CN116694730A - 一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,利用细胞核原位两步Tn5酶切反应构建开放染色质和转录组共测序文库。本发明提供的方法,缩短了实验流程,简化了转录组文库构建中mRNA的物理分离步骤;设计了Tn5测序接头序列和逆转录引物的碱基序列,在mRNA‑cDNA杂合双链上添加接头,避免使用连接反应添加测序接头,提高了反应效率。此外,本发明还提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,使用自主研发的反应试剂体系,降低了单细胞文库的制备成本,具有较高的普遍适用性。不仅如此,本发明还提高了反应效率和测序数据质量,单细胞可检出基因数和染色质开放片段数有了显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法。
背景技术
单细胞测序及组学分析技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。其中,单细胞开放染色质测序(ATAC-seq)在单细胞水平揭示基因组调控元件的染色质开放模式,而单细胞转录组测序(RNA-seq)则提供了在单细胞水平观测基因表达的方法。近年来,同一细胞内转录组与染色质可及性共测序文库构建技术的发展使得可以整合同一细胞内染色质开放与基因转录两个层面的信息,从而对基因表达调控机制进行更深入的研究。
目前,单细胞开放染色质和转录组共测序中,染色质可及性文库一般利用一种或多种转座酶将接头序列插入基因组上开放的DNA片段两端,用于后续建库。对于转录组文库,一种方法是先将细胞裂解后进行RNA逆转录;另一种方法是在细胞原位逆转录。后续两种方法均通过特异性转座酶或连接酶添加接头和标签。在这些技术中,scNMT-seq、scCAT-seq和ASTAR-seq测试的细胞通量较低,无法满足后续研究的需要;SNARE-seq和ChromiumNext GEM Single Cell Multiome ATAC+Gene Expression依赖特殊的仪器设备,操作繁琐,费用昂贵;而sci-CAR、Paired-seq和SHARE-seq反应成本高,实验流程长,对实验人员操作技术要求较高,难以广泛推广。不仅如此,目前这些方法还存在每个单细胞中能检测到的文库复杂度和灵敏度较低的问题,测序数据质量都有待提高。本领域目前亟需一种高质量的、具有普适性的单细胞开放染色质和转录组共测序文库构建方法。
因此,现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,旨在解决目前的单细胞开放染色质和转录组共测序文库构建方法成本较高、普适性不强,且测序数据质量不高,文库复杂度和灵敏度较低的问题。
本发明的技术方案如下:
第一方面,本发明提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述方法包括步骤:
1.1提供Tn5转座子1,在待测细胞的细胞核染色质开放区域添加第一接头;
1.2利用针对待测细胞的特异性逆转录引物A,通过原位逆转录在细胞核中合成mRNA-cDNA杂合双链,并添加第二接头的其中一侧;
1.3提供Tn5转座子2,在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加第二接头的另一侧;
1.4提供含有核酸外切酶和逆转录酶的外切酶/逆转录酶反应体系,去除多余引物并补齐Tn5酶切产生的双链缺口;
1.5反应完成后,利用流式分选将标记完成的细胞核分选至含有针对待测细胞的特异性引物组合B的多孔板中进行裂解和RNA文库预扩增;
1.6提供针对待测细胞的ATAC-S5引物,进行ATAC文库预扩增;
1.7用针对待测细胞的特异性引物组合C对RNA和ATAC文库进行同时扩增;
1.8将扩增产物回收后,即得到所述单细胞开放染色质和转录组共测序文库。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体;所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述逆转录引物A的5'端添加有生物素标记。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述特异性引物组合B包括一条针对待测细胞的通用RNA-S5引物以及一条针对待测细胞的孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述特异性引物组合C包括两组引物1和2;其中,引物组1包含16条RNA样本引物,引物组2包含16条ATAC样本引物。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,步骤1.5中,所述多孔板为384孔板。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其中,所述384孔板的构成方式包含细胞裂解液以及384对引物,每对引物包括一条通用RNA-S5引物以及一条孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列,xxx的取值范围从001-384。
第二方面,本发明还提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,其中,所述体系包括反应混合物A、反应混合物B、反应混合物C、反应混合物D以及混合溶液E;所述反应混合物A包含RNA酶抑制剂混合物1和Tn5转座子1;所述反应混合物B包含RNA酶抑制剂混合物2和逆转录引物A;所述反应混合物C包含Tn5转座子2;所述反应混合物D包含核酸外切酶和逆转录酶;所述混合溶液E包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,其中,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体;所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
第三方面,本发明还提供一种用于单细胞开放染色质和转录组共测序文库构建的试剂盒,其中,所述试剂盒包括如上任一所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系。
