CN116694616A - 一种棘孢木霉zzy可湿性粉剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂及其制备方法与应用，该可湿性粉剂通过以下方法制备：步骤一：培养活化棘孢木霉ZZY菌株，将其至制成孢子悬液；步骤二：将孢子悬液接入液体培养基中，制成种子液；步骤三：该液体种子液接入固体发酵培养基中，进行固体发酵培养；步骤四：将发酵产物自然风干、晾晒、粉碎后进行过筛，获得棘孢木霉ZZY孢子粉；步骤五：棘孢木霉孢子粉10‑20％，润湿剂：1‑9％；分散剂：1‑9％；紫外保护剂：0.1‑1％，载体补余，混匀后过筛，制成棘孢木霉ZZY可湿性粉剂。本发明制备的棘孢木霉ZZY可湿性粉剂能够保持棘孢木霉使用时的活性，促进土壤中农作物副产品的原位降解，增加土壤肥力，提高农作物品质，减少环境污染，同时可以吸附土壤中的重金属，降低作物中重金属含量。
Description
技术领域
本发明涉及农作物副产品技术领域，更具体的说是涉及一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂及其制备方法与应用。
背景技术
秸秆中含有丰富的能源，但目前在秸秆的处理方式上，就地焚烧仍占有很大比例，这种方法虽然能分解土地中的秸秆，但也浪费了宝贵的资源，造成了严重的大气污染，破坏了生态系统的平衡。而通过生物处理方法降解秸秆，能够促进作物秸秆原位还田，有利于土壤团粒的构成、提高土壤肥力，及有效又环保。
棘孢木霉属于木霉属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是土壤中广泛存在的繁殖快、具有较高生防价值的一类重要真菌。且具有适应性强、抗菌谱广的特点，还能促进植物生长，还能够对重金属离子产生吸附作用。同时，棘孢木霉通过产生纤维素酶在农作物副产品降解的生物处理方式上具有重要的经济意义。
目前，本领域已有将棘孢木霉应用于促进秸秆腐熟的技术方案，但主要是将其制备成液体制剂使用，但液体制剂往往需要多种微生物菌种组成，在塑料瓶包装液体中提供一些微生物的营养。液体微生物制剂的优点是活性菌液，使用环节不需要激活，但是存在包装成本高，运输不方便且成本高，活菌衰减快，关键的菌种容易快速死亡失去效果，且不能添加更多的菌种与复合酶制剂结合等缺点。也有技术方案公开了可将棘孢木霉制备成可湿性粉剂应用于促进秸秆腐熟中，但是普遍存在促秸秆腐熟速度慢、应用时孢子萌发率低、存活率低或菌落增长慢等缺点。
例如，专利“一种秸秆还田快速促腐菌剂”(授权号为CN 110846261 B)，利用棘孢木霉SFC-3固体发酵孢子粉，与黑曲霉J4固体发酵孢子粉、构巢曲霉QY5固体吸附菌剂、米根霉JG3固体吸附菌剂、酿酒酵母CXMJ固体吸附菌剂、枯草芽孢杆菌nkkc固体吸附菌剂、解淀粉芽孢杆菌WS3-1固体吸附菌剂、地衣芽孢杆菌WS3-2固体吸附菌剂等按不同种类及比例构成种秸秆还田快速促腐菌剂。在这一公开专利中，主要是利用棘孢木霉对秸秆的降解功效，协同其他具有相同功效的菌种，开发秸秆还田快速促腐菌剂。
专利“一种秸秆腐熟剂及其制备方法和应用”(授权号为CN 106929431 B)公开了利用棘孢木霉DQ-T36制备的液体制剂秸秆腐熟剂和可湿性粉剂秸秆腐熟剂，液体制剂秸秆腐熟剂由棘孢木霉发酵液、山梨酸钾、壳聚糖、竹醋构成；可湿性粉剂秸秆腐熟剂由液体发酵制备的棘孢木霉菌菌粉、氮酮、木质素、聚羧酸盐、萘磺酸盐、高岭土组成。在这一公开专利中，用于制备液体制剂秸秆腐熟剂和可湿性粉剂秸秆腐熟剂的原理是利用棘孢木霉对秸秆的降解功能，其利用的棘孢木霉均为经液体发酵后的菌丝体。
因此，如何提供一种利用棘孢木霉孢子粉制备兼具秸秆降解功能及重金属吸附功能的可湿性粉剂，调整棘孢木霉可湿性粉剂中的成分及其配比，有效促进棘孢木霉孢子的萌发、生长，提高了棘孢木霉制剂对于秸秆的促腐熟效果，还能吸附土壤中的重金属，减少农作物中的重金属含量，成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂及其制备方法与应用，从优化可湿性粉剂成分的角度入手，有效提高了棘孢木霉制剂对秸秆的促腐熟作用。本发明利用固体发酵制备的棘孢木霉ZZY孢子粉，添加润湿剂、分散剂、紫外保护剂、载体等，制备可湿性粉剂。对于可湿性粉剂的使用，自然环境中的喷施条件相对苛刻，由于长时间紫外线的照射，孢子会一定程度的受到影响而无法萌发，因此在本发明的可湿性粉剂中加入紫外保护剂，可使其在使用时，在孢子表面形成保护膜，阻隔紫外线，保护分生孢子能够正常萌发，以天然产物及其衍生物作为紫外保护剂，具有较高的生物安全性和环境友好性。本发明选用糊精作为紫外保护剂，有助于可湿性粉剂中棘孢木霉ZZY孢子活力的保持和有效的萌发率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种棘孢木霉ZZY在制备促进农作物副产品降解及降低农作物中重金属含量的制剂中的应用。
