CN116685348A - 淋巴恶性肿瘤病状的双特异性抗体治疗 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于治疗有需要的受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括与CD47结合的Fab部分和与CD20结合的Fab部分。在一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)或原发性纵隔B细胞淋巴瘤。在某些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是NHL。

Description

淋巴恶性肿瘤病状的双特异性抗体治疗
技术领域
提供了治疗和控制淋巴恶性肿瘤病状的方法，所述方法采用不同的抗CD20/抗CD47双特异性抗体种类。所述方法还为当前抗癌疗法复发性或难治性患者或其中不存在用于所述病状的其它批准的常规疗法的患者提供了未满足的医疗需求。
相关申请的交叉引用
本申请有权根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年10月7日提交的美国临时申请第63/088,879号的优先权，所述美国临时申请特此通过引用整体并入。
序列表
本申请含有以ASCII格式经由EFS-Web提交的序列表并且所述序列表据此通过引用整体并入。创建于2021年9月27日的所述ASCII副本命名为298068-00369_Sequence_Listing.txt，并且大小为77,634字节。
背景技术
非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)是具有不同的生物学和临床表现的异质性淋巴恶性肿瘤组。约85％至90％的NHL源自B细胞并且所有NHL的约65％分为两种亚型，滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。非霍奇金氏淋巴瘤可以分为2个预后组：惰性淋巴瘤(缓慢生长，淋巴结肿大和消退数年)和侵袭性淋巴瘤(快速生长，如果不治疗，会在几周内死亡)。据估计，2020年美国(US)将有非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)新增病例77,240例和死亡病例19,940例(Siegel RL,Miller KD,Jemal A.癌症统计学(Cancer statistics),2020.《CA临床医师癌症杂志(CA Cancer J Clin.)》2020；70(1):7-30)。
最常见的侵袭性淋巴瘤是DLBCL，占所有NHL的30％至40％(Li S,Young KH,Medeiros LJ.弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma.)《病理学(Pathology.)》2018年1月；50(1):74-87)。其它侵袭性淋巴瘤包含但不限于高级B细胞淋巴瘤(HGBCL)、所谓的双重打击(DHL)或三重打击淋巴瘤(THL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)和3b级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。其它侵袭性淋巴瘤亚型的预后和疗法与DLBCL类似。
滤泡性淋巴瘤(FL)是最常见的惰性NHL亚型，占新诊断的NHL病例的大约22％。介入部位放射治疗仍然是疾病部位有限的早期FL患者的标准治疗。对于需要全身疗法的患者，利妥昔单抗(rituximab)与化学疗法联合通常被用作一线疗法。复发性或难治性FL患者没有标准治疗方法。替代的一线化学免疫疗法方案经常用作二线疗法，同时还有其它选择，如单一药剂利妥昔单抗、来那度胺(lenalidomide)组合利妥昔单抗或磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂。对含利妥昔单抗的方案无应答、复发性或对另外的疗法具有难治性的患者的治疗选择有限并且预后不良。新型药剂单独或与常规疗法组合使用显著改善了FL患者的临床结果。然而，尽管最近取得了这些进展，FL仍然是具有多次复发和对后续治疗应答较短的持续时间的不可治愈的疾病(Rivas-Delgado A,Magnano L,Moreno-Velazquez M等人利妥昔单抗治疗的滤泡性淋巴瘤患者每次复发后无进展生存期缩短(Progression-freesurvival shortens after each relapse in patients with follicular lymphomatreated in the rituximab era.)《血液肿瘤学(Hematological Oncology.)》2017；35(S2):360-361)。
例如，大约50％的新诊断的DLBCL患者可以通过一线R-CHOP免疫化学疗法(利妥昔单抗、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿霉素(doxorubicin)、长春新碱(vincristine)和强的松(prednisone))治愈。然而，大约一半接受R-CHOP治疗的患者会复发，大多数在疗法之后的前2年内(Coiffier B等人LNH-98.5试验中患者的长期结果，这是第一项比较DLBCL患者利妥昔单抗-CHOP与标准CHOP化学疗法的随机研究：成人淋巴瘤研究组的研究(Long-term outcome of patients in the LNH-98.5trial,the first randomized studycomparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCL patients:astudy by the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte.)《血液(Blood.)》2010年9月23日；116(12):2040-5；Vitolo U等人奥比妥珠单抗(Obinutuzumab)或利妥昔单抗加环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松治疗先前未治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤(Obinutuzumab or rituximab plus cyclophosphamide,doxorubicin,vincristine,andprednisone in previously untreated diffuse large B-cell lymphoma.)《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol.)》2017年11月1日；35(31):3529-37)。标准二线疗法是补救高剂量免疫化学疗法，随后是自体干细胞移植(ASCT)治疗复发性或难治性(R/R)DLBCL。然而，只有约一半的患者有资格接受ASCT，但是50％的患者在自体HSCT之后的3年内仍然会复发(Bachanova V,Perales MA,Abramson JS.复发性和难治性侵袭性B细胞淋巴瘤的现代管理：当前CAR T细胞疗法的治疗前景和患者选择的展望(Modern management of relapsedand refractory aggressive B-cell lymphoma:A perspective on the currenttreatment landscape and patient selection for CAR T-cell therapy.)《血液评论(Blood Rev.)》2020；40:100640)。另一半的R/R患者由于对补救疗法应答不充分或有医学共病而不符合移植资格。这些患者可以接受强度较低的二线疗法，但其目的通常是减缓性的并且没有针对该群体的单一方案。CD19靶向嵌合抗原受体CAR-T细胞疗法的最新进展使得KymriahTM(替沙仑赛(tisagenlecleucel))和(阿基仑赛(axicabtageneciloleucel))被批准用于治疗在≥2个既往疗法线之后由FL和PMBCL引起的R/R DLBCL、HGBCL、DLBCL。KymriahTM的JULIET研究和的ZUMA-1研究报告的CR比率分别为40％和58％(Locke FL,Ghobadi A,Jacobson CA等人阿基仑赛治疗难治性大B细胞淋巴瘤(ZUMA-1)的长期安全性和活性：单臂、多中心、1-2期试验(Long-term safety andactivity of axicabtagene ciloleucel in refractory large B-cell lymphoma(ZUMA-1):a single-arm,multicentre,phase 1-2trial.)《柳叶刀肿瘤学(Lancet Oncol.)》2019；20(1):31-42；Bachanova V,Westin J,Tam C等人替沙仑赛治疗复发性/难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的细胞因子释放综合征和神经系统事件的相关性分析(Correlativeanalyses of cytokine release syndrome and neurological events intisagenlecleucel-treated relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphomapatients.)《临床淋巴瘤(Clinical Lymphoma)》,Myeloma和Leukemia.2019；19:S251-252)。另外，Transcend-NHL-001研究评价利基迈仑赛(Lisocabtagene Maraleucel，liso-cel)在R/R大B细胞淋巴瘤中报告的CR比率为53％(Abramson JS等人Transcend NHL 001的关键安全性和有效性结果，这是一项关于利基迈仑赛(liso-cel)在复发性/难治性(R/R)大B细胞淋巴瘤中的多中心1期研究(Pivotal Safety and Efficacy Results fromTranscend NHL 001,a Multicenter Phase 1Study of Lisocabtagene Maraleucel(liso-cel)in Relapsed/Refractory(R/R)Large B Cell Lymphomas.)《血液》2019；134(Supplement_1):241)。尽管CAR-T细胞疗法取得了令人鼓舞的结果，但这些患者中大约有一半应答不佳并且仍然是未满足需求的群体。
发明内容
本文提供了一种用于治疗有需要的受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：
i)与CD47结合的Fab部分，所述Fab部分包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL包括：VL CDR1，所述VL CDR1包括氨基酸序列QASQDIHRYLS(SEQ ID NO:43)或RASQDIHRYLS(SEQ ID NO:49)；VL CDR2，所述VL CDR2包括氨基酸序列RESRFVD(SEQ ID NO:50)或RANRLVS(SEQ ID NO:56)；以及VL CDR3，所述VL CDR3包括氨基酸序列LQYDEFPYT(SEQID NO:51)，所述VH包括：VH CDR1，所述VH CDR1包括氨基酸序列DYYLH(SEQ ID NO:52)；VHCDR2，所述VH CDR2包括氨基酸序列WIDPDQGDTYYAQKFQG(SEQ ID NO:53)；以及VH CDR3，所述VH CDR3包括氨基酸序列AYGESSYPMDY(SEQ ID NO:54)；以及
ii)与CD20结合的Fab部分，所述Fab部分包括轻链可变区(VL)区和重链可变区(VH)区，所述VL包括：VL CDR1，所述VL CDR1包括氨基酸序列RASSSVSYIH(SEQ ID NO:37)；VL CDRs，所述VL CDRs包括氨基酸序列ATSNLAS(SEQ ID NO:38)；以及VL CDR3，所述VLCDR3包括氨基酸序列QQWTSNPPT(SEQ ID NO:39)，所述VH包括：VH CDR1，所述VH CDR1包括氨基酸序列SYNMH(SEQ ID NO:40)；VH CDR2，所述VH CDR2包括氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:41)；以及STYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:42)。
