CN116669713A - Curcusone二萜及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了curcusone天然产物的首个非对称全合成和靶标鉴定。该新的汇聚合成建立在廉价且丰富的手性池分子(8)上，并且特征在于热[3,3]‑σ迁移重排和经FeCl3促进的总体水解/羟醛缩合级联，以快速构建关键的环庚二烯酮核心。通过用炔烃探针37进行化学蛋白质组学，我们将先前“无成药性”致癌蛋白BRAT1鉴定为1d的关键细胞靶标。此外，1d在癌细胞中抑制BRAT1，从而降低癌细胞迁移、提高对DNA损伤的易感性、以及诱导对已批准药物依托泊苷的化学敏感性。化合物1d是第一个已知的针对BRAT1的小分子抑制剂，所述BRAT1为DDR和DNA修复的主要调节子。组合物物质和使用方法在本公开内容的范围内。

Description

CURCUSONE二萜及其用途
相关申请的交叉引用
本美国专利申请涉及并要求于2020年9月29日提交的美国临时专利申请序列No.63/084,594的优先权权益，其内容在此通过引用整体并入。
政府权利
本发明在由国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)授予的CA023168和GM128570的政府支持下完成。政府对本发明具有某些权利。
技术领域
本公开内容涉及新的curcusone二萜类似物，涉及curcusone二萜和类似物的新的合成，以及涉及使用curcusone二萜和类似物的方法。
背景技术
本部分介绍了可有助于促进较好地理解本公开内容的方面。因此，这些陈述应以这种角度来阅读，而不应理解为承认什么是或不是现有技术。
天然产物已是救生用药物分子的有价值的来源和启示。它们累积的进化知识以及它们的结构复杂性、新颖性和多样性，使它们对于新的治疗的开发是无与伦比的。另外，天然产物可用作用于阐明基本生物途径和鉴定新的疾病靶标的重要探针分子。然而，其天然的稀缺性和结构复杂性通常阻碍全面的生物学评价和其作用机制的阐明。后者也被认为是基于天然产物的药物发现的主要瓶颈。为了客服这些障碍，可以采用全合成来提供关键物质和类似物。同时，由于缺乏酶活性和/或小分子结合位点，许多有吸引力且经生物学验证的疾病靶标，尤其是癌症中的靶标，从化学角度被认为是“无成药性(undruggable)”。BRCA1相关ATM激活剂1(BRCA1-associated ATM activator 1，BRAT1)蛋白已被验证为致癌蛋白但属于“无成药性”类别，并且尚未鉴定出靶向BRAT1的小分子抑制剂。
因此，仍然需要在curcusone天然产物的全合成和化学蛋白质组学谱分析方面的合作工作。
发明内容
本公开内容涉及新的curcusone二萜类似物，涉及curcusone二萜和类似物的新的合成，以及涉及使用curcusone二萜和类似物的方法。
在一个实施方案中，本公开内容提供了式I化合物：
或任何立体异构体，其中R1是H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代。
在另一个实施方案中，本公开内容提供了制备curcusone化合物A、B、C和D或其异构体的合成方法，其中该方法包括：
提供式A化合物并在卤化条件下处理式A化合物以提供式B化合物；
在第一甲基化条件下处理式B化合物以提供式C化合物或其任何异构体；以及
在第二甲基化条件下处理式C化合物以提供式D化合物或其异构体，其中X是Cl、Br或I。
附图说明
图1示出了curcusone二萜及其合成。
图2示出了curcusone A至D、dimericursone A、及其类似物的全合成。
图3示出了BRAT1作为1d的细胞靶标的鉴定。(A)在进行24小时化合物处理(其中EC50值在括号中)之后，MCF-7细胞的生存力(n＝3)。(B)在MCF-7细胞中由探针37(10μM)富集的被1d竞争的蛋白质的散点图，其中突出显示了BRAT1(n＝3)。(C)用1d处理的过表达的FLAG-BRAT1裂解物的热位移测定的Western印迹(上)和定量(下)。(D)在竞争性牵出(pulldown)测定中用1d处理活细胞并通过探针37富集之后的BRAT1的Western印迹。(E)使用探针37在HeLa细胞中进行的BRAT1的牵出以及与1d剂量依赖性竞争的Western印迹(上图)和定量(下图)。所有误差棒均为S.D。
图4示出了另外的curcusone类似物41至43的合成。
具体实施方式
出于促进对本公开内容原理的理解的目的，现在将参考附图中所示出的一些实施方案并且将使用特定语言对其进行描述。然而，将理解，不旨在由此限制本公开内容的范围。
本文中使用的术语“经取代”是指其中包含的一个或更多个氢原子被一个或更多个非氢原子替代的官能团。本文中使用的术语“官能团”或“取代基”是指可被取代到或被取代到分子上的基团。取代基或官能团的一些实例包括但不限于：卤素(例如F、Cl、Br和I)；基团中的氧原子，所述基团例如羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氧代(羰基)、羧基包括羧酸、羧化物和羧酸酯；基团中的硫原子，所述基团例如硫醇基、亚砜基、砜基、磺酰基和磺酰胺基；基团中的氮原子，所述基团例如胺基、叠氮化物、羟胺、氰基、硝基、N-氧化物、酰肼和烯胺；以及多种其他基团中的其他杂原子。
可与经取代的碳(或其他例如氮)原子键合的取代基的一些非限制性实例包括：
F，Cl，Br，I，OR，OC(O)N(R)2，CN，NO，NO2，ONO2，叠氮基，CF3，OCF3，R，O(氧代)，S(硫逐)，C(O)，S(O)，亚甲基二氧基，亚乙基二氧基，N(R)2,SR,SOR,SO2R,SO2N(R)2,SO3R，(CH2)0- 2P(O)OR2，C(O)R，C(O)C(O)R，C(O)CH2C(O)R，C(S)R，C(O)OR，OC(O)R，C(O)N(R)2，OC(O)N(R)2，C(S)N(R)2，(CH2)0-2N(R)C(O)R，(CH2)0-2N(R)C(O)OR，(CH2)0-2N(R)N(R)2，N(R)N(R)C(O)R，N(R)N(R)C(O)OR，N(R)N(R)CON(R)2，N(R)SO2R，N(R)SO2N(R)2，N(R)C(O)OR，N(R)C(O)R，N(R)C(S)R，N(R)C(O)N(R)2，N(R)C(S)N(R)2，N(COR)COR，N(OR)R，C(＝NH)N(R)2，C(O)N(OR)R，或C(＝NOR)R，
其中R可以是氢或基于碳的部分，并且其中基于碳的部分本身可以被进一步取代；例如，其中R可以是氢、烷基、酰基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基或杂芳基烷基，其中任何烷基、酰基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基或杂芳基烷基或R可以独立地是单取代或多取代的；或者其中与氮原子或相邻氮原子键合的两个R基团可与一个或更多个氮原子一起形成可被单取代或独立地多取代的杂环基。
除非另有说明，否则本文中使用的术语“卤代”、“卤素”或“卤化物”基团本身或作为另外取代基的一部分意指氟、氯、溴或碘原子。本文中所述的化合物可包含一个或更多个手性中心，或者可另外地能够作为多种立体异构体存在。应当理解，在一个实施方案中，本文中所述的本发明不限于任何特定的立体化学要求，并且包含其的化合物和组合物、方法、用途和药物可以是光学纯的，或者可以是多种立体异构体混合物中的任一种，包括对映体的外消旋和其他混合物、非对映体的其他混合物等。还应当理解，立体异构体的这样的混合物可包含在一个或更多个手性中心处的单一立体化学构型，同时包含在一个或更多个其他手性中心处的立体化学构型的混合物。
类似地，本文中所述的化合物可包含几何中心，例如顺式、反式、E和Z双键。应当理解，在另一个实施方案中，本文中所述的本发明不限于任何特定的几何异构体要求，并且包含其的化合物和组合物、方法、用途和药物可以是纯的，或者可以是多种几何异构体混合物中的任一种。还应当理解，几何异构体的这样的混合物可包含在一个或更多个双键处的单一构型，同时包含在一个或更多个其他双键处的几何体的混合物。
本文中使用的术语“任选地经取代的”或“任选的取代基”意指所讨论的基团是未经取代的或者被指定取代基中的一个或更多个取代的。当所讨论的基团被超过一个取代基取代时，所述取代基可以是相同的或不同的。当使用术语“独立地”、“独立地是”和“独立地选自”时，其意指所讨论的基团可以是相同的或不同的。本文中限定的术语中的某些可在结构中出现超过一次，并且在出现这样的情况时，每个术语应被彼此独立地限定。
目前，获取足够量的天然产物例如curcusone二萜天然产物及其类似物用于全面生物学研究和治疗开发仍然是重大挑战，并阻碍了对其作用模式的研究。在此，我们报道了在curcusone天然产物的全合成和靶标鉴定中的合作工作，其在9个步骤中产生了curcusone A和B的第一次全合成，在10个步骤中产生了C和D，并在12个步骤中产生了dimericursone A，并且揭示了BRAT1为curcusone的关键细胞靶标。
Curcusone二萜(图1A)是从麻疯树(Jatropha curcas)中分离的，其是在用于多种疾病包括癌症的传统治疗中广泛使用的成分。在结构上，它们与瑞香烷型(daphnane)和巴豆烷(tigliane)二萜共用特征性[6-7-5]三环碳骨架。由Clardy及同事于1986年分离的curcusone A至D(1a至d)被明确鉴定为位于C2位的两个差向异构体对。从那时起，已经分离出约三十种curcusone分子包括curcusone F至J，其在七元环中缺乏二烯酮部分。最近发现了结构重排类似物(例如spirocurcasone(3))和二聚体类似物(例如dimericursone A(2a)和dimericursone B(2b))。其中，curcusone A至D(1a至1d)表现出针对广谱人癌细胞系的低微摩尔IC50值。然而，在本研究之前，未报道curcusone A至D(1a至1d)及其二聚体产物(2a和2b)的全合成，并且其作用模式仍未知。