所述棘孢木霉ZZY，分类命名：Trichoderma asperellum，是从重金属污染的土壤中分离得到一株对重金属铅有耐受能力的菌株，该菌株已于2016年01月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.12071。
一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂，包含下述比例的组分：
棘孢木霉ZZY孢子粉10-20％、润湿剂1-9％、分散剂1-9％、紫外保护剂0.1-1％、载体余量。
进一步地，所述润湿剂为亚甲基双甲基萘磺酸钠。
进一步地，所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙中的一种或几种。
进一步地，所述紫外线保护剂为糊精。
进一步地，所述载体为硅藻土。
一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将棘孢木霉ZZY菌株活化、培养，制备成种子培养液；
步骤二：将所述种子培养液按10-25％的接种量接入发酵培养基中；在恒温26℃，RH≥75％的条件下培养7-9d，得到发酵产物；
步骤三：将所述发酵产物自然风干、粉碎后，过200目筛，收集得到棘孢木霉ZZY孢子粉；
步骤四：称量所述棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体、混合，过筛后得所述棘孢木霉ZZY可湿性粉剂。
进一步地，所述步骤一操作方法为：将棘孢木霉ZZY菌株接种于PDA平板培养基，26℃培养60-84h，用无菌蒸馏水洗下分生孢子，制成菌悬液，然后将其按培养液的体积的2％的接种量接入灭菌后的PD液体培养液中，置于160r/min，26℃，培养48-60h得到种子培养液。
进一步地，所述步骤二操作方法为：固体发酵培养基以米糠、麸皮质量比2:3的比例放入培养盒内混合，铺至厚度1-2cm，并加入70-75％的营养液，搅拌均匀后将培养盒置于耐高温的培养袋中，然后在121℃高温高压灭菌，冷却后将种子培养液按10-25％的接种量接入培养盒中。将培养盒放入发酵车间中，在恒温26℃，RH≥75％的条件下培养7-9d。
进一步地，所述步骤三操作方法为：将培养盒中的固体发酵产物倒入无菌室中，进行自然风干，风干后的发酵产物放入超微粉碎机中粉碎后，于振动筛分机中过200目筛，收集得到棘孢木霉ZZY孢子粉。
进一步地，所述步骤四操作方法为：称量棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体并混合，过筛后得所述棘孢木霉ZZY可湿性粉剂。
进一步地，步骤一中所述菌悬液中的孢子浓度为4×108个/mL。
进一步地，步骤二中所述营养液包括如下组分：蔗糖1.5％，蛋白胨1％，硫酸锌0.2％，蒸馏水余量。
一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的应用，其特征在于将所述的棘孢木霉ZZY的湿性粉剂喷施于土地上农作物副产品，用于促进农作物副产品如米糠、麸皮、秸秆等的降解，降低农作物中的重金属含量。
上述技术方案的有益效果在于：
本产品中棘孢木霉ZZY孢子粉作为有效成分，能够高效降解秸秆等农作物副产品，促进农作物副产品原位还田增加土壤肥力，减少环境的污染，还可以通过吸附土壤中的重金属减少农作物中重金属含量，提高作物品质。并且，在加入润湿剂、分散剂、紫外保护剂等助剂时，充分考虑棘孢木霉ZZY孢子粉的生物相容性，使产品中的棘孢木霉ZZY孢子粉保持最佳活性，选择硅藻土作为载体，注重生物相容性的同时，延长产品的货架寿命。