在特定实施例中，本文提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述与CD47结合的Fab部分包括：轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成；以及重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或由其组成。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性抗体包括：抗CD47轻链，所述抗CD47轻链包括SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成；以及抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD47重链，例如，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:22的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD47重链缺乏C末端赖氨酸。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性IgG1抗体包括：抗CD20轻链，例如，所述抗CD20轻链包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及抗CD20重链，所述抗CD20重链包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD20重链，例如，所述抗CD20重链包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD20重链缺乏C末端赖氨酸。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性抗体包括：抗CD47轻链，所述抗CD47轻链包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成；以及抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成。
本文进一步提供了一种用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD47重链，例如，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD47重链缺乏C末端赖氨酸。
在本文所提供的治疗方法的特定实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)或原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
在本文所提供的实施例中的任何实施例的一些实施例中，所述受试者患有复发性或难治性淋巴恶性肿瘤在另外的实施例中，所述淋巴恶性肿瘤在标准抗癌疗法中已经发展。在本文所提供的实施例中的任何实施例的又另外的实施例中，对于患有所述淋巴恶性肿瘤的所述受试者，不存在其它批准的常规疗法。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是NHL。在另外的实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是复发性或难治性NHL。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是滤泡性淋巴瘤。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是边缘区淋巴瘤。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。
在本文所提供的方法的一些实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
在本文所提供的治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法的一特定实施例中，所述淋巴恶性肿瘤是NHL，并且所述受试者在如由卢加诺标准(Lugano criteria)定义的通过CT或MRI进行的横截面成像上的至少一个结节病灶的最长径为>1.5cm或至少一个结外病灶的长径为>1.0cm。
在本文所提供的用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法的特定实施例中，所述受试者具有以下中的一者或多者：
a.在持续7天无生长因子支持(如果使用培非格司亭(pegfilgrastim)，则持续14天)的情况下绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.0×109/L；
b.在持续14天未输血的情况下血红蛋白(Hgb)≥8g/dL；
c.在持续7天未输血的情况下血小板(plt)≥75×109/L；
d.如果肝脏中存在肿瘤，则天冬氨酸氨基转移酶(AST/SGOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT/SGPT)≤2.5×正常值上限(ULN)或≤5.0×ULN；
e.血清胆红素≤1.5×ULN；
f.使用Cockcroft-Gault等式估算的血清肌酐清除率或使用24小时尿液收集测量的肌酐清除率≥45毫升/分钟；和/或
g.国际归一化比率(INR)<1.5×ULN并且部分凝血活酶时间(PTT)<1.5×ULN。
在本文所提供的用于治疗受试者的淋巴恶性肿瘤的方法的其它特定实施例中，所述受试者：
a.不患有伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)或淋巴母细胞淋巴瘤；
b.不患有包含里克特转化(Richter's transformation)的慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；
c.不患有涉及症状性中枢神经系统(CNS)的癌症；
d.在14天的所述施用内未接受慢性全身性免疫抑制疗法或超过140mg总剂量的皮质类固醇；
e.不具有临床上显著的移植物抗宿主病(GVHD)；
f.在过去6个月内不具有III级或IV级充血性心力衰竭(CHF)或严重非缺血性心肌病、不稳定型心绞痛、心肌梗塞或室性心律失常的病史；
g.通过在30天的所述施用内进行的超声心动图(ECHO)或多摄取门控采集(MUGA)扫描进行评估，不具有被定义为左心室射血分数(LVEF)<45％的心脏功能不足；
h.未接受针对CD47或SIRPα的既往研究疗法；
i.在所述施用之前≤4周未接受CAR-T疗法治疗；
j.在所述施用之前≤5个半衰期或4周(以较短者为准)未进行既往系统性癌症导向治疗或研究模式；
k.在TPP-1360开始之前≤2周未进行大手术，并且其中所述受试者已经从任何近期手术的任何临床上显著的影响中恢复；
l.在所述施用之前≤3个月未进行自体干细胞移植；
m.在所述施用之前≤6个月未进行在标准或降低强度调节的情况下的同种异体干细胞移植；
n.未诊断出原发性免疫缺陷疾病；
o.未诊断出活动性人免疫缺陷病毒(HIV)感染；除非所述受试者在所述施用之前12个月内已经很好地控制HIV，CD4+T细胞(CD4+)计数≥350个细胞/uL并且不具有机会性感染；
p.不具有活动性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染；
q.未接受慢性、治疗性抗凝剂给药的持续治疗；
r.不具有自身免疫性溶血性贫血或自身免疫性血小板减少症的病史；
s.不具有需要积极、持续的全身治疗的并发第二癌症的病史；和/或
t.在所述施用之前至少4周内未接种活病毒疫苗。
附图说明
图1是本文所描述的双特异性实体的某些属性的示意图，所述双特异性实体被工程化以克服普遍存在的CD47表达的挑战，所述挑战包含对CD47无亲合性的低亲和力结合；与正常细胞的最小结合，即无组织下沉(即，在不存在CD20的情况下，双特异性抗体与正常CD47表达细胞没有假结合)；与CD20的高亲和力选择性亲合性结合，导致与肿瘤细胞的选择性结合。TAA：肿瘤相关抗原。
图2展示了示例双特异性实体架构、蛋白质工程特征和若干个生物药理学属性。
图3A-3C示出了本文所描述的示例物种双特异性实体诱导CD20+CD47+OCI-Ly3NHL细胞的巨噬细胞介导的吞噬作用。图3A-3B是示出了根据抗体浓度的吞噬巨噬细胞的百分比的图。图3C是示出了本文所描述的双特异性物种的KD和EC50值的表。
图4A-4C示出了本文所描述的示例双特异性实体CD47xCD20 IgG1物种证明CDC功能。图4A-4B是示出了根据抗体浓度的CDC的图。图4C是示出了TPP-1360、TPP-1362和利妥昔单抗的平均EC50值的表。
图5A-5C示出了本文所描述的示例双特异性实体CD47xCD20 IgG1物种在CD20高NHL细胞中证明有效的ADCC功能，即，显著高于利妥昔单抗。图5A-5B是示出了根据抗体浓度的细胞毒性的图。图5C是示出了CD20/CD47比率的表。
图6展示了本文所描述的双特异性实体的示例架构以及某些实例的特征。
图7示出了本文所描述的示例物种双特异性实体TPP-1360，其基本上将结合信号转移到B细胞并且相当弱地转移到T细胞、单核细胞和NK细胞，与和TPP-23(408_437Fab(VL：SEQ ID NO:71；VH：SEQ ID NO:72)与IgG1)的结合相比，与血小板或红细胞进行最小程度的结合或不与其结合，由此说明与人全血中的B细胞的选择性结合。
图8展示了本文所描述的示例物种双特异性实体TPP-1360被证明与CD47+/CD20+Raji细胞选择性结合，但不与CD47+/CD20-人红细胞(RBC)结合。
图9示出了在Raji细胞和人RBC的共培养物中，本文所描述的示例物种双特异性实体TPP-1360表现出与CD47+/CD20+Raji细胞的剂量依赖性结合，但不与人RBC结合，即使浓度高达1mg/mL。
图10展示了例如TPP-1360有效并完全阻断重组人SIRPα-Fc与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系OCI-Ly3的表面上表达的人CD47的结合。
图11展示了例如TPP-1360有效并完全阻断重组人SIRPα-Fc与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系Raji的表面上表达的人CD47的结合。
图12展示了例如用TPP-1360治疗诱导CD20+恶性B细胞系Raji的巨噬细胞介导的吞噬作用。
图13展示了例如用TPP-1360治疗诱导CD20+恶性B细胞系OCI-Ly3的巨噬细胞介导的吞噬作用。
图14展示了例如用TPP-1360治疗诱导CD20+恶性B细胞系REC-1的巨噬细胞介导的吞噬作用。
图15展示了例如用TPP-1360治疗诱导CD20+恶性B细胞系RIVA的巨噬细胞介导的吞噬作用。
图16示出了例如在Raji和OCI-Ly3细胞中，用TPP-1360治疗触发了比利妥昔单抗显著更有效的吞噬作用，这可能是由于TPP-1360同时阻断了SIRPα-CD47相互作用和如FcγR等激活受体的参与。
图17示出了例如通过表面等离子共振(SPR)测量的利妥昔单抗和如TPP-1360等双特异性抗体与Raji细胞(CD20+/CD47+)的结合。
图18展示了例如TPP-1360和TPP-1362有效并完全阻断重组人SIRPα与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系OCI-Ly3的表面上表达的人CD47的结合。发现利妥昔单抗对SIRPα结合没有影响。
图19是本文所描述的双特异性实体的作用模式的示意图。
图20示出了在CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系OCI-Ly3中的TPP-1360单一药剂吞噬诱导活性与利妥昔单抗与抗CD47 IgG4PE组合的活性相当。CD＝分化簇；IgG＝免疫球蛋白G1；IgG4PE＝免疫球蛋白G4，在位置228处具有丝氨酸到脯氨酸的取代并且在位置235处具有亮氨酸到谷氨酸的取代；RSV＝呼吸道合胞病毒；TPP-23＝对CD47具有非减弱亲和力的二价抗体；TPP-356＝对CD47具有非减弱亲和力的抗CD47 IgG4PE抗体。
具体实施方式
除非另外规定，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。本文提及的所有公开和专利均通过引用并入。