虽然密切相关的瑞香烷型和巴豆烷二萜吸引了大量的合成兴趣，但是尽管curcusone分子具有治疗潜力但其出乎意料地极少受到关注。在2017年，我们报道了在21个步骤中curcusone I和J(1i和1j)的推定结构的首个全合成(图1B)，最终得出结论：最初提出的1i和1j二者的结构均不正确。参见Li,Y.；Dai,M.Total Syntheses of the ReportedStructures of Curcusones I and J through Tandem Gold Catalysis.Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,11624-11627。我们的合成涉及用于建立具有氧杂桥的5,7-稠环系统的经金催化的串联呋喃形成和呋喃-联烯[4+3]环加成、以及用于构建6元环的Diels-Alder反应。在2019年，Stoltz及同事报道了他们针对合成1a至1d的研究(图1C)。参见(a)Lee,C.W.；Taylor,B.L.H.；Petrova,G.P.；Patel,A.；Morokuma,K.；Houk,K.N.；Stoltz,B.M.AnUnexpected Ireland-Claisen Rearrangement Cascade During the Synthesis of theTricyclic Core of Curcusone C:Mechanistic Elucidation by Trial-and-Error andAutomatic Artificial Force-Induced Reaction(AFIR)Computations.J.Am.Chem.Soc.2019,141,6995-7004.(b)Wright,A.C.；Lee,C.W.；Stoltz,B.M.Progress toward the Enantioselective Synthesis of Curcusones A-D viaaDivinylcyclopropane Rearrangement Strategy.Org.Lett.2019,21,9658-9662.(c)Wright,A.C.；Stoltz,B.M.Enantioselective construction of the tricyclic core ofcurcusones A-D via a cross-electrophile coupling approach.Chem.Sci.2019,10,10562-10565。他们的方法的特征在于以巧妙的二乙烯基环丙烷-环庚二烯重排来形成7元环，并从8开始在12个步骤之后实现高级中间体14。
我们对可共价修饰细胞蛋白质的天然产物的持续兴趣促使我们继续进行具有亲电子环庚二烯酮部分的curcusone A至D(1a至1d)的全合成和靶标鉴定。这种独特的结构特征可以允许它们与某些细胞蛋白质的亲核残基形成共价键。先前的细胞毒性研究发现，C6-C7双键的还原和/或氧化极大地降低了其抗癌活性。因此，允许C6和C7取代基变化的方法将是高度期望的。我们设想15作为高级中间体(图1D)。α-卤化之后进行两次甲基化反应将生成1a和1b，其可通过α-羟基化被氧化成1c和1d。计划了闭环复分解(ring closingmetathesis，RCM)或分子内羟醛缩合以形成7元二烯酮(16/17→15)。16和17二者均可由乙烯基三氟甲磺酸酯18通过钯催化的羰基化交叉偶联来制备。在该阶段，C9-C10键的断开可将18断裂成两个简单的片段，但是直接形成分子间C-C键来构建这样的键是具有挑战性的。因此，我们选择了Claisen重排来以立体选择性方式形成该C-C键，并设计了有经掩蔽醛的19作为Claisen重排前体。19可由简单的结构单元20a/20b和21来组装。后者可来源于廉价的手性池分子(chiral pool molecule)(S)-(-)-紫苏醛8。
结果
全合成。我们的合成以制备23开始(图2)，其是从8开始在以下三个步骤中合成的已知化合物：延长的甲硅烷基烯醇醚形成、插烯(vinylogous)Mukaiyama羟醛反应和NaBH4还原。我们将前两个步骤组合成一锅反应；然后使粗品22直接进行NaBH4还原以在一个批次中产生多十克规模(multidecagram scale)的23。我们接下来需要制备24用于Claisen重排。在23与20b之间经NaH促进的加成-消除得到了24，尽管产率低(35％)。然后，我们使用23与20a之间的光延反应(Mitsunobu reaction)来制备24，但不能从24中分离出来源于偶氮二羧酸二乙酯的肼副产物。也探索了最近报道的氧化还原中性有机催化光延条件，但未能提供24。幸运的是，在Claisen重排中肼副产物可以是耐受的。在将24在DMF中在140℃至150℃下加热18小时之后，发生了Claisen重排，但重排产物25进一步环化而以自23的48％产率提供三环化合物26(CCDC 2033828)作为单个非对映体。
然后我们决定用26继续并探索隐藏的环戊烷-1,3-二酮对称性来合成17。我们以研究锂化乙基乙烯基醚(27)至26的1,2-加成开始，理论上整体水解会立即释放甲基酮和醛以形成用于羟醛缩合的17。该1,2-加成被证明是重要的。当使用两个当量的27时，仅获得小于10％产率的28。氯化铈和氯化镧因其亲氧性已被用于促进1,2-加成。遗憾的是，在我们的案例中二者都失败了。最终，通过将27的量提高至10当量而改善了1,2-加成，并且以57％的产率制备了28。然后将28用TsOH处理之后进行水解，并以自26的51％产率获得17。同时，我们高兴地在同一反应中观察到15的形成，尽管产率非常差(<5％)。我们被鼓励来实现整体水解/羟醛缩合级联在一个步骤中从28合成15，并确定与TMSCl组合的FeCl3为最佳条件。当在室温下用预混合的FeCl3(在2-甲基四氢呋喃中的0.2M)和在甲苯中的TMSCl处理粗品28时，期望的产物15以自26的32％产率产生以及产生21％的30b。使用FeCl3将17转化为15的失败和30b的分离使我们提出，FeCl3/TMSCl促进的级联过程通过中间体29和30a在一个步骤中形成15。在中间体30a中，α-Ha和EtO基团是反叠的，因此随后的1,2-消除是容易的并且在FeCl3/TMSCl条件下发生。在中间体30b中，α-Hb和EtO基团二者都位于伪赤道位置，这由NMR分析和计算建模支持。因此，将其转化为15更困难。为了使15的总产率最大化，我们研究了促进30b的1,2-消除的条件，并确定了在50℃下用在甲苯中的TsOH通过加热可将30b以65％的产率转化为15，这使自26的15总产率为46％。
在[6-7-5]三环碳主链仅在6个步骤中快速组装的情况下，我们接下来需要引入两个甲基。Johnsonα-碘化将15转化为出乎意料地不稳定的碘烯酮31。因此，在快速处理之后，将粗品31立即与四甲基锡烷进行接下来的Stille交叉偶联，以经2个步骤得到57％产率的32。最后，烯酮32在C2位置的α-甲基化以63％产率产生了可分离的(-)-curcusone A(1a)和(-)-curcusone B(1b)的1:1混合物(总共9个步骤)。用KHDMS和MoOPH对1a进行的α-羟基化以63％产率得到了可分离的(-)-curcusone C(1c)和(-)-curcusone D(1d)(d.r.1:1；84％brsm；总共10个步骤)。另外，为了获得用于生物活性比较的类似物，我们按照报道的一步过程将(-)-1b转化为(+)-spirocurcasone(3)和(-)-33(命名为pyracurcasone的合成衍生物)。我们的合成样品的1H、13C NMR和其他分析数据与报道的数据良好匹配，这也得出结论：由Clardy et al.在1986年指定的1a至1d绝对构型与实际构型相反。
然后，我们着手通过仿生二聚化从1a至1d合成dimericursone A(2a)。所提出的2a的生物合成由以下一系列组成：1a/1b的氧化脱氢或1c/1d的脱水以形成反应性环戊二烯酮中间体，随后是Diels-Alder二聚化和一氧化碳的螯键(cheletropic)挤出。8从那里，2a可以通过另外的氧化脱氢和双键异构化转化为2b。我们以1c和1d开始。在通过在升高的温度下直接加热它们来合成2a的尝试未果之后，首先将它们的1:1混合物转化为它们的甲磺酸酯(34)。在广泛探索之后，我们确定在150℃下在1,4-二氯苯中使用三乙胺作为碱经2个步骤以18％产率产生(-)-2a，这为支持提出的生物合成途径提供了直接证据。在我们的条件下，没有观察到2b的形成。
探针合成。为了阐明curcusone的抗癌机制并鉴定其潜在的细胞靶标，设计了经炔烃标记的探针分子37用于化学蛋白质组学研究。由于二烯酮可能具有蛋白质反应性并且对观察到的活性是至关重要的，我们决定使该部分的结构扰动最小化，并且使用叔醇作为柄(handle)与末端炔烃连接。通过DCC促进的与36的偶联，从(-)-1d以59％的产率合成37。
细胞毒性和靶标鉴定。我们使用WST-1测定评价了curcusone及其类似物在乳腺癌MCF-7细胞中的细胞毒性(图3A)。合成的1a至1d、天然的1b和1d以及中间体15和32表现出针对MCF-7细胞的微摩尔EC50值，其中1d是最有效的curcusone。重要的是，合成的1b和1d的细胞毒性值实际上与其天然分离的对应物的值相同。类似物33显示出稍微较好的抗增殖活性，这表明微调环庚二烯酮部分以改善效力的可行性，但2a即使在100μM下也无活性。可能由于测试的MCF-7细胞的完全汇合，我们获得的EC50值比先前报道的(1a至1d的EC50值为1.6至3.1μM)高约一个数量级。令人欣慰的是，37保留了与1d类似的抗癌特性，因此确认了其在竞争性化学蛋白质组学研究中的用途。
然后，我们使用探针37通过竞争性化学蛋白质组学鉴定了curcusone的细胞靶标。将MCF-7细胞用1d或DMSO处理4小时，然后裂解，用37处理，用生物素叠氮化物进行CuAAC，富集，消化，并使用无标记定量进行LC-MS/MS分析(图3B)。最佳竞争性靶标是BRAT1，其在DNA损伤之后通过与BRCA1结合并通过激活DDR激酶例如ATM和PRKDC(DNA-PKc)来充当DNA损伤响应(DNAdamage response，DDR)和DNA修复的主要调节子。敲低BRAT1在人骨肉瘤细胞中提高了组成型凋亡水平并且在体外和小鼠肿瘤异种移植物中降低了癌细胞增殖和致瘤性。BRAT1也是肾癌和肝癌的不良预后标志物。因此，靶向BRAT1是用于癌症治疗的有前景的策略。