有益效果:本发明提供了一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,所述方法包括步骤:1)提供Tn5转座子1,在待测细胞的细胞核染色质开放区域添加接头;2)用针对待测细胞的特异性逆转录引物通过原位逆转录在细胞核中合成mRNA-cDNA杂合双链;3)提供Tn5转座子2,在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头;4)提供外切酶/逆转录酶反应体系,用于同时去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的双链缺口;5)用流式分选将标记完成的单细胞核分选至含特异性引物的多孔板中进行裂解和RNA文库预扩增;6)提供ATAC-S5引物,添加至多孔板每一孔中,进行ATAC文库预扩增;7)用针对待测细胞的特异性引物对RNA和ATAC文库进行同时扩增。本发明提供的方法,简化了转录组文库构建中mRNA的物理分离步骤,缩短了单细胞开放染色质和转录组共测序文库制备的实验流程;在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头,避免使用连接反应添加测序接头,提高了反应效率。此外,本发明还提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,使用自主研发的反应试剂体系,降低了单细胞文库的制备成本,具有较高的普遍适用性。不仅如此,本发明还提高了反应效率和测序数据质量,单细胞可检出基因数和染色质开放片段数有了显著提高。
附图说明
图1为本发明实施例中一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法的流程示意图。
具体实施方式
本发明提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例首先提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,所述体系包括反应混合物A、反应混合物B、反应混合物C、反应混合物D以及混合溶液E。
在一些实施方式中,所述反应混合物A包含RNA酶抑制剂混合物1和Tn5转座子1。
本发明实施例提供的反应混合物A,用于标记细胞染色质开放区域序列并添加测序接头。所述反应混合物A含有RNA酶抑制剂混合物1,可以有效防止细胞核内RNA在第一步标记过程中的降解;含有Tn5转座子1,用于添加染色质开放序列测序接头。
在一些具体的实施方式中,所述RNA酶抑制剂混合物1为1.2U/μl Ribolock RNaseinhibitor,0.8U/μl RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor的混合物。上述RNA酶抑制剂混合物可有效防止RNA降解,同时成本较低。
在另一些具体的实施方式中,所述RNA酶抑制剂混合物为1.4U/μl ProtectorRnase抑制剂或其他有效的Rnase抑制剂的混合物。
在一些具体的实施方式中,所述Tn5转座子1为纯化后的Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体。
优选的,经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的核酸序列分别为:
核酸序列A为:
5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/-3'的退火产物
核酸序列B为:
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/-3'的退火产物。
其中,碱基之间添加磷酸化修饰可防止寡核酸双链自身被Tn5切割。
在另一些优选的方式中,经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的核酸序列分别为:
核酸序列A为:
5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-CTGTCTCTTATACACATC/iInvdT/-3'的退火产物;
核酸序列B为:
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-CTGTCTCTTATACACATC/iInvdT/-3'的退火产物。
在一些具体的实施方式中,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与所述核酸片段在转座子组装缓冲液中结合生成,具体结合方法参照已公开发表的文献(Picelli S,AK,Reinius B,Sagasser S,Winberg G,Sandberg R.Tn5 transposase and tagmentationprocedures for massively scaled sequencing projects.Genome Res.2014;24(12):2033-2040.doi:10.1101/gr.177881.114)。
在一些具体的实施方式中,除RNA酶抑制剂混合物和转座子外,所述反应混合物A的其他成分还包括无核酸酶水以及Tn5酶切反应体系。
在一些实施方式中,所述反应混合物B包含RNA酶抑制剂混合物2和逆转录引物A。
本发明实施例提供的反应混合物B,用于实现细胞核的原位逆转录并添加一侧测序接头。所述反应混合物B含有RNA酶抑制剂混合物2,可以有效防止细胞核内RNA在逆转录过程中的降解;含有针对待测细胞的逆转录引物A,用于结合成熟mRNA的polyA尾,引导合成cDNA-mRNA杂合链,并提供测序所需接头。
在一些具体的实施方式中,RNA酶抑制剂混合物2为0.8U/μl Ribolock RNaseinhibitor,0.4U/μl RnaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor。同样的,上述RNA酶抑制剂混合物可有效防止RNA降解,同时成本较低。
在另一些具体的实施方式中,所述RNA酶抑制剂混合物2为1.4U/μl ProtectorRnase抑制剂或其他有效的Rnase抑制剂的混合物。
在一些实施方式中,所述逆转录引物A的5'端添加有生物素标记。
在一些具体的实施方式中,所述逆转录引物A的序列为:5'-biotin-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
其中,在5'端添加生物素标记可降低引物多聚体的形成概率。
在另一些具体的实施方式中,所述逆转录引物A的序列为:
5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
优选的,所述逆转录引物A可适当增减碱基个数,但需符合[Nextera S7]+[polyN]+[ployT]模式。
在一些具体的实施方式中,所述反应混合物B还含有增加分子作用频率的添加剂,用于提高分子间挤压力。
优选的,所述添加剂为PEG8000水溶液,浓度为10%-15%(w/w),用来增加RNA逆转录效率并且背景反应较低。但不限于此,所述添加剂还可以为其他分子质量的PEG的水溶液,浓度可根据分子量进行调节。
在一些具体的实施方式中,所述反应混合物B其他成分为无核酸酶水和逆转录酶反应体系。
优选的,所述逆转录酶反应体系中逆转录酶为Maxiama H minus reversetranscriptase,浓度为4U/μl,上述浓度下有较好的扩增效率。
优选的,所述逆转录酶还可以为其他种类RNase H酶活性缺失的逆转录酶,可有效完成文库逆转录。
在一些实施方式中,所述反应混合物C包含Tn5转座子2。
本发明实施例提供的反应混合物C,用于标记转录组序列并添加测序接头。所述反应混合物C含有Tn5转座子2,结合cDNA-mRNA杂合链并插入测序接头。
在一些具体的实施方式中,所述Tn5转座子2为纯化后的Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
优选的,所述寡核酸双链B的核酸序列为:
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-C*T*G*T*C*T*C*T*T*A*T*A*C*A*C*A*T*C*/iInvdT/-3'的退火产物。其中,碱基之间添加磷酸化修饰可防止寡核酸双链自身被Tn5切割。
在另一些优选的方式中,所述寡核酸双链B的核酸序列为:
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'与
5'-Phos-CTGTCTCTTATACACATC/iInvdT/-3'的退火产物。
在一些具体的实施方式中,所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与所述核酸片段在转座子组装缓冲液中结合生成,具体结合方法参照已公开发表的文献(Picelli S,AK,Reinius B,Sagasser S,Winberg G,Sandberg R.Tn5 transposase and tagmentationprocedures for massively scaled sequencing projects.Genome Res.2014;24(12):2033-2040.doi:10.1101/gr.177881.114)。
在一些具体的实施方式中,所述反应混合物C其他成分为无核酸酶水和Tn5酶切反应体系。
在一些实施方式中,所述反应混合物D包含核酸外切酶和逆转录酶。
本发明实施例提供的反应混合物D,用于同时去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的DNA双链和DNA-RNA杂合双链缺口。所述反应混合物D含有核酸外切酶用来去除反应体系中可能残留的单链DNA分子;含有逆转录酶,用以补齐Tn5酶切后留下的缺口。
在一些具体的实施方式中,所述核酸外切酶为可热灭活的exo1,浓度为1-2U/μl。
在另一些具体的实施方式中,所述核酸外切酶还可以为其他种类可热灭活的降解DNA单链的核酸外切酶类。
在一些具体的实施方式中,所述逆转录酶为Maxiama H minus reversetranscriptase,浓度为4U/μl,上述浓度下有较好的扩增效率。
在另一些具体的实施方式中,所述逆转录酶还可以为其他种类逆转录酶,可有效完成mRNA-cDNA缺口补齐的功能。
在一些具体的实施方式中,所述反应混合物D还包括无核酸酶水和逆转录酶反应体系中除逆转录酶之外的的其他组份。
在一些实施方式中,所述混合溶液E包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
本发明实施例提供的混合溶液E,用于清洗各个反应过程中残留的上一轮反应物,并维持细胞核的形态。
在一些具体的实施方式中,所述混合溶液E成分为50mM Tris-HCl(pH=8.0)、10mM氯化钠、3mM氯化镁以及无核酸酶水。
优选的,所述混合溶液E中氯化镁浓度可在3-6mM范围内进行调整,以适应不同组织来源的细胞核。
本发明实施例还提供一种i7-384孔板预制板的构成方式,所述构成方式包含细胞裂解液以及384对引物,每对引物包括一条针对待测细胞的通用RNA-S5引物以及一条针对待测细胞的孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列,xxx的取值范围从001-384。
在一些具体的实施方式中,所述通用RNA-S5引物的序列为:5'-CTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'
本发明提供的i7-384孔板预制板的构成方式,用于单细胞流式分选后收集单细胞,进行后续文库扩增。所述构成方式包含的细胞裂解液,用于在65℃有效裂解细胞核,释放DNA分子;包含的384对引物,每对含一条针对待测细胞的通用RNA-S5引物,一条针对待测细胞的孔特异性的N7xxx引物。其中,N7xxx引物含8bp的索引序列,用于提供细胞特异的标签序列,来进行单细胞数据拆分;xxx的取值范围从001-384。
在一些实施方式中,所述细胞裂解液为0.1%-0.2%SDS(w/v)、10mM氯化钠、无核酸酶水。
在另一些实施方式中,所述细胞裂解液还可以为其他去垢剂的低浓度水溶液。
在一些实施方式中,384条N7xxx引物序列所含的8bp索引序列为illumina提供的384样本索引序列。
在另一些实施方式中,384条N7xxx引物序列所含的8bp索引序列为自主设计的碱基序列,满足每个位置的A、C、G和T频率相等,每两个索引序列差异碱基距离大于3。
具体的,384条N7xxx引物序列参考了文献:Xu,W.,Wen,Y.,Liang,Y.et al.Aplate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast and robust profiling ofchromatin accessibility.Nat Protoc 16,4084–4107(2021).https://doi.org/10.1038/s41596-021-00583-5.