分化簇(CD47)在NHL细胞中过度表达并且在多种NHL亚型中显示出与更差的预后相关。抑制性CD47-SIRPα配体-受体对在巨噬细胞的稳态清除中被鉴定为重要的但非普遍的先天免疫检查点调节因子。当淋巴细胞上的CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合时，这触发了巨噬细胞的‘不要吃我’(‘don't eat me’)信号，阻止了其强大的吞噬能力。
巨噬细胞表达与CD47相互作用的SIRPα，所述CD47是普遍表达的蛋白，所述蛋白介导具有抑制吞噬作用的功能的‘不要吃我’信号。癌细胞已经进化到通过上调其细胞表面上的CD47的表达来劫持这种相互作用，因此平衡前吞噬细胞信号并增加逃避先天免疫监视的机会。
如本文所使用的，冠词“一个/一种(a/an)”可以指冠词的一个或多于一个(例如，至少一个)语法对象。
如本文所使用的，“约”通常可以指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例误差程度在给定值或值的范围的5％内。
本文所描述为“包括”一个或多个特征的实施例也可以被认为是“由此类特征组成”和/或“基本上由此类特征组成”的对应的实施例的公开。
如本文所使用的术语“淋巴恶性肿瘤”是指在不同分化阶段由恶性CD20+淋巴细胞表现的病理病状，包含但不限于非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、复发性或难治性(R/R)非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、复发性或难治性(R/R)DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)、高级B细胞淋巴瘤(HGBCL)、双重打击(DHL)或三重打击淋巴瘤(THL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、3b级滤泡性淋巴瘤(FL3B)；以及由FL或PMBCL产生的R/R DLBCL、HGBCL和DLBCL。
开发了例如本文所描述的双特异性抗CD47/抗CD20异二聚体IgG1实体作为CD20+B细胞淋巴瘤患者的静脉内(IV)可注射治疗，并且具体地对当前疗法难治和/或耐受的病状。
如本文所使用的术语“肿瘤”和“肿瘤细胞”广义上是指表现为淋巴恶性肿瘤的经历异常增殖的CD20+癌细胞。
浓度、量、体积、百分比和其它数值在本文中可以以范围格式呈现。还应当理解，此类范围格式仅为了方便和简洁而使用的，并且应当灵活地解释为不仅包含明确叙述为范围的界限的数值，而且还包含涵盖所述范围内的所有单独数值或子范围，如同每个数值和子范围被明确叙述一样。
本文所提供的抗体的氨基酸序列中的微小变化被认为涵盖在本公开内容中，前提是氨基酸序列中的变化与本文所提供的抗体或其抗原结合片段的序列维持至少75％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％或99％的序列同源性或同一性。
本文所提供的抗体可以包含变体，其中来自一个物种的氨基酸残基在保守或非保守位置处被另一个物种的对应的残基取代。在一个实施例中，在非保守位置处的氨基酸残基被保守或非保守残基取代。具体地，设想了保守氨基酸替代。
如本文所使用的，“保守氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，所述侧链包含基本侧链(例如，赖氨酸、精氨酸或组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸或谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸或半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸)、β支化侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或组氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被来自相同侧链家族的另一个氨基酸替代，则氨基酸取代被认为是保守的。本文所提供的抗体中包含经保守修饰的变体并不排除其它形式的变体，例如多态性变体、种间同源物和等位基因。
如本文所使用的，“非保守氨基酸取代”包含这些取代：(i)具有电正性侧链的残基(例如，精氨酸、组氨酸或赖氨酸)取代电负性残基(例如，谷氨酸或天冬氨酸)或被其取代；(ii)亲水性残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)取代疏水性残基(例如，丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸)或被其取代；(iii)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基或被其取代；或(iv)具有大体积疏水性或芳香族侧链的残基(例如，缬氨酸、组氨酸、异亮氨酸或色氨酸)取代具有较小侧链的残基(例如，丙氨酸或丝氨酸)或没有侧链的残基(例如，甘氨酸)或被其取代。
如本文所使用的术语“抗体(antibody/antibodies)”是指常规同种型和单特异性格式以及多价抗体，包含但不限于本领域已知的现有双特异性实体形式以及双特异性抗体，包含但不限于本文以其它方式描述的格式。
典型的抗体包括至少两条“轻链”(LC)和两条“重链”(HC)。此类抗体的轻链和重链是由若干个结构域组成的多肽。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为“VH”)和重链恒定区(在本文中缩写为“CH”)。重链恒定区包括重链恒定结构域CH1、CH2和CH3(抗体类别IgA、IgD和IgG)以及任选地重链恒定结构域CH4(抗体类别IgE和IgM)。每条轻链包括轻链可变结构域(在本文中缩写为“VL”)和轻链恒定结构域(在本文中缩写为“CL”)。可变区VH和VL可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的“恒定结构域”不直接涉及抗体与靶标的结合，但是表现出各种效应子功能。
抗体与其靶抗原或表位之间的结合由互补决定区(CDR)介导。CDR是位于抗体重链和轻链的可变区内的高序列可变性的区，其在所述可变区中形成抗原结合位点。CDR是抗原特异性的主要决定因素。通常，抗体重链和轻链各自包括非连续排列的三个CDR。抗体重链和轻链CDR3区在本文所提供的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供了本公开的另外的方面。
因此，如本文所使用的术语“抗原结合片段”包含抗原结合多肽的任何天然存在或人工构建的构型，其包括一个、两个或三个轻链CDR和/或一个、两个或三个重链CDR，其中所述多肽能够与抗原结合。
CDR的序列可以通过参考本领域已知的任何数字系统来鉴定，例如卡巴特系统(Kabat,E.A.等人,《免疫学关注的蛋白序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达的国立卫生研究院美国公共卫生局(Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD)(1991)；Chothia系统(Chothia和Lesk,“免疫球蛋白的高变区的规范结构(Canonical Structures for theHypervariable Regions of Immunoglobulins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196,901-917(1987))；或IMGT系统(Lefranc等人,“IMGT免疫球蛋白和细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的唯一编号(IMGT Unique Numbering for Immunoglobulin and CellReceptor Variable Domains and Ig superfamily V-like domains)”,《发展竞争免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27,55-77(2003))。根据KABAT，本文所示的CDR采用边界，即大小。本文所描述和所提及的抗体恒定区的位置编号通常根据KABAT。然而，本文所描述的抗CD47VL和VH区的编号，即抗体残基位置和取代位置从每个可变区的N末端残基开始，即VL或VH，具体地分别参考SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
“本文所描述的双特异性实体”通常是指本文所描述的功能性定义的抗体、双特异性基本格式、基本序列、抗体和抗体物种。
本文所描述的双特异性实体选择性且安全地靶向CD20+淋巴恶性肿瘤肿瘤细胞，而基本上不与外周组织、RBC和血小板中的CD47结合。
如本文所使用的术语双特异性IgG1抗体是指抗CD47/抗CD20 IgG1 1+1异二聚体双特异性抗体。
IgG1格式
如本文所使用的IgG1根本上是指全IgG1抗体，所述全IgG1抗体由(i)一侧的一条重链(HC)和一条轻链(LC)；以及(ii)另一侧的一条重链(HC)和一条轻链(LC)构成。
IgG1 1+1异二聚体格式
如本文所使用的IgG1或IgG1 1+1异二聚体格式根本上是指全IgG1抗体，所述全IgG1抗体由(i)来自一个来源，即抗CD47的一侧的一条重链(HC)和一条轻链(LC)；以及(ii)来自另一个来源，例如抗CD20的另一侧的一条重链(HC)和一条轻链(LC)构成。参见例如图2和图6。
旨在用于本公开的方法的双特异性抗体根本上是天然人IgG1抗体，所述天然人IgG1抗体由(A)一个抗CD47 IgG1(单体)部分和(B)一个抗CD20 IgG1(单体)部分构成，所述一个抗CD47 IgG1部分含有一条完整轻链(LC)和一条完整重链(HC)，所述一个抗CD20 IgG1部分含有一条完整轻链(LC)和一条完整重链(HC)。这两种单体形成常规的二聚IgG1抗体，其中一条臂(Fab1)提供CD47的减弱的结合，而另一条臂(Fab2)提供对CD20的亲和力结合和亲合性。图2和图6展示了本文所描述的CD47x CD20示例架构和示例蛋白质工程特征。
如本文所使用的术语“Fab部分”是指抗体的抗原结合片段，即与抗原结合的抗体的区。如本文所使用的，其包括轻链和重链中的各一个(VL/VH)的一个可变结构域。
将CC-90002作为参考亲本序列和抗CD47元件的来源提供，用于构建本文所描述的双特异性实体中的一些双特异性实体。CC-90002VL CDR是SEQ ID NO:31(CDRL1)、SEQ IDNO:32(CDRL2)和SEQ ID NO:33(CDRL3)。CC-90002VH CDR是SEQ ID NO:34(CDRH1)、SEQ IDNO:35(CDRH2)和SEQ ID NO:36(CDRH3)。还提供了CC-90002VL(SEQ ID NO:9)和VH(SEQ IDNO:10)用于参考。将CC-90002VL与天然IgG1 LC恒定区融合以形成全LC用于参考，将所述全LC作为CC-90002全LC/IgG1(SEQ ID NO:11)提供。将CC-90002VH与天然IgG1 HC恒定区融合以形成全HC用于参考，将所述全HC作为CC-90002全HC/IgG1(SEQ ID NO:12)提供。参见美国专利第9,045,541号。
本公开的抗体包括源自CC-90002的VL和VH氨基酸序列，即分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，其中对CD47的结合亲和力显著减弱，即与CD47结合的Fab部分表现出低亲和力。CC-90002的VH和VL区两者被工程化成降低免疫原性，同时保留用于本文所描述的双特异性实体的功能。对CC-90002的VH和VL区两者采用蛋白质工程以降低免疫原性，同时保留功能性；并且具体地对CD47的亲和力失调。
抗CD47表位通过以分辨率解决与人CD47细胞外结构域复合的非失调亲本版本的CC-90002(TPP-23(408_437Fab(VL：SEQ ID NO:71；VH：SEQ ID NO:72)与IgG1))的晶体结构来确定。参见实例3。
本文所提供的双特异性抗体通常分别包括利妥昔单抗VL CDR：SEQ ID NO:37(CDRL1)、SEQ ID NO:38(CDRL2)和SEQ ID NO:39(CDRL3)；以及利妥昔单抗VH CDR：SEQ IDNO:40(CDRH1)、SEQ ID NO:41(CDRH2)和SEQ ID NO:42(CDRH3)。本文所提供的双特异性抗体通常分别包括利妥昔单抗VL(SEQ ID NO:323)和利妥昔单抗VH(SEQ ID NO:324)。抗CD20LC(SEQ ID NO:15)优选用于构建本公开的双特异性实体。抗CD20 HC(SEQ ID NO:16)优选用于构建本公开的双特异性实体。