我们接下来表征了1d与BRAT1之间的物理相互作用。我们在HEK-293T细胞中过表达FLAG-BRAT1，并且通过用1d处理裂解物、如指示进行加热、并通过Western印迹探测剩余的可溶性FLAG-BRAT1来进行热位移测定(图3C)。我们观察到经1d处理的BRAT1的热不稳定性，这表明直接相互作用。为了验证内源性BRAT1在活细胞中作为1d的靶标，我们采用了竞争性牵出实验。将MCF-7细胞用1d或DMSO处理4小时，随后进行裂解、用探针37处理、用生物素叠氮化物进行CuAAC、富集链霉亲和素、洗脱和Western印迹显现。实际上，天然BRAT1通过37富集，并被1d竞争(图3D)。另外，1d竞争从宫颈癌HeLa和三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞富集的BRAT1，因此验证了天然BRAT1在这些细胞系中作为1d的细胞靶标。在活HeLa细胞中原位处理的1d在低微摩尔浓度下竞争通过37富集的BRAT1(EC50＝2.7μM；图4E)。为了评价结合可逆性，我们使用不可逆半胱氨酸反应性探针碘乙酰胺(IAA)进行了竞争性BRAT1牵出测定。将HeLa裂解物在用IAA(30mM)预处理或后处理1小时的情况下用37(10μM)处理1小时，然后如上所述进行富集和Western印迹分析。实际上，用IAA预处理或后处理这两种情况均竞争通过37富集的BRAT1，这表明curcusone探针与BRAT1中的半胱氨酸形成共价键并且该键是可逆的。我们还将活HeLa细胞用不同浓度的1d处理4小时，以通过竞争性牵出测定来评价BRAT1靶标占有，其显示1d在2.7μM浓度下达到50％分数的占有(f occ.(50))(图3E)。总之，这些结果表明1d是BRAT1的第一小分子黏结剂。
BRAT1调节。为了确定1d在细胞中是否抑制BRAT1，我们通过shRNA逆转录病毒转导产生了稳定的BRAT1 KD HeLa细胞。然后，我们通过全面蛋白质组学分析比较了BRAT1 KD细胞与经1d处理的细胞(3μM，24小时)的蛋白质表达谱。在经化合物处理的细胞中的3347种经定量蛋白质中，我们仅发现36种上调蛋白质和42种下调蛋白质。重要的是，78种失调蛋白质中有31种在BRAT1 KD细胞中也失调，因此表明1d在细胞中在功能上抑制了BRAT1。值得注意的是，数种公知的癌症迁移和进展驱动因子下调，包括介导癌症迁移的TRIM47、真正的癌蛋白和潜在生物标志物WBP2、以及经常高度扩增的癌基因FNDC3B。这些蛋白质先前均未与BRAT1功能性连接。然后，我们研究了1d处理和BRAT1 KD对WT和BRAT1 KD HeLa细胞以及WTMCF-7和MDA-MB-231细胞中癌细胞迁移的作用。如所预期的，BRAT1敲低极大地减少了HeLa细胞的迁移，用1μM浓度的1d进行的处理也将所有细胞系的迁移降低了约4倍。
我们的全面蛋白质组学实验还揭示了数种常见的下调的关键DNA修复蛋白，例如：(i)POLD1，其在修复期间合成DNA；(ii)USP47，其促进碱基切除修复；(iii)FANCI，其介导DNA双链断裂和链间交联的修复；以及(iv)BRCC3，其稳定DNA断裂处BRCA1的累积。这些蛋白质先前也未与BRAT1连接。最值得注意的是，如通过Western印迹所确定的，1d处理(24小时)显著下调了实际物理靶标BRAT1(比率0.18)。为了评价这种作用是否是因为蛋白酶体降解或基因表达改变，我们针对1d处理的最后4小时添加了蛋白酶体抑制剂MG132，其恢复了BRAT1蛋白水平。相比之下，当我们在1d处理24小时之后通过RT-qPCR测量BRAT1mRNA水平时，我们未发现差异。总之，这些发现表明了BRAT1作为DDR的主要调节子的重要性，以及细胞中BRAT1的1d抑制随时间诱导蛋白酶体降解。
然后，我们研究了1d是否通过BRAT1抑制来增强临床药物和拓扑异构酶抑制剂依托泊苷的DNA损伤作用。用DMSO、依托泊苷、1d、或依托泊苷与1d组合来处理WT或BRAT1 KDHeLa细胞。然后使用γH2AX染色通过荧光显微术来测量随后的DNA损伤。用1d(3μM)处理或单独的BRAT1的KD未提高γH2AX信号。然而，1d与依托泊苷的共处理引起2倍提高。类似地，依托泊苷处理在BRAT1 KD细胞中显著提高了γH2AX信号，重现了1d/依托泊苷共处理结果。重要的是，1d处理在经依托泊苷处理的BRAT1 KD细胞中没有提高γH2AX信号，这确定了1d-依托泊苷协同作用与BRAT1失活相关。此外，1d与依托泊苷共处理还在HeLa、MCF-7和MDA-MB-231细胞中提高了细胞毒性。同样，相对于WT细胞，在依托泊苷处理之后BRAT1 KD HeLa细胞中的细胞死亡提高。总之，这些结果表明了用1d靶向BRAT1是用于对DNA损伤药物进行化学致敏的有前景的抗癌策略。
类似物合成。另外三种类似物(41至43)是由(-)-curcusone D(1d)通过与氨基酸38至40偶联而合成的(图4)。这些类似物可有助于验证叔醇位置可被修饰而不显著改变curcusone抗癌活性的观点，并为指导未来的类似物设计和制备以改善其药物样特性提供信息。
癌细胞增殖抑制。我们通过测试(-)-curcusone 1a至1d、(-)-dimericurcusone2a、(+)-spirocurcasone(3)、(-)-pyracurcasone(33)和半合成类似物41至43以及两种合成中间体(15和32)在乳腺癌MCF-7细胞中的细胞毒性而开始了我们的生物学研究。将细胞用多种浓度的化合物处理24小时，并且通过对细胞进行成像和WST-1测定来测量细胞生存力(图4a)。可能是由于测试的MCF-7细胞的完全汇合，我们获得的IC50值是先前报道的值(天然1a至1d的IC50值为1.6至3.1μM)的约一个数量级高。尽管如此，合成的curcusone 1a至1d、天然的1b和1d、以及合成中间体15和32表现出针对MCF-7细胞的微摩尔EC50值，其中curcusoneD(1d)显示出curcusone中最强的细胞毒性作用(13.8μM)。最重要的是，在我们的手中，合成的curcusone B(1b)和D(1d)的细胞毒性值实际上与其天然分离的对应物的细胞毒性值相同，这排除了我们的结果与报道的结果之间的IC50值差异是由样品来源(合成的vs.天然的)引起的可能性。另外，spirocurcasone(3)和pyracurcasone(33)的IC50值也是报道的值的约一个数量级高。21 3的高IC50值(62.7μM)强调了curcusone的环庚二烯酮部分的重要性，并且33(8.0μM)的稍微较好的抗增殖活性表明了可微调环庚二烯酮部分以改善效力。令人感兴趣的是，dimericursoneA(2a)在MCF-7细胞中没有显示出毒性。令人欣慰的是，我们的炔烃探针37和半合成的curcusone类似物41至43保留了亲本分子1d的抗癌特性，因此确认了37作为curcusone D细胞靶标发现的蛋白质组探针的用途。
总之，我们完成了curcusone天然产物的首个非对称全合成和靶标鉴定。我们的汇聚合成建立在廉价且丰富的手性池分子(8)上，并且特征在于热[3,3]-σ迁移重排和经FeCl3促进的整体水解/羟醛缩合级联，以快速构建关键的环庚二烯酮核心。该有效合成路线从(S)-(-)-8开始仅在9个步骤中产生curcusone A和B(1a和1b)，在10个步骤中产生curcusone C和D(1c和1d)，以及在12个步骤中产生dimericursone A(2a)。从1c/1d成功合成2a在实验上支持了所提出的Diels-Alder二聚化和螯键挤出生物合成。通过使用炔烃探针37进行化学蛋白质组学，我们将先前“无成药性”的致癌蛋白BRAT1鉴定为1d的关键细胞靶标。此外，1d在癌细胞中抑制BRAT1，从而降低癌细胞迁移、提高对DNA损伤的易感性、以及诱导对已批准药物依托泊苷的化学敏感性。据我们所知，1d是BRAT1的第一个已知的小分子抑制剂，所述BRAT1为DDR和DNA修复的主要调节子。许多有前景的靶向DDR蛋白(例如作为单一治疗或与其他治疗组合的PARP、ATR、ATM、CHK和DNA-PK)的临床试验正在进行中。PARP抑制剂奥拉帕尼(Olaparib)于2014年被FDA批准作为单一治疗来治疗种系BRCA1/2-突变体卵巢癌。我们的简明和汇聚全合成为curcusone类似物合成和结构-活性优化打开了大门，这因此可产生作为用于单一治疗或组合治疗的潜在先导药物的新的BRTAT1抑制剂。
一般方法。在Bruker光谱仪上记录NMR谱(在400MHz、500MHz、800MHz下的1H和在100MHz、125MHz、200MHz下的13C)。化学位移(δ)以ppm并参考溶剂信号[1H NMR：CHCl3(7.26)；13C NMR：CDCl3(77.16)，C6D6(128.02)，CD3OD(49.0)]来给予。在硅胶上进行柱色谱。除非另有说明，否则所有对空气或水分敏感的反应均在氩气氛下在无水条件下在干燥且新鲜蒸馏的溶剂中进行。无水THF和甲苯在氩下经二苯甲酮羰自由基钠(sodiumbenzophenone ketyl)蒸馏。无水CH2Cl2在氩下经氢化钙蒸馏。使用的所有其他溶剂和试剂均从商业来源获得而无需进一步纯化。室温(r.t.)为约23℃。
实验程序和谱数据
在0℃下向(S)-(-)-紫苏醛8(7.8mL，50mmol)在CH2Cl2(500mL)中的溶液中添加三乙胺(10.5mL，75.0mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(13.8mL，60.0mmol)。将反应混合物温热至室温并搅拌25分钟。然后将反应混合物冷却至0℃，然后添加原甲酸三乙酯(33.3mL，200mmol)和三氟化硼二乙醚(8.0mL，65mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌25分钟，然后将其用饱和碳酸氢钠水溶液(250mL)猝灭，并用CH2Cl2(2×100mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)、过滤并浓缩，以得到粗品22，其直接用于下一步。
