CN116685356A - 含有单酯阳离子脂质的脂质纳米颗粒组合物 - Google Patents

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CN116685356A CN202180088552.0A CN202180088552A CN116685356A CN 116685356 A CN116685356 A CN 116685356A CN 202180088552 A CN202180088552 A CN 202180088552A CN 116685356 A CN116685356 A CN 116685356A
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Abstract

本公开内容尤其提供包含单酯阳离子脂质的脂质纳米颗粒制剂。本发明还提供包含单酯阳离子脂质纳米颗粒和核酸的组合物。本公开内容也提供脂质纳米颗粒包封药剂。本公开内容进一步提供生产具有包封的核酸的脂质纳米颗粒的方法。

Description

含有单酯阳离子脂质的脂质纳米颗粒组合物
发明领域
本公开内容尤其提供包含脂质纳米颗粒的组合物。本公开内容还提供包封药剂的脂质纳米颗粒。本公开内容进一步提供生产能够包封药剂(诸如多核苷酸)的脂质纳米颗粒的方法。
背景
近年来，已经探索了纳米颗粒平台的各种生物医学应用。脂质纳米颗粒(“LNP”)是一种可用于例如将药剂递送至对象的纳米颗粒技术。例如，药剂(诸如多核苷酸，包括小干扰RNA(siRNA)、mRNA或质粒DNA)在LNP中的递送为许多疾病提供了潜在的疗法和疫苗，例如，通过沉默病理性基因、表达治疗性蛋白或抗原，或通过基因编辑应用。
与该技术的开发相关的主要挑战是活性和安全性特征的优化以满足与作为治疗剂或疫苗的预期用途、疾病适应症、施用途径以及目标患者或对象群体一致的确定产品特性。所施用的药剂的保护，尤其是例如在多核苷酸药剂的递送中，保护多核苷酸免于核酸酶降解、有效调节生物分布、药代动力学、向靶细胞的细胞内递送、免疫原性特征以及安全性或耐受性，取决于施用途径的全身和局部途径，对产品优化至关重要。此外，由于多核苷酸的化学-物理性能(例如，高分子量、高电荷密度、酶不稳定性等)，大多数多核苷酸需要用于体内使用的药物递送系统和制剂。
LNP已成为基于多核苷酸的治疗剂和疫苗的有前途的递送系统。LNP可以包含多种组分，诸如一种或多种阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质，其中目标多核苷酸被包封在LNP内。虽然已经报道了几种LNP系统，但它们的设计主要集中在治疗性siRNA的体内递送，以通过RNA干扰(RNAi)过程下调疾病相关蛋白的合成。这些siRNA-LNP主要用于肝脏相关的疾病靶标，并通过静脉内(“IV”)途径全身施用。
用作siRNA的全身递送媒介物的LNP的优化主要集中在新型阳离子脂质的发现，当被配制为LNP的一部分时，所述脂质会改善被包封的多核苷酸的细胞内递送和/或胞内体逃逸。此外，已经开发出包含单酯阳离子脂质组分的LNP，以促进脂质从肝脏中的消除并改善全身安全性谱。
随着最近对mRNA多核苷酸作为治疗方式的兴趣，LNP已在基于mRNA的治疗剂和疫苗中得到应用。一般而言，用于mRNA治疗剂和/或疫苗的LNP依赖于最初设计用于递送siRNA或相关多核苷酸的LNP。但是，这些LNP系统不一定针对mRNA应用进行了优化。例如，有效的mRNA递送需要优化的LNP系统，以便在向对象施用(经常通过肌肉内(“IM”)或真皮内(“ID”)途径)时，使mRNA编码的蛋白稳健表达。LNP还必须在施用部位局部耐受，并与特定适应症和目标群体中的用途系统一致。
由于改善的全身耐受性，能够从血浆和组织中快速消除的脂质组分对于全身施用的LNP递送系统而言是合乎需要的组分。参见，例如，Maier MA，Jayaraman M，Matsuda S，等人，“Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles forSystemic Delivery of RNAi Therapeutics”，Mol Ther.2013；21(8)：1570-1578.doi：10.1038/mt.2013.124。但是，仍然需要改进的LNP系统来递送意图用于局部施用途径(例如，肌肉内、真皮内、肿瘤内、鼻内、眼内等)的多核苷酸活性物。
概述
本发明提供了一种组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基；
每个X独立地是顺式烯基、反式烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
且
n是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
本发明也提供了一种组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
且
n是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
本发明也提供了一种组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R1是C1-C12烷基；
R2是顺式-烯基；
R3是C1-C12烷基；
R4是C1-C12烷基；且
n是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
本发明也提供了一种组合物，其包含：
多核苷酸，和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯；
8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；
10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；
6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；
(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；
12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；
(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
及其组合，
(b)磷脂，
(c)胆固醇，和
(d)PEG-脂质，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
本发明还提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒，其包含：
(a)磷脂；
(b)胆固醇；
(c)PEG-脂质；和
(d)具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；
且
n是4、6、8、9或10，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述脂质纳米颗粒中。
本发明还提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含：
(a)磷脂；
(b)胆固醇；
(c)PEG-脂质；和
(d)具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R2是顺式烯基；
R3是C4-C10烷基；
R4是C5-C8烷基或不存在；且
n是4、6、8、9或10；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述脂质纳米颗粒中。
本发明也提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含：
(a)磷脂；
(b)胆固醇；
(c)PEG-脂质；和
(d)单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯；8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；和(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述脂质纳米颗粒中；且
其中与未用所述单酯阳离子脂质配制的相同组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
定义
在本文中使用以下缩写：
ACN 乙腈
AcOH或HOAc 乙酸
anh 无水
aq 水性的
Bn 苄基
盐水 饱和NaCl水溶液
Bz 苯甲酰基
calc′d 计算的
CAN 硝酸铈铵
Celite 硅藻土
DCM 二氯甲烷
DIEA或DIPEA N，N-二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲基氨基吡啶
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMP 戴斯-马丁氧化剂
DMSO 二甲亚砜
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
EDTA 乙二胺四乙酸
ESI 电喷雾电离
Et 乙基
Et2O 乙醚
EtOH 乙醇
EtOAc 乙酸乙酯
Et3N 三乙胺
h 小时
HPLC 高效液相色谱法
IPA 异丙醇
iPr 异丙基
LC 液相色谱法
LCMS 液相色谱质谱法
MeOH 甲醇
mg 毫克
min 分钟
μL 微升
mL 毫升
mmol 毫摩尔
MS 质谱法
NBS N-溴琥珀酰亚胺
NMR 核磁共振光谱法
PBS 磷酸盐缓冲盐水
PDC 重铬酸吡啶鎓
Pet.醚 石油醚
Ph 苯基
Pr 丙基
PS 聚苯乙烯
Rac 外消旋混合物
RT或rt 室温
Sat 饱和的
SFC 超临界流体色谱法
TBAF 叔丁基氟化铵
TBS或TBDMS 叔丁基二甲基甲硅烷基
TBSCl 叔丁基二甲基氯硅烷
t-Bu 叔丁基
TEA 三乙胺
TBAI 四丁基碘化铵
TBDPS 叔丁基二苯基甲硅烷基
TBDPSCl 叔丁基二苯基氯硅烷
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
TLC 薄层色谱法
TMS 三甲基甲硅烷基
本文中使用的波浪线指示与所述化合物的其余部分的连接点。
约：本文中使用的术语“约”当在本文中参考一个值使用时，是指与所提及的值相同或在上下文中与其类似的值。一般而言，熟悉上下文的本领域技术人员将理解“约”在该上下文中所涵盖的绝对量和/或相对差异度。例如，在某些实施方案中，术语“约”可以涵盖在所提及的值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围。
施用：本文中使用的术语“施用”是指向对象(例如，人)提供活性剂、组合物或制剂的行为。向人体的示例性施用途径可以是通过眼睛(眼科)、口腔(口服)、皮肤(透皮)、鼻(鼻腔)、肺(吸入)、直肠、阴道、口腔粘膜(含服)、耳，通过注射(例如，静脉内(IV)、皮下、肿瘤内、腹膜内、肌肉内(IM)、真皮内(ID)等)等。
药剂(agent)：本文中使用的术语“药剂”是指任何化学类别的颗粒、化合物、分子或实体，包括例如小分子、多肽(例如，蛋白)、多核苷酸(例如，DNA多核苷酸或RNA多核苷酸)、糖、脂质或其组合或复合物。在某些实施方案中，术语“药剂”可以表示包括一个聚合物或多个聚合物的化合物、分子或实体。在某些实施方案中，术语“药剂”一般可以表示当施用给生物体时引发期望的药理学作用的药剂。在某些实施方案中，所述药剂可以用于预防疾病的传播。在某些实施方案中，该术语是指意图用作预防剂的药剂。在某些实施方案中，所述预防剂是疫苗。
烷基和烯基：本文中使用的术语“烷基”是指具有指定数目的碳原子的直链、环状或支链饱和脂族烃，例如，C1是甲基且C2是乙基。在不同的实施方案中，烷基含有1-12个碳原子(C1-C12烷基)；4-10个碳原子(C4-C10烷基)；5-8个碳原子(C5-C8烷基)。在一个实施方案中，烷基是直链的。在另一个实施方案中，烷基是支链的。除非另有说明，否则烷基是未被取代的。本文中使用的术语“烯基”是指具有指定数目的碳原子的直链、环状或支链不饱和脂族烃，包括、但不限于二烯、三烯和四烯不饱和脂族烃。
抗原：本文中使用的术语“抗原”是指可以产生一种或多种免疫应答的任何抗原。所述抗原可以是蛋白(包括重组蛋白)、VLP、多肽或肽(包括合成的肽)。在某些实施方案中，所述抗原是脂质或碳水化合物(多糖)。在某些实施方案中，所述抗原是蛋白提取物、细胞(包括肿瘤细胞)或组织。所述抗原可以是产生体液和/或CTL免疫应答的抗原。
API：本文中使用的术语“API”是指活性药物成分，其是本文公开的组合物或制剂的组分，其具有生物活性(例如，能够诱导适当的免疫应答)并给有此需要的人或动物赋予治疗或预防益处。本文中使用的API可以是疫苗活性成分。
生物标志物：本文中使用的术语“生物标志物”是指这样的实体：其存在、水平或形式与感兴趣的特定生物事件或状态相关，因此它被认为是该事件或状态的“标志物”。例如，在某些实施方案中，生物标志物可以是或包括特定不良事件或其它生物学结果的标志物，或预测特定不良事件或其它生物学结果将发展、发生或再次发生的可能性的标志物。因此，在某些实施方案中，生物标志物是预测性的，在某些实施方案中，生物标志物是预后的，并且在某些实施方案中，生物标志物是对相关事件、不良事件或其它生物学结果的诊断。生物标志物可以是任何化学类别的实体。例如，在某些实施方案中，生物标志物可以是或包括多核苷酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、无机试剂(例如，金属或离子)、不良事件的症状或它们的组合。在某些实施方案中，生物标志物是细胞内的。在某些实施方案中，生物标志物在细胞外被发现(例如，分泌或以其它方式在细胞外产生或存在，例如，在体液诸如血液、尿、泪液、唾液、脑脊液等中)。在某些实施方案中，可以通过身体检查来评估生物标志物。
阳离子脂质：本文中使用的术语“阳离子脂质”是指在选定的pH(诸如生理pH)携带净正电荷的脂质种类。本领域技术人员将理解，阳离子脂质可以是可电离的脂质，诸如可电离的阳离子脂质。这样的脂质包括、但不限于在美国专利申请公开号US 2009/0263407、US2009/0285881、US 2010/0055168、US 2010/0055169、US 2010/0063135、US 2010/0076055、US 2010/0099738、US 2010/0104629、US 2016/0361411、US2008/0085870、US2008/0057080和US2013/0017239、国际专利申请公开号WO20 11/022460、WO2012/040184、WO201I/076807、WO2010/021865、WO 2009/132131、WO2010/042877、WO2010/146740和WO2010/105209中和在美国专利号5,208,036、5,264，618、5,279,833、5,283,185、6,890,557和9,669,097中公开的阳离子脂质。
顺式-烯基：本文中使用的术语“顺式-烯基”是指由两个碳构成的双键，其中双键的任一端的取代基彼此呈顺式。
组合物：本文中使用的术语“组合物”是指与一种或多种药学上可接受的载体组合的活性剂。在某些实施方案中，所述活性剂以适合在治疗方案中施用的单位剂量存在，当施用给相关群体时，所述治疗方案显示出实现预定治疗效果的统计上显著的概率。在某些实施方案中，组合物可以特别配制用于以固体或液体形式施用，包括适合于以下的那些：口服施用，例如，灌服剂(水性或非水性溶液或混悬液)，片剂，例如，用于含服、舌下和全身吸收的那些，丸剂，粉剂，颗粒剂，用于应用至舌的糊剂；胃肠外施用，例如，通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射，例如，作为无菌溶液或混悬液，或持续释放制剂；局部应用，例如，作为应用于皮肤、肺或口腔的乳膏剂、软膏剂或控释贴剂或喷雾剂；阴道内或直肠内，例如，作为子宫托、乳膏剂或泡沫；舌下；经眼；透皮；或经鼻、经肺和应用于其它粘膜表面。
有效量：本文中使用的术语“有效量”是指产生施用所期望的效果的量。在某些实施方案中，该术语是指当根据治疗剂给药方案施用给遭受疾病、障碍和/或病症或对疾病、障碍和/或病症敏感的群体时，足以治疗所述疾病、障碍和/或病症的量。在某些实施方案中，有效量是降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的发生率和/或严重程度和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“有效量”实际上并不要求在特定对象中实现成功治疗。相反，有效量可以是当施用给需要这种治疗的对象时在显著数目的对象中提供特定的期望药理学应答的量。在某些实施方案中，对有效量的提及可以是对在一种或多种特定组织(例如，受疾病、障碍或病症影响的组织)或流体(例如，血液、唾液、血清、汗液、泪液、尿等)中测得的量的提及。本领域普通技术人员将理解，在某些实施方案中，有效量的特定药剂或疗法可以以单个剂量配制和/或施用。在某些实施方案中，可以以多个剂量配制和/或施用有效药剂，例如，作为给药方案的一部分。
包封的或包封：本文中使用的术语“包封的”或“包封”是指将一种或多种药剂(诸如一种或多种多核苷酸)限制在纳米颗粒内的过程或结果。本文中使用的术语“包封”和“加载”可以互换使用。所述药剂可以被完全地包封或部分地包封。如果分子或颗粒的至少一部分被限制在载体内(例如，例如在载体的孔内)，则药剂至少部分地被载体包封。
表达：本文中使用的“表达”是指导致从多核苷酸序列产生多肽的一个或多个生物学过程，具体地包括转录和翻译中的任一种或两种。
制剂：本文中使用的术语“制剂”是指含有活性药物或生物成分以及一种或多种另外的组分的组合物。所述制剂可以是液体或固体(例如，冻干的)。可以适当地包含的另外的组分包括药学上可接受的赋形剂、添加剂、稀释剂、缓冲剂、糖、氨基酸、螯合剂、表面活性剂、多元醇、填充剂、稳定剂、冻干保护剂、增溶剂、乳化剂、盐、辅助剂、张度增强剂、递送媒介物和抗微生物防腐剂。在采用的剂量和浓度下，制剂对接受者无毒。在某些实施方案中，所述制剂是指单次剂量的疫苗，其可以被包括在适合注射的任何体积中。
半衰期：本文中使用的术语“半衰期”是指活性药物成分的浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。全身半衰期是指活性药物成分的血浆浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。局部半衰期是指活性药物成分的局部组织浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。
杂烷基：本文中使用的术语“杂烷基”是指如上定义的烷基部分，其具有被一个或多个杂原子(其可以相同或不同)替换的一个或多个碳原子(例如一个、两个或三个碳原子)，其中与所述分子的其余部分的连接点是通过杂烷基的碳原子。合适的这样的杂原子包括O、S、S(O)、S(O)2和-NH-、-N(烷基)-。非限制性例子包括醚、硫醚、胺、羟甲基、3-羟基丙基、1，2-二羟乙基、2-甲氧基乙基、2-氨基乙基、2-二甲基氨基乙基等。在某些实施方案中，杂烷基可以包括含有杂原子的脂族基团。在不同的实施方案中，杂烷基含有1-12个碳原子(C1-C12杂烷基)。在一个实施方案中，杂烷基是直链的。在另一个实施方案中，杂烷基是支链的。
脂质：本文中使用的术语“脂质”是指一组有机化合物中的任一种，所述有机化合物是脂肪酸的酯并且特征在于不溶于水或在水中具有低溶解度但可溶于许多有机溶剂。它们可以分为至少三类：(1)“简单脂质”，其包括例如脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括例如磷脂和糖脂；和(3)“衍生脂质”，其包括例如类固醇。
脂质纳米颗粒：本文中使用的术语“脂质纳米颗粒”(或“LNP”)是指形成具有10至1000纳米的长度或宽度测量值(例如，最大长度或宽度测量值)的颗粒的脂质组合物。在某些实施方案中，所述LNP可以用于递送抗原、抗体、API等。
单酯阳离子脂质：本文中使用的术语“单酯”是指仅含有单个酯基的阳离子脂质。
中性脂质：本文中使用的术语“中性脂质”是指在选定的pH以不带电荷的或中性的两性离子的形式存在的脂质种类。在生理pH，这样的脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
核酸：本文中使用的“核酸”是指单个核酸分子(例如，核苷酸或核苷)。在某些实施方案中，核酸是或包括天然的核酸(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)。在某些实施方案中，核酸是RNA或DNA。在某些实施方案中，核酸是或包括核酸类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞嘧啶、甲基化的碱基和它们的组合)。在某些实施方案中，核酸类似物与典型核酸的差别在于，核酸类似物不利用磷酸二酯主链与多核苷酸的其它核酸结合。例如，在某些实施方案中，核酸是或包括本领域已知的“肽核酸”以通过肽键主链而不是通过磷酸二酯键主链与其它核酸结合。在某些实施方案中，与天然核酸的糖相比，核酸包括修饰的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖或己糖)。
药学上可接受的：如本文中关于组合物的载体、稀释剂或赋形剂所使用的，术语“药学上可接受的”指示，载体、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。
多核苷酸：本文中使用的术语“多核苷酸”是指包括两个或更多个核酸的分子。在某些实施方案中，多核苷酸是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。DNA多核苷酸的例子可以包括反义DNA、质粒DNA、预缩合的DNA、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的DNA、载体DNA(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、DNA适体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或其衍生物形式。RNA多核苷酸的例子可以包括tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、miRNA、shRNA(短发夹RNA)、ncRNA(非编码RNA)、RNA适体、核酶、嵌合序列、或其衍生物形式。多核苷酸在其整体中或在其任何部分中可以是单链、双链、三链或四链。在某些实施方案中，多核苷酸包括磷酸二酯主链。在某些实施方案中，多核苷酸包括肽键主链。在某些实施方案中，多核苷酸包括一个或多个硫代磷酸酯键和/或5′-N-亚磷酰胺键，例如，替代磷酸二酯键。在某些实施方案中，多核苷酸具有编码功能基因产物(诸如RNA或蛋白)的核苷酸序列。在某些实施方案中，多核苷酸包括一个或多个内含子。在某些实施方案中，通过以下中的一种或多种来制备多核苷酸：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中再生，和化学合成。在某些实施方案中，多核苷酸是至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核酸残基长。在某些实施方案中，多核苷酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽的全部或部分，或者是编码多肽的全部或部分的序列的互补物。在某些实施方案中，多核苷酸具有酶活性。
分泌型胚胎碱性磷酸酶(“SEAP”)：本文中使用的术语“SEAP”是指分泌型胚胎碱性磷酸酶蛋白，其为包含520个氨基酸的人胎盘碱性磷酸酶的截短形式(SEQ ID NO.1)。本领域技术人员将理解，SEAP在CHO细胞中表达并在SDS page凝胶上显示75kDa条带。通过亲和色谱法纯化重组SEAP蛋白。
样品：本文中使用的术语“样品”通常是指从感兴趣的来源获得或衍生出的材料的等分试样。在某些实施方案中，感兴趣的来源是溶液或乳剂。在某些实施方案中，感兴趣的来源是反应产物、实验室产品或制成品。在某些实施方案中，感兴趣的来源是生物或环境来源。在某些实施方案中，感兴趣的来源可以是或包括细胞或生物体，诸如微生物、植物或动物(例如，人)。在某些实施方案中，感兴趣的来源是或包括生物组织或流体。在某些实施方案中，生物样品是或包括从对象得到的细胞。在某些实施方案中，样品是通过任何适当方式直接从感兴趣的来源获得的“初级样品”。在某些实施方案中，如从上下文中将清楚的，术语“样品”是指通过处理初级样品(例如，通过从其除去一种或多种组分和/或通过向其添加一种或多种试剂)而获得的制品。例如，使用半透性膜过滤。这样的“处理过的样品”可以包括例如从样品中提取的或通过使初级样品经受一种或多种技术(诸如多核苷酸的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等)而获得的多核苷酸或蛋白。
对象：本文中使用的术语“对象”是指生物体，通常是哺乳动物(例如，人，在某些实施方案中包括出生前的人体形态)。在某些实施方案中，对象正在遭受有关的疾病、障碍或病症。在某些实施方案中，对象易感疾病、障碍或病症。在某些实施方案中，对象表现出疾病、障碍或病症的一种或多种症状或特征。在某些实施方案中，对象不表现出疾病、障碍或病症的任何症状或特征。在某些实施方案中，对象是具有对疾病、障碍或病症的易感性特有的一种或多种特征或具有疾病、障碍或病症的风险的人。在某些实施方案中，对象是患者。在某些实施方案中，对象是给其施用和/或已经给其施用诊断和/或疗法的个体。
反式烯基：本文中使用的术语“反式烯基”是指由两个碳构成的双键，其中双键的任一端的取代基彼此呈反式。
耐受性：本文中使用的术语“耐受性”是指由药剂或组合物(例如，药学上可接受的组合物或制剂)向对象的施用造成的不良作用的存在和/或程度的定量或定性量度。在某些实施方案中，局部地评估耐受性，例如，在对象的施用部位。在某些实施方案中，全身性地评估耐受性，例如，遍及整个身体。在某些实施方案中，可以将耐受性测量为生物标志物的改善。在某些情况下，耐受性是或包括例如以下方面的主观或客观评估：疼痛、不适、恶心、疲劳、排便活动、进食行为(例如，厌食)、睡眠行为、脱发、炎症、肿胀、皮疹、体重变化、皮肤相关的毒性、生活质量、情绪状态或生活方式影响。在某些情况下，通过从业人员是否继续、停止、中断、延迟、更新剂量(例如，减小剂量)或以其它方式修改疗程来评估耐受性。在某些情况下，评估耐受性包括对象的身体检查。在某些情况下，评估耐受性包括评估医疗不良事件的存在和/或程度，包括、但不限于急诊室就诊、住院治疗、死亡和/或美国卫生和人类服务部不良事件通用术语标准(CTCAE)认可的任何不良事件。在各种实施方案中，评估耐受性包括评估生物标志物。本领域技术人员将理解，可以构成或促进耐受性的确定的一些或所有评估可以应用于人和/或非人动物对象，例如，关于在非人动物对象中的相同或等同的生物学应答或事件。本领域技术人员将进一步理解，用于测量不良作用的方法和/或标准是本领域已知的。
附图简述
图1是描绘本发明的LNP 9、10、11和13的SEAP表达的图。
图2A和2B是描绘本发明的LNP 3、6、8和12的SEAP表达的图。
图3A和3B描绘了表征本发明的LNP 13的组织病理学图。
图4A和4B描绘了表征本发明的LNP 9的组织病理学图。
图5A和5B描绘了表征本发明的LNP 10的组织病理学图。
图6A和6B描绘了表征本发明的LNP 3的组织病理学图。
图7A和7B描绘了表征本发明的LNP 6的组织病理学图。
图8A和8B描绘了表征本发明的实施例13中使用的对照的组织病理学图。
详细描述
本发明一般地涉及包含包封在基于单酯阳离子脂质的脂质纳米颗粒(LNP)中的药剂的组合物，其用于通过胃肠外途径(例如，肌肉内(“IM”)、皮下(“SC”)、真皮内(“ID”)、鼻内或静脉内(“IV”))施用。在某些实施方案中，所述药剂可以是多核苷酸。如本文所示，当被配制为LNP的一部分时，单酯阳离子脂质在体内施用给对象后显示出短的半衰期，并且在LNP组合物的施用部位处表现出增加的耐受性。在体内施用给对象后，与不用单酯阳离子脂质配制的LNP相比，单酯阳离子脂质作为LNP的一部分显示出短的半衰期和增加的局部耐受性。单酯阳离子脂质作为LNP的一部分导致改善的局部耐受性或全身耐受性，如通过各种生物标志物所测量的。当通过IM途径施用时，尤其会观察到这种改善。本发明的单酯阳离子脂质可以提供在注射部位处减少的肿胀和/或发红。本发明的LNP组合物提供药剂(例如，多核苷酸)的有效细胞内递送，并且比用不同阳离子脂质类别(包括非单酯阳离子脂质和甚至其它单酯阳离子脂质)配制的组合物更好地被受体对象耐受。本发明的单酯阳离子脂质进一步适用于递送mRNA和非-mRNA活性物，包括、但不限于dsRNA、siRNA等。
在此令人惊讶地发现，特定的单酯阳离子脂质在被配制为脂质纳米颗粒的一部分时提供包封的药剂的有效细胞内递送。这些制剂还提供了mRNA有效负载的改进递送(例如，由mRNA编码的蛋白(例如，抗原)的表达)和在LNP组合物的施用部位处改善的局部耐受性(例如，当通过TM途径施用时)。此外，令人惊讶地发现，与不包含特定单酯阳离子脂质(诸如MC3、MC3酯衍生物和Langer脂质)的LNP相比，特定单酯阳离子脂质在被配制为本发明的LNP组合物的一部分时提供了核苷酸负荷的稳健细胞内递送和改善的耐受性。(参见例如，MaierMA，Jayaraman M，Matsuda S，等人.Biodegradable lipids enabling rapidlyeliminated lipid nanoparticles for systemic delivery of RNAi therapeutics.MolTher.2013；21(8)：1570-1578；Hassett等人，Optimization of Lipid Nanoparticles forIntramuscular Administration of mRNA Vaccines，Molecular Therapy第15卷，第1-11页，2019年4月15日)。
令人惊讶地发现，某些单酯阳离子脂质当被配制为LNP的一部分时，导致在包封的有效负载的递送(例如，mRNA有效负载的表达)和/或在施用部位处的耐受性方面改善的LNP性能。另外，令人惊讶地发现，与其它已知的脂质(包括其它单酯阳离子脂质)相比，被配制为LNP系统的一部分的特定单酯阳离子脂质提供了核苷酸负荷的稳健细胞内递送和在施用部位处改善的耐受性。最后，用于递送含有特定单酯阳离子脂质的mRNA的LNP的施用提供改善的抗原或蛋白表达和在施用部位处改善的耐受性。
LNP
本发明的脂质纳米颗粒(LNP)在本文中用于递送包封的药剂以治疗或预防疾病。通常，本发明的LNP包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种聚(乙二醇)-脂质(PEG-脂质)、一种或多种胆固醇和一种或多种磷脂。
在某些实施方案中，所述LNP包含在美国专利申请公开号US 2008/0085870、US2008/0057080、US 2009/0263407、US 2009/0285881、US 2010/0055168、US 2010/0055169、US 2010/0063135、US 2010/0076055、US 2010/0099738、US 2010/0104629、US 2013/0017239或US 2016/0361411、国际专利申请公开号WO2011/022460、WO2012/040184、WO2011/076807、WO2010/021865、WO 2009/132131、WO2010/042877、WO2010/146740或WO2010/105209和美国专利号5,208,036、5,264,618、5,279,833、5,283,185、6,890,557或9,669,097中提及的任何阳离子脂质。
在某些实施方案中，所述LNP包含在选定的pH(诸如生理pH)携带净正电荷的阳离子脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含阳离子脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的阳离子脂质：N，N-二油烯基-N，N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵；12-二油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(“DODAP”)；3-(N-(N,N-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)一N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(“DMRIE”)。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的阳离子脂质：(商购可得的阳离子脂质纳米颗粒，其包含DOTMA和1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)，来自Gibco BRL，Grand Island，N.Y.，美国)；(商购可得的阳离子脂质纳米颗粒，其包含三氟乙酸N-(1-(2，3-二油烯基氧基)丙基)N-(2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N，N-二甲基-铵；(2，3-二油酰氧基-N-[2-(精胺-甲酰氨基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵)(“DOSPA”)和1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)，来自(Gibco BRL)；和(商购可得的阳离子脂质，其包含在乙醇中的双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)，来自PromegaCorp.，Madison，WI.，美国)。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的阳离子脂质：DODAP、DODMA、DMDMA、1，2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、4-(2，2-二辛-9，12-二烯基-[1，3]二氧杂环戊烷-4-基甲基)-二甲基胺、DLinKDMA(WO 2009/132131)、DLin-K-C2-DMA(WO2010/042877)、DLin-M-C3-DMA(WO2010/146740和/或WO2010/105209)、2-{4-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]丁氧基}-N，N-二甲基-3-[(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯基氧基]丙烷-1-胺)(CLinDMA)等。