在另一些具体的实施方式中,384条N7xxx引物序列还可参考文献:Satpathy,A.T.,Granja,J.M.,Yost,K.E.et al.Massively parallel single-cell chromatinlandscapes of human immune cell development and intratumoral T cellexhaustion.Nat Biotechnol 37,925–936(2019).https://doi.org/10.1038/s41587-019-0206-z.
不仅如此,本发明实施例还提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,所述方法包括步骤:
S10、提供Tn5转座子1,在待测细胞的细胞核染色质开放区域添加第一接头;
S20、利用针对待测细胞的特异性逆转录引物A,通过原位逆转录在细胞核中合成mRNA-cDNA杂合双链,并添加第二接头的其中一侧;
S30、提供Tn5转座子2,在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加第二接头的另一侧;
S40、提供含有核酸外切酶和逆转录酶的外切酶/逆转录酶反应体系,去除多余引物并补齐Tn5酶切产生的双链缺口;
S50、反应完成后,利用流式分选将标记完成的细胞核分选至含有针对待测细胞的特异性引物组合B的多孔板中进行裂解和RNA文库预扩增;
S60、提供针对待测细胞的ATAC-S5引物,进行ATAC文库预扩增;
S70、用针对待测细胞的特异性引物组合C对RNA和ATAC文库进行同时扩增;
S80、将扩增产物回收后,即得到所述单细胞开放染色质和转录组共测序文库。
图1所示即为本发明实施例一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法的流程示意图。
在一些实施方式中,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体;所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
具体的,所述Tn5转座子1和Tn5转座子2与上文所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系中一致。
更具体的,所述Tn5转座子1和2为Tn5蛋白与相应核酸片段在转座子组装缓冲液中结合生成,具体结合方法参照(Picelli S,AK,Reinius B,Sagasser S,WinbergG,Sandberg R.Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaledsequencing projects.Genome Res.2014;24(12):2033-2040.doi:10.1101/gr.177881.114)。
RNA文库两端测序接头通过两步反应进行添加:第一步是逆转录引物上含有一段测序接头序列,第二部是通过Tn5转座子2酶切添加。因此,本发明实施例通过步骤S20添加所述第二接头的其中一侧,通过步骤S30添加另一侧。
在一些实施方式中,提供外切酶/逆转录酶反应体系,利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中可能残留的单链DNA分子,并补齐Tn5酶切后留下的缺口。
在一些实施方式中,提供针对待测细胞的ATAC-S5引物,添加至多孔板每一孔中,进行ATAC文库预扩增,所述ATAC-S5引物的序列为:
5'-TCGTCGGCAGCGTC-3'
本发明实施例提供的构建方法,在标记完成的细胞核分选至多孔板后,先对其进行RNA文库预扩增和ATAC文库预扩增,之后对RNA和ATAC文库进行同时扩增。
在一些实施方式中,文库扩增流程具体为:
1)提供RNA-S5+N7xxx引物于多孔板中,进行RNA文库预扩增;
2)提供RNA-S5+ATAC-S5+N7xxx引物于多孔板中,进行ATAC文库预扩增;
3)提供样本特异性的RNA样本引物+样本特异性的ATAC样本引物+P7引物,进行RNA和ATAC文库同时扩增。
在一些实施方式中,可通过磁珠纯化回收步骤S80的扩增产物。
在一些实施方式中,所述特异性引物组合B为多条引物的组合,包括一条通用RNA-S5引物以及一条孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列。
具体的,当多孔板为384孔板时,xxx的取值范围从001-384,所述通用RNA-S5引物以及孔特异性的N7xxx引物,与上文所述的i7-384孔板预制板的构成方式一致。
在一些实施方式中,所述特异性引物组合C为多条引物的组合,包括两组引物1和2;其中,引物组1包含16条样本特异性的RNA样本引物,引物组2包含16条样本特异性的ATAC样本引物。
具体的,16条样本特异性的RNA样本引物的序列为:
具体的,16条样本特异性的ATAC样本引物的序列为:
在一些实施方式中,所述方法具体步骤包括:
(1)准备384孔板,每孔含2μl裂解液,孔特异性的N7xxx引物,以及通用的RNA-S5引物;
(2)将待测细胞样本制备为单细胞悬液,温和裂解细胞后,转移细胞核至反应混合物A中以捕获开放染色质序列添加测序接头;
(3)反应完成后,使用混合溶液E洗去残余的反应混合物A,并转移细胞核至反应混合物B中,完成细胞核内RNA的原位逆转录;
(4)反应完成后,使用混合溶液E洗去残余反应混合物B,并转移细胞核至反应混合物C中,完成转录组序列的标记和添加测序接头;
(5)反应完成后,使用混合溶液E洗去残余反应混合物C,并转移细胞核至反应混合物D中,利用外切酶和逆转录酶去除反应体系中可能残留的单链DNA分子,并补齐Tn5酶切后留下的缺口;
(6)反应完成后,使用混合溶液E洗去残余反应混合物D,并在混合溶液E中重悬细胞核,通过流式分选单个细胞至多孔板中,使用PCR封板膜封板;
(7)65℃,15min条件下在多孔板中反应裂解细胞,之后向每孔中加入吐温-20来中和裂解液中的SDS;加入PCR反应预混液,进行第一轮PCR反应;
(8)向每孔中加入ATAC-S5引物和PCR反应预混液,进行第二轮预扩增;
(9)反应完成后,离心收集每个孔板的PCR产物于一个15ml管中,通过PCR产物回收试剂盒回收DNA片段;之后使用EXO1去除上轮反应剩余的引物,并通过磁珠纯化DNA片段;
(10)洗脱纯化后的DNA片段,添加样本特异性RNA引物、样本特异性ATAC引物、P7引物、PCR反应预混液进行第三轮PCR反应;得到的PCR产物通过磁珠纯化回收即为最终的单细胞开放染色质和转录组共测序文库。