将上述粗剩余物22溶解在CH2Cl2(500mL)和EtOH(100mL)的混合物中。在0℃下添加硼氢化钠(4.73g，125mmol)。将反应混合物在室温下剧烈搅拌2小时，然后将其用水(200mL)猝灭，并用CH2Cl2(3×100mL)萃取。将合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，并在真空中浓缩。将剩余物通过柱色谱(己烷/EtOAc＝4/1至2/1)纯化，以得到作为浅黄色液体的已知化合物23(10.1g，73％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.82(br m，1H)，4.78(br m，1H)，4.74(br m，1H)，4.35(d，J＝3.9Hz，1H)，4.05-3.98(br s，2H)，3.74(dq，J＝9.7，7.1Hz，1H)，3.59(dq.J＝9.2，7.0Hz，1H)，3.49(dp，J＝9.7，7.0Hz，2H)，2.49-2.43(m，1H)，2.26(ddd，J＝10.8，9.1，3.2Hz，1H)，2.11-2.05(m，2H)，1.74-1.69(m，4H，包括s，3H，at δ＝1.72)，1.65-1.57(m，2H)，1.21(t，J＝7.0Hz，3H)，1.18(t，J＝7.1Hz，3H).13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝148.0，138.8，121.4，110.9，104.2，67.5，64.2，63.1，43.1，42.3，27.7，25.2，19.9，15.4，15.3；[α]D 25＝+77.0(c0.5，CHCl3)[[α]D 27＝+75.6(c1.0，CHCl3)]。
向醇23(8.44g，33.2mmol)在THF(500mL)中的溶液中添加1，3-环戊烷二酮(7.90g，80.5mmol)和三苯基膦(21.8g，83.1mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，并然后冷却至0℃。在0℃下在5分钟的时间内，添加偶氮二羧酸二乙酯溶液(在甲苯中的40重量％，37.8mL，83.0mmol)，并将所得棕色溶液立即置于经预热的油浴(50℃)中。将反应混合物在50℃下搅拌25分钟，并然后冷却至室温。在减压下除去THF，得到黑色油状物，将其通过Et2O(300mL)稀释并经Celite过滤。浓缩滤液，并将剩余物通过柱色谱(己烷/EtOAc＝10/1至2/1)纯化，以得到橙色固液混合物。向该粗产物中添加100mL己烷。将混合物声处理2分钟，并然后过滤。在减压下浓缩滤液，以得到作为橙色液体的24(10.2g，包含痕量的三苯基氧化膦和1，2-肼二甲酸二乙酯)，其直接用于下一步。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.99(s，1H)，5.33(s，1H)，4.82-4.80(m，1H)，4.76-4.74(m，1H)，4.41(s，2H)，4.37(d，J＝3.7Hz，1H)，3.75(dq，J＝9.6，7.0Hz，1H)，3.61(dq，J＝9.3，7.0Hz，1H)，3.54-3.44(m，2H)，2.64-2.59(m，2H)，2.52-2.47(m，1H)，2.45-2.41(m，2H)，2.27(ddd，J＝10.3，9.3，3.1Hz，1H)，2.13-2.07(m，2H)，1.78-1.70(m，4H，包括s，3H，at δ＝1.73)，1.64(dddd，J＝12.8，10.9，8.7，6.9Hz，1H)，1.22(t，J＝7.0Hz，3H)，1.19(t，J＝7.1Hz，3H)；13C NMR (125MHz，CDCl3)δ＝206.3，190.3，147.7，133.0，126.9，111.4，105.3，103.9，76.4，64.5，63.4，42.9，42.7，34.1，28.8，27.6，25.4，19.9，15.615.4；
HRMS(ESI)：C20H30O4Na[M+H]+的m/z计算值：357.2036，实测值：357.2034。IR(膜)：2974，2927，1702，1675，1587，1439，1385，1336，1247，1177，1110，1090，1056cm-1；[α]D 23＝+59.3(c＝0.3，CHCl3)。
将插烯酯24(10.2g，30.5mmol)在DMF(250mL)中的溶液在140℃至150℃下加热18小时。在完成之后，将反应混合物冷却至室温，用Et2O(500mL)稀释，并用饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)随后用水(2×100mL)洗涤。将合并的水层进一步用Et2O(2×100mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱(己烷/EtOAc＝10/1至4/1至2/1)纯化，以得到作为橙色固体的26(4.57g，48％，从24经2个步骤)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.07(d，J＝2.2Hz，1H)，4.87-4.85(m，1H)，4.83-4.81(m，1H)，4.81-4.79(m，1H)，4.56(s，1H)，3.79(dq，J＝9.7，7.0Hz，1H)，3.56(dq，J＝9.7，7.1Hz，1H)，2.99(d，J＝11.5Hz，1H)，2.65-2.57(m，1H)，2.54-2.35(m，5H)，2.24(td，J＝13.1，4.6Hz，1H)，1.84(dtd，J＝12.8，4.4，2.4Hz，1H)，1.67(s，3H)，1.59(td，J＝11.3，2.3Hz，1H)，1.51(qd，J＝12.9，4.6Hz，1H)，1.18(t，J＝7.1Hz，3H)；13C NMR (125MHz，CDCl3)δ＝202.6，182.8，146.1，145.9，116.2，112.5，107.7，101.2，65.4，46.8，46.4，36.4，35.9，34.5，33.6，26.4，19.0，15.2；IR(膜)：2976，2930，1697，1627，1394，1163，1076cm-1；
HRMS(ESI)：C18H25O3[M+H]+的m/z计算值：289.1798，实测值：289.1798；[α]D 24＝-251.6(c＝0.5，CHCl3)。
在氩下，在-78℃下向乙基乙烯基醚(0.64mL，6.94mmol)在无水THF(12mL)中的溶液中逐滴添加t-BuLi(在戊烷中的1.7M，4.2mL，6.94mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌5分钟，并然后温热至0℃并进一步搅拌30分钟。将混合物重新冷却至-78℃，并添加TMEDA(1.0mL)。在搅拌30分钟之后，缓慢添加无水THF(2.0mL)中的化合物26(200mg，0.69mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，并然后温热至0℃并搅拌30分钟。用H2O(10mL)和Et2O(15mL)猝灭反应。将水层用Et2O(5mL)萃取，并将合并的有机层经Na2SO4干燥、过滤并在真空中浓缩。粗产物28用于下一步而无需纯化。
在室温下，将FeCl3(在2-Me-THF中的0.2M，3.5mL，0.69mmol)和TMSCl(37mg，0.35mmol)与甲苯(5mL)在反应烧瓶中预混合。将甲苯(3mL)中的粗化合物28(上述制备的)在2小时中通过注射泵缓慢地逐滴添加至反应混合物中。在室温下将反应进一步搅拌20小时。然后将反应混合物用H2O(5mL)猝灭并分离。用Et2O(15mL)萃取水相。将合并的有机相用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗剩余物通过柱色谱(己烷中的10％EtOAc)纯化，以得到作为白色固体的15(59mg，32％产率，从26经2个步骤)和作为无色油状物的30b(45mg，自26的21％)。
化合物15：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝6.25(dd，J＝11.8，4.6Hz，1H)，6.11(dd，J＝11.8，2.3Hz，1H)，4.87(t，J＝1.7Hz，1H)，4.84(s，1H)，4.79(s，1H)，4.24(s，1H)，3.26(dt，J＝12.3，3.2Hz，1H)，3.02-2.96(m，1H)，2.69(ddd，J＝11.8，4.6，2.3Hz，1H)，2.66-2.60(m，1H)，2.48(dd，J＝5.4，4.5Hz，2H)，2.47-2.43(m，1H)，2.40(td，J＝11.8，4.3Hz，1H)，2.30(td，J＝12.5，4.7Hz，1H)，1.93-1.88(m，1H)，1.61(s，3H)，1.50(ddd，J＝12.6，4.8Hz，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝209.6，194.8，160.6，149.4，149.1，146.7，143.4，133.3，113.8，108.6，51.4，46.3，44.1，36.4，34.4，34.0，26.7，18.8；IR(膜)：2928，1713，1637，1442，1376，1173，899cm-1；
HRMS(ESI)：C18H21O2[M+H]+的m/z计算值：269.1536，实测值：269.1537；[α]D25＝-303(c＝0.2，CHCl3)。