在本发明的某些实施方案中，通过各种中间体合成LNP的阳离子脂质组分。在某些实施方案中，所述中间体是(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛；(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯；(Z)-十一碳-2-烯-1-醇；(Z)-壬-2-烯-1-醇；(Z)-十三碳-2-烯-1-醇；(Z)-辛-2-烯-1-醇；(Z)-庚-2-烯-1-醇；或1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯。在某些实施方案中，所述中间体是(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛。在某些实施方案中，所述中间体是(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯。在某些实施方案中，所述中间体是(Z)-十一碳-2-烯-1-醇。在某些实施方案中，所述中间体是(Z)-壬-2-烯-1-醇。在某些实施方案中，所述中间体是(Z)-十三碳-2-烯-1-醇。在某些实施方案中，所述中间体是(Z)-辛-2-烯-1-醇。在某些实施方案中，所述中间体是((Z)-庚-2-烯-1-醇。在某些实施方案中，所述中间体是1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯。
在本发明的LNP的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式A中所示的结构表示：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R8是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
R9是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
任选地，R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，可以连接形成4-8元单环杂环烷基；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
且
每个n独立地是0-12。
在本发明的LNP的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式A中所示的结构表示，其中
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
R8是C1烷基；
R9是C1烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式B中所示的结构表示：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式B中所示的结构表示，其中
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式C中所示的结构表示：
其中，
X2是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式C中所示的结构表示，其中
X2是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式D中所示的结构表示：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式D中所示的结构表示，其中
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；且
每个n独立地是4、6、8、9或10。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式E中所示的结构表示：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式E中所示的结构表示，其中
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在，
R4是C5-C8烷基或不存在；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是4、6、8、9或10。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式F中所示的结构表示：
其中，
R1是C1-C12烷基；
R2是顺式-烯基；
R3是C1-C12烷基；
R4是C1-C12烷基；且
n是0-12。
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质由在式F中所示的结构表示，其中
R1是C1；
R2是顺式-烯基；
R3是C4-C10烷基；
R4是C5-C8烷基或不存在；且
每个n独立地是4、6、8、9或10。
在某些实施方案中，示例性的单酯阳离子脂质包含下面表I中所示的化合物1-8：
表I
在本发明的某些实施方案中，所述阳离子脂质是3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯。在某些实施方案中，所述阳离子脂质是(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯。
在某些实施方案中，所述LNP包含30-65摩尔％阳离子脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含30-55摩尔％阳离子脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含30-45摩尔％阳离子脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含55-65摩尔％阳离子脂质。
在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的中性脂质：磷脂、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂、二酰基甘油和它们的组合。在某些实施方案中，所述中性脂质包括磷脂和胆固醇。
在某些实施方案中，所述中性脂质包括甾醇，诸如胆固醇。在某些实施方案中，所述中性脂质包括胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含10-40摩尔％胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含15-25摩尔％胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含10-20摩尔％胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含20-30摩尔％胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含10-15摩尔％胆固醇。在某些实施方案中，所述LNP包含25-35摩尔％胆固醇。
在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的磷脂：磷脂、氨基脂质和鞘脂。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的中性脂质：鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和S-酰氧基酸。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的中性脂质：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(磷脂酸酯)(PA)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、单酰基-磷脂酰胆碱(溶血PC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、N-酰基-PE、磷酸肌醇和鞘磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的中性脂质：磷脂酸(DMPA、DPPA、DSPA)、磷脂酰胆碱(DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)、磷脂酰甘油(DMPG、DPPG、DSPG、POPG)、磷脂酰乙醇胺(DMPE、DPPE、DSPE DOPE)和磷脂酰丝氨酸(DOPS)。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的中性脂质：脂肪酸包括C14：0、棕榈酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、亚麻酸(C18∶3)、花生四烯酸(C20∶4)、C20∶0、C22∶0和卵磷脂。在某些实施方案中，所述磷脂包括1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在某些实施方案中，所述中性脂质包括磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含5-30摩尔％磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含5-15摩尔％磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含10-20摩尔％磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含20-30摩尔％磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含10-15摩尔％磷脂。在某些实施方案中，所述LNP包含25-30摩尔％磷脂。
在某些实施方案中，所述聚合物-脂质缀合物包含PEG-脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含选自以下的PEG-脂质：α-[8’-(1，2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-甲酰胺-3’，6’-二氧杂辛烷基]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)；1，2-二癸酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯；1，2-二十二烷酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯；和1，2-二硬脂酰基-消旋-甘油-3-甲基聚氧乙烯。
在某些实施方案中，所述LNP包含0.05-5摩尔％聚合物-脂质缀合物。在某些实施方案中，所述LNP包含1-4摩尔％聚合物-脂质缀合物。在某些实施方案中，所述LNP包含0.5-2摩尔％聚合物-脂质缀合物。在某些实施方案中，所述LNP包含1-4摩尔％聚合物-脂质缀合物。在某些实施方案中，所述LNP包含1-3摩尔％聚合物-脂质缀合物。在某些实施方案中，所述LNP包含1-2.5摩尔％聚合物-脂质缀合物。
在某些实施方案中，所述LNP包含30-65摩尔％阳离子脂质、10-30摩尔％胆固醇、5-30摩尔％磷脂和.05-4摩尔％PEG-脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含55-65摩尔％阳离子脂质、25-35摩尔％胆固醇、5-15摩尔％磷脂和1-2.5摩尔％PEG-脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含40-50摩尔％阳离子脂质、15-20摩尔％胆固醇、18-20摩尔％磷脂和1.5-2.5摩尔％PEG-脂质。在某些实施方案中，所述LNP包含56-59摩尔％阳离子脂质、15-20摩尔％胆固醇、18-20摩尔％磷脂和0.5-1.5摩尔％PEG-脂质。
药剂
在某些实施方案中，本发明的LNP递送包封的药剂。药剂可以包括任何化学类别的任何颗粒、化合物、分子或实体，包括例如小分子、多肽(例如，蛋白)、多核苷酸(例如，DNA多核苷酸或RNA多核苷酸)、糖、脂质、或其组合或复合物。
在某些实施方案中，所述药剂是核酸或多核苷酸。所述药剂可以包括多核苷酸，诸如mRNA、自扩增的mRNA、siRNA、miRNA、DNA、cDNA。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以是DNA多核苷酸或RNA多核苷酸。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括DNA多核苷酸诸如反义DNA、质粒DNA、预缩合的DNA、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的DNA、载体DNA(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、DNA适体、表达盒、嵌合序列、染色体DNA、或其衍生物形式。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括RNA多核苷酸诸如tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA(信使RNA)、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)、miRNA、shRNA(短发夹RNA)、ncRNA(非编码RNA)、RNA适体、核酶、嵌合序列或其衍生物形式。在某些实施方案中，所述多核苷酸在其整体中或在其任何部分中可以是单链、双链、三链或四链。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括磷酸二酯主链。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括肽键主链。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括一个或多个硫代磷酸酯键和/或5′-N-亚磷酰胺键，例如，替代磷酸二酯键。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以具有编码功能基因产物(诸如RNA或蛋白)的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述多核苷酸可以包括一个或多个内含子。在某些实施方案中，可以通过以下中的一种或多种来制备多核苷酸：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合的酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中再生，和化学合成。在某些实施方案中，多核苷酸是至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核酸残基长。在某些实施方案中，多核苷酸可以具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽的全部或部分，或者是编码多肽的全部或部分的序列的互补物。在某些实施方案中，多核苷酸具有酶活性。
LNP组合物
在本发明的某些实施方案中，例如通过快速沉淀工艺形成LNP组合物，该工艺需要将溶解在低级烷醇溶液(例如，乙醇)中的脂质组分与含有多核苷酸的水溶液使用限定体积混合设备诸如限定体积T-混合器、多入口涡旋混合器、微流体混合器装置或其它装置微混合。所述脂质溶液可以包括在乙醇中的特定摩尔比的一种或多种阳离子脂质、一种或多种中性脂质(例如，磷脂、DSPC、胆固醇)、一种或多种聚合物-脂质缀合物(例如，PEG-DMG)以形成有机溶液。在某些实施方案中，然后将脂质/乙醇溶液与药剂(例如，多核苷酸或mRNA)的水溶液混合。所述水溶液可以是选自以下的缓冲液：柠檬酸钠、醋酸钠缓冲的盐溶液和它们的组合，其中所述缓冲液可以具有约2-6的pH。
在某些实施方案中，任选地将水溶液和有机溶液加热到25℃-45℃、优选30℃-40℃范围内的温度，然后在限定体积混合器中混合以形成LNP。当使用限定体积T-混合器时，T-混合器可以具有0.25至10.0mm的内径范围。在某些实施方案中，可以使用可编程的注射泵和总流速10mL/分钟至600L/分钟将醇和水溶液递送至T-混合器的入口。在某些实施方案中，可以在限定体积混合器中以1∶1至4∶1体积：体积范围内的比率合并水溶液和醇溶液。在某些实施方案中，可以以1.1∶1至4∶1、1.2∶1至4∶1、1.25∶1至4∶1、1.3∶1至4∶1、1.5∶1至4∶1、1.6∶1至4∶1、1.7∶1至4∶1、1.8∶1至4∶1、1.9∶1至4∶1、2.0∶1至4∶1、2.5∶1至4∶1、3.0∶1至4∶1和3.5∶1至4∶1范围内的比率合并水溶液和醇溶液。
在某些实施方案中，可以使用可编程的注射泵和总流速10mL/分钟至600L/分钟将有机溶液和水溶液递送至T-混合器的入口，并以约1∶1至4∶1体积：体积范围内的比率合并。在某些实施方案中，脂质/乙醛(ethanal)和mRNA/水溶液的混合形成LNP组合物。然后可以将得到的LNP悬浮液在连续线内混合工艺中用缓冲液(诸如具有约6-8的pH的柠檬酸盐缓冲溶液)稀释2次。对于第一次稀释，可以将LNP悬浮液与具有约6-7.5的pH的缓冲溶液以约1∶1至1：3体积：体积的范围内的混合比混合。然后可以将得到的LNP悬浮液进一步与具有约6-8的pH的缓冲溶液以1∶1至1∶3体积：体积的范围内的混合比混合。
在某些实施方案中，然后可以通过超滤工艺浓缩和过滤LNP组合物，其中除去醇并将缓冲液更换为最终的缓冲溶液。具有切向流过滤形式(“TFF”)的超滤工艺使用标称分子量截止值范围为30-500KD的中空纤维膜，目标为100KD。TFF可能将LNP组合物保留在渗余物中，而滤液或渗透液可能含有醇和最终的缓冲液废物。TFF可以提供初始浓度至20-100mg/mL的脂质浓度。在浓缩后，可以将LNP悬浮液相对于pH 7-8的最终缓冲液(10mM Tris、140mMNaCl，pH 7-8，或10mM Tris、70mM NaCl、5-10重量％蔗糖，pH 7-8)渗滤5-20个体积，以除去醇并进行缓冲液交换。然后可以通过超滤浓缩物质。
在某些实施方案中，然后将浓缩的LNP悬浮液在无菌条件下无菌过滤到合适的容器中。通过使LNP悬浮液穿过预过滤器(Acropak 500PES 0.45/0.8μm胶囊)和生物负载减少过滤器(Acropak 500PES 0.2/0.8μm胶囊)来完成无菌过滤。在过滤后，可以在0℃至-20℃储存装瓶的LNP产物。
在某些实施方案中，在该混合阶段利用的乙醇体积分数、溶液流速、脂质浓度、多核苷酸浓度、混合器配置和内径和混合器管道内径的组合可以提供具有30至300nm的颗粒尺寸的LNP和约70-100％的量的药剂(例如，多核苷酸或mRNA)的包封效率。多核苷酸的包封效率可以定义为，相对于LNP的外部，在LNP内部发现(即包封)的药剂(例如，多核苷酸或mRNA)的分数。在某些实施方案中，在本发明的组合物中包封的多核苷酸的包封效率可以大于80％。在某些实施方案中，在本发明的组合物中包封的多核苷酸的包封效率为约80-100％。可以将得到的LNP悬浮液稀释两次到6-8范围内的较高pH缓冲液中以形成组合物。
在某些实施方案中，可以在15-40℃范围内的温度执行所述稀释步骤。在某些实施方案中，可以在30-40℃范围内的温度执行所述稀释步骤。在某些实施方案中，可以将得到的LNP悬浮液进一步与高pH缓冲液(即，具有较高pH(例如，6-8)的缓冲溶液)以1：1至1：3体积：体积范围内的混合比混合以形成组合物。在某些实施方案中，所述LNP悬浮液可以经历温育阶段，其中悬浮液可以在阴离子交换过滤步骤之前保持最少1秒至48小时。在某些实施方案中，在该温育阶段中的温度可以在15-40℃的范围内。在某些实施方案中，可以将LNP悬浮液在温育步骤后过滤。在某些实施方案中，可以将LNP悬浮液通过包含阴离子交换分离步骤的过滤器(诸如0.8微米过滤器)过滤。
在某些实施方案中，也可以将LNP组合物通过超滤工艺浓缩和过滤以除去醇。在某些实施方案中，也可以除去高pH缓冲液并更换为最终的缓冲溶液。在某些实施方案中，最终的缓冲溶液可以选自磷酸盐缓冲盐水或任何适合冷冻保存的缓冲系统(例如，含有蔗糖、海藻糖或其组合的缓冲液)。
在某些实施方案中，所述LNP组合物可以经历使用切向流过滤形式(“TFF”)的超滤工艺。在某些实施方案中，所述工艺可以使用标称分子量截止值范围为30-500KD的膜。在某些实施方案中，所述过滤膜可以包括中空纤维或平板盒。在某些实施方案中，具有适当分子量截止值的TFF工艺可以将LNP保留在渗余物中，而滤液或渗透液包含醇和最终的缓冲液废物。在某些实施方案中，TFF工艺是多步骤工艺，具有初始浓度至20-100mg/mL的脂质浓度。在浓缩后，可以将LNP悬浮液相对于最终缓冲液渗滤5-20个体积，以除去醇并进行缓冲液交换。在某些实施方案中，还可以通过超滤将悬浮液再浓缩1-3倍。在某些实施方案中，LNP组合物制造工艺还可以包括灭菌步骤，其中在无菌条件下将浓缩的LNP悬浮液无菌过滤到合适的容器中。在某些实施方案中，所述无菌过滤可以通过本领域考虑的任何系统完成，诸如，例如，使LNP悬浮液穿过预过滤器(诸如，例如，Acropak 500PES 0.45/0.8μm胶囊)或生物负载减少过滤器(诸如，例如，Acropak 500PES 0.2/0.8μm胶囊)。在过滤后，可以将装瓶的LNP产物在合适的储存条件下(诸如，2℃-8℃，或如果冷冻的话，-80至-20℃)储存或可以冻干。
LNP组合物的耐受性
在某些实施方案中，耐受性可以表示局部耐受性，例如，在施用部位，或全身耐受性，例如遍及整个身体，或其组合。在某些实施方案中，如通过生物标志物的存在所确定的，可以评估耐受性，所述生物标志物可以通过取自对象的组织或血液样品进行分析。在某些实施方案中，生物标志物可以是施用LNP后对象的嗜中性粒细胞和/或白细胞的数目。在某些实施方案中，在施用了包含单酯阳离子脂质的LNP的对象中耐受性增加的生物标志物可以是比施用了不包含单酯阳离子脂质的LNP的对象中的嗜中性粒细胞和/或白细胞水平低的嗜中性粒细胞和/或白细胞水平。在某些实施方案中，生物标志物可以包括在施用LNP后观察到的对象的体温变化。在某些实施方案中，与施用了不包含单酯阳离子脂质的LNP的对象相比，施用了包含单酯阳离子脂质的LNP的对象可能表现出更低的体温升高。在某些实施方案中，与施用了不包含单酯阳离子脂质的LNP的对象相比，施用了包含单酯阳离子脂质的LNP的对象可能表现出更快的恢复到正常温度(例如，大约98.6°F)的初始体温升高。在某些实施方案中，生物标志物可以指示在施用LNP后对象的身体中的整体炎症应答水平。在某些实施方案中，与施用了不包含单酯阳离子脂质的LNP的对象相比，施用了包含单酯阳离子脂质的LNP的对象可能表现出更低的炎症应答。
在某些实施方案中，通过确定阳离子脂质终末消除半衰期(t1/2)，可以评价LNP组合物在施用部位处的耐受性。具体地，本发明的终末半衰期可以表示包含药剂(诸如多核苷酸或mRNA)的LNP的浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。全身半衰期是指活性药物成分的血浆浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。局部半衰期是指活性药物成分的局部组织浓度降低至其原始值的一半所花费的时间。
在某些实施方案中，通过收集注射部位周围的血液和组织(包括例如，肌肉)的样品，可以确定终末半衰期。可以将血液样品离心以获得血浆样品。可以将组织样品在有匀浆缓冲液(诸如Tris缓冲液)、蔗糖、非选择性的蛋白酶抑制剂4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟或其组合等存在下匀浆。
在某些实施方案中，在蛋白沉淀步骤和添加适当的内部标准品(拉贝洛尔、丙米嗪或双氯芬酸)之后，通过LC-MS/MS测定可以确定血浆和组织样品中阳离子脂质的浓度。通过确定阳离子脂质与内部标准品的峰面积比，可以进行定量。
在某些实施方案中，可以使用非房室法(例如，)获得药代动力学参数。使用线性梯形或线性/对数-线性梯形法则，可以从第一个时间点(0min)直到具有可测量的药物浓度的最后一个时间点计算药物浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)。通过对数转换数据的未加权线性回归分析，可以确定终末消除半衰期(t1/2)。可以通过目视检查数据来选择确定半衰期的时间点。
在某些实施方案中，与不包含酯的阳离子脂质相比，当作为脂质纳米颗粒制剂的组分通过肌肉内途径施用时，阳离子脂质在施用部位处的终末消除半衰期(t1/2)可能会因含酯阳离子脂质而缩短。在某些实施方案中，相对于不含酯的阳离子脂质(例如，LNP 12和13)，含酯的阳离子脂质(例如，本发明的LNP 3、6和9-11)更快速地从施用部位消除。
在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，单酯阳离子脂质的终末消除半衰期小于100小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期小于50小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期小于25小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期小于10小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是4小时至10小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是5小时至9小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是5小时至8小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是6小时至8小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是7小时至9小时。在某些实施方案中，当作为LNP组合物的组分施用时，阳离子脂质的终末消除半衰期是1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时。
在某些实施方案中，与不包含相同单酯阳离子脂质的LNP组合物相比，当作为LNP组合物的组分施用时，本发明的单酯阳离子脂质的应用提供改善的全身耐受性。在某些实施方案中，通过生物标志物测量全身耐受性。在某些实施方案中，所述生物标志物可以指示对包含本发明的单酯阳离子脂质的LNP的减弱的炎症应答。在某些实施方案中，包含本发明单酯的LNP组合物可以提供比不包含本发明单酯的LNP组合物低的生物标志物。在某些实施方案中，包含本发明单酯的LNP组合物可以提供比不包含本发明单酯的LNP组合物更快地恢复到正常水平的生物标志物。
在某些实施方案中，与不包含具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质的LNP组合物相比，包含具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质的LNP组合物，
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12，
提供改善的全身耐受性。在某些实施方案中，所述改善的全身耐受性包括减弱的生物标志物。在某些实施方案中，所述改善的全身耐受性包括减弱的炎症应答。在某些实施方案中，改善的全身耐受性可以包括比不包含具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质的LNP组合物更快地恢复到正常水平的生物标志物。
在某些实施方案中，与不包含单酯阳离子脂质的LNP组合物相比，包含单酯阳离子脂质的LNP组合物提供改善的全身耐受性，所述单酯阳离子脂质选自：3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯及其组合。在某些实施方案中，所述改善的全身耐受性包括减弱的生物标志物。在某些实施方案中，所述改善的全身耐受性包括减弱的炎症应答。在某些实施方案中，通过比不包含单酯阳离子脂质的LNP组合物更快地恢复到正常水平的生物标志物，测量改善的全身耐受性。
为了描述和公开可能与本发明关联使用的方法和材料的目的，本文提及的所有出版物通过引用并入。本文中的内容不应解释为承认本发明由于先前发明而丧失先于这样的公开内容的资格。
已经参考附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方案，并且本领域技术人员可以使用各种变化和修改，而不脱离如在所附权利要求中限定的本发明的范围或精神。
在实施方案1中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式A中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R8是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
R9是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
任选地，R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，可以连接形成4-8元单环杂环烷基；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在实施方案2中，提供了实施方案1的组合物，其中
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
R8是C1烷基；
R9是C1烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在实施方案3中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式B中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在实施方案4中，提供了实施方案3的组合物，其中
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在实施方案5中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式C中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12。
在实施方案6中，提供了实施方案5的组合物，其中
X2是或不存在；
R3是C4-C10烷基、R1-X1-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5和R6不存在；
R7是C2烷基；
每个X1独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
每个n独立地是1、2、4、5、6、8、9或10。
在实施方案7中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
n是0-12。
在实施方案8中，提供了实施方案7的组合物，其中
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案9中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
n是0-12。
在实施方案10中，提供了实施方案9的组合物，其中
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案11中，提供了包含脂质纳米颗粒(LNP)的组合物，所述脂质纳米颗粒包含：
具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R1是C1-C12烷基；
R2是顺式-烯基；
R3是C1-C12烷基；
R4是C1-C12烷基；且