CD47xCD20双特异性程序被启动以鉴定治疗性抗体，所述治疗性抗体能够阻断人CD47与仅在表达CD20的淋巴恶性肿瘤细胞上的SIRPα结合。由本文所提供的项目产生的三(3)种有效双特异性IgG1抗体以高亲和力与CD20结合，同时表现出对CD47的失调亲和力。
将可变重(VH)结构域与人IgG1恒定结构域融合并且将可变轻(VL)结构域与人κ恒定结构域融合。IgG1恒定结构域和κ恒定结构域包含氨基酸取代以确保期望的异二聚体轻链(LC)和重链(HC)配对以及异二聚体片段可结晶(Fc)配对。
TPP-1360，例如，共靶向CD47和CD20的免疫球蛋白G1(IgG1)双特异性抗体被设计成以高亲和力与CD20结合并以最佳降低的(失调的)亲和力与CD47结合。通过Celgene的抗CD47单克隆抗体CC-90002的衍生化获得的失调的抗CD47臂与来自利妥昔单抗的抗CD20臂配对以形成IgG1双特异性。
当与表达CD20的细胞结合时，TPP-1360也与CD47结合以阻断巨噬细胞检查点抑制剂SIRPα，同时激活巨噬细胞表达的FcγR以加强其对CD20阳性细胞的吞噬和破坏。另外地，除了吞噬作用之外，TPP-1360的抗肿瘤活性还包含通过ADCC和CDC机制参与激活髓样细胞和NK细胞上的FcR以消除肿瘤细胞。
在特定实施例中，命名为TPP-1360、TPP-1361和TPP-1367的本文所提供的CD47xCD20双特异性包括如下重链和轻链序列：TPP-1360包括(CD47 LC SEQ ID NO:19；HCSEQ ID NO:20)X(CD20 LC SEQ ID NO:15；HC SEQ ID NO:16)。TPP-1361包括(CD47 LC SEQID NO:17；HC SEQ ID NO:18)X(CD20 LC SEQ ID NO:15；HC SEQ ID NO:16)。TPP-1367包括(CD47 LC SEQ ID NO:21；HC SEQ ID NO:22)X(CD20 LC SEQ ID NO:15；HC SEQ ID NO:16)。
这些双特异性抗体表现出对CD20的高亲和力和对CD47的失调的亲和力，示出了有效的CD47阻断、食蟹猴交叉反应性、良好的物理化学性质(溶解性、稳定性、表达)和低免疫原性预测(EpiVax)。参见实例15。IgG1异二聚体格式和Fc使用标准CHO工艺以足够的量和纯度提供可靠的产生，具有相适当的滴度、产量、产物质量和液体调配物。这些物种表现出优于CC-90002的CD20+肿瘤细胞的体外吞噬作用能力和比利妥昔单抗更有效的ADCC。这些物种还表现出外周血和淋巴组织中的食蟹猴B细胞显著减少。这些高度评价的物种也表现出最小下沉效应，不与CD20-CD47+健康细胞(RBC和血小板)结合。重要的是，这些物种表现出可接受的PK参数以支持本文所描述的给药。
例如，TPP-1360的RBC结合能力在纯化的人RBC和人RBC与肿瘤细胞的共培养物中被广泛评价。如图8所展示的，TPP-1360被证明与CD47+/CD20+Raji细胞选择性结合，但不与CD47+/CD20-人RBC结合。此外，在Raji细胞和人RBC的共培养物中，TPP-1360表现出与CD47+/CD20+Raji细胞的剂量依赖性结合，但不与人RBC结合，即使浓度高达1mg/mL。参见图9。相反，CD47野生型/CD20双特异性TPP-2与Raji细胞和人RBC两者显著结合。另外，TPP-1360不示出与来自多个供体的纯化的食蟹猴RBC的结合。
例如，本公开的TPP-1360物种双特异性实体是共靶向CD47和CD20的第一类抗体，其被设计成以高亲和力与CD20结合并以最佳失调的亲和力与CD47结合。例如，当与表达CD20的细胞结合时，TPP-1360不仅阻断巨噬细胞检查点抑制剂SIRPα与CD47的相互作用，而且还激活FcγR以充分增强巨噬细胞吞噬和破坏CD20阳性细胞。例如，TPP-1360通过多种作用模式，包含吞噬作用、ADCC和CDC诱导有效的体外活性，以消除与本文所描述的淋巴恶性肿瘤病状相关的肿瘤细胞。本文所描述的双特异性实体的实例TPP-1360提供了优于利妥昔单抗和CC-90002的增强的药理学活性。
IgG1双特异性分子TPP-1360被设计成以高亲和力与CD20结合并以最佳失调的亲和力与CD47结合。TPP-1360证明与CD20+CD47+细胞的选择性结合。当与表达CD20和CD47的细胞结合时，TPP-1360不仅阻断巨噬细胞检查点抑制剂SIRPα与CD47的相互作用，而且还通过WT IgG1激活FcγR以充分增强吞噬和破坏CD20阳性细胞的巨噬细胞效应子功能。总体而言，TPP-1360通过多种作用模式，包含吞噬作用、ADCC和补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导有效的体外活性以消除癌细胞(图22)。
TPP-1361也是共靶向CD47和CD20的IgG1双特异性抗体，其被设计成以高亲和力与CD20结合并以最佳失调的亲和力与CD47结合。此外，TPP-1367也是共靶向CD47和CD20的IgG1双特异性抗体，其被设计成以高亲和力与CD20结合并以最佳失调的亲和力与CD47结合。参见图3A-3C进一步讨论的。
一旦与肿瘤细胞上的CD20结合，本文所描述的抗CD47/抗CD20双特异性IgG1异二聚体抗体物种有效地阻断CD47-SIRPα相互作用，并通过IgG1 Fc共同激活效应细胞上的受体FcγR，从而激活巨噬细胞介导的吞噬作用和自然杀伤(NK)细胞介导的针对肿瘤细胞的细胞毒性。本文所描述的双特异性物种与表达CD20的肿瘤细胞上的CD47选择性结合并且基本上不与正常细胞中的CD47结合。例如，在本文所描述的双特异性物种的共培养结合测定中，与Raji(CD47+CD20+)结合的比率是与人RBC结合的比率的约6,000倍。例如，对于本文所描述的双特异性实体，与人B细胞(CD47+CD20+)结合的比率是与人RBC结合的比率约700倍。根据肿瘤细胞和正常细胞上的CD20和CD47的表达水平，本文所描述的双特异性实体的选择水平表现出范围为约400至约8,000倍的选择。因此，假设CD47表达水平是固定的，随着CD20水平增加，本文所描述的双特异性实体表现出增加的选择性和效力。
用效应抗原CD47的细胞外结构域进行的体外亲和力测量最初揭示，对本文所描述的双特异性IgG1异二聚体抗体物种的亲和力降低100-200倍。CD47的细胞外结构域的体外亲和力测量揭示，所例示的物种的亲和力降低100-500倍。使用这些失调的IgG1 1+1异二聚体双特异性进行的基于体内和体外细胞的研究证实，相对于单特异性抗体，基于效应细胞的细胞杀伤和与非靶细胞类型的结合减少。
本文所描述的双特异性物种证明与表达CD20的细胞的选择性结合，例如，其中CD47与巨噬细胞检查点抑制剂、信号调节蛋白α(SIRPα)的相互作用被阻断。与单特异性抗CD47方法相比，这种增加的选择性允许使用IgG1 Fc，其与激活片段可结晶γ受体(FcγR)结合以充分增强巨噬细胞吞噬和破坏CD20阳性细胞。例如，与抗CD20抗体利妥昔单抗相比，本文所描述和所例示的抗CD47/抗CD20双特异性抗体在诱导吞噬作用和ADCC方面更有效。
体外基于细胞的研究证明，本文所描述的失调的CD47双特异性实体激活抗体依赖性细胞吞噬作用、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)。参见图4A-4C和图5A-5C。此外，食蟹猴(cyno)药代谢动力学(PK)和探索性毒性(E-tox)研究实验证明，相对于亲本单特异性抗CD47抗体，失调的CD47双特异性有效地耗竭B细胞并降低与食蟹猴红细胞(RBC)的结合，由此基本上证实了本文所描述和要求保护的靶细胞选择性策略的成功和医学价值。本文所例示的物种证明CD20+B细胞的良好药代动力学和耗竭对在非人灵长类动物多次施用之后的血液学参数的有害影响最小。
结构分析证明TPP-1360与CD47的区结合，所述区先前被鉴定为由SIRPα识别。重组SIRPα与细胞表面上的人CD47之间的相互作用被纳摩尔范围内的TPP-1360 50％抑制浓度(IC50)值阻断。参见实例6。TPP-1360在与肿瘤细胞和人单核细胞源性巨噬细胞的共培养测定中被评价为单一药剂。TPP-1360能够在体外对一组NHL细胞系进行抗体介导的吞噬作用。参见实例6和12。对于所有测试的细胞系，该组的最大吞噬指数的范围为大约28％至86％。抗体浓度-应答研究指示，TPP-1360效应在淋巴瘤细胞系中是浓度依赖性的，其EC50值在亚纳摩尔范围内。
TPP-1360的Fc部分的表征包含Fcγ受体(FcγR)结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和细胞因子释放测定(CRA)。TPP-1360根据亚型以从低到高的亲和力与FcγR结合。TPP-1360在采用人NK细胞和一组NHL细胞系的细胞共培养测定中表现出ADCC。另外地，以CD47+CD20+DLBCL作为靶细胞观察到CDC。浓度为至多200nM的TPP-1360以板结合的格式诱导多个人供体PBMC释放最少细胞因子，类似于利妥昔单抗或同种型对照抗体。
TPP-1360证明与人和食蟹猴B细胞的高水平结合和与NK细胞的低水平结合。参见实例11。在人全血和外周血单核细胞(PBMC)两者中，由TPP-1360识别的主要免疫亚群是CD19+CD14-B细胞。在人全血中，TPP-1360能够以浓度依赖性方式耗竭B细胞，其中IC50值以次纳摩尔为单位。浓度为至多1333.3nM的TPP-1360不与人或食蟹猴的红细胞(RBC)结合。与其对人CD47的亲和力降低且不与红细胞结合一致，TPP-1360在浓度为至多1333.3nM下不诱导人红细胞的血凝。
使用表面等离子共振进行研究以评价TPP-1360与CD47的结合。参见实例4。TPP-1360证明最近计算的人CD47的细胞外结构域的示例数据平衡常数(KD)值为2.32±0.11μM，食蟹猴CD47的示例数据平衡常数值为23μM±0.14，并且不与小鼠CD47结合。失调的抗CD47表位通过晶体学确定。使VH CDR与CD47的KGRD环多次接触并且使VL CDR与SIRPα结合位点重叠，这解释了阻断SIRPα结合的能力。
TPP-1360在其CH2结构域中使用的野生型(WT)IgG1序列证明，对于测试的重组人片段可结晶γ受体(FcγR)家族成员，计算的KD值的范围为0.04nM至1624nM。与对照抗呼吸道合胞病毒(RSV)IgG1抗体相比，TPP-1360显示出对FcγR2A(H131)、FcγR2A(R131)、FcγR3A(F176)和FcγR3A(V176)重组蛋白的更高亲和力，p值分别为0.0038、0.00019、0.0045和0.0049。另外地，TPP-1360与不同FcγR工程化的HEK293细胞结合的能力通过时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)进行评估。尽管当与对照抗RSV IgG1抗体相比时，未观察到TPP-1360与FcγR1细胞系的结合差异，但当与对照抗RSV IgG1抗体相比时，TPP-1360证明与FcγR2A、FcγR2B和FcγR3A细胞系的更高结合，指示与自然杀伤(NK)细胞的更高亲和力和激活NK介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力增强。
将作为单一药剂的TPP-1360与利妥昔单抗和TPP-356的组合进行比较，其是对CD47具有非减弱亲和力的CD47 mAb和具有丝氨酸228到脯氨酸和亮氨酸235到谷氨酸突变的免疫球蛋白G4(IgG4PE)，具有失调的可结晶片段(Fc)。巨噬细胞中的TPP-1360单一药剂的活性高于单独的利妥昔单抗或TPP-356的活性，并且在诱导巨噬细胞介导的吞噬作用方面等同于TPP-356和利妥昔单抗的组合的活性，如一个代表性图表所示(图23)。
例如，可以证明的是失调的CD47臂有助于细胞功能：
a)与利妥昔单抗或CC-90002作为单一药剂相比，CD47xCD20双特异性证明增强的吞噬作用。CD47xCD20双特异性的吞噬活性通常与其CD47结合亲和力相关。另外，TPP-1360单一药剂活性等同于CC-90002样抗CD47 IgG4PE抗体(TPP-356)和利妥昔单抗在诱导吞噬作用中的组合。
b)在对利妥昔单抗敏感和耐受的肿瘤细胞中，TPP-1360证明比利妥昔单抗更好的ADCC。
c)在Raji NOD-SCID异种移植模型中，TPP-1360在体内也证明比利妥昔单抗更好的功效。
