaga taaggtgatg tcagagttta ataacaactt ccggcagcag 60
atggagaatt acccgaaaaa caaccacact gcttcgatcc tggacaggat gcaggcagat 120
tttaagtgct gtggggctgc taactacaca gattgggaga aaatcccttc catgtcgaag 180
aaccgagtcc ccgactcctg ctgcattaat gttactgtgg gctgtgggat taatttcaac 240
gagaaggcga tccataagga gggctgtgtg gagaagattg ggggctggct gaggaaaaat 300
gtg 303
<210> 4
<211> 258
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(258)
<400> 4
aaggaccaga tcgccaagga tgtgaagcag ttctatgacc aggccctaca gcaggccgtg 60
gtggatgatg acgccaacaa cgccaaggct gtggtgaaga ccttccacga gacgcttgac 120
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ccctcgggca gcaacatcat cagcaacctc ttcaaggagg actgccacca gaagatcgat 240
gacctcttct ccgggaag 258
<210> 5
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
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<400> 5
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<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<400> 6
aagcttgcca ccatgtacag gatgcaactc ctgtcttgca ttgcactaag tcttgcactt 60
gtcacgaatt cg 72
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(39)
<400> 7
catcaccatc accaccatca tcaccatcac taactcgag 39
Claims (16)
1.一种应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述外泌体蛋白为Survivin。
2.如权利要求1所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体。
3.如权利要求2所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述夹心检测试剂包括与Survivin蛋白结合的抗体。
4.如权利要求2所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述夹心检测试剂包括与外泌体通用蛋白结合的抗体。
5.如权利要求4所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述与外泌体通用蛋白结合的抗体包括但不限于CD9、CD63、CD81中的一种或几种。
6.如权利要求2所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段。
7.如权利要求2所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。
8.如权利要求1所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述标志物体系还包括混合融合蛋白校准品;所述混合融合蛋白校准品是哺乳动物细胞表达的重组蛋白Survivin+CD9、Survivin+CD63和Survivin+CD81的混合物。
9.如权利要求8所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述混合融合蛋白校准品由以下方法得到:合成序列分别为SEQ1+SEQ2、SEQ1+SEQ3、SEQ1+SEQ4的三组序列,每组两个基因序列之间均以SEQ5序列相连,并分别在每组的前一基因前添加SEQ6,每组的后一个基因后接上SEQ7,然后每组整体分别连接到pVAX1载体上;再将获得的3个人重组质粒pVAX1-Survivin+CD9-His、pVAX1-Survivin+CD63-His和pVAX1-Survivin+CD81-His分别转入真核哺乳动物细胞293F中;转染、收集、过滤,保留上清液进行蛋白纯化,得到混合融合蛋白校准品。
10.如权利要求8所述的应用于乳腺癌诊断的外泌体蛋白标志物体系,其特征在于,所述外泌体蛋白标志物体系中适用于实现健康人和乳腺癌区分的组合是:Survivin-CD9、Survivin-81、Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺结节和乳腺癌区分的组合是:Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺癌和其他癌区分的组合是:Survivin-CD9+CD63+CD81。
11.如权利要求1~10任一所述的外泌体蛋白标志物体系在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。
12.如权利要求11所述的外泌体蛋白标志物体系在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用,其特征在于,所述外泌体蛋白为Survivin;
所述标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体;所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段;所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。
13.一种乳腺癌诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1所述的外泌体蛋白为Survivin的外泌体蛋白标志物体系。
14.如权利要求13所述的乳腺癌诊断试剂盒,其特征在于,所述外泌体蛋白标志物体系还包括夹心检测试剂;所述夹心检测试剂至少包括捕获抗体和检测抗体;所述捕获抗体是免疫原为Survivin蛋白的重组蛋白或多肽片段;所述检测抗体是包含免疫原分别为CD9、CD63、CD81中的一种、两种或多种的重组蛋白或多肽片段。
15.如权利要求13所述的乳腺癌诊断试剂盒,其特征在于,所述标志物体系还包括混合融合蛋白校准品;所述混合融合蛋白校准品是哺乳动物细胞表达的重组蛋白Survivin+CD9、Survivin+CD63和Survivin+CD81的混合物。
16.如权利要求15所述的乳腺癌诊断试剂盒,其特征在于,所述外泌体蛋白标志物体系中适用于实现健康人和乳腺癌区分的组合是:Survivin-CD9、Survivin-81、Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺结节和乳腺癌区分的组合是:Survivin-CD9+CD63+CD81;适用于乳腺癌和其他癌区分的组合是:Survivin-CD9+CD63+CD81。
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