n是0-12。
在实施方案12中，提供了实施方案11的组合物，其中
R1是C1；
R2是顺式-烯基；
R3是C4-C10烷基；
R4是C5-C8烷基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案13中，提供了一种组合物，其包含：
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含
(a)实施方案1-12中的任一个的单酯阳离子脂质；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；和
多核苷酸，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。在某些实施方案中，所述多核苷酸完全包封在所述LNP中。
在实施方案14中，提供了一种组合物，其包含：
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含
(a)单酯阳离子脂质，其选自：3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z,17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯及其组合；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d) PEG-脂质；和
多核苷酸，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
在实施方案15中，提供了实施方案1-14中的任一个的组合物，其中与未用单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案16中，提供了实施方案13-14中的任一个的组合物，其中所述LNP包含30-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-30摩尔％磷脂、10-40摩尔％胆固醇和0.5-4摩尔％PEG-脂质。
在实施方案17中，提供了实施方案13-14中的任一个的组合物，其中所述LNP包含55-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-15摩尔％磷脂、25-35％胆固醇和1-2.5摩尔％PEG-脂质。
在实施方案18中，提供了实施方案13-17中的任一个的组合物，其中所述LNP包含DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG和单酯，所述单酯选自：3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z,17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯或其组合。
在实施方案19中，提供了实施方案13-18中的任一个的组合物，其中所述LNP包含约5-15摩尔％的量的DSPC、约25-35摩尔％的量的胆固醇、约1-2.5摩尔％的量的PEG2000-DMG和约55-65摩尔％的量的单酯，所述单酯选自：3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯或其组合。
在实施方案20中，提供了一种组合物，其包含：
(a)具有在式A中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R8是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
R9是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基；
任选地，R8和R9，与它们所连接的氮原子一起，可以连接形成4-8元单环杂环烷基；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在、每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；
(d)PEG-脂质；和
(e)多核苷酸，
其中与未用具有在式A中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式A中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案21中，提供了一种组合物，其包含：
(a)具有在式B中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
X3是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基或不存在；
R6是C1-C12烷基或不存在；
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在，
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在，
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在、且
每个n独立地是0-12，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；
(d)PEG-脂质；和
(e)多核苷酸，
其中与未用具有在式B中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式B中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案21中，提供了一种组合物，其包含：
(a)具有在式c中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
X2是或不存在；
R3是C1-C12烷基、X1-R1-R2、R1-X1-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在，
R5是C1-C12烷基或不存在，
R6是C1-C12烷基或不存在，
R7是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在，
每个X1独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在，
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在，
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在、且
每个n独立地是0-12，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；
(d)PEG-脂质，和
(e)多核苷酸，
其中与未用具有在式C中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式C中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案22中，提供了一种组合物，其包含：
(a)具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在，
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在，
R5是C1-C12烷基，
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
n是0-12，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；
(d)PEG-脂质；和
(e)多核苷酸，
其中与未用具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案23中，提供了实施方案21的组合物，其中
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案24中，提供了一种组合物，其包含：
具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
每个n独立地是0-12，
其中与未用具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案25中，提供了一种组合物，其包含：
具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质
其中，
R1是C1-C12烷基；
R2是顺式-烯基；
R3是C1-C12烷基；
R4是C1-C12烷基；且
n是0-12，
其中与未用具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案26中，提供了一种组合物，其包含：
(a)单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯及其组合，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；
(d)PEG-脂质；和
(e)多核苷酸，
其中与未用所述单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案27中，提供了实施方案1-26中的任一个的组合物，其中每个X独立地是或顺式-烯基。
在实施方案28中，提供了实施方案1-27中的任一个的组合物，其中每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在。
在实施方案29中，提供了实施方案1-28中的任一个的组合物，其中每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在。
在实施方案30中，提供了实施方案1-29中的任一个的组合物，其中
每个R3独立地是C1-C10烷基、R1-X1-R2或不存在。
在实施方案31中，提供了实施方案1-30中的任一个的组合物，其中每个R4独立地是C1-C8烷基或不存在。
在实施方案32中，提供了实施方案1-31中的任一个的组合物，其中每个R5独立地是C1-C2烷基或不存在。
在实施方案33中，提供了实施方案1-32中的任一个的组合物，其中每个n独立地是4、6、8、9或10。
在实施方案34中，提供了实施方案1-33中的任一个的组合物，其中所述单酯选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯；
8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；
10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；
6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；
(14Z,17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；
12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；
(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
及其组合。
在实施方案35中，提供了实施方案1-34的组合物，其中所述单酯以约55-65摩尔％的量存在。
在实施方案36中，提供了一种组合物，其包含：
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
单酯阳离子脂质，其选自由以下成员组成的集合：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯；
8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；
10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；
6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；
(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；
12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；
(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
及其组合，
磷脂，
胆固醇，和
PEG-脂质，和
多核苷酸，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
在实施方案37中，提供了实施方案1-36中的任一个的组合物，其中与未用单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
在实施方案38中，提供了实施方案1-37中的任一个的组合物，其中所述LNP包含30-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-30摩尔％磷脂、10-40摩尔％胆固醇和0.5-4摩尔％PEG-脂质。
在实施方案39中，提供了实施方案1-38中的任一个的组合物，其中所述LNP包含55-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-15摩尔％磷脂、25-35％胆固醇和1-2.5摩尔％PEG-脂质。
在实施方案40中，提供了实施方案1-39中的任一个的组合物，其中所述磷脂是DSPC。
在实施方案41中，提供了实施方案40的组合物，其中所述DSPC以约5-15摩尔％的量存在。
在实施方案42中，提供了实施方案1-41中的任一个的组合物，其中所述PEG-脂质是PEG2000-DMG。
在实施方案43中，实施方案42的组合物，其中所述PEG2000-DMG以约5-15摩尔％的量存在。
在实施方案44中，提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；和
脂质纳米颗粒组合物，其包含：
至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂，
胆固醇，
PEG-脂质，和
具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案45中，提供了实施方案44的组合物，其中与未用具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，所述疫苗提供改善的耐受性。
在实施方案46中，提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；和
脂质纳米颗粒组合物，其包含：
至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂；
胆固醇；
PEG-脂质；和
具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R1是C1；
R2是顺式-烯基；
R3是C4-C10烷基；
R4是C5-C8烷基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
在实施方案47中，提供了实施方案44的组合物，其中与未用具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，所述疫苗提供改善的耐受性。
在实施方案48中，提供了一种组合物，其包含：
缓冲液；和
脂质纳米颗粒组合物，其包含：
至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂；
胆固醇；
PEG-脂质；和
单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2一(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯、(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯，
其中与未用所述单酯阳离子脂质配制的相同组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的疫苗提供改善的耐受性。
在实施方案49中，提供了实施方案1-48中的任一个的组合物，其中所述疫苗被配制用于肌肉内施用。
在实施方案50中，提供了实施方案1-49中的任一个的组合物，其中所述疫苗是肌肉内疫苗，其在施用后提供小于100小时的终末消除半衰期。
在实施方案51中，提供了实施方案1-50中的任一个的组合物，其中所述疫苗是肌肉内疫苗，其在施用后提供小于10小时的终末消除半衰期。
在实施方案52中，提供了实施方案1-51中的任一个的组合物，其中所述疫苗是肌肉内疫苗，其在施用后提供4-10小时的终末消除半衰期。
在实施方案53中，提供了实施方案1-52中的任一个的组合物，其中所述疫苗是肌肉内疫苗，其在施用后提供5-8小时的终末消除半衰期。
在实施方案54中，提供了实施方案1-53中的任一个的组合物，其中所述改善的耐受性是全身耐受性。
在实施方案55中，提供了实施方案1-54中的任一个的组合物，其中所述改善的耐受性是局部耐受性。
在实施方案56中，提供了一种组合物，其包含(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛。
在实施方案57中，提供了一种组合物，其包含(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯。
在实施方案58中，提供了一种组合物，其包含(Z)-十一碳-2-烯-1-醇。
在实施方案59中，提供了一种组合物，其包含(Z)-壬-2-烯-1-醇。
在实施方案60中，提供了一种组合物，其包含(Z)-十三碳-2-烯-1-醇。
在实施方案61中，提供了一种组合物，其包含(Z)-辛-2-烯-1-醇。
在实施方案62中，提供了一种组合物，其包含(Z)-庚-2-烯-1-醇。
在实施方案63中，提供了一种组合物，其包含1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯。
实施例
下述实施例例证了本发明。这些实施例例证、但不限制本发明。对于所有实施例，可以利用本领域技术人员已知的标准后处理和纯化方法。除非另外指出，否则所有温度以℃(摄氏度)为单位表示。除非另外指出，否则所有反应在室温进行。本文所示的合成方法意图通过使用具体实施例来举例说明适用的化学法，且不指示本公开内容的范围。
中间体
中间体1和5：(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛和(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯的合成
步骤1：(6Z，9Z)-18-溴十八碳-6，9-二烯的合成
在0℃向(9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-醇(10g，37.5mmol)和Ph3P(22.64g，86mmol)在DCM(40mL)中的溶液中缓慢地加入NBS(13.36g，75mmol)。将反应混合物在N2下在25℃搅拌3h。然后将反应用H2O(150mL)稀释，并将得到的混合物用DCM(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液浓缩，并将得到的混合物通过柱色谱法(SiO2，石油醚)纯化以产生(6Z,9Z)-18-溴十八碳-6，9-二烯(11g，26.7mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.32-5.39(m，4H)，4.05(t，J＝6.80Hz，2H)，2.77(t，J＝6.80Hz，2H)，1.83-2.08(m，6H)，1.33-1.42(m，16H)，0.88(t，J＝7.60Hz，3H)。
步骤2：2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸二乙酯的合成
在0℃将K2CO3(20.98g，152mmol)加入在THF(50mL)和DMF(50mL)的1∶1混合物中的丙二酸二乙酯(24.32g，152mmol)中。然后将(6Z，9Z)-18-溴十八碳-6，9-二烯(10g，30.4mmol)加入反应混合物中。将混合物在N2下在60℃加热16h。将得到的溶液过滤，并用EtOAc(50mL*3)洗涤。将合并的有机层用1.0M的HCl水溶液洗涤以将pH调至3～4。将得到的溶液用EtOAc(150mL*3)萃取。将合并的有机萃取物用水(160mL)、盐水(160mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝50：1至10：1)纯化以产生期望产物2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸二乙酯(10g，19.58mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.29-5.38(m，4H)，3.19(q，J＝7.2Hz，4H)，3.30(t，J＝7.60Hz，1H)，2.76(t，J＝6.40Hz，2H)，1.86-2.05(m，6H)，1.24-2.34(m，24H)，0.88(t，J＝7.20Hz，3H)。
步骤3：2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸的合成
在0℃将KOH(20.60g，367mmol)加入在MeOH(150mL)中的2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸二乙酯(15g，36.7mmol)中。将混合物在N2气氛下在25℃加热2h。将反应浓缩。然后将1.0M的HCl水溶液加入得到的溶液中以将pH调至4～5。将混合物用DCM(500mL*3)和H2O(500mL)萃取。将合并的有机层经无水Na2SO4干燥，并在真空中除去溶剂以产生2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸(11g，23.40mmol)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝12.64(brs，2H)，5.26-5.36(m，4H)，3.16(t，J＝7.2Hz，1H)，2.73(t，J＝6.00Hz，2H)，1.98-2.02(m，4H)，1.60-1.70(m，2H)，1.23-1.32(m，18H)，0.85(t，J＝7.20Hz，3H)。
步骤4：(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯酸的合成
将吡啶(11.36mL，140mmol)加入在甲苯(170mL)中的2-((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基)丙二酸(11g，31.2mmol)中。将混合物在N2下在120℃加热14h。将得到的溶液在减压下浓缩以产生(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯酸(11g，26.7mmol)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.98(brs，1H)，5.26-5.35(m，4H)，2.73(t，J＝6.00Hz，2H)，2.17(t，J＝7.20Hz，2H)，1.98-2.01(m，4H)，1.40-1.50(m，2H)，1.23-1.31(m，18H)，0.85(t，J＝7.20Hz，3H)。
步骤5：(11Z，14Z)-N-甲氧基-N-甲基二十碳-11，14-二烯酰胺的合成
将(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯酸(11g，35.7mmol)和DIEA(31.1mL，178mmol)溶解在DCM(100mL)中。加入HATU(20.34g，53.5mmol)，并将混合物搅拌1h。然后加入N，O-二甲基羟胺盐酸盐(5.22g，53.5mmol)。将反应在25℃搅拌16h。将反应用DCM(100mL*3)萃取，用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20∶1)纯化以产生(11Z，14Z)-N-甲氧基-N-甲基二十碳-11，14-二烯酰胺(12g，27.3mmol)。MS：m/z＝352.3(M+1)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.30-5.38(m，4H)，3.67(s，3H)，3.17(s，3H)，2.77(t，J＝6.40Hz，2H)，2.38-2.40(m，2H)，2.01-2.05(m，4H)，1.59-1.61(m，2H)，1.27-1.38(m，18H)，0.883(t，J＝6.80Hz，3H)。
步骤6：(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛(中间体1)的合成
在N2下在-78℃向(11Z，14Z)-N-甲氧基-N-甲基二十碳-11，14-二烯酰胺(10g，28.4mmol)在DCM(100mL)中的溶液中缓慢地加入DIBAL-H(56.9mL，56.9mmol)。将反应混合物在-78℃搅拌2h。然后将混合物用酒石酸钾钠四水合物饱和水溶液(100mL)淬灭，并将混合物搅拌1h。然后将其用DCM(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝99：1至25：1)纯化以产生产物(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛(6g，16.41mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝9.76(s，1H)，5.30-5.42(m，4H)，2.77(t，J＝6.00Hz，2H)，2.38-2.42(m，2H)，2.01-2.07(m，4H)，1.62-1.64(m，2H)，1.25-1.35(m，18H)，0.883(t，J＝6.80Hz，3H)。
步骤7：(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯(中间体5)的合成
在N2下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(9.93g，44.3mmol)在THF(140mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(1.477g，36.9mmol)。将反应混合物在0℃搅拌20min。然后在0℃将(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛(7.2g，24.62mmol)在THF(10mL)中的溶液加入上述混合物中。将反应混合物在25℃搅拌13h。将混合物用饱和NH4Cl水溶液(100mL)淬灭，然后在0℃将水(100mL)加入上述混合物中，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯(6.5g，14.34mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝6.96(dt，J＝15.2，7.2Hz，1H)，5.73-5.85(m，1H)，5.30-5.42(m，4H)，4.14-4.22(m，2H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.14-2.22(m，2H)，2.04(q，J＝6.8Hz，4H)，1.40-1.47(m，2H)，1.27-1.36(m，21H)，0.87-0.90(m，3H)。
中间体2：(Z)-十一碳-2-烯-1-醇的合成
步骤1：十一碳-2-炔-1-醇的合成
在N2下在-78℃向癸-1-炔(9g，65.1mmol)在THF(72mL)中的溶液中缓慢地加入正丁基锂(31.8mL，79mmol，2.5M)。使反应混合物温热至0℃并搅拌1h。然后将反应混合物冷却至-78℃，并加入低聚甲醛(2.346g，78mmol)。将反应混合物再次温热至25℃并搅拌16h。将反应用饱和NH4Cl水溶液(70mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(70mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用水(70mL)、盐水(70mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生十一碳-2-炔-1-醇(8g，38.0mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝4.25(s，2H)，2.18-2.22(m，2H)，1.26-1.57(m，13H)，0.88(t，J＝6.80Hz，3H)。
步骤2：(Z)-十一碳-2-烯-1-醇(中间体2)
在H2气氛(15psi)下在0℃向十一碳-2-炔-1-醇(1g，5.94mmol)在吡啶(10mL)中的溶液中缓慢地加入Pd/BaSO4(0.1g，5％Pd/BaSO4)。使反应混合物温热至25℃并搅拌28h。将得到的混合物过滤，并将滤液用EtOAc(200mL*3)萃取。将有机相用HCl(1M，100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩以产生粗产物(Z)-十一碳-2-烯-1-醇(900mg，5.29mmol)，将其不经进一步纯化用在后续化学中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.52-5.62(m，4H)，4.19(d，J＝6.00Hz，2H)，2.03-2.08(m，2H)，1.25-1.30(m，12H)，0.87(t，J＝6.80Hz，2H)。
中间体3、4、6和7：(Z)-壬-2-烯-1-醇、(Z)-十三碳-2-烯-1-醇、(Z)-辛-2-烯-1-醇、(Z)-庚-2-烯-1-醇的合成
使用与上面对于中间体2的概要相同的合成顺序，分别用辛-1-炔、十二碳-1-炔、庚-1-炔或己-1-炔替换癸-1-炔，制备中间体3、4、6和7。
中间体8：1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯的合成
步骤1：6-((4-甲氧基苄基)氧基)己烷-1-醇的合成
在0℃向己烷-1，6-二醇(31.7g，268mmol)在无水THF(500mL)中的溶液中加入NaH(8.94g，223mmol)，并将混合物在相同温度搅拌30min。然后在0℃缓慢地加入1-(氯甲基)-4-甲氧基苯(35g，223mmol)。将混合物在50℃搅拌16h。冷却至室温并然后冷却至0℃以后，在0℃加入冷H2O，将两个层分离，并将水相用EtOAc(50mL)萃取。将合并的有机层用H2O和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10∶1至5：1)纯化以产生6-((4-甲氧基苄基)氧基)己烷-1-醇(40g，159mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.24～7.30(m，2H)，6.86～6.88(m，2H)，4.43(s，2H)，3.80(s，3H)，3.61～3.66(m，3H)，3.44(t，J＝7.4Hz，2H)，1.50～1.70(m，8H)。
步骤2：1-(((6-溴己基)氧基)甲基)-4-甲氧基苯的合成
在25℃分6份向6-((4-甲氧基苄基)氧基)己烷-1-醇(38g，159mmol)和三苯基膦(84g，319mmol)在无水THF(200mL)中的溶液中加入1-溴吡咯烷-2,5-二酮(56.8g，319mmol)，并将混合物在相同温度搅拌2h。加入冷H2O，将两个层分离，并将水相用EtOAc(500mL)萃取。将合并的有机层用H2O和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚)纯化以产生1-(((6-溴己基)氧基)甲基)-4-甲氧基苯(30g，95mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.24～7.28(m，2H)，6.86～6.89(m，2H)，4.43(s，2H)，3.80(s，3H)，3.38～3.43(m，4H)，1.83～1.89(m，3H)，1.60～1.70(m，2H)，1.40～1.50(m，3H)。
步骤3：(8-((4-甲氧基苄基)氧基)辛-1-炔-1-基)三甲基甲硅烷
在-60℃将正丁基锂在THF中的溶液(1.592mL，3.98mmol)逐滴加入乙炔基三甲基甲硅烷(0.391g，3.98mmol)在THF(8mL)中的溶液中，然后使反应温热至0℃保持30min。然后将反应冷却至-20℃，并逐滴加入HMPA(2mL)，随后加入1-(((6-溴己基)氧基)甲基)-4-甲氧基苯(1.0g，3.32mmol)。将反应在0℃搅拌5h，然后在20℃搅拌另外14h。将反应用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并萃取进EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生(8-((4-甲氧基苄基)氧基)辛-1-炔-1-基)三甲基甲硅烷(0.73g，2.177mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.10～7.20(m，2H)，6.73(d，J＝8.8Hz，2H)，4.29(s，2H)，3.66(s，3H)，3.29(t，J＝6.4Hz，2H)，2.07(t，J＝7.2Hz，2H)，1.22～1.51(m，8H)，0.00(s，9H)。