TPP-1360不同于目前正在临床试验中测试的靶向CD20和CD3(CD20xCD3)的T细胞接合双特异性抗体。由于TPP-1360具有不同的作用模式，包含吞噬作用、ADCC和CDC，与T细胞激活相比，TPP-1360与CD20xCD3双特异性抗体相比表现出较低的细胞因子释放综合征(CRS)风险。这些试验中的一些试验，如NCT02500407(莫舒尼妥珠单抗(mosunetuzumab))、NCT03075696(格菲妥单抗(glofitamab))和NCT02290951(REGN1979)报告的CRS比率分别为28.4％、57.1％和57.3％(Schuster SJ等人莫舒尼妥珠单抗在预后不良的非霍奇金氏淋巴瘤患者中诱导完全缓解，包含那些在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法之后具有耐受性或复发的患者，并在通过多种细胞系的治疗中具有活性(Mosunetuzumab induces completeremissions in poor prognosis non-Hodgkin lymphoma patients,including thosewho are resistant to or relapsing after chimeric antigen receptor T-cell(CAR-T)therapies,and is active in treatment through multiple lines.)《血液》2019；134(S1):6；Morschhauser F等人在复发性或难治性B细胞非霍奇金氏淋巴瘤中，同时使用CD20-TCB和奥比妥珠单抗的双重CD20靶向疗法显示出非常有前景的临床活性和可管理的安全性：Ib期试验的初步结果(Dual CD20-Targeted Therapy With Concurrent CD20-TCBand Obinutuzumab Shows Highly Promising Clinical Activity and ManageableSafety in Relapsed or Refractory B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma:PreliminaryResults From a Phase Ib Trial.)《血液》2019；134(S1):1584；Bannerji R等人双特异性人抗CD20 x抗CD3抗体REGN1979在患有复发性/难治性(R/R)B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)的患者中的临床活性(Clinical Activity of REGN1979,a Bispecific Human,Anti-CD20 x Anti-CD3 Antibody,in Patients with Relapsed/Refractory(R/R)B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma(B-NHL))《血液》2019:134(S1):762)。此外，在对非人灵长类动物多次施用之后，TPP-1360证明对血液学参数，即RBC的有害影响最小的良好的药代动力学。TPP-1360具体地开发为用于对当前疗法难治和/或耐受的CD20+B细胞淋巴瘤患者的静脉(IV)可注射治疗。
体内药理学
在两种淋巴瘤细胞系源性异种移植模型中评价TPP-1360的体内功效。在DLBCL细胞系异种移植模型WSU-DLCL2中，用TPP-1360治疗观察到显著的剂量依赖性抗肿瘤活性。TPP-1360在伯基特淋巴瘤细胞系异种移植模型Raji中实现了显著但非剂量依赖性的肿瘤抑制。
总体而言，TPP-1360对预期患者群体表现出可接受的安全性，并且毒理学计划充分支持对患有晚期癌症的患者进行临床试验。参见实例1。
在所有研究中，包含重复剂量GLP毒理学研究，直至并包含评估的最高剂量(100mg/kg，每周施用5次)，猴对TPP-1360具有耐受性。
CD20靶向的安全性特性已被很好地确立，并且TPP-1360在食蟹猴中的作用与预期的药理学一致。源自利妥昔单抗的TPP-1360抗CD20臂与失调的抗CD47臂配对，所述抗CD47臂依赖于CD20参与用于与靶标结合。TPP-1360在人全血中的总体结合特性与利妥昔单抗类似。参见实例11。利妥昔单抗以每周375mg/m2(对于70kg受试者大约10mg/kg)的批准剂量广泛用于NHL，耐受性良好。
TPP-1360的失调的抗CD47臂(Hu CD47 KD 2.32±0.11μM)源自抗CD47单克隆抗体CC-90002(Hu CD47 KD 0.54±0.37nM)。CC-90002与利妥昔单抗(375mg/m2)组合治疗在患有R/R NHL的受试者中的良好耐受性为至多20mg/kg(Abrisqueta P等人抗CD47抗体CC-90002与利妥昔单抗组合治疗患有复发性和/或难治性非霍奇金氏淋巴瘤(R/R NHL)的受试者(Anti-CD47 Antibody,CC-90002,in Combination with Rituximab in Subjects withRelapsed and/or Refractory Non-Hodgkin Lymphoma(R/R NHL).)《血液》2019；134(Supplement_1):4089)。
据报道，许多CD47抗体已经导致人红细胞的血凝，并且这表示现有IgG抗体治疗性靶向CD47的主要限制，由于溶血性贫血，所述现有IgG抗体保留Fc功能。在浓度为至多1333.3nM(200μg/mL)的情况下，TPP-1360不促进人RBC中的血凝，这与其对人CD47的亲和力降低以及缺乏与人RBC的结合相一致。另外，使用浓度为至多300μg/mL的抗球蛋白(库姆斯(Coombs))测试，没有观察到TPP-1360与RBC结合。食蟹猴在100mg/kg Q1W(Cmax为4640μg/mL，是示例临床起始剂量下的预测Cmax的58.7倍)时，红细胞仅有极小的减少。
使用浓度为至多200nM(30μg/mL)的平板结合TPP-1360，TPP-1360在CRA中诱导最小水平的细胞因子释放，类似于利妥昔单抗，指示人类的细胞因子释放的低风险。
利妥昔单抗的安全性数据和亲本抗CD47抗体的临床经验已得到充分确立。CC-90002(20mg/kg)与375mg/m2的利妥昔单抗(对于70kg受试者大约10mg/kg)组合证明所述组合具有良好的耐受性。
病状
本文所描述的TPP-1360和相关实体的功效、安全性和耐受性被提供用于治疗淋巴恶性肿瘤病症，包含NHL，例如，具体地患有复发性或难治性CD20+NHL的受试者，所述受试者在标准抗癌疗法中取得进展或不存在其它批准的常规疗法。非霍奇金氏淋巴瘤被期望表达CD20抗原，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、1、2、3a和3b级滤泡性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)和套细胞淋巴瘤(MCL)。
TPP-1360和相关实体的功效、安全性和耐受性被提供用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，例如，具体地患有复发性或难治性DLBCL的受试者，所述受试者在标准抗癌疗法中取得进展或不存在其它批准的常规疗法。未另外指定弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)(NOS；包含从惰性组织学转化的DLBCL、具有DLBCL组织学的高级B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤和3b级滤泡性淋巴瘤)。
TPP-1360和相关实体的功效、安全性和耐受性被提供用于治疗滤泡性淋巴瘤(FL)，例如，具体地患有复发性或难治性FL的受试者，所述受试者在标准抗癌疗法中取得进展或不存在其它批准的常规疗法。
例如，NHL受试者可能需要在如由卢加诺标准(Lugano criteria)定义的通过CT或MRI进行的横截面成像上的具有二维可测量的疾病(至少一个结节病灶的最长径为>1.5cm或至少一个结外病灶的长径为>1.0cm)(Cheson BD等人霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤的初始评价、分期和应答评估的建议：卢加诺分类(Recommendations for initialevaluation,staging,and response assessment of Hodgkin and non-Hodgkinlymphoma:the Lugano classification.)《临床肿瘤学杂志》2014；32(27):3059-3068)。
本文所描述的治疗的受试者可能需要表现出以下中的一种或多种：
绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.0×109/L，无生长因子支持持续7天(如果使用培非格司亭，则持续14天)。
在持续14天未输血的情况下血红蛋白(Hgb)≥8g/dL。
在持续7天未输血的情况下血小板(plt)≥75×109/L。
如果肝脏中存在肿瘤，则天冬氨酸氨基转移酶(AST/SGOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT/SGPT)≤2.5×正常值上限(ULN)或≤5.0×ULN。
血清胆红素≤1.5×ULN。
使用Cockcroft-Gault等式估算的血清肌酐清除率或使用24小时尿液收集测量的肌酐清除率≥45毫升/分钟。
国际归一化比率(INR)<1.5×ULN并且部分凝血活酶时间(PTT)<1.5×ULN。
任何以下的存在可能将受试者排除在本文所描述的治疗之外：
伯基特氏或淋巴母细胞淋巴瘤。
包含里克特转化的慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
IV施用
例如，注射用溶液TPP-1360以50mg/mL的浓度以小瓶中的液体形式提供，包装在纸盒中并根据美国食品和药物管理局(FDA)要求和良好临床实践(GCP)标准进行适当标记。将注射用溶液药品产物储存在2℃至8℃下。
TPP-1360剂量和方案将基于所有可用数据，包含非临床毒理学、体外研究和临床信息。
本文所描述的双特异性抗体的制造过程可以遵循典型的中国仓鼠卵巢(CHO)制造平台。在这些双特异性抗体的纯化中观察到的常见污染物是半抗体，所述半抗体需要特定的纯化方案来去除。在中国仓鼠卵巢细胞中表达4链双特异性之后，蛋白A用作纯化基于IgG的双特异性的第一步。在第一步之后，通常存在两种物种，期望的4链双特异性和半抗体。在大多数情况下，离子交换色谱法足以分离这两种物种，但在其它情况下，可能需要疏水相互作用色谱法。LC的正确配对应通过质谱法进行评估并且错配的杂质应通过另外的蛋白质纯化方法去除，如离子交换或疏水相互作用色谱法。在任一二级纯化方法之后，制备型尺寸排阻色谱法(SEC)可以用于改进和确保构象均一性，同时缓冲液交换4链双特异性。最终质量控制应包含分析SEC、质谱法和不同抗原的体外结合评估，以确保双特异性的构象和化学完整性。参见例如J.B.Ridgway等人,《蛋白质工程(Protein Eng.)》9(1996)617-621。K.Gunasekaran等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》285(2010)19637-19646。
实例
实例1：毒理学
基于物种同源性、跨物种抗体对CD47和CD20的结合亲和力以及对食蟹猴的功能评估，食蟹猴被选为进行非临床毒性评估的单一相关物种。食蟹猴CD47和CD20与人CD47和CD20高度同源，而大鼠和小鼠CD47和CD20同源性较低。进一步地，TPP-1360以类似亲和力与人和食蟹猴CD47和CD20结合，并且不与小鼠CD47或CD20结合。TPP-1360导致食蟹猴外周血B细胞显著耗竭，证明了体内功能活性。基于该信息，食蟹猴被选为单一相关毒理学物种。
在食蟹猴中进行了两项一般毒性研究，以表征TPP-1360的潜在毒性：非给药时间段为14天的为期2周的探索性研究和为期一个月的GLP顺应性毒性研究。研究通过IV注射进行。
两项猴毒理学研究的影响大体类似。向食蟹猴，BIW或Q1W施用TPP-1360导致外周血中的B-细胞的预期显著减少以及主要在淋巴器官滤泡区的淋巴细胞减少，这与药理学一致并与如Rituxan和Gazyva等其它抗CD20药剂观察到的结果一致([产品专论].加拿大安大略省密西沙加(Mississauga,ON,Canada)：豪夫迈·罗氏公司有限责任公司(Hoffmann-La Roche Ltd.)；2000,2019年修订；《Gazyva FDA药理学综述(Gazyva FDAPharmacology Review)》125486,2013)。其它血液学影响包含NK细胞中度至显著减少(Rituxan临床报告；Enqvist M等人在滤泡性淋巴瘤的利妥昔单抗单一疗法之后的NK细胞的全身和淋巴结内激活(Systemic and Intra-Nodal Activation of NK Cells AfterRituximab Monotherapy for Follicular Lymphoma.)《免疫学前沿(Front Immunol.)》2019.10:2085；据报告，食蟹猴的Gazyva出现短暂下降)，并且还注意到T细胞群体中的微小可变非剂量依赖性减少(CD8和CD4 T细胞)，并且对于后者，不能排除与治疗的关系。还注意到一系列无剂量应答的其它不良和非不良变化，反映了对食蟹猴施用TPP-1360的免疫/炎症应答，包含ADA产生和免疫复合物沉积。