在一些实施方式中,P7引物的序列为:
5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3'
本发明实施例提供的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,所用到的试剂、酶、引物等,与上文所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系中一致;所用到的384孔板,与上文所述的i7-384孔板预制板的构成方式一致;所用到的孔特异性的N7xxx引物、通用的RNA-S5引物、样本特异性RNA引物、样本特异性ATAC引物与上文所述一致。
本发明实施例提出了一种细胞核原位两步Tn5酶切反应构建开放染色质和转录组共测序文库的方法,并提出了Tn5测序接头序列和逆转录引物的碱基序列设计方案。本发明简化了转录组文库构建中mRNA的物理分离步骤,缩短了实验流程。此外,本发明还提出一组反应体系的溶液配制方法和反应程序,用以实现本发明。通过使用自主研发的反应试剂体系,降低了单细胞文库的制备成本,提高了反应效率和测序数据质量,具有较高的普遍适用性。
本发明实施例还提供一种用于单细胞开放染色质和转录组共测序文库构建的试剂盒,所述试剂盒包括如上所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系。该试剂盒包括上述的反应混合物A、反应混合物B、反应混合物C、反应混合物D以及混合溶液E,提供了构建文库所需的全部试剂,极其方便,节省了溶液配制的时间,且标准化程度高,最大可能避免了人为因素的干扰,具有极高的普遍适用性。
下面通过具体实施例对本发明一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法做进一步的解释说明:
实施例1批量制备i7-384孔板
(1)按照表1配制裂解液,并通过0.22μm滤膜过滤除菌:
表1
(2)在新的384孔板的每个孔中加入31.5μl裂解液;
(3)向384孔板的每个孔中加入3.5μl的100μM N7xxx引物母液,使每个孔中的引物终浓度为10μM;
(4)使用裂解液稀释RNA-S5引物,向每个孔加入1μl的10μM RNA-S5引物;
(5)用PCR封板膜封板,短暂离心,室温下孵育384孔板5分钟;
(6)将384孔板短暂离心后,于-80℃储存备用。
实施例2对染色质开放区域进行标记
(1)制备单细胞核悬液
将待测细胞通过组织消化或流式分选分离单细胞,重悬在含有2%FBS的冷的PBS中(v/v)。检测细胞浓度及活率,活率高于90%为宜。
(2)配制溶液:
按照表2配制反应混合物A:
表2
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
4×THS TD buffer | 12.5μl | 1× |
0.1%Digitonin(w/v) | 5μl | 0.01% |
Tn5转座子1 | 5μl | - |
Ribolock Rnase inhibitor | 1.5μl | 1.2U/μl |
RnaseOUT Rnase inhibitor | 1μl | 0.8U/μl |
无核酸酶水 | 25μl | - |
按照表3配制反应终止液,并通过0.22μm滤膜过滤除菌:
表3
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
30%BSA(w/v) | 66μl | 2% |
0.5M EDTA | 40μl | 20mM |
1M Tris-HCl(pH=8.0) | 20μl | 20mM |
无核酸酶水 | 874μl | - |
按照表4配制混合溶液E,并通过0.22μm滤膜过滤除菌:
表4
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
30%BSA(w/v) | 83.3μl | 0.5% |
5M NaCl | 10μl | 10mM |
1M MgCl2 | 15μl | 3mM |
1M Tris-HCl(pH=8.0) | 50μl | 10mM |
Ribolock Rnase inhibitor | 12.5μl | 0.1U/μl |
无核酸酶水 | 4.829ml | - |
(3)吸取10万个细胞,在800g,4℃下离心3分钟,吸去培养基,加入1ml预冷的PBS-0.5%BSA重悬;
(4)在800g,4℃下离心3分钟收集细胞核,彻底吸去上清;
(5)使用50μl反应混合物A重悬细胞核,轻轻吹打混匀30次;
(6)在30℃,800rpm下孵育30分钟,进行反应;
(7)反应结束后,加入50μl反应终止液,轻轻吹打混匀6-8次;
(8)在800g,4℃下离心3分钟,用200μl预冷的混合溶液E洗涤细胞核两次,彻底吸去上清。
实施例3细胞核内原位进行逆转录反应
(1)配制溶液:
按照表5配制5×NaCl溶液,并通过0.22μm滤膜过滤除菌:
表5
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
1M Tris-HCl(pH=8.0) | 1250μl | 250mM |
5M NaCl | 375μl | 375mM |
1M MgCl2 | 75μl | 15mM |
二硫苏糖醇 | 250μl | 50mM |
无核酸酶水 | 4.829ml | - |
按照表6配制反应混合物B:
表6
(2)使用100μl反应混合物B重悬细胞核,轻轻吹打混匀30次;
(3)将100μl逆转录反应混合物转移到新的PCR管中,在PCR仪中进行如下反应:25℃10min,50℃10min,3×[8℃12s,15℃45s,20℃45s,30℃30s,42℃2min,50℃3min],50℃5min;
(4)反应结束后,将100μl逆转录反应混合物转移到新的1.5ml管中,加入100μl预冷的混合溶液E,轻轻吹打混匀6-8次;
(5)在800g,4℃下离心3分钟,用200μl预冷的混合溶液E洗涤细胞核两次,彻底吸去上清。
实施例4细胞核原位标记转录组序列
(1)配制溶液:
按照表7配制反应混合物C:
表7
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
4×THS TD buffer | 12.5μl | 1× |
0.1%Digitonin(w/v) | 5μl | 0.01% |
Tn5转座子2 | 1.5μl | - |