步骤4：1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯(中间体8)
将(8-((4-甲氧基苄基)氧基)辛-1-炔-1-基)三甲基甲硅烷(8g，25.1mmol)和四丁基氟化铵(50.2mL，50.2mmol)的混合物在20℃搅拌16h。然后将混合物萃取进EtOAc中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并真空浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯(5.9g，22.75mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.26(t，J＝4.0Hz，2H)，6.87(d，J＝8.4Hz，2H)，4.40(s，2H)，3.80(s，3H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，2.17～2.20(m，2H)，1.93(s，1H)，1.35～1.40(s，8H)。
实施例1：脂质1，3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯的合成
根据下述步骤形成脂质1，3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯。
步骤1：(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-醇的合成
在N2气球下在25℃将新鲜制备的壬基溴化镁(14.19mL，6.84mmol)溶液与在THF(2mL)中的(11Z，14Z)-二十碳-11，14-二烯醛(1.0g，3.42mmol)混合。将混合物在25℃搅拌2h。将得到的混合物冷却至0℃。然后将得到的混合物用饱和NH4Cl(10mL)淬灭，并将混合物用EtOAc(20mL*2)萃取。将合并的有机层用饱和NaCl水溶液(100mL*2)洗涤。然后将有机层分离并经Na2SO4干燥。然后将混合物过滤，并将滤液浓缩。然后将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以形成(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-醇)(1.1g，2.61mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.28～5.46(m，4H)，3.55～3.40(m，1H)，2.78(t，J＝7.0Hz，2H)，2.03～2.08(m，4H)，1.22～1.51(m，38H)，0.86～0.94(m，6H)。
步骤2：3-(二甲基氨基)丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯的合成
在0℃将(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-醇(1g，2.377mmol)、3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(1.095g，7.13mmol)在吡啶(30mL)中的溶液与EDC(1.822g，9.51mmol)和DMAP(0.290g，2.377mmol)混合。然后将混合物温热至40℃并搅拌另外12h。将得到的混合物在真空中浓缩。然后将残余物用水(20mL)稀释，并用DCM(50mL*3)萃取。将有机层合并，并用盐水(100mL*2)洗涤。然后将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。然后将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1至1：1)纯化以形成脂质1的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
3-(二甲基氨基)丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯(400mg，0.769mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.21～5.47(m，4H)，4.86～4.92(m，1H)，3.38(t，J＝7.0Hz，2H)，2.82～2.90(m，8H)，2.78(t，J＝7.0Hz，2H)，2.03～2.08(m，4H)，1.45～1.55(m，4H)，1.19～1.41(m，34H)，0.86～0.92(m，6H)。MS(ESI)m/z：520.1[M+H]+。
实施例2：脂质2，8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯的合成
步骤1：8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛烷-1-醇的合成
将辛烷-1，8-二醇(25g，171mmol)在THF(400mL)中的溶液与咪唑(23.28g，342mmol)和DMAP(2.089g，17.10mmol)混合。然后在0℃将TBDPSCl(43.5ml，169mmol)加入上述混合物中。将反应混合物加热至25℃并搅拌16h。将混合物冷却至室温，并将水(500mL)加入其中。然后将混合物用EtOAc(500ml x 2)萃取。将合并的有机层用盐水(100mL)洗涤并经无水Na2SO4干燥。将得到的混合物过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至5：1)纯化以产生8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-辛烷-1-醇(35g，82mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝1.8，7.9Hz，4H)，7.50～7.31(m，6H)，3.68(m，4H)，1.69～1.48(m，4H)，1.41～1.23(m，8H)，1.04(s，9H)。
步骤2：8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛醛的合成
在0℃将8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛烷-1-醇(35g，91mmol)在DCM(700mL)中的溶液与DMP(116g，273mmol)混合。将混合物在15℃搅拌3h。然后将反应通过加入NaHCO3(1000mL)淬灭，过滤并用DCM(1000mL*2)萃取。然后将有机相用盐水(1000mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(Sio2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛醛(28g，65.9mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝9.76(t，J＝1.8Hz，1H)，7.67(dd，J＝1.8，7.9Hz，4H)，7.50～7.31(m，6H)，3.65(t，J＝6.4Hz，2H)，2.41(dt，J＝2.0，7.3Hz，2H)，1.69～1.48(m，4H)，1.41～1.23(m，6H)，1.04(s，9H)。
步骤3：(E)-10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸-2-烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃将2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(12.30g，54.9mmol)在THF(250mL)中的溶液与NaH(1.903g，47.6mmol)混合。将反应混合物在0℃搅拌40min。然后在0℃将8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛醛(14g，36.6mmol)在THF(50mL)中的溶液加入上述混合物中。将反应混合物在15℃搅拌16h。将得到的混合物用饱和NH4Cl(水溶液100mL)淬灭，然后在0℃将水(200mL)加入上述混合物中，并将得到的混合物用EtOAc(2*500mL)萃取。将合并的有机萃取物用水(800mL)、盐水(1000mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝50：1)纯化以产生(E)-10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸-2-烯酸乙酯(14g，29.4mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝1.8，7.9Hz，4H)，7.50～7.31(m，6H)，7.15～6.90(m，1H)，5.83～5.77(m，1H)，4.19(q，J＝7.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.5Hz，2H)，2.19～2.16(m，2H)，1.57～1.24(m，13H)，1.05(s，9H)。
步骤4：3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)庚基)十二烷酸乙酯的合成
在圆底烧瓶中加入氯化锂(0.112g，2.65mmol)和溴化亚铜(I)(0.190g，1.325mmol)，并将其通过吹风机加热并脱气30min。然后将其冷却至0℃并缓慢地加入THF(20mL)。在0℃将(E)-10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸-2-烯酸乙酯(2g，4.42mmol)、三甲基氯硅烷(0.576g，5.30mmol)加入上述反应混合物中，并在0℃搅拌30min。然后在0℃将制备的壬基溴化镁(53.0ml，26.5mmol)缓慢地加入其中，并将混合物在0℃搅拌30min。然后将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)淬灭，用冰水(50mL)稀释，并用EtOAc(50mL*2)萃取。然后将合并的有机层用盐水(100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1)纯化以产生标题产物3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)庚基)十二烷酸乙酯(2g，3.27mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(d，J＝6.6Hz，4H)，7.48～7.32(m，6H)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H)，3.64(t，J＝6.5Hz，2H)，2.21(d，J＝6.9Hz，2H)，1.83(br s，1H)，1.55～1.49(m，2H)，1.39～1.16(m，29H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤5：3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)庚基)十二烷-1-醇的合成
在N2气球下在0℃向3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)庚基)十二烷酸乙酯(16g，27.5mmol)在THF(160mL)中的溶液中缓慢地加入二异丁基氢化铝(83mL，83mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2h。然后将混合物用酒石酸钾钠四水合物饱和水溶液(200ml)淬灭，并将混合物搅拌1h。然后将其用EtOAc(200ml x 2)萃取。将有机层用盐水(200mL*2)洗涤，分离，并经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20∶1)纯化以产生产物3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-庚基)十二烷-1-醇(12.4g，21.86mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(d，J＝7.6Hz，4H)，7.51～7.31(m，6H)，3.65(q，J＝6.4Hz，4H)，1.55～1.48(m，4H)，1.40(br s，1H)，1.37～1.14(m，27H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤6：叔丁基((8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷基)氧基)-二苯基甲硅烷的合成
向3-(7-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)庚基)十二烷-1-醇(11.3g，20.97mmol)在DMF(110mL)中的溶液中加入四丁基碘化铵(7.74g，20.97mmol)。然后在0℃加入NaH(5.03g，126mmol)。将混合物在0℃搅拌30min并加入1-(氯甲基)-4-甲氧基苯(17.06ml，126mmol)。将混合物在20℃搅拌2h。将反应混合物冷却至0℃，用饱和NH4Cl水溶液(200mL)在0℃淬灭，用水(100mL)稀释，用EtOAc(100mL*2)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1)纯化以产生产物叔丁基((8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)-乙基)十七烷基)-氧基)二苯基甲硅烷(9g，10.92mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝1.5，7.9Hz，4H)，7.45～7.29(m，8H)，6.94～6.79(m，2H)，4.42(s，2H)，3.79(s，3H)，3.65(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，1.36～1.17(m，32H)，1.04(s，9H)，0.94～0.77(m，3H)。
步骤7：8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷-1-醇的合成
在圆底烧瓶中，在15℃向叔丁基((8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)-十七烷基)氧基)二苯基甲硅烷(9g，13.66mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入TBAF(41.0mL，41.0mmol)。将混合物在15℃搅拌16h。加入水(100mL)，并将反应混合物用EtOAc(50mL*2)萃取，将合并的有机层用盐水(饱和，100mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过制备型TLC(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1)纯化以产生8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷-1-醇(2.6g，5.87mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.45～7.15(m，2H)，7.04～6.67(m，2H)，4.42(s，2H)，3.91～3.75(m，3H)，3.63(t，J＝6.6Hz，2H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，1.72～1.48(m，4H)，1.41(br s，1H)，1.39～1.10(m，27H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤8：8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸的合成
在圆底烧瓶中，在0℃向8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷-1-醇(2.6g，6.18mmol)在DMF(26ml)中的溶液中加入PDC(6.98g，18.54mmol)。将混合物在20℃搅拌12h。将反应混合物通过柱色谱法(SiO2，THF(200ml))过滤并在真空中浓缩以提供8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸(2.5g，4.60mmol)。将该物质不经进一步纯化用于下一步。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.26～7.18(m，2H)，6.87(d，J＝8.5Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.80(s，3H)，3.45(t，J＝6.9Hz，2H)，2.34(t，J＝7.5Hz，2H)，1.58～1.49(m，4H)，1.42(br d，J＝11.3Hz，2H)，1.35～1.08(m，23H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤9：8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸(2.5g，5.75mmol)在DCM(25mL)中的溶液中缓慢地加入(Z)-十一碳-2-烯-1-醇(1.469g，8.63mmol)、DMAP(0.703g，5.75mmol)、DIEA(4.02mL，23.01mmol)和EDC(2.205g，11.50mmol)。然后将混合物在20℃搅拌16h。将得到的混合物用水(10mL)稀释，并用DCM(2*10mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(20mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(2g，3.41mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.34～7.19(m，2H)，6.86(d，J＝8.6Hz，2H)，5.75～5.41(m，2H)，4.61(d，J＝6.8Hz，2H)，4.41(s，2H)，3.79(s，3H)，3.43(t，J＝7.0Hz，2H)，2.29(t，J＝7.6Hz，2H)，2.08(q，J＝7.2Hz，2H)，1.67～1.49(m，4H)，1.44～1.12(m，35H)，0.87(br t，J＝6.7Hz，6H)。
步骤10：8-(2-羟基乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向8-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(2g，3.41mmol)在ACN(20mL)和水(5mL)中的溶液中缓慢地加入CAN(7.47g，13.63mmol)，然后将混合物温热至25℃并搅拌2h。将反应混合物用饱和Na2SO3水溶液(10mL)淬灭，用EtOAc(10mL*2)萃取，将合并的有机层用盐水(饱和，20mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：7.6)纯化以产生8-(2-羟基乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(2.1g，2.70mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.72～5.59(m，1H)，5.57～5.46(m，1H)，4.62(d，J＝6.9Hz，2H)，3.66(t，J＝7.0Hz，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.09(q，J＝7.4Hz，2H)，1.62(td，J＝7.5，14.6Hz，4H)，1.51(q，J＝6.9Hz，2H)，1.45～1.18(m，36H)，0.92～0.83(m，6H)。
步骤11：8-(2-氧代乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向8-(2-羟基乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(1.2g，2.57mmol)在DCM(24mL)中的溶液中加入DMP(3.27g，7.71mmol)。将混合物在25℃搅拌3h。将反应混合物用冰水(50mL)稀释并用饱和的NaHCO3(20mL)淬灭。将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(50mL*2)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物用反应1007182-071通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生8-(2-氧代乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(0.8g，1.377mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝9.75(t，J＝2.4Hz，1H)，5.73～5.59(m，1H)，5.58～5.47(m，1H)，4.62(d，J＝6.9Hz，2H)，2.37～2.25(m，4H)，2.09(q，J＝7.2Hz，2H)，1.93(brs，1H)，1.66～1.58(m，3H)，1.40～1.17(m，35H)，0.92～0.80(m，6H)。
步骤12：8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向8-(2-氧代乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(1.9g，3.27mmol)在DCE(19mL)中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(0.800g，9.81mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(2.079g，9.81mmol)。然后将混合物温热至20℃并进一步搅拌16小时。LCMS表明反应结束。将反应混合物用冰水(40mL)稀释，将得到的混合物用DCM(30mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(50mL*2)洗涤，将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(柱YMC-Actus Pro C18，条件35％至5％水(0.1％TFA)-ACN)纯化以提供脂质2，其具有如下所示的结构：
脂质2，
即8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯(1187.35mg，2.404mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝11.74(br s，1H)，5.66～5.57(m，1H)，5.50(td，J＝6.8，10.8Hz，1H)，4.60(br d，J＝6.7Hz，2H)，3.06～2.92(m，2H)，2.82(br s，6H)，2.28(t，J＝7.5Hz，2H)，2.07(q，J＝7.3Hz，2H)，1.70～1.54(m，4H)，1.39～1.15(m，37H)，0.86(br t，J＝6.7Hz，6H)。MS(ESI)m/z：494.5[M+H]+。
实施例3：脂质3，10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯的合成
步骤1：10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸烷-1-醇的合成
向癸烷-1，10-二醇(25g，143mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入咪唑(19.53g，287mmol)、DMAP(1.752g，14.34mmol)。然后在0℃将TBDPSCl(36.5ml，142mmol)加入上述混合物中，并将反应加热至25℃并搅拌16h。将反应冷却至室温并将水(100mL)加入其中。然后将其用EtOAc(100mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至5：1)纯化以产生10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)-氧基)癸烷-1-醇(30g，69.1mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.77～7.62(m，4H)，7.57～7.36(m，6H)，3.73～3.61(m，4H)，1.56(qd，J＝6.7，13.7Hz，4H)，1.39-1.25(m，12H)，1.04(s，9H)。
步骤2：10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸醛的合成
在0℃向10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸烷-1-醇(30g，72.7mmol)在DCM(450mL)中的溶液中加入DMP(77g，182mmol)。将混合物在25℃搅拌3h。然后将得到的混合物用NaHCO3(500ml)在0℃淬灭。然后将反应混合物过滤，并将滤液用DCM(500mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(1000mL)洗涤，将有机层分离，并经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生产物10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸醛(20g，46.3mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝9.76(s，1H)，7.67(d，J＝6.9Hz，4H)，7.45～7.34(m，6H)，3.65(t，J＝6.5Hz，2H)，2.42(dt，J＝1.4，7.4Hz，2H)，1.67～1.55(m，4H)，1.38～1.21(m，10H)，1.05(s，9H)。
步骤3：(E)-12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二碳-2-烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(15.29g，68.2mmol)在THF(200mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(2.53g，63.3mmol)。将反应混合物在0℃搅拌40min。然后在0℃将10-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)癸醛(20g，48.7mmol)加入上述混合物中。将反应混合物在15℃搅拌16h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭，然后在0℃将水(200mL)加入上述混合物中。然后将得到的混合物用EtOAc(500mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(1000mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc 40：1)纯化以产生(E)-12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二碳-2-烯酸乙酯(15.5g，32.2mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝1.3，7.9Hz，4H)，7.45～7.32(m，6H)，7.05～6.88(m，1H)，5.81(d，J＝15.8Hz，1H)，4.18(q，J＝7.0Hz，2H)，3.65(t，J＝6.4Hz，2H)，2.18(q，J＝6.7Hz，2H)，1.56-1.50(m，2H)，1.50～1.39(m，2H)，1.38～1.18(m，9H)，1.04(s，9H)。
步骤4：12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷酸乙酯的合成
向圆底烧瓶中加入溴化亚铜(I)(1.074g，7.49mmol)和LiCl(0.65g，15mmol)。然后加入THF(120mL)。在0℃将(E)-12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二碳-2-烯酸乙酯(12g，24.96mmol)和三甲基氯硅烷(3.83mL，30.0mmol)加入上述反应混合物中，并在0℃搅拌30min。然后在0℃将新鲜制备的壬基溴化镁(300mL，150mmol)缓慢地加入其中，并将混合物在0℃搅拌30min。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(500mL)淬灭，用冰水(100mL)稀释，用EtOAc(500mL*2)萃取。然后将合并的有机层用盐水(500mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生标题产物12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷酸乙酯(14g，21.84mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.71～7.63(m，4H)，7.44～7.34(m，6H)，4.12(q，J＝7.1Hz，2H)，3.65(t，J＝6.6Hz，2H)，2.22(d，J＝6.9Hz，2H)，1.84(br s，1H)，1.56-1.50(m，2H)，1.33～1.19(m，33H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤5：12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷-1-醇的合成
在N2气球下在0℃向12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷酸乙酯(34g，55.8mmol)在THF(340mL)中的溶液中缓慢地加入DIBAL-H(167mL，167mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2h。然后将混合物用饱和酒石酸钾钠四水合物溶液(100mL)淬灭，并将混合物搅拌1h。然后将其用EtOAc(200mL*2)萃取。将有机相用盐水(200mL*2)洗涤，分离，并经Na2SO4干燥，过滤并将滤液浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生产物12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷-1-醇(22g，38.8mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.64～7.74(m，4H)，7.34～7.48(m，6H)，3.67(q，J＝6.4Hz，4H)，1.49～1.63(m，2H)，1.21～1.45(m，34H)，1.04(s，9H)，0.89(t，J＝6.7Hz，3H)。
步骤6：叔丁基((10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷基)氧基)-二苯基甲硅烷的合成