化合物30b：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝4.85(s，1H)，4.80(s，1H)，4.68(s，1H)，4.08(s，1H)，3.71(dd，J＝3.6，3.6Hz，1H)，3.53-3.47(m，1H)，3.38-3.33(m，1H)，3.32(d，J＝10.7Hz，1H)，3.04-2.96(m，2H)，2.68(dd，J＝18.7，4.1Hz，1H)，2.61-2.54(m，1H)，2.52-2.45(m，3H)，2.42-2.38(m，1H)，2.33(dd，J＝12.8，4.3Hz，1H)，1.89-1.86(m，1H)，1.78(t，J＝11.0Hz，1H),1.61(s，3H)，1.49(qd，J＝13.0，5.0Hz，1H)，1.07(t，J＝6.9Hz，3H)，13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝209.6，203.0，160.7，150.6，149.0，113.4，106.7，72.8，65.6，50.5，49.7，49.6，43.7，36.4，34.8，34.2，26.6，19.1，15.7；IR(膜)：2926，2856，1713，1660，1442，1377，1261。1181，1089cm-1；
HRMS(ESI)：C20H27O3[M+H]+的m/z计算值：315.1954，实测值：315.1953；[α]D 25＝-198(c＝0.057，CHCl3)。
将化合物30b(45mg，0.14mmol)和TsOH(2mg，0.01mmol)在甲苯(1.5mL)中的溶液在50℃下搅拌20小时。将反应混合物冷却至室温并用H2O(1mL)猝灭。将水层用Et2O(5mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗剩余物通过柱色谱(SiO2，己烷中的10％ EtOAc)纯化，以得到作为白色固体的烯酮15(24mg，65％)。
在室温下向烯酮15(10mg，0.037mmol)在无水CH2Cl2/吡啶(2ml，5:1)中的溶液中添加I2(28mg，0.11mmol)和DMAP(13.4mg，0.11mmol)。将反应混合物在室温下搅拌5小时，然后用H2O(2mL)猝灭。将混合物通过Celite过滤，并分离各层。将有机层用H2O、盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。粗产物31用于下一步而无需纯化。
在室温下向粗品31(上述制备的)在DMF(2mL，用氩脱气)的溶液中添加Pd(dppf)Cl2(3mg，0.0034mmol)、CuI(2mg，0.01mmol)和Me4Sn(2滴)。将反应混合物用氩鼓泡10分钟，并然后放入油浴(在60℃下预加热)中。将混合物在60℃下搅拌1小时，然后冷却至室温并随后用Et2O(6mL)和H2O(2mL)稀释。将有机层用H2O(2mL)、盐水(2mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗剩余物通过硅胶柱色谱(己烷中的10％ EtOAc)纯化，以得到作为白色固体的烯酮32(4.7mg，45％，从15经2个步骤)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.87(dq，J＝5.2，1.5Hz，1H)，4.84(s，1H)，4.82(s，1H)，4.76(s，1H)，4.20(s，1H)，3.15(d，J＝12.3Hz，1H)，3.07-3.01(m，1H)，2.62-2.25(m，2H)，2.48(d，J＝4.20Hz，1H)，2.47(d,J＝3.7Hz，1H)，2.43(dddd，J＝12.7，4.4，2.7，2.7，Hz，1H)，2.35(td,J＝11.9，4.1Hz，1H)，2.28(td，J＝12.8，4.3Hz，1H)，1.91-1.86(m，1H)，1.85(t，J＝1.5Hz，3H)，1.56(s，3H)，1.46(qd，J＝12.7，4.4Hz，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝209.9，198.7，161.2，149.3，148.9，147.0，141.0，136.5，113.4，108.4，51.8，45.9，43.8，36.7，34.6，34.0，27.3，19.6，18.8；IR(膜)：2930，2864，1728，1646，1442，1170cm-1；
HRMS(ESI)：C19H23O2[M+H]+的m/z计算值：283.1693，实测值：283.1693；[α]D 24＝-418(c＝0.06，CHCl3)。
在氩气氛下，在-78℃下向32(10mg，0.036mmol)在无水THF(2mL)中的溶液中逐滴添加KHMDS(THF中的1.0M，40μL，0.04mmo))溶液。将混合物搅拌约30分钟，然后添加MeI(8μL，0.12)。将反应混合物搅拌3小时，并然后用饱和NH4Cl水溶液(2mL)猝灭。将水层用EtOAc(4mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗剩余物通过硅胶柱色谱(在己烷中的5至10％EtOAc)纯化，以得到(-)-curcusone A(1a，2.1mg，20％)、(-)-curcusone B(1b，2.3mg，21％)和回收的化合物32(5.1mg，50％)。
(-)-Curcusone A(1a)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.86(m，1H)，4.84(s，1H),4.82(s，1H)，4.76(s，1H),4.20(s，1H)，3.14(d,J＝12.1Hz,1H),2.82(ddd，J＝18.5，6.8,3.1Hz，1H)，2.63-2.58(m，2H)，2.46-2.41(m，2H)，2.35(ddd，J＝12.0，12.0，4.2Hz,1H),2.28(ddd，J＝12.8，12.8，4.6Hz，1H)，1.90-1.86(m，1H)，1.83(dd，J＝1.7，1.7Hz，3H)；1.59(s，3H)，1.47(dddd，J＝12.8，12.8，12.8，4.7Hz，1H)，1.25(d，J＝7.5Hz，3H)，13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝212.7，199.1，160.5，149.0，147.7，147.0，141.2，136.4，113.4，108.2，51.9，45.6，43.9，39.2，36.7，36.3，34.6，19.6，18.8，17.8；IR(膜)：2923，2853，1713，1660，1454，1149cm-1；
HRMS(ESI)：C20H25O2[M+H]+的m/z计算值：297.1849，实测值：297.1850；[α]D 25＝-311(c＝0.05，CH2Cl2)。
(-)-Curcusone B(1b)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.87(m，1H)，4.82(dd，J＝1.6，1.6Hz，1H)，4.81(s，1H)，4.74(s，1H)，4.20(s，1H)，3.31(ddd,J＝18.4,7.3,2.5Hz,1H)，3.15(dt，J＝12.3，3.0Hz，1H)，2.59(m，1H)，2.49(ddd，J＝7.5，7.5，3.4Hz，1H)，2.42(ddd，J＝12.5，4.5，4.5Hz，1H),2.34(ddd，J＝12.0，12.0，4.1Hz，1H)，2.27(ddd，J＝12.8，12.8，4.5Hz，1H)，2.16(ddd，J＝18.5，3.5，3.5Hz，1H)，1.88-1.85(m，1H)，1.84(dd，J＝1.6，1.6Hz，3H)，1.59(s，3H)，1.45(dddd，J＝12.8，12.8，12.8，4.6Hz，1H)，1.21(d，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝212.1，198.5，158.6，149.0，148.8，147.0，141.0，136.7，113.4，108.3，51.9，46.0，43.8，39.8，36.7，36.4，34.6，19.6，18.8，14.7；IR(膜)：2955，2929，1780，1715，1382，1249，1093cm-1；
HRMS(ESI)：C20H25O2[M+H]+的m/z计算值：297.1849，实测值：297.1850；[α]D 25＝-477(c＝0.3，CH2Cl2)。
在氩气氛下在-78℃下，向1a和1b的1∶1混合物(5mg，0.017)在无水THF(2mL)中的溶液中添加KHMDS(在THF中的1.0M，20μL，0.02mmol)溶液。然后在相同温度下将反应混合物搅拌30分钟，然后添加MoOPH(12mg，0.026mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌约2小时，然后用饱和NH4C1水溶液(2mL)猝灭。将水相用EtOAc(5mL)萃取，并将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩。将粗剩余物通过硅胶柱色谱(在己烷中的10至20％EtOAc)纯化，以得到(-)-curcusone C(1c，1.8mg，34％)、(-)-curcusone D(1d，1.54mg，29％)以及回收的curcusone A和B的混合物(1.2mg，24％)。