无核酸酶水 | 31μl` | - |
(2)使用50μl反应混合物C重悬细胞核,轻轻吹打混匀30次;
(3)在37℃,800rpm下孵育半小时,进行反应;
(4)反应结束后,加入50μl反应终止液,轻轻吹打混匀6-8次;
(5)在800g,4℃下离心3分钟,用200μl预冷的混合溶液E洗涤细胞核两次,彻底吸去上清。
实施例5去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的双链缺口
(1)配制溶液:
按照表8配制反应混合物D:
表8
成分 | 体积(μl) | 终浓度 |
dNTP | 2.5μl | 0.5mM |
Maxima H minus reverse transcriptase | 1μl | 4U/μl |
5×NaCl溶液 | 10μl | 1× |
EXOⅠ | 5μl | 2U/μl |
无核酸酶水 | 30.5μl` | - |
(2)使用50μl反应混合物D重悬细胞核,轻轻吹打混匀30次;
(3)在37℃,800rpm下孵育15min,进行反应;
(4)反应结束后,加入50μl预冷的混合溶液E,轻轻吹打混匀6-8次;
(5)在800g,4℃下离心3分钟,吸去上清,用600μl预冷的混合溶液E重悬细胞核并转移至流式管中,加入1μl 100μg/ml DAPI进行染色。
实施例6流式分选
(1)使用流式分选仪,将DAPI阳性的单细胞分选至多孔板中,每个孔一个细胞;
(2)分选结束后,用PCR封板膜封板,立即1000g离心1min,-80℃冻存。
实施例7文库预扩增
(1)从-80℃取出多孔板解冻,瞬时离心后,65℃孵育15分钟;
(2)向每孔加入1μl 10%Tween-20水溶液中和SDS,离心混匀;
(3)向每孔加入3μl NEB Q5 High-Fidelity 2×Master Mix,离心混匀;
(4)进行RNA文库预扩增,反应程序如下:
/>
(5)反应完成后,短暂离心,除去封板膜,每孔加入1μl ATAC-S5引物和1μl NEB Q5High-Fidelity 2×Master Mix。
(6)用封板膜进行紧密封板,1000g离心1分钟混匀;
(7)进行ATAC文库预扩增,反应程序如下:
(8)反应完成后,短暂离心,除去封板膜,离心收集384孔板中所有PCR产物到同一个15ml离心管中;
(9)使用Zymo DNA Clean&Concentrator kit回收PCR产物,以41μl无核酸酶水洗脱预扩增产物。
实施例8文库最终扩增
(1)向41μl预扩增产物中加入5μl NEB3.1 buffer,5μl EXO I酶消化,37℃反应30分钟,除去两轮预扩增后残余的引物。80℃反应2分钟,使EXO I酶失活。
(2)使用1.2倍体积的VAHTS DNA Clean Beads纯化回收预扩增产物,以15μlNuclease-free Water洗脱。
(3)进行最终文库扩增,配制反应体系如下:
运行如下程序:72℃5min,98℃30s,6-8cycles of[98℃20s,63℃20s,72℃1min],72℃5min;
(4)使用1.2倍体积的VAHTS DNA Clean Beads纯化,最终溶解在无核酸酶水中;
(5)采用Qubit dsDNA定量试剂测定文库浓度,采用Agilent-2100分析仪检测文库分布;
(6)测序
采用Illumina测序仪进行测序,模式为PE50加双端index;其中i7作为细胞标签测量8bp,i5作为样本标签测量8bp。测序数据量可根据细胞数及测序深度确定,可选的,数据量为每个细胞200,000reads。
实施例9
按照实施例1-8所述的方法、试剂、引物等,对小鼠胚胎干细胞E14细胞系进行单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建,其中,384条N7xxx引物序列与文献:Xu,W.,Wen,Y.,Liang,Y.et al.A plate-based single-cell ATAC-seq workflow for fast androbust profiling of chromatin accessibility.Nat Protoc 16,4084–4107(2021).一致。最终,在单细胞内检测到的基因数的中位值为4199,检测到UMI数为17862个,检测到特异性开放区域片段为71710个。
综上所述,本发明提供了一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,所述方法包括步骤:1)提供Tn5转座子1,在待测细胞的细胞核染色质开放区域添加接头;2)用针对待测细胞的特异性逆转录引物通过原位逆转录在细胞核中合成mRNA-cDNA杂合双链;3)提供Tn5转座子2,在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头;4)提供外切酶/逆转录酶反应体系,用于同时去除多余引物和补齐Tn5酶切产生的双链缺口;5)用流式分选将标记完成的单细胞核分选至含特异性引物的多孔板中进行裂解和RNA文库预扩增;6)提供针对待测细胞的ATAC-S5引物,添加至多孔板每一孔中,进行ATAC文库预扩增;7)用针对待测细胞的特异性引物对RNA和ATAC文库进行同时扩增。本发明提供的方法,简化了转录组文库构建中mRNA的物理分离步骤,缩短了单细胞开放染色质和转录组共测序文库制备的实验流程;在mRNA-cDNA杂合双链上添加接头,避免使用连接反应添加测序接头,提高了反应效率。此外,本发明还提供一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,使用自主研发的反应试剂体系,降低了单细胞文库的制备成本,具有较高的普遍适用性。不仅如此,本发明还提高了反应效率和测序数据质量,单细胞可检出基因数和染色质开放片段数有了显著提高。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 南方科技大学
<120> 一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法
<160> 35
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S5
ctacacgacg ctcttccgat ct 22
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-S5
tcgtcggcag cgtc 14
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> P7