在0℃向12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十二烷-1-醇(15g，26.5mmol)在DMF(150mL)中的溶液中加入四丁基碘化铵(9.77g，26.5mmol)，并加入NaH(6.35g，159mmol)。将混合物在0℃搅拌30分钟，然后将1-(氯甲基)-4-甲氧基苯(24.86g，159mmol)加入上述混合物中。将混合物在20℃搅拌2h。然后将混合物冷却至0℃，用饱和NH4Cl水溶液(200mL)淬灭，然后用水(100mL)稀释，用EtOAc(100mL*2)萃取，将有机层合并，用盐水(200mL*2)洗涤，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将得到的残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1)纯化以产生产物叔丁基((10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷基)-氧基)二苯基甲硅烷(10g，14.55mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.66(d，J＝6.6Hz，4H)，7.45～7.34(m，6H)，7.25(t，J＝4.2Hz，2H)，6.87(d，J＝8.5Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.79(s，3H)，3.64(t，J＝6.5Hz，2H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，1.56～1.50(m，2H)，1.28-1.20(m，33H)，1.04(s，9H)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤7：10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷-1-醇的合成
在30℃向叔丁基((10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷基)氧基)二苯基甲硅烷(6g，8.73mmol)在THF(30mL)中的溶液中加入TBAF(30mL，30.0mmol)，并将混合物在30℃搅拌12小时。将得到的混合物用水(100mL)稀释，用EtOAc(200mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(500mL)洗涤，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩，将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1)纯化，以产生标题产物10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷-1-醇(3g，6.35mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.29～7.25(m，2H)，6.95～6.76(m，2H)，4.42(s，2H)，3.79(s，3H)，3.64(t，J＝6.5Hz，2H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，1.56～1.50(m，2H)，1.28～1.20(m，32H)，0.87(t，J＝6.9Hz，3H)。
步骤8：10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸的合成
在0℃向10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷-1-醇(5g，11.14mmol)在DMF(60mL)中的溶液中加入PDC(20.96g，55.7mmol)，然后温热至30℃并搅拌12h。将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释，通过柱色谱法(SiO2，EtOAc和THF)过滤以产生产物10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸(5g，10.27mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.29～7.25(m，2H)，6.89～6.76(m，2H)，4.42(s，2H)，3.79(s，3H)，3.45(t，J＝6.4Hz，2H)，2.35(t，J＝7.6Hz，2H)，1.71～1.50(m，2H)，1.28～1.20(m，32H)，0.90～0.86(m，3H)。
步骤9：10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸(11g，23.77mmol)在DCM(110mL)中的溶液中缓慢地加入(Z)-壬-2-烯-1-醇(5.18g，35.7mmol)、DMAP(2.90g，23.77mmol)、DIEA(16.61mL，95mmol)和EDC(9.11g，47.5mmol)。然后将混合物在20℃搅拌16h。将得到的混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(2*100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(00mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20∶1)纯化以产生10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(8.3g，13.43mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.35～7.16(m，2H)，6.95～6.76(m，2H)，5.78～5.59(m，1H)，5.55～5.43(m，1H)，4.62(d，J＝6.9Hz，2H)，4.47～4.38(m，2H)，3.80(s，3H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，2.30(t，J＝7.6Hz，2H)，2.09(q，J＝7.0Hz，2H)，2.04(m，1H)，1.58～1.48(m，2H)，1.32～1.14(m，38H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。
步骤10：10-(2-羟基乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向10-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(7g，11.93mmol)在ACN(70mL)和水(17.5mL)中的溶液中缓慢地加入CAN(26.2g，47.7mmol)。然后将混合物温热至25℃并搅拌2h。将得到的混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10∶1)纯化以产生10-(2-羟基乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(4.4g，8.95mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.76～5.39(m，2H)，4.62(d，J＝6.6Hz，2H)，3.66(t，J＝7.0Hz，2H)，2.30(t，J＝7.6Hz，2H)，2.09(q，J＝6.9Hz，2H)，1.57～1.47(m，2H)，1.37～1.19(m，40H)，0.92～0.79(m，6H)。
步骤11：10-(2-氧代乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向10-(2-羟基乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(2g，4.28mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入DMP(5.45g，12.85mmol)。将混合物在25℃搅拌3h。将反应混合物用冰水(500mL)稀释，用饱和NaHCO3淬灭以将pH调至7，将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(20mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(40mL*2)洗涤，将有机层在真空中浓缩，将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1至20：1)纯化以产生10-(2-羟基乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(1.3g，2.79mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝9.75(t，J＝2.4Hz，1H)，5.71～5.45(m，2H)，4.62(d，J＝6.9Hz，2H)，2.38～2.21(m，4H)，2.09(q，J＝7.0Hz，2H)，1.93(br s，1H)，1.67～1.59(m，2H)，1.43～1.14(m，36H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。
步骤12：10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯
在0℃向10-(2-氧代乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(2.6g，5.59mmol)在DCE(40mL)中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(1.369g，16.78mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(3.56g，16.78mmol)。然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌12h。将反应混合物用冰水(20mL)稀释，将得到的混合物用DCM(30mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(50mL*2)洗涤，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩，将残余物通过制备型HPLC (柱YMC-Actus ProC18；条件30％至10％水(0.1％TFA)-ACN)纯化以形成棕色液体，其为脂质3的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质3，
即10-(2-(二甲基氨基)乙基)-十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯(1154.14mg，2.313mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.64(td，J＝7.6，10.8Hz，1H)，5.57～5.39(m，1H)，4.61(d，J＝6.9Hz，2H)，3.07～2.95(m，2H)，2.82(d，J＝4.6Hz，6H)，2.30(t，J＝7.6Hz，2H)，2.09(q，J＝7.5Hz，2H)，1.70～1.57(m，4H)，1.41～1.31(m，4H)，1.30～1.21(m，33H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。MS(ESI)m/z：494.5[M+H]+。
实施例4：脂质4，6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯的合成
步骤1：6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己烷-1-醇的合成
向己烷-1，6-二醇(45g，381mmol)在THF(500mL)中的溶液中加入咪唑(51.8g，762mmol)、DMAP(4.65g，38.1mmol)。然后在0℃将TBDPSCl(93mL，362mmol)加入上述混合物中，并将反应加热至25℃并在N2气球下搅拌16h。通过TLC监测反应的进展。将反应冷却至室温并将水(500mL)加入其中。然后将其用EtOAc(500mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至5：1)纯化以产生6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己烷-1-醇(45g，101mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.68(dd，J＝7.6，1.6Hz，4H)，7.36～7.46(m，6H)，3.65(dt，J＝19.6，6.4Hz，4H)，1.51～1.64(m，4H)，1.32～1.42(m，4H)，1.06(s，9H)。
步骤2：6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己醛的合成
在0℃向6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己烷-1-醇(45g，126mmol)在DCM(500mL)中的溶液中加入DMP(161g，379mmol)。将混合物在N2气球下在25℃搅拌4h。将得到的混合物用冰水(500mL)稀释并用NaHCO3(饱和)淬灭以将pH调至7。将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(1L*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(1L)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝99：1至20：1)纯化以产生6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己醛(31g，69.9mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝9.75(d，J＝1.6Hz，1H)，7.67(d，J＝7.6Hz，4H)，7.35～7.47(m，6H)，3.67(t，J＝6.4Hz，2H)，2.41(t，J＝7.2Hz，2H)，1.60(tt，J＝14.4，7.2Hz，4H)，1.35～1.47(m，2H)，1.06(s，9H)。
步骤3：(E)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛-2-烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(27.4g，122mmol)在THF(500mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(4.55g，114mmol)。将反应混合物在0℃搅拌40min。然后在0℃将6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己醛(31g，87mmol)在THF(100mL)中的溶液加入上述混合物中。将反应混合物在25℃搅拌16h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭。然后在0℃将水(200mL)加入上述混合物中，并将得到的混合物用EtOAc(500mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用水(800mL)、盐水(1000mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝50：1至20：1)纯化以产生(E)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛-2-烯酸乙酯(27g，52.1mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.62～7.70(m，4H)，7.34～7.45(m，6H)，6.90～7.00(m，1H)，5.80(d，J＝16.0Hz，1H)，4.15～4.23(m，2H)，3.65(t，J＝6.5Hz，2H)，2.17(q，J＝7.0Hz，2H)，1.52～1.59(m，2H)，1.36～1.45(m，4H)，1.29(t，J＝7.0Hz，3H)，1.05(s，9H)。
步骤4：3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)戊基)十二烷酸乙酯的合成
制备溴化亚铜(I)(2.230g，15.54mmol)和氯化锂(1.318g，31.1mmol)[在高加热枪下干燥并冷却至室温]在THF(220mL)中的溶液，并搅拌10min。接着，在N2下在0℃将(E)-8-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)辛-2-烯酸乙酯(22g，51.8mmol)和TMSCl(7.95mL，62.2mmol)缓慢地加入上述混合物中，并将混合物搅拌30min。然后将新鲜制备的壬基溴化镁(71.9g，311mmol)加入上述混合物中，并将混合物在0℃搅拌2h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭，并将水(40mL)加入上述混合物中。然后将其用EtOAc(300mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(360mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝99：1至20：1)纯化以产生产物3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)-氧基)-戊基)十二烷酸乙酯(24g，34.7mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝8.0，1.6Hz，4H)，7.34～7.45(m，6H)，4.12(q，J＝7.2Hz，2H)，3.65(t，J＝6.4Hz，2H)，2.21(d，J＝7.2Hz，2H)，1.54～1.60(m，2H)，1.21～1.38(m，26H)，1.05(s，9H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤5：3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)戊基)十二烷-1-醇的合成
在N2气球下在0℃向3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)戊基)十二烷酸乙酯(29g，52.5mmol)在THF(290mL)中的溶液中缓慢地加入DIBAL-H(157mL，157mmol)，并将混合物在0℃搅拌2h。然后将混合物用酒石酸钾钠四水合物饱和水溶液(200m1)淬灭，并将混合物搅拌1h。然后将其用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(260mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生产物3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)戊基)十二烷-1-醇(21g，32.9mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.67(dd，J＝7.6，1.2Hz，4H)，7.34～7.46(m，6H)，3.65(t，J＝6.8Hz，4H)，1.48～1.59(m，4H)，1.23～1.41(m，23H)，1.05(s，9H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤6：叔丁基((6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷基)氧基)-二苯基甲硅烷的合成
在N2气球下在0℃向3-(5-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)戊基)十二烷-1-醇(7.5g，14.68mmol)在DMF(50mL)中的溶液中加入TBAI(5.42g，14.68mmol)和NaH(3.52g，88mmol)，并将混合物在0℃搅拌30min。然后将4-甲氧基苄基氯(12.00mL，88mmol)加入上述混合物中，并将混合物在25℃搅拌2h。然后将混合物用饱和NH4Cl水溶液(160mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(260mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1.25)纯化以产生产物叔丁基((6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)-十五烷基)氧基)二苯基甲硅烷(5.5g，6.97mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.66(dd，J＝7.6，1.6Hz，4H)，7.34～7.43(m，6H)，7.23～7.26(m，2H)，6.86(d，J＝8.8Hz，2H)，4.41(s，2H)，3.78(s，3H)，3.64(t，J＝6.4Hz，2H)，3.44(t，J＝7.2Hz，2H)，1.52～1.58(m，4H)，1.19～1.34(m，23H)，1.04(s，9H)，0.87(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤7：6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷-1-醇的合成
在0℃向叔丁基((6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷基)氧基)二苯基甲硅烷(5g，7.92mmol)在THF(50mL)中的溶液中加入TBAF(39.6mL，39.6mmol)，并将混合物在25℃搅拌12h。将得到的混合物用H2O(200mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至10：1)纯化以产生产物6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷-1-醇(2.3g，4.69mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.24～7.28(m，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.80～3.81(m，1H)，3.80(s，1H)，3.79～3.81(m，1H)，3.62(t，J＝6.8Hz，2H)，3.45(t，J＝7.2Hz，2H)，1.50～1.58(m，4H)，1.21～1.44(m，24H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤8：6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸的合成
在0℃向6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷-1-醇(6.6g，16.81mmol)在DMF(70mL)中的溶液中缓慢地加入PDC(31.6g，84mmol)。将反应混合物在N2气球下在25℃搅拌14h。将得到的混合物用EtOAc(200mL)稀释，将混合物用SiO2(300g)过滤，将混合物用EtOAc(700mL)和THF(900mL)洗涤，并将有机层在真空中浓缩以产生粗产物6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸(6.7g，12.36mmol)，将其不经进一步纯化用在下一步中。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝11.99(s，1H)，7.16～7.27(m，2H)，6.88(d，J＝8.8Hz，2H)，4.34(s，2H)，3.70～3.77(m，3H)，2.17(t，J＝7.2Hz，2H)，1.40～1.48(m，4H)，1.12～1.32(m，23H)，0.85(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤9：6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸(6.7g，16.48mmol)在DCM(70mL)中的溶液中缓慢地加入(Z)-十三碳-2-烯-1-醇(4.90g，24.72mmol)、DIEA(11.51mL，65.9mmol)、DMAP(2.013g，16.48mmol)和EDC(6.32g，33.0mmol)，然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌12h。将混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100*2mL)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1)纯化以产生6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(5g，6.82mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.23～7.27(m，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.59～5.69(m，1H)，5.47～5.56(m，1H)，4.61(d，J＝6.8Hz，2H)，4.41(s，2H)，3.80(s，3H)，3.43(t，J＝7.2Hz，2H)，2.29(t，J＝7.6Hz，2H)，2.09(q，J＝7.2Hz，2H)，1.51～1.59(m，4H)，1.21～1.36(m，37H)，0.87(t，J＝6.8Hz，6H)。MS(ESI)m/z：609.5[M+Na]+。
步骤10：6-(2-羟基乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向6-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(5g，8.52mmol)在ACN(70mL)和水(17.5mL)中的溶液中缓慢地加入CAN(18.68g，34.1mmol)。然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌3h。将得到的混合物用饱和Na2SO3水溶液(100mL)淬灭，并用EtOAc(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝25：1至10：1)纯化以产生6-(2-羟基乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(3.5g，6.00mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.59～5.68(m，1H)，5.45～5.55(m，1H)，4.62(d，J＝7.2Hz，2H)，3.65(t，J＝7.2Hz，2H)，2.31(t，J＝7.6Hz，2H)，2.09(q，J＝7.2Hz，2H)，1.59～1.65(m，2H)，1.48～1.55(m，2H)，1.24～1.39(m，37H)，0.88(t，J＝6.8Hz，6H)。
步骤11：6-(2-氧代乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向6-(2-羟基乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(3.7g，7.93mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入DMP(9.54g，22.49mmol)。将混合物在N2气球下在25℃搅拌3h。将得到的混合物用冰水(50mL)稀释并用饱和NaHCO3水溶液淬灭以将pH调至7。将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(50mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1至20：1)纯化以产生6-(2-氧代乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(2.6g，4.48mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝9.75(s，1H)，5.58～5.68(m，1H)，5.46～5.53(m，1H)，4.61(d，J＝6.8Hz，2H)，2.27～2.35(m，4H)，2.09(q，J＝7.2Hz，2H)，1.95(s，1H)，1.62(s，2H)，1.24～1.36(m，36H)，0.87(t，J＝6.4Hz，6H)。
步骤12：6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向6-(2-氧代乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(2.6g，5.59mmol)在DCE(40mL)中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(1.369g，16.78mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(3.56g，16.78mmol)。然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌12h。将得到的混合物用冰水(20mL)稀释，并将得到的混合物用DCM(40mL*3)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过制备型HPLC(YMC-Actus Pro C18；条件35％至5％水(0.1％TFA)-ACN)纯化为脂质4的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质4
即，6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯(1.4g，2.83mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.59～5.68(m，1H)，5.46～5.55(m，1H)，4.61(d，J＝6.8Hz，2H)，2.99(d，J＝4.8Hz，2H)，2.83(s，6H)，2.31(t，J＝7.6Hz，2H)，2.08(q，J＝7.2Hz，2H)，1.57～1.69(m，4H)，1.22～1.39(m，37H)，0.87(t，J＝6.8Hz，6H)。MS(ESI)m/z：494.9[M+H]+。
实施例5：脂质5，(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯的合成
步骤1：(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯酸乙酯的合成
制备溴化亚铜(I)(0.831g，5.79mmol)、氯化锂(0.491g，11.58mmol)[在高加热枪下干燥，并冷却至室温]在THF(20mL)中的溶液并搅拌5min，然后在0℃将(2E，13Z，16Z)-二十二碳-2，13，16-三烯酸乙酯(7g，19.31mmol)、TMSCl(2.96mL，23.17mmol)缓慢地加入上述混合物中，并将混合物搅拌15min，然后将(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)溴化镁(300mL，116mmol)的THF溶液加入上述混合物中，并将混合物在0℃搅拌2h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(50mL)淬灭，用水(50mL)稀释，并用EtOAc(100mL*3)萃取。将合并的有机层用盐水(500mL)洗涤，将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生标题产物(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯酸乙酯(10g，16.58mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.26(d，J＝8.5Hz，2H)，6.88(d，J＝8.5Hz，2H)，5.28～5.49(m，4H)，4.43(s，3H)，4.12(q，J＝7.0Hz，2H)，3.81(s，3H)，3.43(t，J＝6.5Hz，2H)，2.78(t，J＝7.0Hz，2H)，2.23(d，J＝6.5Hz，2H)，2.06(q，J＝7.0Hz，4H)，1.79～1.92(m，1H)，1.54～1.67(m，4H)，1.21～1.44(m，27H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H)。MS(ESI)m/z：565.4[M+Na]+。