(-)-Curcusone C(1c)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.86(m，1H)，4.85(dd，J＝1.7，1.7Hz,1H),4.80(s,1H)，4.75(s,1H)，4.18(s，1H)，3.17(m，1H)，3.13(dd,J＝18.6，2.5Hz，1H)，2.68(dd，J＝18.3，3.6Hz,1H)，2.66-2.60(m，1H)，2.52(brs，1H)，2.41(ddd，J＝12.5，4.4，2.7Hz，1H)，2.35(ddd，J＝1 1.9，1 1.9，4.2Hz，1H)，2.23(ddd，J＝12.5，12.5，4.4Hz，1H)，1.92-1.87(m，1H)，1.85(dd，J＝1.7，1.7Hz，3H)，1.59(s，3H)，1.45(m，1H)，1.44(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝212.3，198.4，158.1，148.7，146.8，145.4，141.2，136.9，113.6，108.3，74.7，52.0，45.4，43.7，43.5，36.7，34.6，26.3，19.6，18.9；IR(膜)：3432，2924，2854，1722，1648，1450，1376，1052cm-1；
HRMS(ESI)：C20H25O3[M+H]+的m/z计算值：313.1798，实测值：313.1800；[α]D 23＝-340(c＝0.1，CH2Cl2)。
(-)-Curcusone D(1d)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.94(m，1H)，4.85(s，1H)，4.83(s，1H)，4.78(s，1H)，4.42(s，1H)，3.14(dd，J＝12.1，3.1Hz，1H)，3.08(dd，J＝18.2，3.0Hz，1H)，2.66(dd，J＝18.2，3.0Hz，1H)，2.66-2.60(m，1H)，2.43(ddd，J＝12.5，4.7，3.0Hz，1H)，2.34(ddd，J＝11.9，11.9，4.3Hz，1H)，2.28(ddd，J＝12.4，12.4，4.6Hz，1H)，2.18(brs，1H)，1.91-1.88(m，1H)，1.84(s，3H)，1.59(s，3H)，1.49(dddd，J＝12.5，12.5，12.5，4.8Hz，1H)，1.38(s，3H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)δ＝209.3,197.5，158.4，148.3，146.9，146.0，140.9，137.5，113.5，109.1，73.0，51.5，45.6，43.8，43.1，36.4，34.3，24.0，19.7,18.8；IR(膜)：3420，2926，2856，1717，1648，1451，1375，1054cm-1；
HRMS(ESI)：C20H25O3[M+H]+的m/z计算值：313.1798，实测值：313.1797；[α]D 23＝-352(c＝0.1，CH2Cl2)。
在氩气氛下在0℃下，向1c和1d的1：1混合物(5mg，0.016mmol)在CH2Cl2(2mL)中的溶液中添加MsCl(4μL，0.05mmol)和Et3N(7μL，0.05mmol)。将反应混合物在相同温度下搅拌约1小时，然后用饱和NH4Cl水溶液(2mL)猝灭。分离层，并将水层用CH2Cl2(5mL)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩，以得到相当纯的粗产物，其直接用于下一步而无需进一步纯化。
将上述粗产物溶解在对二氯苯(2mL)中，然后添加Et3N(4.5μL，0.03mmol)。然后将混合物在150℃下加热2小时。将反应混合物冷却至室温并在真空中浓缩。将粗剩余物通过柱色谱(SiO2，在己烷中的10％EtOAc)纯化，以得到作为黄色固体的-dimericursone A(2a，1.25mg，18％，经2个步骤)。
(-)-dimericursone A 2a：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝6.17(s，1H),5.72(brs，1H)，5.42(dd，J＝5.6，1.7Hz，1H)，4.90(s，1H)，4.83(s，1H)，4.82(dd，J＝1.5Hz，1H)，4.79(dd，J＝1.5Hz，1H)，4.76(s，1H)，4.74(s，1H)，4.66(s，1H)，4.10(s，1H)，3.83(d，J＝2.8Hz，1H)，3.72(d，J＝11.3Hz.1H)，2.99(dd，J＝12.0，2.7Hz，1H)，2.55(ddd，J＝11.4，4.5，1.9Hz，1H),2.45-2.40(m,3H),2.35-2.25(m，4H),1.91-1.82(m，2H)，1.78(s，3H)，1.72(dd，J＝1.6，1.6Hz，3H)，1.58(s，3H)，1.57(s，3H)，1.55(6H)，1.45(dq，J＝12.8，4.4Hz，2H)，1.25(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝207.3，202.8，199.2，162.8，151.1，148.6，147.1，147.0，146.8，144.6，142.9，141.1，135.3，135.0，133.8，130.2，119.6,113.2，113.2，110.1，108.2,59.1,56.8，53.7，51.4,50.5，46.0，44.2，44.0，36.5，36.0，34.3，34.3，20.9，19.5，18.8，18.6，18.1，17.9；IR(膜)：2926，2855，1715，1679，1646，1448，1375cm-1；
HRMS(ESI)：C39H45O3[M+H]+的m/z计算值：561.3363，实测值：561.3362；[α]D 25＝-742(c＝0.1，MeOH)；报道的：[α]D 20＝-887(c＝0.43，MeOH)。
在火焰干燥的8mL小瓶中，将(-)-curcusone B(1b，20.0mg，0.067mmol)溶解在MeOH(3ml)中，并用O2随后用TMEDA(15.7mg，0.13mmol)冲洗溶液。将反应加热至50℃并在该温度下搅拌过夜。在将反应冷却之后，在真空中除去溶剂。将粗产物通过制备型TLC(己烷中的2％EtOAc)纯化，以获得作为白色固体的(+)-spirocurcasone(3)(12.0mg，60％产率)和作为白色固体的(-)-pyracurcasone(33)(4.5mg，21％)。
(+)-Spirocurcasone(3)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.27(s，1H)，6.59(s，1H)，4.93(s，1H)，4.84(s，1H)，4.65(s，1H)，4.17(s，1H)，3.16(dt，J＝18.7，2.4Hz，1H)，3.06(d，J＝10.7Hz，1H)，2.46(ddd，J＝18.7，3.3，1.9Hz，1H)，2.35(m，1H)，2.31(m，1H)，2.18(td，J＝13.5，3.9Hz，1H),2.11(td，J＝11.9，3.7Hz，1H)，1.88(d,J＝1.9Hz，3H)，1.85-1.81(m，1H)，1.73-1.72(m，2H)，1.52(m，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝208.7，199.5，153.6，146.8，146.3，145.6，144.2，133.4，113.5，106.9，60.7，50.6，48.1，41.1，37.0，33.8,33.1，19.4，16.2，10.5；IR(膜)：2922，2854，1716，1664，1643，1440，1376，1330，1241，1103，896cm-1；
HRMS(ESI)：C20H24NO2[M+H]+的m/z计算值：297.1849，实测值：297.1850；[α]D 22＝+71(c＝0.4，CHCl3)。
(-)-Pyracurcasone(33)：
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝7.75(d，J＝1.2Hz，1H)，5.84(dd，J＝5.5，1.7Hz，1H)，4.84-4.83(m，2H)，4.61(s，1H)，4.21(s，1H)，3.64(d，J＝12.2Hz，1H)，2.58-2.51(m，1H)，2.49(ddd，J＝12.6，4.7，2.6Hz，1H)，2.45-2.36(m，2H)，1.94(d，J＝1.2Hz，3H)，1.90(td，J＝4.4，2.5Hz，1H)，1.87(t，J＝1.6Hz，3H)，1.60(s，3H)，1.49(ddd，J＝12.8，12.8，4.7Hz，1H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝193.5，180.6，154.9，151.0，150.6，146.9，140.2，135.9，131.4，125.1，113.4，106.2，51.9，46.7，43.0，36.8，34.5，19.1，18.8，11.2；IR(膜)：2925，2856，1683，1643，1451，1333，1190，1122，892cm-1；
HRMS(ESI)：C20H22NO3[M+H]+的m/z计算值：311.1642，实测值：311.1641；[α]D 22＝-393(c＝0.15，CHCl3)。