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S502
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc tctctataca ctctttccct acacgacgct 60
cttccg 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S503
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctctaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccg 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S505
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccg 66
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S506
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cttccg 66
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S507
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cttccg 66
<210> 9
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S508
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<210> 10
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S510
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cttccg 66
<210> 11
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S511
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S513
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<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S515
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tctagctaca ctctttccct acacgacgct 60
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<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S516
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc ctagagtaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccg 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S517
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cttccg 66
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
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<400> RNA-S518
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cttccg 66
<210> 17
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S520
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<210> 18
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S521
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cttccg 66
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> RNA-S522
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tatgcgaaca ctctttccct acacgacgct 60
cttccg 66
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS502
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<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS503
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact atcctcttcg tcggcagcgt c 51
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS505
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg taaggagtcg tcggcagcgt c 51
<210> 23
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS506
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca ctgcatatcg tcggcagcgt c 51
<210> 24
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS507
aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca aggagtatcg tcggcagcgt c 51
<210> 25
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS508
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc taagccttcg tcggcagcgt c 51
<210> 26
<211> 51
<212> DNA
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<400> ATAC-SS510
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<210> 27
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<212> DNA
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<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS513
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<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS515
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<210> 30
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS521
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<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
<400> ATAC-SS522
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact tatgcgatcg tcggcagcgt c 51
Claims (10)
1.一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
1.1提供Tn5转座子1,在待测细胞的细胞核染色质开放区域添加第一接头;
1.2利用针对待测细胞的特异性逆转录引物A,通过原位逆转录在细胞核中合成mRNA-cDNA杂合双链,并添加第二接头的其中一侧;
1.3提供Tn5转座子2,在所述mRNA-cDNA杂合双链上添加第二接头的另一侧;
1.4提供含有核酸外切酶和逆转录酶的外切酶/逆转录酶反应体系,去除多余引物并补齐Tn5酶切产生的双链缺口;
1.5反应完成后,利用流式分选将标记完成的细胞核分选至含有针对待测细胞的特异性引物组合B的多孔板中进行裂解和RNA文库预扩增;
1.6提供针对待测细胞的ATAC-S5引物,进行ATAC文库预扩增;
1.7用针对待测细胞的特异性引物组合C对RNA和ATAC文库进行同时扩增;
1.8将扩增产物回收后,即得到所述单细胞开放染色质和转录组共测序文库。
2.根据权利要求1所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体;所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
3.根据权利要求1所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述逆转录引物A的5'端添加有生物素标记。
4.根据权利要求1所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述特异性引物组合B包括一条针对待测细胞的通用RNA-S5引物以及一条针对待测细胞的孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列。
5.根据权利要求1所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述特异性引物组合C包括两组引物1和2;其中,引物组1包含16条RNA样本引物,引物组2包含16条ATAC样本引物。
6.根据权利要求1所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,步骤1.5中,所述多孔板为384孔板。
7.根据权利要求6所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建方法,其特征在于,所述384孔板的构成方式包含细胞裂解液以及384对引物,每对引物包括一条针对待测细胞的通用RNA-S5引物以及一条针对待测细胞的孔特异性的N7xxx引物;其中,所述N7xxx引物含8bp的索引序列,xxx的取值范围从001-384。
8.一种单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,其特征在于,所述体系包括反应混合物A、反应混合物B、反应混合物C、反应混合物D以及混合溶液E;所述反应混合物A包含RNA酶抑制剂混合物1和Tn5转座子1;所述反应混合物B包含RNA酶抑制剂混合物2和逆转录引物A;所述反应混合物C包含Tn5转座子2;所述反应混合物D包含核酸外切酶和逆转录酶;所述混合溶液E包含Tris-HCl、氯化钠和氯化镁。
9.根据权利要求8所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系,其特征在于,所述Tn5转座子1为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链A和寡核酸双链B的结合体;所述Tn5转座子2为Tn5蛋白与经修饰的寡核酸双链B的结合体。
10.一种用于单细胞开放染色质和转录组共测序文库构建的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如权利要求8-9任一所述的单细胞开放染色质和转录组共测序文库的构建体系。
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PB01 | Publication | ||
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