步骤2：(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-醇的合成
在N2保护下在0℃向(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯酸乙酯(9g，14.92mmol)在THF(90mL)中的溶液中加入DIBAL-H(44.8mL，44.8mmol)，然后将混合物在0℃搅拌1h。然后将得到的混合物用酒石酸钾钠四水合物饱和水溶液(200mL)淬灭，用EtOAc(300mL*3)萃取，合并有机层，用盐水(1000mL)洗涤，将有机层分离，并经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩，将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1至3：1)纯化以产生标题产物(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-醇(6.4g，12.78mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.26(d，J＝8.4Hz，2H)，6.88(d，J＝8.4Hz，2H)，5.28～5.49(m，4H)，4.43(s，3H)，3.81(s，3H)，3.66(t，J＝6.4Hz，2H)，3.43(t，J＝6.4Hz，2H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.05(q，J＝6.8Hz，4H)，1.18-1.73(m，29H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤3：叔丁基(((13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-基)氧基)二苯基甲硅烷的合成
在N2气球下在0℃向1H-咪唑(1.903g，28.0mmol)、(13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)-丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-醇(7g，13.98mmol)在DCM(70mL)中的溶液中缓慢地加入叔丁基氯二苯基甲硅烷(4.69ml，20.97mmol)。将反应混合物温热至20℃并搅拌12h。将反应用饱和NH4Cl水溶液(100mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用DCM(300mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(1200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生叔丁基(((13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-基)氧基)二苯基甲硅烷(10g，12.85mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.33～7.46(m，6H)，7.26(d，J＝8.5Hz，2H)，6.88(d，J＝8.5Hz，2H)，5.28～5.49(m，4H)，4.43(s，3H)，3.81(s，3H)，3.68(t，J＝6.5Hz，2H)，3.43(t，J＝6.4Hz，2H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.05(q，J＝6.8Hz，4H)，1.15～1.60(m，29H)，1.05(s，9H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤4：(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯-1-醇的合成
在0℃向叔丁基(((13Z，16Z)-3-(3-((4-甲氧基苄基)氧基)丙基)二十二碳-13，16-二烯-1-基)氧基)二苯基甲硅烷(8g，10.82mmol)在ACN(96mL)、水(32mL)中的溶液中加入CAN(23.73g，43.3mmol)，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌4h。将得到的混合物用饱和Na2SO3水溶液(50mL)淬灭，用冰水(50mL)稀释，将得到的混合物用EtOAc(300mL*2)萃取，将合并的有机层用盐水(500mL*2)洗涤，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过p-TLC(SiO2，石油醚：EtOAc＝50：1，10：1)纯化以产生标题产物(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)-氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯-1-醇(3.5g，5.65mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.33～7.46(m，6H)，5.28～5.49(m，4H)，3.68(t，J＝6.5Hz，2H)，3.58(t，J＝6.5Hz，2H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.05(q，J＝6.8Hz，4H)，1.15～1.60(m，29H)，1.05(s，9H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤5：(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸的合成
在0℃向(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯-1-醇(2.5g，4.04mmol)在DMF(60mL)中的溶液中加入PDC(7.60g，20.19mmol)，并将混合物在0℃搅拌30min，然后温热至30℃并搅拌12h。将混合物用EtOAc(300mL)稀释，通过柱色谱法(SiO2，EtOAc至THF)过滤，然后将滤液在真空中浓缩以产生粗产物(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸(2.8g，2.65mmol)，将其不经进一步纯化直接用在后续步骤中。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.33～7.46(m，6H)，5.28～5.49(m，4H)，3.68(t，J＝6.5Hz，1H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.28(t，J＝8.0Hz，2H)，2.05(q，J＝6.8Hz，4H)，1.15～1.60(m，27H)，1.05(s，9H)，0.90(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤6：(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯的合成
在0℃向(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸(2.8g，2.65mmol)在DCM(30mL)中的溶液中加入戊烷-1-醇(0.702g，7.96mmol)、EDC(1.526g，7.96mmol)、DMAP(0.324g，2.65mmol)、DIEA(1.854mL，10.62mmol)，然后将混合物温热至30℃，并将混合物在30℃搅拌12h。将得到的混合物直接通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20∶1)纯化以产生标题产物(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(1.1g，1.486mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.33～7.46(m，6H)，5.28～5.49(m，4H)，4.04(t，J＝6.5Hz，2H)，3.68(t，J＝6.5Hz，2H)，2.77(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23(t，J＝8.0Hz，2H)，2.05(q，J＝6.8Hz，4H)，1.15～1.65(m，33H)，1.05(s，9H)，0.88～0.92(m，6H)。
步骤7：(14Z，17Z)-4-(2-羟基乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯的合成
在0℃向(14Z，17Z)-4-(2-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(1.1g，1.564mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入TBAF(10mL，10.00mmol)，并将混合物在0℃搅拌30min，然后温热至30℃并搅拌12h。将混合物用水(10mL)稀释，并用EtOAc(20mL*2)萃取。将合并的有机层用盐水(40mL)洗涤，将有机层分离并经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生产物(14Z，17Z)-4-(2-羟基乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(600mg，1.226mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.28～5.42(m，4H)，4.07(t，J＝6.5Hz，2H)，3.70(t，J＝6.5Hz，2H)，2.77(t，J＝6.5Hz，2H)，2.30(t，J＝8.0Hz，2H)，2.05(q，J＝6.5Hz，4H)，1.15～1.65(m，33H)，0.88～0.92(m，6H)。
步骤8：(14Z，17Z)-4-(2-氧代乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯的合成
在0℃向(14Z，17Z)-4-(2-羟基乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(600mg，1.291mmol)在DCM(18mL)中的溶液中加入DMP(1643mg，3.87mmol)，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌4h。将得到的混合物用冰水(20mL)稀释，并将得到的混合物用DCM(30mL*2)萃取，将有机层合并，用盐水(50mL*2)洗涤，并将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1)纯化以产生标题产物(14Z，17Z)-4-(2-氧代乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(400mg，0.864mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝9.77(s，1H)，5.28～5.42(m，4H)，4.07(t，J＝6.5Hz，2H)，3.70(t，J＝6.5Hz，2H)，2.77(t，J＝6.5Hz，2H)，2.31(t，J＝7.5Hz，2H)，2.05(q，J＝6.5Hz，4H)，1.15～1.65(m，31H)，0.88～0.92(m，6H)。
步骤9：(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯的合成
在0℃向(14Z，17Z)-4-(2-氧代乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(400mg，0.864mmol)在DCE(10mL)中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(211mg，2.59mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(550mg，2.59mmol)，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌12h。将得到的混合物用冰水(10mL)稀释，并将混合物用DCM(20mL*2)萃取，将有机层合并，用盐水(50mL*2)洗涤，并将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(YMC-ActusPro C18；条件35％至5％水(0.1％TFA)-ACN)纯化，其为脂质5的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质5
(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯(226.68mg，0.461mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝9.77(s，1H)，5.28～5.42(m，4H)，4.06(t，J＝6.5Hz，2H)，3.00～3.13(m，2H)，2.84(s，6H)，2.77(t，J＝6.5Hz，2H)，2.31(t，J＝7.5Hz，2H)，2.05(q，J＝7.0Hz，4H)，1.15～1.72(m，33H)，0.88～0.92(m，6H)。MS(ESI)m/z：492.5[M+H]+。
实施例6：脂质6，11-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯的合成
步骤1：11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一烷-1-醇的合成
向十一烷-1，11-二醇(25g，133mmol)在THF(250mL)中的溶液中加入咪唑(18.08g，266mmol)、DMAP(1.622g，13.28mmol)。然后在0℃将TBDPSCl(33.8ml，131mmol)加入上述混合物中，并将反应加热至25℃并搅拌16h。将反应冷却至0℃并加入水(200mL)。然后将其用EtOAc(200mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至5：1)纯化以产生11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一烷-1-醇(30g，70.3mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.37～7.44(m，6H)，3.64～3.67(m，4H)，1.53～1.59(m，4H)，1.26～1.35(m，14H)，1.05(s，9H)。
步骤2：11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一醛的合成
在0℃向11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一烷-1-醇(30g，70.3mmol)在DCM(300mL)中的溶液中加入DMP(74.5g，176mmol)，然后将混合物在25℃搅拌3h。将得到的混合物用冰水(500mL)淬灭并过滤。将滤液用DCM(500mL*3)萃取，将合并的有机层用盐水(1000mL)洗涤，并将有机层分离，并经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一醛(21g，47.0mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ9.77(s，1H)，7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.37～7.44(m，6H)，3.66(d，J＝6.5Hz，2H)，2.42～2.44(m，2H)，1.56～1.63(m，4H)，1.26～1.34(m，12H)，1.05(s，9H)。
步骤3：(E)-13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十三碳-2-烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(15.52g，69.2mmol)在THF(210mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(2.57g，64.3mmol)。将反应混合物在0℃搅拌40min。然后在0℃将11-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十一醛(21g，49.4mmol)在THF(20mL)中的溶液加入上述混合物中。将反应混合物在20℃搅拌4h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(100mL)淬灭，然后在0℃将水(100mL)加入上述混合物中，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(500mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液浓缩并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100∶1)纯化以产生(E)-13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十三碳-2-烯酸乙酯(21g，40.3mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.68(d，J＝7.0Hz，4H)，7.37～7.43(m，6H)，6.96～6.99(m，1H)，5.78～5.86(m，1H)，4.16～4.23(m，2H)，3.67(d，J＝5.5，12.5Hz，2H)，2.19～2.21(m，2H)，1.44～1.59(m，4H)，1.26～1.31(m，15H)，1.05(s，9H)。
步骤4：13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷酸乙酯的合成
将溴化亚铜(I)(1.305g，9.09mmol)、氯化锂(0.771g，18.19mmol)在THF(20mL)中的溶液搅拌10min，然后在N2气球下在0℃将(E)-13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十三碳-2-烯酸乙酯(15g，30.3mmol)、TMSCl(4.65mL，36.4mmol)缓慢地加入上述混合物中。将混合物搅拌30min。然后将新鲜制备的壬基溴化镁(42.1g，182mmol)加入上述混合物中，并将混合物在0℃搅拌2h。将得到的混合物用饱和NH4Cl水溶液(150mL)淬灭，并将水(40mL)加入上述混合物中。将反应混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(260mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1至20：1)纯化以产生产物13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷酸乙酯(15g，19.26mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.63～7.70(m，4H)，7.34～7.46(m，6H)，4.13(q，J＝7.2Hz，2H)，3.65(t，J＝6.8Hz，2H)，2.22(d，J＝7.2Hz，2H)，1.85(s，1H)，1.52～1.59(m，2H)，1.26(d，J＝2.4Hz，35H)，1.05(s，9H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤5：13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷-1-醇的合成
在0℃向13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷酸乙酯(21g，33.7mmol)在THF(210mL)中的溶液中缓慢地加入DIBAL-H(101mL，101mmol)，并将混合物在0℃搅拌2h。然后将混合物用酒石酸钾钠四水合物饱和水溶液(200mL)淬灭。将混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(260mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚∶EtOAc＝10：1)纯化以产生13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷-1-醇(18g，24.78mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.68(dd，J＝8.0，1.2Hz，4H)，7.35～7.45(m，6H)，3.64～3.68(m，4H)，1.50～1.60(m，4H)，1.24～1.37(m，33H)，1.05(s，9H)，0.89(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤6：叔丁基((11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷基)氧基)-二苯基甲硅烷的合成
在N2气球下在0℃向13-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十三烷-1-醇(11g，18.93mmol)在DMF(150mL)中的溶液中加入TBAI(6.99g，18.93mmol)和NaH(4.54g，114mmol)。将混合物在0℃搅拌30min。然后将4-甲氧基苄基氯(15.34mL，114mmol)加入上述混合物中并在25℃搅拌2h。将混合物用饱和NH4Cl水溶液(160mL)在0℃淬灭，并用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(260mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液浓缩并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1)纯化以产生产物叔丁基((11-(2-((4-甲氧基苄基)-氧基)乙基)二十烷基)氧基)二苯基甲硅烷(10g，11.41mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.67(dd，J＝7.6，1.6Hz，4H)，7.34～7.44(m，6H)，7.26～7.29(m，2H)，6.85～6.89(m，2H)，4.43(s，2H)，3.78～3.82(m，5H)，3.45(t，J＝7.0Hz，2H)，1.52～1.57(m，4H)，1.22～1.34(m，33H)，1.05(s，9H)，0.86～0.90(m，3H)。
步骤7：11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷-1-醇的合成
在0℃向叔丁基((11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷基)氧基)二苯基甲硅烷(15g，21.39mmol)在THF(70mL)中的溶液中加入TBAF(107mL，107mmol)，并将混合物在25℃搅拌12h。将得到的混合物用H2O(200mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至10：1)纯化以产生产物11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷-1-醇(8g，13.83mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.25(d，J＝4.4Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，4.43(s，2H)，3.80(s，3H)，3.64(t，J＝6.8Hz，2H)，3.45(t，J＝7.2Hz，2H)，1.53～1.59(m，4H)，1.21～1.35(m，33H)，0.86～0.90(m，3H)。
步骤8：11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸的合成
在0℃向11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷-1-醇(8g，17.29mmol)在DMF(70mL)中的溶液中缓慢地加入PDC(32.5g，86mmol)。将反应混合物在N2气球下在25℃搅拌14h。将得到的混合物用EtOAc(200mL)稀释，将混合物用SiO2(300g)过滤，将混合物用EtOAc(700mL)和THF(900mL)洗涤，并将有机层在真空中浓缩以产生粗产物11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸(8g，12.59mmol)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ11.99(s，1H)，7.14～7.25(m，2H)，6.87(d，J＝5.8Hz，2H)，4.34(s，2H)，3.73(s，3H)，2.17(s，2H)，1.45(s，4H)，1.22(s，33H)，0.85(s，3H)。
步骤9：11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸(8g，16.78mmol)在DCM(150mL)中的溶液中缓慢地加入(Z)-辛-2-烯-1-醇(2.367g，18.46mmol)、DIEA(11.72mL，67.1mmol)、DMAP(2.050g，16.78mmol)和EDC(6.43g，33.6mmol)。然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌16h。将得到的混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在减压下浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1至20：1)纯化以产生11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(5g，6.82mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.25～7.26(m，2H)，6.85～6.89(m，2H)，5.61～5.68(m，1H)，5.49～5.56(m，1H)，4.62(d，J＝7.0Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.80(s，3H)，3.45(t，J＝7.5Hz，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.09(q，J＝7.0Hz，2H)，1.59～1.65(m，2H)，1.52～1.55(m，2H)，1.34～1.39(m，2H)，1.21～1.31(m，35H)，0.8～090(m，6H)。
步骤10：11-(2-羟基乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向11-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(5g，8.52mmol)在ACN(70mL)和水(17.5mL)中的溶液中缓慢地加入CAN(18.68g，34.1mmol)。然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌3h。将得到的混合物用饱和Na2SO3水溶液(100mL)淬灭，并用EtOAc(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(100mL*2)洗涤，并将有机层经无水Na2SO4干燥并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝25∶1至10：1)纯化以产生11-(2-羟基乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(3.5g，6.00mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ5.59～5.69(m，1H)，5.48～5.55(m，1H)，4.62(d，J＝6.5Hz，2H)，3.66(t，J＝7.0Hz，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.09(q，J＝7.0Hz，2H)，1.55～1.65(m，4H)，1.52(q，J＝6.9Hz，2H)，1.35～1.40(m，2H)，1.23～1.31(m，33H)，0.88(td，J＝7.0，2.5Hz，6H)。
步骤11：11-(2-羟基乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向11-(2-羟基乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(3.5g，7.50mmol)在DCM(40mL)中的溶液中加入DMP(9.54g，22.49mmol)。将混合物在N2气球下在25℃搅拌3h。将得到的混合物用冰水(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3水溶液淬灭以将pH调至7。将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(50mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1至20：1)纯化以产生11-(2-氧代乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(2.6g，4.48mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ9.75(t，J＝2.5Hz，1H)，5.61～5.68(m，1H)，5.48～5.56(m，1H)，4.61(d，J＝6.5Hz，2H)，2.28～2.34(m，4H)，2.09(q，J＝7.0Hz，2H)，1.59～1.65(m，2H)，1.23～1.38(m，37H)，0.85～0.89(m，6H)。
步骤12：11-(2-羟基乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向11-(2-氧代乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(2.6g，5.59mmol)在DCE(40mL)中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(1.369g，16.78mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(3.56g，16.78mmol)。然后将混合物温热至25℃并在N2气球下搅拌12h。将得到的混合物用冰水(20mL)稀释并用DCM(40mL*3)萃取。将合并的有机萃取物用盐水(60mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过制备型HPLC(Y Agela DuraShell；条件：等度12％水(0.1％TFA)-ACN)纯化以提供脂质6的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质6
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯(1.5g，3.04mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ5.61～5.68(m，1H)，5.45～5.55(m，1H)，4.61(d，J＝7.0Hz，2H)，2.30(t，J＝7.5Hz，2H)，2.20～2.24(m，7H)，2.06～2.13(m，2H)，1.59～1.64(m，2H)，1.33～1.42(m，5H)，1.21～1.30(m，35H)，0.88(td，J＝7.0，3.0Hz，6H)。MS(ESI)m/z：494.3[M+H]+。
实施例7：脂质7，12-(2-(二甲基氨基)乙基)-二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯的合成
步骤1：12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二烷-1-醇的合成