使用本发明制备的棘孢木霉ZZY的可湿性粉剂，能够有效促进棘孢木霉的孢子萌发率和菌落直径日增长量，并且显著促进秸秆腐熟，降低农作物中的重金属含量。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
耐高温棘孢木霉ZZY孢子粉的培育与收获
1)将棘孢木霉ZZY菌株接种到PDA培养基上，于26℃恒温培养。
2)将PDA培养基上的棘孢木霉ZZY孢子粉与灭菌后的蒸馏水混匀制成浓度为4×108个/mL的菌悬液。
3)将菌悬液按PD培养液体积的2％的接种量接入灭菌后的PD培养液中，置于160r/min，26℃，培养48-60h得到种子培养液，批量培养。
4)按所需用量将蔗糖1.5％，蛋白胨1％，硫酸锌0.2％溶于蒸馏水，配制成营养液。
5)将米糠、麸皮以质量比2:3的比例放入培养盒内混匀，铺至厚度1-2cm，并加入70-75％的营养液，搅拌均匀后将培养盒置于耐高温的培养袋中，然后在121℃高温高压灭菌，制成固体发酵培养基，批量制备。
6)将种子培养液按10-25％的接种量接入固体发酵培养基中。放入发酵车间内，在恒温26℃，RH≥75％的条件下培养7-9d。
7)将发酵产物倒入无菌室中，进行自然风干，风干后的发酵产物放入超微粉碎机中粉碎，于振动筛分机中过200目筛，收集得到棘孢木霉ZZY孢子粉。
实施例2
配方1:15％棘孢木霉ZZY孢子粉
棘孢木霉ZZY孢子粉15％，亚甲基双甲基萘磺酸钠4％，木质素磺酸钠3％，木质素磺酸钙2％，硅藻土补余。将棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体充分混匀，过筛后制成成品。
实施例3
配方2:20％棘孢木霉ZZY孢子粉
棘孢木霉ZZY孢子粉20％，亚甲基双甲基萘磺酸钠4％，木质素磺酸钠2％，木质素磺酸钙4％，硅藻土补余。将棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体充分混匀，过筛后制成成品。
实施例4
配方3:10％棘孢木霉ZZY孢子粉
棘孢木霉ZZY孢子粉10％，亚甲基双甲基萘磺酸钠5％，木质素磺酸钠1％，木质素磺酸钙3％，硅藻土补余。将棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体充分混匀，过筛后制成成品。
实施例5
棘孢木霉ZZY可湿性粉剂质量检测
以实施例2中的棘孢木霉ZZY可湿性粉为例进行检测，制剂的湿润时间≤90s，质量悬浮率≥85％，悬浮状况呈云雾状自动分散，pH＝6.89，在常温条件下储藏360d后其中棘孢木霉ZZY孢子粉萌发率≥93.67％，制剂质量检测均符合要求。
实施例6
以实施例2中的棘孢木霉ZZY可湿性粉为例进行其他指标检测，检测结果见表1。
表1制剂其他指标检测结果
实施例7
棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的助剂筛选
将润湿剂、分散剂分别按照不同的含量加入到PD液体培养液中，接入棘孢木霉ZZY孢子粉后，对孢子粉的萌发率进行测定，进行不同助剂对棘孢木霉ZZY孢子粉的生物相容性检测。以不加入助剂的棘孢木霉ZZY孢子粉的萌发率为对照；
将润湿剂、分散剂按照不同的含量加入到PDA固体培养基中，接入棘孢木霉ZZY孢子粉后，对固体培养基上菌落直径日增长量进行测定，以不加入助剂的棘孢木霉ZZY的菌落直径日增长量为对照，实验结果见表2和表3。
表2润湿剂的筛选结果
由表2可见，亚甲基双甲基萘磺酸钠对棘孢木霉ZZY孢子粉的活性影响最小，而使用十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、二异丁基萘磺酸钠作为润湿剂的组别棘孢木霉孢子粉的活性明显降低、生长也停滞。
表3分散剂的筛选结果
由表3可见，木质素磺酸钠、木质素磺酸钙对棘孢木霉ZZY孢子粉的活性影响较小，而添加羧甲基纤维素钠的组别明显抑制了孢子的萌发率，菌落直径日增长量也不如木质素磺酸钠组、木质素磺酸钙组。
实施例7
将不同浓度的紫外保护剂加入到PD液体培养基中，接入棘孢木霉ZZY孢子粉后进行紫外灯照射2min，测定棘孢木霉ZZY孢子粉萌发率，检测不同紫外保护剂对棘孢木霉ZZY孢子粉的保护效果。以不加紫外保护剂，不经紫外灯照射的棘孢木霉ZZY孢子粉为对照组1，以不加紫外保护剂，经紫外灯照射的棘孢木霉ZZY孢子粉为对照2，检测结果见表4。