对食蟹猴施用TPP-1360导致预期的外周血中的B细胞减少和淋巴器官、NK细胞和红细胞的细胞性减少，以及被认为是在对食蟹猴施用人源化蛋白质之后的其它副作用。在食蟹猴中，外周血和淋巴组织中的利妥昔单抗和其生物类似物的B细胞效应也显示是可逆的([产品专论].加拿大安大略省密西沙加：豪夫迈·罗氏公司有限责任公司；2000,2019年修订)。Rituxan或Gavyza介导的NK细胞减少通常是短暂的(Enqvist M等人在滤泡性淋巴瘤的利妥昔单抗单一疗法之后的NK细胞的全身和淋巴结内激活《免疫学前沿》2019.10:2085；《Gazyva FDA药理学综述》125486,2013)，并且CD47介导的对红细胞的药理作用也是可逆的。此外，有证据表明，随着血清TPP-1360水平的降低，外周血中的B细胞、NK细胞和T细胞恢复。另外，没有观察到骨髓效应，并且一些动物的网织红细胞增加，指示对红细胞减少的再生应答。
在为期一个月的研究中，基于所有剂量水平下的B细胞和NK细胞效应，未确定无可见不良效应水平(No-Observable-Adverse-Effect-Level，NOAEL)。
实例2：药代动力学
在单次IV剂量和重复IV剂量研究之后，评价食蟹猴体内TPP-1360的药代动力学和毒代动力学。使用异速生长源性PK参数，TPP-1360的预计人类清除率为25.6毫升/小时，并且预计TPP-1360在人体中的预测t1/2为大约5天。
实例3：CC-90002的失调
通过与CD47的细胞外结构域的抗CD47 Fab结合的晶体结构能够进行合理的设计以降低CC-90002(408_437)抗CD47臂的非失调亲本版本的亲和力。CC-90002结合的表位与和人CD47结合的原始鼠抗CD47 2A1的表位相同。参见美国专利第9,045,541号。
将2A1的可变结构域人源化并且将最终抗体命名为由HC_2.3Q和LC_N构成的“QN”，所述最终抗体最终发展成IgG4 P/E格式(CC-90002)。通过将残基引入到可变重结构域中来进一步修饰QN以提高无细胞表达，该HC变体被命名为“HC_Q_5_MUT”。使用免疫原性的计算机模拟和计算机预测进一步修饰HC_Q_5_MUT HC和LC_N以降低其免疫原性，这些统称为“CD47 2.0”。CD47 2.0LC_1147_2和CD47 2.0HC_434的可变重结构域和可变轻结构域中的其它变体被设计用于改善药代动力学，这些被称为“CD47 3.0”。WO2016109415(US.20170369572)；WO2018009499(US.20190241654)；以及WO2018183182，其中的每个通过引用并入本文。
抗CD47表位覆盖了大的表面积并且来自轻链(LC)和重链(HC)两者的残基参与相互作用。
为了降低抗CD47臂对CD47的亲和力，使用分子操作环境(MOE)建模程序的“残基扫描”模块对LC和HC两者的CD47相互作用残基进行计算机诱变。该过程创造了由数千个变体组成的文库，这些变体具有广泛的预测亲和力。对每个计算机Fab变体进行建模以计算预测的稳定性变化(d稳定性)或对CD47 ECD的亲和力变化(d亲和力)。使用免疫原性评估软件分析超过5,000个具有阳性d亲和力评分(预计相对于亲本Fab具有较低的亲和力)和阴性d稳定性(预计相对于亲本Fab具有更高的稳定性)的变体以鉴定预计具有低免疫原性的变体。其中，CD47的预测Kd范围为10nM至1mM的143个低免疫原性风险Fab变体被选择用于基于细胞的测试。
为了筛选靶细胞选择性抗CD47 Fab，将所选抗CD47 Fab变体构建为IgG1融合体并与来自西妥昔单抗的抗EGFR臂配对。4链双特异性的适当装配是通过在所有4条链中存在本文所描述的Fab和Fc取代来实现的。在Expi-CHO细胞中瞬时表达含有143个所选变体的4链双特异性并且使用磁性蛋白A珠在单一步骤中纯化双特异性。为了鉴定靶细胞选择性双特异性，用两个实验测试变体。第一实验测量失调的抗CD47 x抗EGFR双特异性与表达CD47抗原但不表达EGFR抗原的非靶Raji细胞系结合的能力。第二实验测量失调的抗CD47 x抗EGFR双特异性阻断SIRPα与表达CD47抗原和EGFR抗原的靶Fadu细胞系结合的能力。这些实验产生了一组8个变体，这些变体相对于非失调的抗CD47x抗EGFR亲本抗体对非靶CD47+/EGFR-Raji细胞系的亲和力降低了10倍至20倍，但仍能阻断75％-90％的SIRPα与CD47+/EGFR+Fadu靶细胞系的结合。
类似地，使用IgG1 Fc将利妥昔单抗抗CD20臂与8个失调的抗CD47变体配对。观察到失调的CD47xCD20双特异性相对于非失调的CD47xCD20亲本抗体降低了与CD47+/CD20-非靶Fadu细胞系的结合，但仍能阻断75％-90％的SIRPα与CD47和CD20阳性的靶Raji细胞系的结合。
对变体的另外的可开发性评估使得选择单一抗CD47 Fab变体VH E59Y/S102E，将其克隆到三个CC-90002源性框架中，用于食蟹猴的药代动力学测试：TPP-1367、TPP-1360和TPP-1361。
实例4：本文所描述的双特异性实体的SPR结合结果的总结
表面等离子共振(SPR)实验用于测量TPP-1360对CD47的亲和力。测试TPP-1360与人CD47和食蟹猴CD47的结合，并且发现其不与小鼠CD47结合。经测量，TPP-1360对人CD47ECD的亲和力为1.7μM Kd，这反映了相对于亲本抗CD47结合物的亲和力降低了约350倍。发现TPP-1360对食蟹猴CD47 ECD的亲和力为4.51μM Kd。除了测量的亲和力之外，夹心SPR测定证明TPP-1360同时与CD47和CD20结合。
实例5：示例双特异性实体的结合和SIRPα阻断的剂量应答
产生TPP-1360阻断人SIRP∝与各种表达CD20的非霍奇金氏淋巴瘤肿瘤细胞系结合的剂量应答曲线。将细胞系以浓度增加的双特异性温育，然后以饱和浓度添加到人SIRPα中。除了双特异性之外，还包含利妥昔单抗和亲本抗CD47结合剂(TPP-23，与IgG1为408_437)用于参考。将细胞洗涤，然后与二级抗体一起温育以测量与肿瘤细胞结合的SIRPα的量。对于细胞系OCI-Ly3(DLBCL细胞系)，发现TPP-1360的EC50＝1.30nM。对于Raji细胞系(B淋巴细胞伯基特氏淋巴瘤细胞系)，发现TPP-1360的EC50＝1.64nM。发现亲本抗CD47 TPP-23的IC50为0.11nM，用于阻断人SIRPα与OCI-Ly3细胞的结合，如图21所示。利妥昔单抗对SIRPα结合没有影响。
实例6：吞噬作用的剂量应答
产生TPP-1360激活对各种表达CD20的非霍奇金氏淋巴瘤肿瘤细胞系的吞噬作用的剂量应答曲线。将人单核细胞分化为巨噬细胞，然后将其添加到已经以浓度增加的任一双特异性温育的肿瘤细胞系中。除了双特异性实体之外，还包含利妥昔单抗和亲本抗CD47结合剂(TPP-23)用于参考。使用基于图像的定量方法，巨噬细胞和肿瘤细胞的荧光标记用于测量吞噬事件的数量。对于OCI-Ly3细胞系，发现TPP-1360的IC50＝1.4nM。对于Raji细胞系，发现TPP-1360的IC50＝1.8nM。
实例7：与人和食蟹猴RBC的结合研究和血凝
确定某些双特异性实体实例与人和食蟹猴RBC的结合以评估其非靶细胞结合潜力。将RBC从全血中分离并以浓度递增的示例双特异性温育。结合表示为在2μg/ml亲本抗CD47结合剂(TPP-23)下观察到的结合量的百分比。在200μg/ml时，TPP-1360和TPP-1361与针对亲本抗CD47与人RBC结合可见的结合量的<1％结合。类似地，在200μg/ml时，TPP-1360与针对亲本抗CD47与食蟹猴RBC结合可见的结合量的<1％结合。最后，两种范例的亲本抗CD47结合剂证明，在200μg/ml时，人RBC没有血凝。类似地，在200μg/ml时，TPP-1360和TPP-1361两者没有显示出血凝。已知的血凝抗体BRIC6用作阳性对照。
实例8：对人PBMC和全血的结合研究
评估了本文所描述的双特异性实体物种与人外周血单核细胞(PBMC)的结合。相对于亲本抗CD47结合剂TPP-23和利妥昔单抗，TPP-1360双特异性显示出对除了B细胞之外的所有细胞类型的较少结合，所述B细胞通过抗CD20 Fab部分的存在显示出显著的结合。
实例9：首轮范例食蟹猴PK
用本文所描述的示例双特异性实体物种进行食蟹猴PK实验。观察到B细胞耗竭。从这些研究中选择TPP-1360用于食蟹猴探索性毒理学(E-tox)研究中的进一步研究，如实例10中所描述的。
实例10：第二轮范例食蟹猴E-tox
用TPP-1360进行食蟹猴E-tox实验。这些研究表明，TPP-1360耐受性良好，显示出深度B细胞耗竭，并实现了剂量比例暴露，证实了避免了与正常CD47+但CD20阴性细胞的假结合。因此，双特异性抗体是靶细胞选择性的。
实例11：体外药理学
A.人全血结合
为了评估TPP-1360的特异性，首先使用流式细胞术在全血中评价其结合特性。在两个供体中，200nM TPP-1360基本上将结合信号转移到B细胞并且相当弱地转移到T细胞、单核细胞和NK细胞，与血小板或红细胞进行最小程度的结合或不与其结合，由此说明与人全血中的B细胞的选择性结合。参见图7。
图7示出了例如双特异性TPP-1360主要与B细胞结合，与所列其它细胞类型结合的量非常少，这可能是因为CD47的水平高于在血细胞上发现的水平，或者是因为可以与NK细胞和单核细胞上表达的Fc受体结合的Fc的贡献。相反，由于CD47的普遍表达和在TPP-23中发现的对CD47的高亲和力，高亲和力CD47单特异性抗体TPP-23与所有这些细胞类型结合。
TPP-1360在人全血中的总体结合特性与利妥昔单抗类似。相反，亲本CD47 mAbTPP-23用作CD47表达的对照，与人血液中的所有细胞群体显著结合。
B.肿瘤细胞结合
此外，例如，TPP-1360的RBC结合能力在纯化的人RBC和人RBC与肿瘤细胞的共培养物中被广泛评价。如图8所展示的，TPP-1360与CD47+/CD20+Raji细胞选择性结合，但不与CD47+/CD20-人RBC结合。此外，在Raji细胞和人RBC的共培养物中，TPP-1360表现出与CD47+/CD20+Raji细胞的剂量依赖性结合，但不与人RBC结合，即使浓度高达1mg/mL。参见图9。相反，亲本CD47型/CD20双特异性TPP-2与Raji细胞和人RBC两者显著结合。另外，TPP-1360不示出与来自多个供体的纯化的食蟹猴RBC的结合。
C.SIRPα竞争
已经证明其与CD20+/CD47+细胞的选择性结合，使用体外竞争测定评估TPP-1360拮抗人SIRPα与细胞表面CD47相互作用的能力。TPP-1360有效并阻断重组人SIRPα-Fc与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系OCI-Ly3和Raji的表面上表达的人CD47的结合，平均EC50值分别为1.30nM和1.64nM。参见图10和图11。图10展示了例如TPP-1360有效并完全阻断重组人SIRPα-Fc与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系OCI-Ly3的表面上表达的人CD47的结合的事实。图11展示了例如TPP-1360有效并完全阻断重组人SIRPα-Fc与CD20+/CD47+淋巴瘤细胞系Raji的表面上表达的人CD47的结合的事实。相反，利妥昔单抗和对照双特异性抗体TPP-1480(抗CD20/鸡蛋溶菌酶)都不能与人SIRPα-Fc竞争与相同的细胞系结合。本文所呈现的数据还证明，TPP-1360阻断人SIRPα-CD47相互作用的效力低于TPP-23，这与TPP-1360对人CD47的亲和力减弱一致。
实例12：功能活动：人巨噬细胞吞噬作用
该实例证明TPP-1360在触发肿瘤吞噬作用中的能力，如通过自动计数标记的巨噬细胞内“被吃掉的”CD20+CD47+肿瘤细胞在体外所确定的。
CD20和CD47的表达首先在每个靶肿瘤细胞系(OCI-Ly3、Raji、REC-1和RIVA)中通过使用流式细胞术测定定量抗体结合能力(ABC)来验证(Denny TN等人,《细胞术(Cytometry.)》1996年12月；26(4):265-74)。所有四种细胞系表达高水平的CD47和CD20。表1.