向十二烷-1，12-二醇(15g，74.1mmol)在THF(500mL)中的溶液中加入咪唑(10.09g，148mmol)、DMAP(0.906g，7.41mmol)。然后在0℃将TBDPSCl(18.09mL，70.4mmol)加入上述混合物中，并将反应加热至25℃并搅拌16h。将反应冷却至0℃并加入水(500mL)。然后将得到的混合物用EtOAc(500mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(500mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1至5：1)纯化以产生12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二烷-1-醇(16g，32.7mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.66～7.72(m，4H)，7.36～7.42(m，6H)，3.63～3.66(m，4H)，1.55～1.70(m，4H)，1.20～1.31(m，16H)，1.04(s，9H)。
步骤2：12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二醛的合成
在0℃向12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二烷-1-醇(27g，61.3mmol)在DCM(500mL)中的溶液中加入DMP(78g，184mmol)。将混合物在15℃搅拌4h。将得到的混合物用冰水(500mL)稀释，用饱和NaHCO3淬灭，将得到的混合物过滤，并将滤液用DCM(1L*2)萃取。合并有机层，用盐水(2L*2)洗涤，在真空中浓缩，将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1至20：1)纯化以产生12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二醛(16g，34.6mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ9.80(s，1H)，7.43～7.69(m，4H)，7.37～7.43(m，6H)，3.66(t，J＝6.4Hz，2H)，2.41～2.45(m，4H)，1.60～1.70(m，4H)，1.20～1.40(m，14H)，1.06(s，9H)。
步骤3：21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)二十一烷-10-醇的合成
在圆底烧瓶中，在0℃向新鲜制备的壬基溴化镁溶液(100mL，58.0mmol)中加入12-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)十二醛(16g，36.5mmol)。将混合物在15℃搅拌1h。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(100mL)淬灭，用EtOAc(100mL*2)萃取，将合并的有机层用盐水(饱和，200mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将反应混合物过滤，并将溶剂在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)-氧基)二十一烷-10-醇(17g，28.5mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.66～7.70(m，4H)，7.36～7.42(m，6H)，3.65(t，J＝6.5Hz，2H)，3.57～3.62(m，1H)，1.24～1.46(m，36H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.5Hz，3H)。
步骤4：21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)二十一烷-10-酮的合成
在0℃向21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)二十一烷-10-醇(29g，51.1mmol)在DCM(500mL)中的溶液中加入DMP(65.1g，153mmol)。将混合物在25℃搅拌6h。将反应混合物用饱和NH4Cl水溶液(500mL)淬灭，用EtOAc(500mL*2)萃取，将合并的有机层用盐水(500mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将反应混合物过滤，并将溶剂在减压下浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)二十一烷-10-酮(22g，38.9mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.62～7.67(m，4H)，7.33～7.40(m，6H)，3.60(t，J＝6.8Hz，2H)，2.32～2.37(m，4H)，1.50～1.65(m，6H)，1.20～1.40(m，26H)，1.04(s，9H)，0.88(t，J＝6.5Hz，3H)。
步骤5：(E)-14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四碳-2-烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(23.81g，106mmol)在THF(240mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(4.25g，106mmol)。将反应混合物在15℃搅拌0.5h。然后在0℃向反应混合物中缓慢地加入21-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)二十一烷-10-酮(12g，21.24mmol)。将反应混合物温热至50℃并搅拌12h。然后将其用饱和NH4Cl水溶液(200mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(200mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝50：1)纯化以产生(E)-14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四碳-2-烯酸乙酯(12g，17.95mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.62～7.70(m，4H)，7.37～7.44(m，6H)，5.62(s，1H)，4.11～4.17(m，2H)，3.66(t，J＝6.5Hz，2H)，2.57～2.60(m，2H)，2.11～2.14(m，2H)，1.26～1.65(m，35H)，1.05(s，9H)，0.89(t，J＝6.5Hz，3H)。
步骤6：14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷酸乙酯的合成
在N2气球下在20℃向(E)-14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四碳-2-烯酸乙酯(13g，20.47mmol)在EtOAc(200mL)中的溶液中缓慢地加入Pd/C(2.179g，20.47mmol)。将反应混合物在H2气氛下净化3次，然后将混合物温热至20℃，并进一步在20℃搅拌12h。将反应过滤并将滤液在真空中浓缩以产生粗产物14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷酸乙酯(12g，17.89mmol)，将其不经进一步纯化直接用于下一步。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.66～7.71(m，4H)，7.35～7.47(m，6H)，4.08～4.18(m，2H)，3.64～3.68(m，2H)，2.22(d，J＝7.0Hz，2H)，1.22-1.43(m，39H)，1.06(s，9H)，0.88(t，J＝7.0Hz，3H)。
步骤7：14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷-1-醇的合成
在N2气球下在0℃向14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷酸乙酯(12.5g，19.62mmol)在THF(200mL)中的溶液中缓慢地加入DIBAL-H(58.9mL，58.9mmol)。将反应混合物在0℃搅拌2h。将混合物用饱和酒石酸钾钠四水合物溶液(100mL)淬灭，并将混合物搅拌1h，将混合物用EtOAc(200mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(1L*2)洗涤，将有机层分离并经Na2SO4干燥，过滤并将滤液浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生产物14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷-1-醇(9.5g，15.17mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.60～7.70(m，4H)，7.37～7.44(m，6H)，3.64～3.73(m，4H)，1.50-1.58(m，4H)，1.21-1.45(m，35H)，1.05(s，9H)，0.90(t，J＝6.4Hz，3H)。
步骤8：叔丁基((12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷基)氧基)-二苯基甲硅烷的合成
在0℃向14-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-3-壬基十四烷-1-醇(16g，26.9mmol)在DMF(180mL)中的溶液中加入TBAI(9.93g，26.9mmol)、NaH(6.45g，161mmol)，并将混合物在0℃搅拌30min，然后将1-(氯甲基)-4-甲氧基苯(17.19ml，161mmol)加入上述混合物中，然后温热至30℃并搅拌2h。然后将混合物冷却至0℃，用饱和NH4Cl水溶液(150mL)淬灭，然后用水(100mL)稀释，用EtOAc(300mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(500mL*2)洗涤，将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩以产生残余物，将其通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝100：1至80：1)进一步纯化，以产生产物叔丁基((12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷基)氧基)二苯基甲硅烷(10g，11.89mmol)。
1H NMR(400MHz.氯仿-d)：δ7.65～7.72(m，4H)，7.26～7.44(m，8H)，6.87～6.89(m，2H)，4.44(s，2H)，3.80(s，3H)，3.66(t，J＝6.4Hz，2H)，3.46(t，J＝6.8Hz，2H)，1.50-1.58(m，4H)，1.21-1.60(m，35H)，1.05(s，9H)，0.89(t，J＝6.4Hz，3H)。
步骤9：12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷-1-醇的合成
在20℃向叔丁基((12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷基)氧基)二苯基甲硅烷(10g，11.89mmol)在THF(50mL)中的溶液中加入TBAF(50mL，50.0mmol)，并将混合物在30℃搅拌12h。将反应用水(100mL)稀释，用EtOAc(300mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(500mL*2)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩以产生残余物，将其通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝5：1)进一步纯化，以产生产物12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷-1-醇(5.5g，10.96mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ7.24～7.29(m，2H)，6.84～6.91(m，2H)，4.44(s，2H)，3.81(s，3H)，3.65(t，J＝6.6Hz，2H)，3.46(t，J＝7.2Hz，2H)，1.51～1.64(m，4H)，1.17-1.48(m，35H)，0.89(t，J＝6.5Hz，3H)。
步骤10：12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷酸的合成
在0℃向12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷-1-醇(5g，10.49mmol)在DMF(90mL)中的溶液中加入PDC(19.73g，52.4mmol)，并将混合物在0℃搅拌30min，然后温热至30℃并搅拌12h。然后将混合物用EtOAc(800mL)稀释，通过柱(SiO2，EtOAc和THF)过滤，然后将滤液在真空中浓缩以产生粗产物12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷酸(5g，9.68mmol)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.25(J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.80(s，3H)，3.44(t，J＝7.0Hz，2H)，2.33(t，J＝7.2Hz，2H)，1.55～1.66(m，4H)，1.12～1.45(m，33H)，0.87(t，J＝6.4Hz，3H)。
步骤11：12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷酸(5.0g，10.19mmol)在DCM(50mL)中的溶液中加入(Z)-庚-2-烯-1-醇(1.280g，11.21mmol)、EDC(3.91g，20.38mmol)、DMAP(1.245g，10.19mmol)、DIEA(7.12ml，40.8mmol)，然后将混合物温热至30℃，并将混合物在30℃搅拌12h。将得到的混合物直接通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20：1)纯化以产生标题产物12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)-乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(4g，6.47mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ7.25(J＝8.5Hz，2H)，6.87(d，J＝8.5Hz，2H)，5.51～5.67(m，2H)，4.62(d，J＝6.7Hz，2H)，4.42(s，2H)，3.80(s，3H)，3.45(t，J＝7.2Hz，2H)，2.30(t，J＝7.6Hz，2H)，2.10(q，J＝7.1Hz，2H)，1.54～1.62(m，4H)，1.12～1.45(m，37H)，0.86～0.91(m，6H)。
步骤12：12-(2-羟基乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向12-(2-((4-甲氧基苄基)氧基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(1.0g，1.704mmol)在ACN(8mL)中的溶液中加入CAN(3.74g，6.82mmol)的水(2mL)溶液，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌2h。将得到的混合物用饱和Na2SO3水溶液(10mL)淬灭并加入冰水(20mL)。将得到的混合物用EtOAc(30mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(50mL*2)洗涤，并将有机层经Na2SO4干燥，过滤并将滤液在真空中浓缩，将残余物通过制备型TLC(SiO2，石油醚：EtOAc＝10∶1)纯化以产生标题产物12-(2-羟基乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(0.7g，1.275mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ5.51～5.67(m，2H)，4.63(d，J＝7.0Hz，2H)，3.67(t，J＝7.0Hz，2H)，2.31(t，J＝7.0Hz，2H)，2.11(q，J＝7.1Hz，2H)，1.54～1.62(m，4H)，1.12～1.45(m，37H)，0.86-0.91(m，6H)。
步骤13：12-(2-氧代乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向12-(2-羟基乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(0.7g，1.275mmol)在DCM(10mL)溶液中的溶液中加入DMP(1.622g，3.82mmol)，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌3h，TLC表明反应完成，将得到的混合物用饱和NaHCO3水溶液(10mL)淬灭，用冰水(20mL)稀释，将得到的混合物用DCM(30mL*2)萃取，合并有机层，用盐水(50mL*2)洗涤，并将有机层经Na2SO4干燥。将反应过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40∶1)纯化以产生标题产物12-(2-氧代乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(600mg，1.097mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ9.78(s，1H)，5.51～5.67(m，2H)，4.63(d，J＝6.7Hz，2H)，2.29～2.34(m，4H)，2.11(q，J＝7.1Hz，2H)，1.90～2.00(m，1H)，1.61～1.69(m，2H)，1.12～1.45(m，36H)，0.86-0.91(m，6H)。
步骤14：12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯的合成
在0℃向12-(2-氧代乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(450mg，0.968mmol)在DCE(10mL)溶液中的溶液中加入二甲胺盐酸盐(237mg，2.90mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(616mg，2.90mmol)，然后将混合物温热至30℃并进一步搅拌12h。将得到的混合物用冰水(20mL)淬灭并稀释，并将得到的混合物用DCM(30mL*2)萃取。将合并的有机层用盐水(50mL*2)洗涤，并将有机层经Na2SO4干燥。将反应混合物过滤并将滤液在真空中浓缩。将残余物通过制备型HPLC(YMC Actus ProC18；条件：等度40％至10％水(0.1％TFA)-ACN)纯化以提供脂质7的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质7
即12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯(300mg，0.607mmol)。
1H NMR(500MHz，氯仿-d)：δ＝5.51～5.67(m，2H)，4.63(d，J＝6.7Hz，2H)，2.98～3.02(m，2H)，2.82(d，J＝4.3Hz，6H)，2.31(t，J＝7.5Hz，2H)，2.11(q，J＝7.5Hz，2H)，1.60～1.70(m，4H)，1.12～1.45(m，37H)，0.85～0.92(m，6H)。MS(ESI)m/z：494.9[M+H]+。
实施例8：脂质8，(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯的合成
步骤1：10-(苄氧基)癸醛的合成
在圆底烧瓶中，在0℃向10-(苄氧基)癸烷-1-醇(10g，37.8mmol)在DCM(100mL)中的溶液中分批加入DMP(32.1g，76mmol)。将混合物在15℃搅拌1.5h。将反应用饱和NaHCO3水溶液(100mL)淬灭，并将得到的混合物用DCM(2*100mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝40：1)纯化以产生10-(苄氧基)癸醛(6.6g，25.2mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝9.76(s，1H)，7.27～7.40(m，5H)，4.50(s，2H)，3.46(t，J＝6.4Hz，2H)，2.41(dd，J＝5.6Hz，7.2Hz，2H)，1.58～1.64(m，4H)，1.29～1.35(m，10H)。
步骤2：1-(苄氧基)十九烷-10-醇的合成
在N2气球下在25℃向镁(14.52g，598mmol)在THF(650mL)中的溶液中缓慢地加入在THF(50mL)中的1-溴壬烷(61.9g，299mmol)。将反应混合物温热至40℃并搅拌2h。然后将反应混合物冷却至25℃。将溶液转移至另一个瓶子并加入在THF(50mL)中的10-(苄氧基)癸醛(39.2g，149mmol)。将反应混合物在20℃搅拌12h。将MeOH(250mL)加入混合物中，并将混合物在25℃搅拌10h。然后将反应通过加入1NHCl淬灭以将pH调至2～3。将得到的溶液用EtOAc(3*200mL)萃取，并将有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生1-(苄氧基)十九烷-10-醇(40g，97mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.29～7.40(m，5H)，4.53(s，2H)，3.55～3.70(m，1H)，3.49(t，J＝6.8Hz，2H)，1.61～1.67(m，2H)，1.26～1.45(m，32H)，0.90(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤3：((1-(苄氧基)十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷的合成
在20℃将三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷基酯(81g，307mmol)逐滴加入2，6-二甲基吡啶(65.8g，614mmol)和1-(苄氧基)十九烷-10-醇(40g，102mmol)在DCM(500mL)中的溶液中，然后将反应在20℃搅拌12h。然后将混合物用EtOAc(3*200mL)萃取，用盐水洗涤，并经Na2SO4干燥。将混合物过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚)纯化以产生((1-(苄氧基)-十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷(48g，90mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.29～7.40(m，5H)，4.50(s，2H)，3.57～3.70(m，1H)，3.46(t，J＝7.2Hz，2H)，1.59～1.64(m，2H)，1.26～1.40(m，32H)，0.87～0.89(m，12H)，0.05(s，6H)。
步骤4：10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十九烷-1-醇的合成
将((1-(苄氧基)十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷(47g，93mmol)、Pd/C(催化剂)和EtOAc(500mL)的混合物在H2气氛(50psi)下在50℃搅拌16h。然后将混合物在真空中浓缩以产生10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十九烷-1-醇(38g，87mmol)，将其不经进一步纯化直接用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝3.58～3.63(m，3H)，1.20～1.40(m，32H)，0.75～0.90(m，12H)，0.02(s，6H)。
步骤5：((1-溴十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷的合成
向10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)十九烷-1-醇(10g，24.11mmol)和三苯基膦(9.49g，36.2mmol)在DCM(150mL)中的溶液中加入1-溴吡咯烷-2，5-二酮(5.58g，31.3mmol)。将混合物在25℃搅拌1h。将反应混合物用DCM稀释，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚)纯化以产生((1-溴十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷(12g，23.87mmol)。
步骤6：四乙基叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-炔-10-基)氧基)二甲基甲硅烷的合成
在-60℃将正丁基锂(5.02mL，12.56mmol)逐滴加入1-甲氧基-4-((辛-7-炔-1-基氧基)甲基)苯(2.58g，10.47mmol)在THF(50mL)中的溶液中，然后使反应温热至-20℃保持30min。逐滴加入HMPA(10mL)，随后加入((1-溴十九烷-10-基)氧基)(叔丁基)二甲基甲硅烷(5g，10.47mmol)。将反应在0℃搅拌5h，然后温热至20℃保持另外14h。然后将反应用饱和NH4Cl水溶液淬灭，并萃取进EtOAc(3*100mL)中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝10：1)纯化以产生四乙基叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-炔-10-基)氧基)二甲基甲硅烷(3.9g，5.76mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.22(d，J＝6.8Hz，2H)，6.84(d，J＝6.8Hz，2H)，4.39(s，2H)，3.77(s，3H)，3.54～3.59(m，1H)，3.40(t，J＝6.4Hz，2H)，2.10(t，J＝6.0Hz，2H)，1.22～1.60(m，42H)，0.85(m，12H)，0.00(s，6H)。
步骤7：(Z)-叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-基)氧基)二甲基甲硅烷的合成
在圆底烧瓶中，在15℃向叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-炔-10-基)氧基)二甲基甲硅烷(1.8g，2.80mmol)在吡啶(50mL)中的溶液中加入Lindlar催化剂(180mg，0.085mmol)。将混合物在H2下搅拌10h。然后将反应过滤并浓缩以产生(Z)-叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-基)氧基)二甲基甲硅烷(1.8g，2.79mmol)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，6.88(d，J＝8.8Hz，2H)，5.36(s，2H)，4.44(s，2H)，3.81(s，3H)，3.58～3.65(m，1H)，3.44(t，J＝6.4Hz，2H)，2.00～2.02(m，4H)，1.20～1.40(m，40H)，0.87～0.89(m，12H)，0.04(s，6H)。
步骤8：(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-醇的合成
在圆底烧瓶中，在20℃向(Z)-叔丁基((27-((4-甲氧基苄基)-氧基)二十七碳-20-烯-10-基)氧基)二甲基甲硅烷(1.8g，2.79mmol)中加入TBAF(8.37mL，8.37mmol)。将混合物在50℃搅拌16h。将反应浓缩，将水(20mL)加入残余物中并将其用EtOAc(20mL*3)萃取，用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，石油醚：EtOAc＝20∶1至1∶1)纯化以产生(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-醇(1.3g，2.449mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，6.88(d，J＝8.8Hz，2H)，5.35(s，2H)，4.44(s，2H)，3.81(s，3H)，3.55～3.63(m，1H)，3.44(t，J＝6.4Hz，2H)，2.00～2.02(m，4H)，1.20～1.40(m，40H)，0.89(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤9：(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-酮的合成
在圆底烧瓶中，在0℃向(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-醇(1.3g，2.449mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入DMP(3.12g，7.35mmol)。将混合物在20℃搅拌2h。将反应过滤。将滤液用饱和NaHCO3水溶液(50mL)淬灭并将其再次过滤。然后将得到的混合物用DCM(20mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiQ2，石油醚：EtOAc＝80：1)纯化以产生(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-酮(1.1g，2.080mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，6.88(d，J＝8.8Hz，2H)，5.35(d，J＝5.2Hz，2H)，2.02(s，2H)，3.81(s，3H)，3.44(t，J＝6.8Hz，2H)，2.38(t，J＝7.2Hz，4H)，2.00～2.02(m，4H)，1.20～1.40(m，36H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤10：(2E，13Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-2，13-二烯酸乙酯的合成
在N2气球下在0℃向2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(4.66g，20.80mmol)在THF(11mL)中的溶液中缓慢地加入NaH(0.832g，20.80mmol)。将反应混合物在15℃搅拌0.5h。然后在0℃将(Z)-27-((4-甲氧基苄基)氧基)二十七碳-20-烯-10-酮(1.1g，2.080mmol)缓慢地加入反应混合物中。将反应混合物温热至55℃并搅拌12h。将反应用水(100mL)在0℃淬灭，并将得到的混合物用EtOAc(100mL*2)萃取。将合并的有机萃取物用水和盐水(100mL*2)洗涤，经无水Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩，并将残余物通过柱色谱法(SiO2，己烷：EtOAc＝50：1)纯化以产生(2E，13Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-2，13-二烯酸乙酯(1.1g，1.837mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.28(d，J＝8.8Hz，2H)，6.88(d，J＝8.8Hz，2H)，5.61(s，1H)，5.36(s，2H)，4.44(s，2H)，4.14(q，J＝6.8Hz，2H)，3.81(s，3H)，3.44(t，J＝6.4Hz，2H)，2.58(t，J＝8.0Hz，2H)，2.12(t，J＝8.0Hz，2H)，1.90～2.05(m，4H)，1.25～1.50(m，39H)，0.86～0.90(m，3H)。MS(ESI)m/z：621.5[M+Na]+。