表4紫外保护剂的筛选结果
由表4结果可知，糊精对棘孢木霉ZZY孢子粉的保护效果最好，能够有效防止紫外线对孢子萌发率的影响，而氧化锌组、维生素C组虽然达到了抗紫外线效果，但并不显著。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (9)
1.一种棘孢木霉ZZY在制备促进农作物副产品降解及降低农作物中重金属含量的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂包括棘孢木霉可湿性粉剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述农作物包括如米糠、麸皮、秸秆。
4.一种棘孢木霉可湿性粉剂，其特征在于，包含下述比例的组分：
棘孢木霉ZZY孢子粉10-20％、润湿剂1-9％、分散剂1-9％、紫外保护剂0.1-1％，载体余量，且各组分相加为100％。
5.根据权利要求4所述的一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂，其特征在于，所述润湿剂为亚甲基双甲基萘磺酸钠；所述分散剂为木质素磺酸钠、木质素磺酸钙中的一种或几种；所述紫外线保护剂为糊精；所述载体为硅藻土。
6.一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将棘孢木霉ZZY菌株活化、培养，制备成种子培养液；
步骤二：将所述种子培养液按10-25％的接种量接入发酵培养基中；在恒温26℃，RH≥75％的条件下培养7-9d，得到发酵产物；
步骤三：将所述发酵产物自然风干、粉碎后，过200目筛，收集得到棘孢木霉ZZY孢子粉；
步骤四：称量所述棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体，混合、过筛后得所述棘孢木霉ZZY可湿性粉剂。
7.如权利要求6所述的一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤一至四具体操作如下：
步骤一：将棘孢木霉ZZY菌株接种于PDA平板培养基，26℃培养60-84h，用无菌蒸馏水洗下分生孢子，制成菌悬液，然后将其按培养液的体积的2％的接种量接入灭菌后的PD液体培养液中，置于160r/min，26℃，培养48-60h得到种子培养液；
步骤二：固体发酵培养基以米糠、麸皮质量比2:3的比例放入培养盒内混合，铺至厚度1-2cm，并加入70-75％的营养液，搅拌均匀后将培养盒置于耐高温的培养袋中，然后在121℃高温高压灭菌，冷却后将种子培养液按10-25％的接种量接入培养盒中；将培养盒放入发酵车间中，在恒温26℃，RH≥75％的条件下培养7-9d；
步骤三：将培养盒中的固体发酵产物倒入无菌室中，进行自然风干，风干后的发酵产物放入超微粉碎机中粉碎后，于振动筛分机中过200目筛，收集得到棘孢木霉ZZY孢子粉；
步骤四：称量棘孢木霉ZZY孢子粉、润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体并混合，过筛后得所述棘孢木霉ZZY可湿性粉剂。
8.如权利要求6所述的一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤一中所述菌悬液中的孢子浓度为4×108个/mL。
9.如权利要求6所述的一种棘孢木霉ZZY可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，步骤二中所述营养液包括如下组分：蔗糖1.5％，蛋白胨1％，硫酸锌0.2％，蒸馏水余量。
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| CN117511749A (zh) * | 2023-10-31 | 2024-02-06 | 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) | 一种棘孢木霉HG1与枯草芽孢杆菌Tpb55的固态发酵方法及其应用 |
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