表1：淋巴瘤细胞表面上的CD47和CD20抗原表达
细胞系 CD20 ABC CD47 ABC
OCI-Ly3 154,000 247,000
REC-1 510,036 453,415
RIVA 722,000 443,000
Raji 522,596 213,927
ABC＝抗体结合能力。
接下来，将滴定的抗体添加到预分化的巨噬细胞中，然后与用TPP-1360调理的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CSFE)标记的肿瘤细胞共培养。通过标记的巨噬细胞内的标记的肿瘤细胞的数量来定量确定吞噬作用活性。在CD14别藻蓝蛋白(APC)中的每一个标记的巨噬细胞中测量绿色强度(CFSE)，并且阈值门用于鉴定CFSE阳性巨噬细胞。在整个实验中观察到大约1000MFI(平均荧光强度)的阈值，方差不超过几百MFI。对于每个样品，计算的吞噬作用百分比确定为：[(CFSE阳性巨噬细胞的数量)/(巨噬细胞的总数)]x 100。在至少两个供体中，用TPP-1360处理诱导了巨噬细胞介导的对四种CD20+恶性B细胞系的吞噬作用。来自一个供体的代表性数据在图12(Raji细胞)、图13(OCI-Ly3细胞)、图14(REC-1细胞)和图15(RIVA细胞)中示出。计算曲线下面积并且然后进行配对t检验以确定TPP-1360与利妥昔单抗相比的统计学显著性。参见图16。数据证明，在Raji和OCI-Ly3细胞中，用TPP-1360治疗触发了比利妥昔单抗显著更有效的吞噬作用，这可能是由于TPP-1360同时阻断了SIRPα-CD47相互作用和如FcγR等激活受体的参与。
实例13：药代动力学
为了确定本文所描述的双特异性实体(抗体物种TPP-1360、TPP-1361和TPP-1367)的药代动力学(PK)特性，对小鼠和食蟹猴进行了非GLP研究。在72小时内进行了稀疏PK采样(每个时间点n＝4)，并且所有动物在整个研究持续时间显示出可检测的抗体物种浓度。计算出的半衰期为3.4天，但考虑到采样持续时间，这可能被低估了。为了评价食蟹猴的PK特性，进行了重复剂量探索性毒理学研究。在抗体物种的重复给药之后，实现了全身性暴露，并且在整个研究持续时间(第15天给药之后336小时)，在3只猴中的2只的血清中可检测到抗体物种。作为血液学和免疫表型评估的重复剂量研究的一部分，还收集了样品。观察到的B淋巴细胞耗竭证明药物在体内的功能。总体而言，在单剂量小鼠和重复剂量猴研究中，抗体物种暴露在整个研究持续时间保持不变，两项研究之间报告的类似半衰期的范围为3-3.5天。
实例14：安全性特性
这些高度评价的物种表现出可接受的毒理学特性。作为对食蟹猴进行的为期28天的探索性毒理学研究的一部分，对毒代动力学进行评价。使用抗利妥昔单抗抗体用于捕获和山羊抗人IgG Fc用于检测，用夹心ELISA测量血清浓度。在多次IV剂量之后，TPP-1360的全身暴露在所有剂量水平实现并在整个研究持续时间由所有动物维持。TPP-1360表现出Cmax和AUC0-168大致呈剂量比例增加的线性TK。根据剂量水平和剂量方案，计算出的平均半衰期的范围为2-4天。在给药之前第15天测试的8只动物中有5只检测到抗药物抗体并且在研究第29天测试的6只动物中有5只检测到抗药物抗体。抗药物抗体确实影响TPP-1360的暴露，这可以通过观察ADA阳性动物的暴露减少来证明。然而，没有观察到与测试品相关的血小板减少。T细胞、NK细胞、中性粒细胞和红细胞的减少被认为是由TPP-1360的CD47臂介导的，因为这些细胞不表达CD20。
实例15：免疫原性
由EpiVax开发的交互式筛选和蛋白质再工程界面(ISPRI)软件是用于评估人类的潜在抗体免疫原性的计算机方法，并且是临床上公认的T细胞依赖性分析工具(图18)。分析TPP-1360的VH和VL氨基酸序列的推定T效应子和T调节热点并发现其具有低免疫原性风险。
实例16：临床研究：设计和纳入和排除标准
CD47xCD20双特异性抗体(“双特异性”或“双特异性抗体”)的首次人体临床研究是开放标记、多中心、1期研究以评价双特异性抗体在患有复发性或难治性CD20+NHL受试者中的安全性和耐受性，所述受试者在标准抗癌疗法中取得进展或不存在其它批准的常规疗法。
所述研究分2个部分进行：A部分，单一疗法剂量递增和B部分，单一疗法剂量扩大。A部分和B部分包括3个阶段：筛查、治疗和随访。
研究的剂量递增部分(A部分)评价增加TPP-1360剂量水平的安全性和耐受性，以鉴定除了患有CLL/SLL(慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤)的受试者之外的患有R/RCD20+NHL的受试者的MTD和/或RP2D。
本研究的单一疗法剂量扩大部分(B部分)进一步评价在患有弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和滤泡性淋巴瘤(FL)受试者的所选队列中的推荐2期剂量的双特异性的安全性、药代动力学和抗肿瘤活性。
实施所有治疗直到临床意义的疾病进展、不可接受的毒性或受试者/研究者决定退出为止。
研究群体：受试者(男性或女性)≥18岁，患有CD20+NHL，在标准抗癌疗法疗中取得进展(或由于医学共病或不可接受的毒性而无法耐受)，或不存在其它批准的常规疗法，均被纳入本研究。大约35至40名接受强制性配对活检的受试者被纳入A部分剂量递增。大约60名受试者(每队列30名)被纳入B部分剂量扩大。
研究治疗：提供双特异性抗体用于IV施用。双特异性是共靶向CD47和CD20的免疫球蛋白G1(IgG1)双特异性抗体，并且被设计成以高亲和力与CD20结合并以失调的亲和力与CD47结合。
纳入标准：受试者必须满足以下标准才能接受双特异性抗体治疗作为临床研究的一部分：
受试者必须具有以下实验室值：
a.绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.0×109/L，无生长因子支持持续7天(如果使用培非格司亭，则持续14天)。
b.在持续14天未输血的情况下血红蛋白(Hgb)≥8g/dL。
c.在持续7天未输血的情况下血小板(plt)≥75×109/L。
d.如果肝脏中存在肿瘤，则天冬氨酸氨基转移酶(AST/SGOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT/SGPT)≤2.5×正常值上限(ULN)或≤5.0×ULN。
e.血清胆红素≤1.5×ULN。
f.使用Cockcroft-Gault等式估算的血清肌酐清除率或使用24小时尿液收集测量的肌酐清除率≥45毫升/分钟。
g.国际归一化比率(INR)<1.5×ULN并且部分凝血活酶时间(PTT)<1.5×ULN。
排除标准：受试者必须满足以下标准中的一个或多个才能接受双特异性抗体治疗作为临床研究的一部分：
a.不患有伯基特氏淋巴瘤或淋巴母细胞淋巴瘤；
b.不患有包含里克特转化的慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；
c.不患有涉及症状性中枢神经系统(CNS)的癌症；
d.在14天的所述施用内未接受慢性全身性免疫抑制疗法或超过140mg总剂量的皮质类固醇；
e.不具有临床上显著的移植物抗宿主病(GVHD)；
f.在过去6个月内不具有III级或IV级充血性心力衰竭(CHF)或严重非缺血性心肌病、不稳定型心绞痛、心肌梗塞或室性心律失常的病史；
g.通过在30天的所述施用内进行的超声心动图(ECHO)或多摄取门控采集(MUGA)扫描进行评估，不具有被定义为左心室射血分数(LVEF)<45％的心脏功能不足；
h.未接受针对CD47或SIRPα的既往研究疗法；
i.在所述施用之前≤4周未接受CAR-T疗法治疗；
j.在所述施用之前≤5个半衰期或4周(以较短者为准)未进行既往系统性癌症导向治疗或研究模式；
k.在TPP-1360开始之前≤2周未进行大手术，并且其中所述受试者已经从任何近期手术的任何临床上显著的影响中恢复；
l.在所述施用之前≤3个月未进行自体干细胞移植；
m.在所述施用之前≤6个月未进行在标准或降低强度调节的情况下的同种异体干细胞移植；
n.未诊断出原发性免疫缺陷疾病；
o.未诊断出活动性人免疫缺陷病毒(HIV)感染；除非所述受试者在所述施用之前12个月内已经很好地控制HIV，CD4+T细胞(CD4+)计数≥350个细胞/uL并且不具有机会性感染；
p.不具有活动性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染；
q.未接受慢性、治疗性抗凝剂给药的持续治疗；
r.不具有自身免疫性溶血性贫血或自身免疫性血小板减少症的病史；
s.不具有需要积极、持续的全身治疗的并发第二癌症的病史；和/或
t.在所述施用之前至少4周内未接种活病毒疫苗。
在一些情况下，必须满足标准a-t。
表2：序列
* * *
本文提及的所有公开和专利均通过引用并入。在不背离本文所公开的范围和精神的前提下，对所描述的主题作出的各种修改和改变对本领域的技术人员而言是显而易见的。尽管已结合特定实施例描述了所述方法，但应当理解，不能将所要求保护的本公开不适当地限定为这些实施例。事实上，用于执行本文所公开的各种修改对于本领域技术人员来说是容易获得的，并且旨在落入以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 细胞基因公司（CELGENE CORPORATION）
Hadjivassiliou, Haralambos
Zhu, Dan
Sun, Jeonghoon
Acharya, Sharmistha
Johnson, Jeffrey
Hariharan, Kandasamy
Cho, Ho
<120> 淋巴恶性肿瘤病状的双特异性抗体治疗
<130> 298068-00369
<150> US 63/088,879
<151> 2020-10-07
<160> 72
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
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Tyr Arg Glu Ser Arg Phe Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
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<220>
<223> CD20 VH
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe
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<400> 11
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
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Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
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210
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<400> 12
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
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Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 13
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC - 全利妥昔单抗
<400> 13
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC - 全利妥昔单抗
<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 15
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20全LC
<400> 15
Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Ala Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Val Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Arg Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD20全HC
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Trp Leu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47全LC
<400> 17
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Asp Pro Gly Thr Val Pro Gln His Leu Ile
35 40 45
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Trp Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
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165 170 175
Ser Thr Leu Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
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Leu Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 19
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47全LC
<400> 19
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Glu Ser Arg Phe Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Trp Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 20
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47全HC
<400> 20
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Asn Ala Ala Tyr Gly Glu Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 21
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47全LC
<400> 21
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Trp Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 22
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47全HC
<400> 22
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
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Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
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Leu Lys Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Val Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
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Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly Lys
450
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD47 IgG1 LC恒定区
<400> 23
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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<210> 24
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD47 IgG1 LC恒定区
<400> 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD47 IgG1 HC恒定区
<400> 25
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1 5 10 15
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<210> 26
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD47 IgG1 HC恒定区
<400> 26
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210 215 220
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 IgG1 LC恒定区
<400> 27
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Ala Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Val Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Arg Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 28
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 IgG1 LC恒定区
<400> 28
Ala Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Arg Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
1 5 10 15
Val Val Cys Val Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
20 25 30
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
35 40 45
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Arg
50 55 60
<210> 29
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 IgG1 HC恒定区
<400> 29
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Trp Leu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala
275 280 285
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 30
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 IgG1 HC恒定区部分
<400> 30
Trp Leu Gly Cys Glu Val Thr Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
1 5 10 15
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
20 25 30
Val Leu Glu Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
35 40 45
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
50 55 60
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
65 70 75 80
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
85 90 95
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
100 105 110