步骤11：(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯酸甲酯的合成
将(2E，13Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-2，13-二烯酸乙酯(50mg，5mmol)、Mg(81mg，3.34mmol)和MeOH(5mL)的混合物温热至70℃。将反应混合物在70℃搅拌2h。将得到的混合物用水(20mL)淬灭，用DCM(10mL*3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩以产生(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯酸甲酯(44mg)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.27(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.33～5.38(m，2H)，4.23(s，2H)，3.80(s，3H)，3.67(s，3H)，3.42(t，J＝6.8Hz，2H)，2.22(d，J＝6.8Hz，2H)，2.00～2.10(m，4H)，1.25～1.40(m，43H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤12：(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-醇的合成
将(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯酸甲酯(2.8g，4.67mmol)、LAH(1.77g，46.75mmol)和THF(15mL)的混合物在0℃搅拌。然后将混合物在0℃搅拌2h。将得到的混合物用水(20mL)淬灭，用DCM(10mL*3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩以产生(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-醇(2.5g)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.26(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.30～5.35(m，2H)，4.43(s，2H)，3.80(s，3H)，3.66(d，J＝7.2Hz，2H)，3.43(t，J＝6.4Hz，2H)，1.90～2.00(m，5H)，1.19～1.52(m，43H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤13：甲磺酸(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-基酯的合成
将(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-醇(2.4g，4.1mmol)、MsCl(1.41g，12.31mmol)和Et3N(2.18g，21.55mmol)和THF(15mL)的混合物在0℃搅拌。然后将混合物在0℃搅拌2h。将得到的混合物用水(20mL)淬灭并在0℃搅拌2h。将得到的混合物用水(20mL)稀释，用DCM(20mL*3)萃取，用盐水(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，并过滤。将滤液在真空中浓缩以产生甲磺酸(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-基酯(2.6g)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝＝7.27(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.32～5.34(m，2H)，4.23(s，2H)，4.24(t，J＝6.4Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.43(t，J＝6.8Hz，2H)，3.00(s，3H)，2.00～2.10(m，4H)，1.25～1.40(m，42H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤14：(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-N，N-二甲基-3-壬基二十碳-13-烯-1-胺的合成
将甲磺酸(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-3-壬基二十碳-13-烯-1-基酯(2.4g，3.77mmol)和NHMe2(29.25g，20％在THF中，188.38mmol)的混合物在0℃搅拌。然后将混合物温热至30℃并搅拌20h。将得到的混合物在真空中浓缩以产生(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-N，N-二甲基-3-壬基二十碳-13-烯-1-胺(2.0g)，将其不经进一步纯化用在后续步骤中。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝7.25(d，J＝8.8Hz，2H)，6.87(d，J＝8.8Hz，2H)，5.34(s，2H)，4.43(s，2H)，3.80(s，3H)，3.42(t，J＝6.4Hz，2H)，2.23～2.28(m，8H)，1.80～2.10(m，5H)，1.20～1.40(m，42H)，0.87(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤15：(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯-1-醇的合成
将(Z)-20-((4-甲氧基苄基)氧基)-N，N-二甲基-3-壬基二十碳-13-烯-1-胺(1.9g，3.24mmol)、ACN(40mL)和水(5mL)的混合物在30℃搅拌。然后逐份加入CAN(5.4g，12.97mmol)。将混合物在30℃搅拌4h。将反应混合物用饱和NH4Cl淬灭并在真空中浓缩。将残余物通过柱色谱法(SiO2，EtOAc)纯化以产生(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯-1-醇(2.0g)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.26～5.31(m，2H)，3.56(t，J＝6.8Hz，2H)，2.17～2.20(m，8H)，1.80～2.00(m，4H)，1.15～1.30(m，43H)，0.81(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤16：(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯醛的合成
将(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯-1-醇(200mg，0.429mmol)、DMP(364mg，0.859mmol)和DCM(10mL)的混合物在30℃搅拌2h。然后将反应混合物过滤，在真空中浓缩，并用制备型TLC(DCM：MeOH＝10：1)纯化以产生(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯醛(200mg，0.345mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.26～5.39(m，2H)，2.42(t，J＝7.6Hz，2H)，2.20～2.30(m，10H)，1.80～2.10(m，6H)，1.15～1.30(m，37H)，0.88(t，J＝6.8Hz，3H)。
步骤17：(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯酸的合成
将(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯醛(1.5g，3.23mmol)溶解在丙酮(2mL)中并冷却至0℃。加入Jones试剂(50mg，0.500mmol)和水(0.4mL)，并逐滴加入硫酸(50mg，0.510mmol)。将反应温热至30℃并搅拌1h。将反应混合物直接通过制备型HPLC纯化以产生为澄清油的(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯酸(500mg，0.834mmol)。MS(ESI)m/z：480.5[M+H]+。
步骤18：(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯的合成
将(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯酸(500mg，1.042mmol)溶解在DCM(10mL)和MeOH(1.00mL)中。将(重氮基甲基)三甲基甲硅烷(2.61mL，5.21mmol)加入反应混合物中。将反应温热至30℃并搅拌16h。将反应混合物在真空中浓缩，并将得到的残余物直接通过制备型HPLC(酸)纯化以提供脂质8的单酯阳离子脂质，其具有如下所示的结构：
脂质8
即(Z)-18-(2-(二甲基氨基)乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯(388.70mg，0.787mmol)。
1H NMR(400MHz，氯仿-d)：δ＝5.26～5.39(m，2H)，3.65(s，3H)，3.12(t，J＝7.6Hz，2H)，2.88(s，6H)，2.31(t，J＝7.2Hz，2H)，1.95～2.10(m，5H)，1.58～1.67(m，4H)，1.30～1.40(m，36H)，0.90(t，J＝6.8Hz，3H)。MS(ESI)m/z：494.5[M+H]+。
实施例9：脂质纳米颗粒组合物的制备
如在下面详细描述的，制备表II的脂质纳米颗粒(LNP)组合物。
表II
*所有LNP组合物分别由58：30：10：2的摩尔比的阳离子脂质(如在表II中指出)加上胆固醇、DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和PEG-脂质(α-[8’-(1，2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-甲酰胺-3’，6’-二氧杂辛烷基]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)，也被称作PEG2000-DMG)组成。
制备脂质纳米颗粒组合物的方法
根据下述方法制备本发明的LNP组合物。首先，将脂质组分溶解在乙醇中以形成有机溶液。使用限定体积混合T-混合器，将脂质/乙醇溶液与溶解在柠檬酸钠缓冲的盐溶液(具有约2-6的pH)中的mRNA水溶液混合。
使用可编程的注射泵和总流速10mL/分钟至600L/分钟将有机溶液和水溶液递送至T-混合器的入口。将水溶液和有机溶液以约1：1至4：1体积：体积范围内的比率合并。脂质/乙醛(ethanal)和mRNA/水溶液的混合形成LNP。在连续线内混合过程中，将得到的LNP悬浮液用pH为约6-8的柠檬酸盐缓冲溶液稀释两次。对于第一次稀释，将LNP悬浮液与pH为约6-7.5的缓冲溶液混合，混合比在约1：1至1：3体积：体积范围内。将得到的LNP悬浮液进一步与pH为约6-8的缓冲溶液混合，混合比在1：1至1：3体积：体积范围内。
然后将LNP通过超滤工艺浓缩和过滤，其中除去醇并将缓冲液更换为最终的缓冲溶液。具有切向流过滤形式(“TFF”)的超滤工艺使用标称分子量截止值范围为30-500KD的中空纤维膜，目标为100KD。TFF将LNP保留在渗余物中，而滤液或渗透液含有醇和最终的缓冲液废物。TFF提供初始浓度至20-100mg/mL的脂质浓度。在浓缩后，将LNP悬浮液相对于pH7-8的最终缓冲液(10mM Tris、140mM NaCl，pH 7-8，或10mM Tris、70mM NaCl、5-10重量％蔗糖，pH 7-8)渗滤5-20个体积，以除去醇并进行缓冲液交换。然后通过超滤浓缩物质。
然后将浓缩的LNP悬浮液在无菌条件下无菌过滤到合适的容器中。通过使LNP悬浮液穿过预过滤器(Acropak 500PES 0.45/0.8μm胶囊)和生物负载减少过滤器(Acropak500PES 0.2/0.8μm胶囊)来完成无菌过滤。在过滤后，在-20℃储存装瓶的LNP产物。
实施例10：含有不同阳离子脂质组分的SEAP mRNA LNP组合物的体内评价
给雌性Balb/C(CRL)小鼠(6-8周龄；N＝10只小鼠/组)施用在LNP中配制的分泌型胎盘碱性磷酸酶(“SEAP”)mRNA(即，mRNA-LNP)的100μl肌肉内(IM，50μl/四头肌)注射液。使用如在上面表II中示出的LNP组合物，通过在实施例9中描述的方法制备mRNA-LNP。
如在表III中所示，组1-4对比了1.0μgSEAP mRNA剂量的LNP 9、LNP 10、LNP 11和LNP 13。
表III
组 SEAP mRNA(μg) LNP编号
1 1.0 9
2 1.0 10
3 1.0 11
4 1.0 13
给动物接种一次。在第1天，从每只动物抽血。使用用于SEAP(分泌型胎盘碱性磷酸酶)报道基因检测的Novabright Phospha-Light EXP测定试剂盒(N10578)(ThermoFisher)按照生产商的方案，测量SEAP活性的表达水平。
首先，将血清样品在56℃热灭活30分钟。然后将样品在PBS中1∶2稀释。在96孔平板中，一式两份添加12.5μl血清样品和12.5μl PBS。使用重组SEAP蛋白(InvivoGen)建立标准曲线。将原初小鼠血清在PBS中1：2稀释，并加入单独的96孔平板中。将SEAP蛋白加入第一个孔中，最终浓度为100μg/孔。然后将对照血清1：2稀释以获得15-点标准曲线。将25μl每种标准品加入测定板中。将50μl非胎盘碱性磷酸酶抑制剂的混合物(“组分A”)加入平板的每个孔中，并将平板在65℃温育5分钟。接下来，然后将50μl包含底物和Emerald-IIITM发光增强剂的组合物(“组分B”)加入每个孔中，并将平板在室温在暗处温育17分钟。使用Versa Max平板读数器读出发光。使用Graphpad Prism中的线性回归计算每个样品的血清SEAP浓度。
代表性的第1天血清SEAP滴度显示在图1中。如在图1中所示，对于LNP 9、LNP 10、LNP 11和LNP 13，SEAP表达是相当的，表明LNP的阳离子脂质组分中酯部分的添加不会对LNP 9、LNP 10、LNP 11或LNP 13的mRNA表达产生不利影响。
实施例11：含有不同阳离子组分的SEAP mRNA LNP组合物的体内评价
给雌性Balb/C(CRL)小鼠(6-8周龄；N＝10只小鼠/组)施用在LNP中配制的分泌型胎盘碱性磷酸酶(“SEAP”)mRNA(即，mRNA-LNP)的100μl肌肉内(IM，50μl/四头肌)注射液。使用如在上面表II中示出的LNP组合物，通过在实施例9中描述的方法制备mRNA-LNP。
如在表IV中所示，组1-4对比了1.0μg SEAP mRNA剂量的LNP 3、LNP 6、LNP 8和LNP12。
表IV
组 SEAP mRNA(μg) LNP编号
1 1.0 3
2 1.0 6
3 1.0 8
4 1.0 12
给动物接种一次。在第1天，从每只动物抽血。使用用于SEAP(分泌型胎盘碱性磷酸酶)报道基因检测的Novabright Phospha-Light EXP测定试剂盒(N10578)(ThermoFisher)按照生产商的方案，测量SEAP活性的表达水平。
首先，将血清样品在56℃热灭活30分钟。然后将样品在PBS中1：2稀释。在96孔平板中，一式两份添加12.5μl血清样品和12.5μl PBS。使用重组SEAP蛋白(InvivoGen)建立标准曲线。将原初小鼠血清在PBS中1：2稀释，并加入单独的96孔平板中。将SEAP蛋白加入第一个孔中，最终浓度为100μg/孔。然后将对照血清1：2稀释以获得15-点标准曲线。将25μl每种标准品加入测定板中。将50μl非胎盘碱性磷酸酶抑制剂的混合物(“组分A”)加入平板的每个孔中，并将平板在65℃温育5分钟。接下来，将50μl包含底物和Emerald-IIITM发光增强剂的组合物(“组分B”)加入每个孔中，并将平板在室温在暗处温育17分钟。使用VersaMax平板读数器读出发光。使用Graphpad Prism中的线性回归计算每个样品的血清SEAP浓度。
代表性的第1天血清SEAP滴度显示在图2A和2B中。如在图2B中所示，对于LNP 3、LNP 6和LNP 12，SEAP表达是相当的，但LNP 8的SEAP表达显著降低，这如图2A所示，表明与LNP 3、LNP 6和LNP 12相比，LNP的阳离子脂质组分中酯部分的添加确实影响了LNP组合物8的mRNA表达。
来自实施例10和11的数据证实，单独的酯基在LNP的阳离子脂质中的存在不能预测对mRNA表达的影响。相反，显然，一些修饰保留了表达(例如，利用LNP 3、LNP 6、LNP 9、LNP 10或LNP 13的阳离子脂质)，而其它修饰(诸如利用LNP 8的阳离子脂质)则使表达失效(negate)。
实施例12：作为mRNA LNP组合物的组分在施用部位处的阳离子脂质半衰期的体内评价
当通过肌肉内途径作为脂质纳米颗粒组合物的组分施用时，在动物中评价了阳离子脂质在施用部位处的终末消除半衰期(t1/2)。选择用于研究的纳米颗粒制剂如下表V所示。
给多达15只大鼠(大约9-10周龄；N＝1-3只大鼠/时间点组)施用在LNP中配制的RSV F mRNA(mRNA-LNP)的400μl肌肉内(IM，200μl/四头肌)注射液。通过在实施例9中描述的方法制备mRNA-LNP。在3-5个时间点(直到给药后504小时)中的每个时间点处死至少一只动物。从血液和组织(包括在注射部位周围的肌肉)收集终末样品。在血液离心后获得血浆样品。在由Tris缓冲液、蔗糖和非选择性蛋白酶抑制剂4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟组成的匀浆缓冲液存在下，将组织样品匀浆。在蛋白沉淀步骤和添加适当的内部标准品(拉贝洛尔、丙米嗪或双氯芬酸)以后，通过LC-MS/MS测定法确定血浆和组织样品中的阳离子脂质的浓度。通过确定阳离子脂质与内部标准品的峰面积比来进行定量。
使用非房室法获得药代动力学参数。使用线性梯形或线性/对数-线性梯形法则，从第一个时间点(0min)直到具有可测量的药物浓度的最后一个时间点计算在药物浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)。通过对数转换数据的未加权线性回归分析，确定终末消除半衰期(t1/2)。通过目视检查数据来选择确定半衰期的时间点。阳离子脂质的终末消除半衰期(t1/2)的值如下表V所示。
表V
所有LNP组合物分别由58：30：10：2的摩尔比的阳离子脂质(如在表V中示出)加上胆固醇、DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)和PEG-脂质(α-[8’-(1，2-二肉豆蔻酰基-3-丙氧基)-甲酰胺-3’，6’-二氧杂辛烷基]氨基甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)，也被称作PEG2000-DMG)组成。
如在表V中所示，当通过肌肉内途径作为脂质纳米颗粒组合物的组分施用时，阳离子脂质在施用部位处的终末消除半衰期(t1/2)对于含酯的阳离子脂质而言缩短。相对于不含酯的阳离子脂质(即，LNP 12和13)，含酯的阳离子脂质(即，LNP 3、6和9-11)从施用部位更快地消除。如数据所示，终末消除半衰期是脂质特异性的；值得注意的是，并非所有酯修饰的脂质都同样快速地被清除。
实施例13：mRNA脂质纳米颗粒组合物的耐受性的体内评价
将Crl：CD(SD)大鼠(在研究开始时大约9-11周龄)分配到至多10只雄性大鼠并且每只接受50μg/剂的在LNP中配制的RSV F mRNA(mRNA-LNP)(其在注射前在磷酸盐缓冲盐水中稀释)的组，或仅注射PBS的对照组。通过在实施例9中描述的方法制备mRNA-LNP。每只动物在左四头肌中接受0.20mL相应的mRNA-LNP试验物或PBS对照注射物，然后在右四头肌中接受0.20mL相同制剂，总日剂量为0.4mL。5只雄性/组被指定用于在研究第3天(SD 3)的最终尸检，和/或5只雄性/组被指定用于在研究第8天(SD 8)的回收处死。耐受性评估是基于计划外死亡、临床观察、体重、临床病理学评价(血清生物化学和特殊化学，以及有限的解剖病理学评价(左四头肌和上覆皮肤)。一般而言，将动物在异氟烷下麻醉以在剂量施用之前起作用，并且将注射部位用不能消除的墨水标记(单个点，在注射部位上方近端约4mm)。
LNP 13的特征在于如在图3A和3B中所示的组织病理学图。如在图3A中所示，在研究第3天观察到肌肉的轻度至中度急性炎症，并且特征在于肌纤维周围结缔组织中的粒细胞浸润、细胞碎片和水肿。如在图3B中所示，在研究第8天观察到在注射部位处肌肉的轻微慢性炎症，并且特征在于被单核炎症细胞包围的罕见退化肌细胞。
LNP 9的特征在于如在图4A和4B中所示的组织病理学图。如在图4A中所示，在研究第3天观察到中度急性炎症，并且包括水肿、粒细胞和巨噬细胞引起的在肌纤维、肌束和血管周围的结缔组织的扩张，在研究第8天观察到慢性炎症，并且特征在于被最少单核炎症细胞包围的肌纤维和肌束，如在图4B中所示。
LNP 10的特征在于如在图5A和5B中所示的组织病理学图。如在图5A中所示，在研究第3天观察到轻度急性炎症，并且特征在于分隔肌束和肌纤维的结缔组织内的肌纤维变性和炎症细胞，在研究第8天观察到轻微慢性炎症，并且特征在于在相邻肌纤维之间的偶见单核细胞浸润，如在图5B中所示。
LNP 3的特征在于如在图6A和6B中所示的组织病理学图。如在图6A中所示，在研究第3天观察到轻微炎症，包括在肌纤维、肌束和血管周围的结缔组织中的多灶性单核细胞浸润，并且炎症的严重程度和特征与在研究第3天、在研究第8天在四头肌中观察到的结果相似，如在图6B中所示。
LNP 6的特征在于如在图7A和7B中所示的组织病理学图。如在图7A中所示，在研究第3天观察到轻微急性炎症，并且特征在于粒细胞和单核细胞在结缔组织内和在单个肿胀的肌纤维周围的非常小的局灶性浸润，并且没有在研究第8天在肌肉中观察到炎症变化的证据，如在7B中所示。
对照组(仅PBS)的特征在于在图8A和8B中所示的组织病理学图。如在图8A中所示，正常肌细胞内衬一层脆弱的结缔组织，并且在研究第3天没有炎症证据。类似地，如在图8B中所示，在研究第8天没有炎症证据。
如表V以及图6A-B和7A-B中的数据所示，LNP 3和LNP 6指示LNP组合物相对于其它LNP组合物提供改善的耐受性。数据也指示，改善的耐受性是LNP 3和LNP 6所独有的，它们分别由10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯和11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯阳离子脂质组成，并且不可推广到由其它含酯脂质组成的LNP组合物。

Claims (32)

1.组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含
(a)具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
R5是C1-C12烷基；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
n是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
2.组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)具有在式E中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C1-C12烷基、X-R1-R2、R1-X-R2或不存在；
R4是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个X独立地是顺式-烯基、反式-烯基或不存在；
每个R1独立地是C1-C12烷基、C1-C12杂烷基或不存在；
每个R2独立地是C1-C12烷基、顺式-烯基、反式-烯基或不存在；且
n是0-12；
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
3.组合物，其包含：
多核苷酸；和
脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R1是C1-C12烷基；
R2是顺式-烯基；
R3是C1-C12烷基；
R4是C1-C12烷基；且
n是0-12，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
4.根据权利要求1-2中的任一项所述的组合物，其中每个X独立地是或顺式-烯基。
5.根据权利要求1-2或4中的任一项所述的组合物，其中每个R1独立地是C1-C5烷基。
6.根据权利要求1-2或4-5中的任一项所述的组合物，其中每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在。
7.根据权利要求1-2或4-6中的任一项所述的组合物，其中每个R3独立地是C1-C10烷基、R1-X1-R2或不存在。
8.根据权利要求1-2或4-7中的任一项所述的组合物，其中每个R4独立地是C1-C8烷基或不存在。
9.根据权利要求1或4-8中的任一项所述的组合物，其中每个R5独立地是C1-C2烷基或不存在。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的组合物，其中n是4、6、8、9或10。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的组合物，其中所述单酯阳离子脂质选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z,23Z)-二十九碳-20,23-二烯-10-基酯；
8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；
10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；
6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；
(14Z,17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；
12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；
(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
及其组合。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述单酯阳离子脂质以约55-65摩尔％的量存在。
13.组合物，其包含：
(i)脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯；
8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯；
10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯；
6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯；
(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯；
11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯；
12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯；
(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯；
及其组合，
(b)磷脂；
(c)胆固醇；和
(d)PEG-脂质；和
(ii)多核苷酸，
其中所述多核苷酸至少部分地包封在所述LNP中。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的组合物，其中与未用单酯阳离子脂质配制的组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的组合物，其中所述LNP包含30-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-30摩尔％磷脂、10-40摩尔％胆固醇和0.5-4摩尔％PEG-脂质。
16.根据权利要求1-15中的任一项所述的组合物，其中所述LNP包含55-65摩尔％单酯阳离子脂质、5-15摩尔％磷脂、25-35％胆固醇和1-2.5摩尔％PEG-脂质。
17.根据权利要求1-16中的任一项所述的组合物，其中所述磷脂是DSPC。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述DSPC以约5-15摩尔％的量存在。
19.根据权利要求1-18中的任一项所述的组合物，其中所述PEG-脂质是PEG2000-DMG。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述PEG2000-DMG以约5-15摩尔％的量存在。
21.组合物，其包含：
(a)缓冲液；和
(b)至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂；
胆固醇；
PEG-脂质；和
具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R3是C4-C10烷基、R1-X-R2或不存在；
R4是C5-C8烷基或不存在；
R5是C2烷基；
每个X独立地是或顺式-烯基；
每个R1独立地是C1-C5烷基或不存在；
每个R2独立地是C1烷基、顺式-烯基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中与未用具有在式D中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，所述组合物提供改善的耐受性。
23.组合物，其包含：
(a)缓冲液；和
(b)至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂；
胆固醇；
PEG-脂质；和
具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质：
其中，
R1是C1；
R2是顺式-烯基；
R3是C4-C10烷基；
R4是C5-C8烷基或不存在；且
n是4、6、8、9或10。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中与未用具有在式F中所示的结构的单酯阳离子脂质配制的组合物相比，所述组合物提供改善的耐受性。
25.组合物，其包含：
(a)缓冲液；和
(b)至少部分地包封在脂质纳米颗粒中的多核苷酸，其中所述脂质纳米颗粒包含：
磷脂；
胆固醇；
PEG-脂质；和
单酯阳离子脂质，其选自：
3-(二甲基氨基)-丙酸(20Z，23Z)-二十九碳-20，23-二烯-10-基酯、8-(2-(二甲基氨基)乙基)十七烷酸(Z)-十一碳-2-烯-1-基酯、10-(2-(二甲基氨基)乙基)十九烷酸(Z)-壬-2-烯-1-基酯、6-(2-(二甲基氨基)乙基)十五烷酸(Z)-十三碳-2-烯-1-基酯、(14Z，17Z)-4-(2-(二甲基氨基)乙基)二十三碳-14，17-二烯酸戊酯、11-(2-(二甲基氨基)乙基)二十烷酸(Z)-辛-2-烯-1-基酯、12-(2-(二甲基氨基)乙基)二十一烷酸(Z)-庚-2-烯-1-基酯和(Z)-18-(2-(二甲基氨基)-乙基)二十七碳-7-烯酸甲酯，
其中与未用所述单酯阳离子脂质配制的相同组合物相比，用所述单酯阳离子脂质配制的组合物提供改善的耐受性。
26.根据权利要求21-25中的任一项所述的组合物，其中所述组合物配制用于肌肉内施用。
27.根据权利要求21-26中的任一项所述的组合物，其中所述组合物是肌肉内疫苗，其在施用后提供小于100小时的终末消除半衰期。
28.根据权利要求21-27中的任一项所述的组合物，其中所述组合物是肌肉内疫苗，其在施用后提供小于10小时的终末消除半衰期。
29.根据权利要求21-28中的任一项所述的组合物，其中所述组合物是肌肉内疫苗，其在施用后提供4-10小时的终末消除半衰期。
30.根据权利要求21-29中的任一项所述的组合物，其中所述组合物是肌肉内疫苗，其在施用后提供5-8小时的终末消除半衰期。
31.根据权利要求21-30中的任一项所述的组合物，其中所述改善的耐受性是全身耐受性。
32.根据权利要求22-31所述的组合物，其中所述改善的耐受性是局部耐受性。
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