将(-)-curcusone D(1d，8mg，0.026mmol)溶解在CH2Cl2(0.5mL)中，然后逐滴添加戊-4-炔酸(3.9mg，0.04mmol)。在溶液变澄清之后，添加DCC(8.3mg，0.04mmol)，然后添加DMAP(0.6mg，0.005mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物用H2O(2mL)猝灭，并分离层。将水层用CH2Cl2(3mL)萃取，并将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗产物通过制备型TLC(在己烷中的20％EtOAc)纯化，以获得探针分子37(6mg，59％)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.97-5.96(m，1H)，4.85-4.84(m，1H)，4.83-4.82(m，3H)，3.38(dd，J＝17.4，3.4Hz，1H)，3.14-3.11(m，1H)，2.72-2.66(m，1H)，2.63(dd，J＝17.4，3.4Hz，1H)，2.59-2.55(m，1H)，2.56(d，J＝6.9Hz，1H)，2.49-2.46(m，2H)，2.43(ddd，J＝12.7，5.0，3.2Hz，1H)，2.33(td，J＝11.9，4.4Hz，1H)，2.28-2.22(m，1H)，1.98(t，J＝2.6Hz，1H)，1.88-1.86(m，1H)，1.85(t，J＝1.6Hz，3H)，1.59(s，3H)，1.52(dd，J＝12.5，5.0Hz，1H)，1.38(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝204.8，197.6，170.5，157.4，147.3，147.0，145.6，140.8，138.1，113.5，110.3，82.2，80.0，69.4，51.6，46.3，43.8，40.7，36.3，34.2，33.2，24.1，19.7，18.8，14.4；IR(膜)：2923，2853，1722，1661，1451，1375，1272，1163，1114，713cm-1；
HRMS(ESI)：C25H28O4[M+H]+的m/z计算值：393.2060，实测值：393.2059。
基于以下方案制备类似物45至47：
类似物41：将(-)-curcusone D(1d，24.0mg，0.077mmol)溶解在CH2Cl2(0.8mL)中，然后溶解在二甲基甘氨酸(18.0mg，0.15mmol)中。在将溶液搅拌5分钟之后，一次性添加EDC盐酸盐(15.3mg，0.08mmol)，然后添加DMAP(38mg，0.31mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物加载在制备型TLC(在己烷中的40％EtOAc)上并通过其进行纯化，以获得作为白色固体的产物41(6.7mg，22％产率)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝5.99-5.98(m，1H)，4.85-4.81(m，4H)，3.38(dd，J＝17.3，3.4Hz，1H)，3.23(d，J＝2.5Hz，1H)，3.13(d，J＝12.3Hz，1H)，2.73-2.67(m，1H)，2.65(dd，J＝17.2，2.5Hz，1H)，2.43(ddd，J＝12.6，5.1，3.3Hz，1H)，2.40-2.30(s，6H)，2.28-2.36-2.18(m，3H)，1.88-1.83(m，1H)，1.85(t，J＝1.6Hz，3H)，1.59(s，3H)，1.56-1.48(m，1H)，1.38(s，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝204.7，197.4，169.1，157.4，147.1，147.0，145.6，140.7，138.4，113.5，110.5，80.2，59.9，51.4，46.4，45.2，43.7，40.6，36.2，34.0，24.2，19.7，18.8；IR(膜)：3357，2923，2853，1728，1663，1434，1373，1243，1045，712，610cm-1；
HRMS(ESI)：C24H31NO4[M+H]+的m/z计算值：398.2326，实测值：398.2326。
类似物42：将(-)-curcusone D(1d，16.0mg，0.05mmol)溶解在CH2Cl2(0.8mL)中，然后溶解在二乙基甘氨酸(13.1mg，0.10mmol)。在将溶液搅拌5分钟之后，一次性添加EDC盐酸盐(22.0mg，0.11mmol)，然后添加DMAP(29mg，0.15mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物加载在制备型TLC(在己烷中的40％EtOAc)上并通过其进行纯化，以获得作为白色固体的产物42(9.0mg，42％产率)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝6.00-5.95(m，1H)，4.93-4.75(m，4H)，3.44-3.30(m，3H)，3.16-3.09(m，1H)，2.73-2.56(m，6H)，2.43(ddd,J＝12.6，5.1，3.3Hz，1H)，2.32(td，J＝11.8，4.5Hz，1H)，2.28-2.20(m，1H)，1.90-1.76(m，1H)，1.85(t，J＝1.6Hz，3H)，1.59(t，J＝1.0Hz，3H)，1.57-1.44(m，1H)，1.37(s，3H)，1.05(t，J＝7.1Hz，6H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝204.8，197.5，170.2，157.3，147.1，145.7，140.7，138.3，113.5，110.6，79.9，53.8，51.5，48.0，46.4，43.7，40.6，36.2,34.1，24.2，19.7，18.8，12.4(缺失一个sp2碳)；IR(膜)：2923，2853，1724，1650，1434，1374，1243，1097，1046,712，612cm-1；
HRMS(ESI)：C26H35NO4[M+H]+的m/z计算值：426.2639，实测值：426.2638。
类似物43：将(-)-curcusone D(1d，16.0mg，0.05mmol)溶解在CH2Cl2(0.8mL)中，然后溶解在吗啉-4-基-乙酸盐酸盐(18.0mg，0.10mmol)中。在将溶液搅拌5分钟之后，一次性添加EDC盐酸盐(19.0mg，0.10mmol)，然后添加DMAP(31mg，0.25mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物加载在制备型TLC(在己烷中的40％EtOAc)上并通过其进行纯化，以获得作为白色固体的产物43(6.7mg，15％产率)。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ＝6.06-5.90(m，1H)，4.84(t，J＝1.7Hz，1H)，4.83-4.81(m，3H)，3.74(t，J＝4.7Hz，4H)，3.37(dd，J＝17.4，3.4Hz，1H)，3.26(s，2H)，3.17-3.10(m，1H)，2.73-2.65(m，1H)，2.66(dd，J＝17.3，2.5Hz，1H)，2.59(d，J＝4.9Hz，4H)，2.43(ddd，J＝12.6，5.1，3.3Hz，1H)，2.32(td，J＝11.9，4.5Hz，1H)，2.29-2.20(m，1H)，1.91-1.79(m，1H)，1.85(t，J＝1.7Hz，3H)，1.59(d，J＝1.2Hz，3H)，1.57-1.47(m，1H)，1.38(s，3H)；门C NMR(125MHz，CDCl3)δ＝204.6，197.3，168.8，157.4，147.2，147.0，145.6，140.6，138.4，113.5，110.5，80.3，66.8，59.3，53.2，51.4，46.4，43.7，40.6，36.1，34.0，24.1，19.7，18.8；IR(膜)：2923，2853，1720，1660，1452，1375，1273，1113，1026，712cm-1；
HRMS(ESI)：C26H33NO5[M+H]+的m/z计算值：440.2431，实测值：440.2431。
生物学方法
细胞培养和裂解物的制备
将HeLa、MCF-7和MDA-MB-231细胞维持在补充有10％胎牛血清(FCS，Gibco10437028)、1×MEM非必需氨基酸溶液(100×Gibco11140050)和1×青霉素-链霉素(pen-strep，100×Sigma-Aldrich P4333)的DMEM(Corning MT10013CV)中。将细胞培养在37℃下在5％ CO2气氛下。将细胞培养至汇合，并通过刮擦收获，在4℃下在1,500×g下离心5分钟，并重悬于PBS中。将细胞通过声处理裂解以形成细胞裂解物，并且除非另有说明，否则使用Bradford测定(Biorad)来确定并使用BioTek Synergy H1微板读取器来测量蛋白质浓度。
Curcusone在多种细胞系中的细胞毒性
将MCF-7(3e4)细胞接种在96孔板中。在孵育过夜之后，将细胞在有FCS的DMEM中用所示化合物(1:1000，来自DMSO储备液)、DMSO(最终0.1％)或作为阳性对照的10％v/v DMSO进行处理。在24小时之后，对细胞进行成像(Olympus IX51倒置显微镜)，并然后用5％v/vWST1(Sigma-Aldrich)处理，在37℃下孵育1小时。然后，使用BioTek Synergy H1微板读取器获取420nm和630nm处的吸光度。在GraphPad Prism 7中绘制细胞生存力结果。
基于原位竞争性MS的靶标鉴定