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
115 120 125
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
130 135 140
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
165 170 175
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
180 185 190
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
195 200 205
Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
210 215 220
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
225 230 235 240
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
245 250 255
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Ala Leu Val
260 265
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VL CDR1
<400> 31
Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VL CDR2
<400> 32
Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VL CDR3
<400> 33
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VH CDR1
<400> 34
Asp Tyr Tyr Leu His
1 5
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VH CDR2
<400> 35
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 90002 VH CDR3
<400> 36
Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VL CDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VL CDR2
<400> 38
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VL CDR3
<400> 39
Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VH CDR1
<400> 40
Ser Tyr Asn Met His
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VH CDR2
<400> 41
Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 利妥昔单抗CD20 VH CDR3
<400> 42
Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val
1 5 10
<210> 43
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VL CDR1
<400> 43
Gln Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VL CDR2
<400> 44
Arg Glu Ser Arg Phe Val Asp
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VL CDR3
<400> 45
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VH CDR1
<400> 46
Asp Tyr Tyr Leu His
1 5
<210> 47
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VH CDR2
<400> 47
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 48
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1361 CD47 VH CDR3
<400> 48
Ala Tyr Gly Glu Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VL CDR1
<400> 49
Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VL CDR2
<400> 50
Arg Glu Ser Arg Phe Val Asp
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VL CDR3
<400> 51
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VH CDR1
<400> 52
Asp Tyr Tyr Leu His
1 5
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VH CDR2
<400> 53
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1360 CD47 VH CDR3
<400> 54
Ala Tyr Gly Glu Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VL CDR1
<400> 55
Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VL CDR2
<400> 56
Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VL CDR3
<400> 57
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VH CDR1
<400> 58
Asp Tyr Tyr Leu His
1 5
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VH CDR2
<400> 59
Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1367 CD47 VH CDR3
<400> 60
Ala Tyr Gly Glu Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VL CDR1
<400> 61
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VL CDR2
<400> 62
Ala Ala Ser Val Leu Glu Ser
1 5
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VL CDR3
<400> 63
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VH CDR1
<400> 64
Asn Phe Val Met Ser
1 5
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VH CDR2
<400> 65
Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VH CDR3
<400> 66
His Tyr Ile Leu Arg Tyr Phe Asp
1 5
<210> 67
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VL
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Val Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47 VH
<400> 68
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asn Phe
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Tyr Ile Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ala Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47全LC
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Val Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Glu Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Trp Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Glu
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Glu Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 70
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TPP-1362 CD47全HC
<400> 70
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Asn Phe
20 25 30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Met Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Tyr Ile Leu Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Ala Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Lys Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 408_437 VL
<400> 71
Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Arg Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys His Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 72
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 408_437 VH
<400> 72
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Asp Gln Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Ala Ala Tyr Gly Ser Ser Ser Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120

Claims (22)

1.一种用于治疗有需要的受试者的淋巴恶性肿瘤的方法，所述方法包括施用有效量的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括：
i)与CD47结合的Fab部分，所述Fab部分包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL包括：VL CDR1，所述VL CDR1包括氨基酸序列QASQDIHRYLS(SEQ ID NO:43)或RASQDIHRYLS(SEQ ID NO:49)；VL CDR2，所述VL CDR2包括氨基酸序列RESRFVD(SEQ ID NO:50)或RANRLVS(SEQ ID NO:56)；以及
VL CDR3，所述VL CDR3包括氨基酸序列LQYDEFPYT(SEQ ID NO:51)，所述VH包括：VHCDR1，所述VH CDR1包括氨基酸序列DYYLH(SEQ ID NO:52)；
VH CDR2，所述VH CDR2包括氨基酸序列WIDPDQGDTYYAQKFQG(SEQ ID NO:
53)；以及VH CDR3，所述VH CDR3包括氨基酸序列AYGESSYPMDY(SEQ ID NO:
54)；以及
ii)与CD20结合的Fab部分，所述Fab部分包括轻链可变区(VL)区和重链可变区(VH)区，所述VL包括：VL CDR1，所述VL CDR1包括氨基酸序列RASSSVSYIH(SEQ ID NO:37)；VL CDRs，所述VL CDRs包括氨基酸序列ATSNLAS(SEQ ID NO:
38)；以及VL CDR3，所述VL CDR3包括氨基酸序列QQWTSNPPT(SEQ ID NO:39)，所述VH包括：VH CDR1，所述VH CDR1包括氨基酸序列SYNMH(SEQ ID NO:40)；
VH CDR2，所述VH CDR2包括氨基酸序列AIYPGNGDTSYNQKFKG(SEQ ID NO:
41)；以及STYYGGDWYFNV(SEQ ID NO:42)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述与CD47结合的Fab部分包括：轻链可变区(VL)，所述VL包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成；以及重链可变区(VH)，所述VH包括SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或由其组成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述双特异性抗体包括：抗CD47轻链，所述抗CD47轻链包括SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21的氨基酸序列或由其组成；以及抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD47重链缺乏C末端赖氨酸。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述双特异性IgG1抗体包括抗CD20轻链，所述抗CD20轻链包括SEQ ID NO:15的氨基酸序列；以及抗CD20重链，所述抗CD20重链包括SEQ IDNO:16的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD20重链，所述抗CD20重链包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD20重链缺乏C末端赖氨酸。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述双特异性抗体包括：抗CD47轻链，所述抗CD47轻链包括SEQ ID NO:19的氨基酸序列或由其组成；以及抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述双特异性抗体包括抗CD47重链，所述抗CD47重链包括SEQ ID NO:20的氨基酸序列或由其组成，但是其中所述抗CD47重链缺乏C末端赖氨酸。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma，NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞淋巴瘤(MCL)或原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者患有复发性或难治性淋巴恶性肿瘤。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤在标准抗癌疗法中已经发展。
12.根据权利要求10所述的方法，其中或者对于患有所述淋巴恶性肿瘤的所述受试者，不存在其它批准的常规疗法。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是NHL。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是复发性或难治性NHL。
15.根据权利要求9所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是滤泡性淋巴瘤。
16.根据权利要求9所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤。
17.根据权利要求9所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是边缘区淋巴瘤。
18.根据权利要求9所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。
19.根据权利要求9所述的方法，其中所述淋巴恶性肿瘤是原发性纵隔B细胞淋巴瘤。
20.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者在如由卢加诺标准(Luganocriteria)定义的通过CT或MRI进行的横截面成像上的至少一个结节病灶的最长径为>1.5cm或至少一个结外病灶的长径为>1.0cm。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有以下中的一者或多者：
a.在持续7天无生长因子支持(如果使用培非格司亭(pegfilgrastim)，则持续14天)的情况下绝对中性粒细胞计数(ANC)≥1.0×109/L；
b.在持续14天未输血的情况下血红蛋白(Hgb)≥8g/dL；
c.在持续7天未输血的情况下血小板(plt)≥75×109/L；
d.如果肝脏中存在肿瘤，则天冬氨酸氨基转移酶(AST/SGOT)和丙氨酸氨基转移酶(ALT/SGPT)≤2.5×正常值上限(ULN)或≤5.0×ULN；
e.血清胆红素≤1.5×ULN；
f.使用Cockcroft-Gault等式估算的血清肌酐清除率或使用24小时尿液收集测量的肌酐清除率≥45毫升/分钟；和/或
g.国际归一化比率(INR)<1.5×ULN并且部分凝血活酶时间(PTT)<1.5×ULN。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者：
a.不患有伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)或淋巴母细胞淋巴瘤；
b.不患有包含里克特转化(Richter's transformation)的慢性淋巴细胞白血病(CLL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)；
c.不患有涉及症状性中枢神经系统(CNS)的癌症；
d.在14天的所述施用内未接受慢性全身性免疫抑制疗法或超过140mg总剂量的皮质类固醇；
e.不具有临床上显著的移植物抗宿主病(GVHD)；
f.在过去6个月内不具有III级或IV级充血性心力衰竭(CHF)或严重非缺血性心肌病、不稳定型心绞痛、心肌梗塞或室性心律失常的病史；
g.通过在30天的所述施用内进行的超声心动图(ECHO)或多摄取门控采集(MUGA)扫描进行评估，不具有被定义为左心室射血分数(LVEF)<45％的心脏功能不足；
h.未接受针对CD47或SIRPα的既往研究疗法；
i.在所述施用之前≤4周未接受CAR-T疗法治疗；
j.在所述施用之前≤5个半衰期或4周(以较短者为准)未进行既往系统性癌症导向治疗或研究模式；
k.在TPP-1360开始之前≤2周未进行大手术，并且其中所述受试者已经从任何近期手术的任何临床上显著的影响中恢复；
l.在所述施用之前≤3个月未进行自体干细胞移植；
m.在所述施用之前≤6个月未进行在标准或降低强度调节的情况下的同种异体干细胞移植；
n.未诊断出原发性免疫缺陷疾病；
o.未诊断出活动性人免疫缺陷病毒(HIV)感染；除非所述受试者在所述施用之前12个月内已经很好地控制HIV，CD4+T细胞(CD4+)计数≥350个细胞/uL并且不具有机会性感染；
p.不具有活动性乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染；
q.未接受慢性、治疗性抗凝剂给药的持续治疗；
r.不具有自身免疫性溶血性贫血或自身免疫性血小板减少症的病史；
s.不具有需要积极、持续的全身治疗的并发第二癌症的病史；和/或
t.在所述施用之前至少4周内未接种活病毒疫苗。
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