将MCF-7(8e6)细胞接种在10cm Petri皿中并孵育过夜。第二天将细胞用DPBS洗涤一次，并在37℃下在无FCS的DMEM中用DMSO或30μM 1d(1:1000，来自DMSO储备液)处理4小时。如上所述制备裂解物。将裂解物(2mg/mL，0.75mL)在室温下用10μM 37(DMSO中的50×储备液)处理1小时，并然后进行点击化学。将生物素炔烃(Click Chemistry Tools，50μM，DMSO中的50×储备液)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)(1mM，Sigma-Aldrich C4706-2G，水中的50×新鲜储备液)、三[(1-苄基-1H1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)(100μM，ClickChemistry Tools，DMSO:tBuOH 1:4中的16×储备液)和硫酸铜(II)(Sigma-Aldrich，1mM，水中的50×储备液)添加至蛋白质组并在室温下反应1小时。通过向反应混合物中添加MeOH(4体积)、CHCl3(1体积)和水(3体积)来沉淀蛋白质，并将混浊的混合物在4℃下在20,000×g下离心5分钟，在水层与有机层之间产生蛋白质层。将蛋白质层分离，干燥，并通过声处理溶解在PBS中的2％ SDS中。将管在4,700×g下离心5分钟，并将可溶性级分转移至新管。添加PBS，以得到0.2％的最终SDS浓度。添加160μL链霉亲和素琼脂糖珠(ProteoChem)，并将混合物在室温下旋转4小时。用PBS中的1％ SDS(1×10mL)、PBS(3×10mL)和水(3×10mL)洗涤珠。将珠重悬在PBS中的6M脲(500μL)中，在室温下用10mM中和TCEP(水中的20×新鲜储备液)还原30分钟，并在室温下在黑暗中用25mM碘乙酰胺(水中的400mM新鲜储备液)烷基化30分钟。将珠通过离心(1,400×g，2分钟)进行沉淀，并重悬在150μL的在50mM NH4HCO3中的2M脲、1mM CaCl2(水中的100×储备液)和胰蛋白酶(Thermo Scientific，1.5μL，0.5μg/μL)中。在37℃下进行消化6小时。将样品酸化至5％乙酸的最终浓度，经自填充C18旋转柱脱盐，并干燥。通过LC-MS/MS分析样品(参见下文)，并使用MaxQuant处理MS数据(参见下文)。
LC-MS/MS分析
将肽重悬在含0.1％甲酸(formic acid，FA)的水中，并使用与Q Exactive HF-XQuadrupole-Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)耦合的EASY-nLC 1200nano-UHPLC进行分析。色谱柱由50cm长、75μm i.d.的微毛细管组成，所述微毛细管被5μm尖端加帽并填充有ReproSil-Pur 120C18-AQ 2.4μm珠(Dr.Maisch GmbH)。LC溶剂为在H2O中的0.1％ FA(缓冲液A)和在90％ MeCN:10％ H2O中的0.1％ FA(缓冲液B)。在65℃下在300nL/分钟的流量下在240分钟线性梯度(5至35％缓冲液B)内将肽洗脱到质谱仪中。在S25全MS扫描(R＝60’000，m/z 400-1’300)之后，以数据依赖性模式(top-20，NCE 28，R＝7’500)获取数据。将动态排阻设置为10秒，将肽匹配设置为优选，并启用同位素排阻。
MaxQuant分析
使用MaxQuant9(V1.6.1.0)7分析MS数据，并针对人蛋白质组(Uniprot)和常见污染物列表(包含在MaxQuant中)进行搜索。第一肽搜索容差设置为20ppm，将10ppm用于主肽搜索，并将片段质量容差设置为0.02Da。肽、蛋白质和位点鉴定的错误发现率设置为1％。将最小肽长度设置为6个氨基酸，并启用肽重新定量、无标记定量(MaxLFQ)和“运行之间的匹配”。每个蛋白质的肽的最小数目设置为两个。将甲硫氨酸氧化作为可变修饰进行搜索，并将半胱氨酸的脲基甲基化作为固定修饰进行搜索。
FLAG-BRAT1在HEK-293T中的过表达
将HEK-293T(8e6)细胞接种在10cm皿中不含pen-strep的DMEM中。在孵育过夜之后，将24μg的FLAG-BRAT1 pExp质粒与在最终体积为2mL的Opti-MEM(Gibco 11058021)中的96μL PEI MAXTM40K(Polysciences 24765-1)在室温下孵育15分钟。然后小心地将混合物添加至细胞中。在24小时之后，将细胞用PBS小心地洗涤两次，并如上所述在PBS中通过声处理制备裂解物。
通过Western印迹进行FLAG-BRAT1的热位移测定。
将过表达的FLAG-BRAT1裂解物(2mg/mL)用DMSO或1d(来自DMSO中25×储备液的30μM)在室温下处理1小时，在指示温度(34℃至61℃)下加热3分钟，在室温下冷却3分钟，并随后在冰上冷却3分钟，然后在4℃下在17,000×g下离心20分钟。小心地分离上清液。向分离的上清液中添加SDS-PAGE还原加载缓冲液(4×)，并使用湿转移法用tris-甘氨酸转移缓冲液(20％甲醇)将蛋白质转移至PVDF(0.2μm)膜，在350mA下持续1小时。将膜在室温下用在含0.1％Tween 20的tris-缓冲盐水(TBST)中的5％乳封闭30至60分钟，并随后用原代兔多克隆BRAT1抗体(Novus NB100-2256，TBST中的5％乳中的1:2000)在4℃下摇动孵育过夜。将膜用TBST洗涤3次，每次5分钟，并用抗兔Alexa Fluor647(Jackson ImmunoResearch Inc.，TBST中的5％乳中的1:500)在室温下孵育1小时。然后将膜用TBST洗涤3×，并用AzureBiosystems SapphireBiomolecular成像仪使其显现。然后将膜用TBST洗涤，并用小鼠单克隆β-微管蛋白抗体(Proteintech 66240-1-Ig；TBST中的5％乳中的1:10,000)在室温下孵育2小时或在4℃下孵育过夜。洗涤膜，将其用抗小鼠AlexaFluor 488(JacksonImmunoResearch Inc.，TBST中的5％乳中的1:500)孵育，并如上所述进行扫描。
通过Western印迹进行的原位竞争性牵出测定
将MCF-7(8e6)和HeLa(4e6)细胞接种在10cm皿中，并将MDA-MB-231(14e6)细胞接种在15cm皿中。在孵育过夜之后，将细胞用DPBS洗涤一次，并在不含FCS的DMEM中用10μM 1d(1:1000，来自DMSO储备液)或DMSO(最终0.1％)处理4小时。如上所述制备并量化裂解物。将裂解物(2mg/mL，0.5mL)在室温下用10μM 37(DMSO中的50×储备液)或DMSO处理1小时，并然后在室温下如上所述用生物素叠氮化物进行点击化学，持续1小时。如上所述使用MeOH(4体积)、CHCl3(1体积)和水(3体积)沉淀蛋白质。将蛋白质层分离，干燥，并通过声处理溶解在PBS中的0.2％ SDS(1mL)中；添加70μL链霉亲和素琼脂糖珠(ProteoChem)，并将混合物在黑暗中在室温下旋转过夜。用PBS中的1％ SDS(2×1mL)、PBS中的6M脲(2×1mL)和PBS(3×1mL)洗涤珠。通过离心(1’400×g，2分钟)沉淀珠，并小心地除去上清液。将富集的蛋白质用35μLSDS-PAGE还原加载缓冲液(4×)从珠上洗脱，然后进行10分钟热变性(95℃)，并使用11％ SDS-PAGE凝胶进行分离。如上所述进行Western印迹。将β-微管蛋白用作加载对照，因为其在基于竞争性MS的靶标鉴定中被检测到但不被1d竞争(TUBB6的LFQ比率为1.02±0.17)。
通过竞争性牵出测定的原位剂量响应和动力学
将HeLa(2.0e6)细胞接种到60mm皿中。在孵育过夜之后，将细胞用DPBS洗涤，并在37℃下在不含FCS的DMEM中用1、3、10或30μM1d(1:1000，来自DMSO储备液)或DMSO(最终0.1％)处理1、2或4小时。如上所述制备并量化裂解物。将裂解物(2mg/mL，140μL)在室温下用10μM 37(DMSO中的50×储备液)处理1小时，并然后在室温下如上所述用生物素叠氮化物进行点击化学，持续1小时。如上所述，使蛋白质沉淀，重新溶解在PBS中的0.2％ SDS中，用50μL链霉亲和素珠富集，并洗涤。如上所述，将蛋白质使用30μLSDS-PAGE还原加载缓冲液(4×)洗脱，进行10分钟热变性(95℃)，使用11％ SDS-PAGE凝胶进行分离，并通过Western印迹显现。使用ImageJ对图像进行定量。使用GraphPad Prism 7计算EC50和Kitz-Wilson结合常数。
BRAT1 shRNA敲低细胞系的产生
BRAT1逆转录病毒shRNA和非靶向对照质粒(transOMIC)由Scripps研究所的遗传扰动筛选机构提供。将HEK-293T(4e6)细胞接种在10cm板中不含pen-strep的10mLDMEM中。在约70％汇合时，在与转染试剂一起在室温下孵育15分钟之后，将细胞用各10μg的BRAT1shRNA或非靶向对照质粒和pCL-ECO质粒(Addgene 12371)与80μL的PEIMAX-40(Polysciences 24765-1)在Opti-MEM(Gibco 11058021)中在950μL的最终体积下进行转染。在转染6至8小时之后，用8mL不含pen-strep的DMEM来替换培养基。在48和72小时时收集上清液，使其通过0.45μm注射器过滤器进行过滤，并合并。将6孔皿中的HeLa细胞(0.2e6)孵育过夜，并然后用温和且缓慢的离心进行逆转录病毒转导。在24小时之后，将细胞用2μg/mL嘌呤霉素选择2周，并通过如上所述的Western印迹监测BRAT1敲低。
使用LC-MS/MS的全面蛋白质组学谱分析
对于1d化合物处理，将HeLa(0.8e6)细胞接种在6孔板中。在孵育过夜之后，将细胞在含有10％ FCS的DMEM培养基中用3μM 1d(1:1000，来自DMSO储备液)或DMSO(最终0.1％)处理24小时。对于BRAT1敲低，在24小时内将BRAT1敲低或非靶向对照(WT)HeLa细胞培养至完全汇合。如上所述制备且量化裂解物。使用在100mM NH4HCO3中的新鲜9M脲使裂解物(2mg/mL；PBS中15μL/重复)达到6M脲的最终浓度，并然后在室温同时旋转下用10mM TCEP孵育30分钟。对于烷基化，添加25mM IAA，并在室温下在黑暗中在旋转下孵育30分钟。将溶液用50mM NH4HCO3和1mM CaCl2稀释至2M脲，并然后添加1.5μg胰蛋白酶(Thermo Scientific)。在37℃下进行胰蛋白酶消化过夜。将肽经自填充C18旋转柱脱盐并干燥。通过LC-MS/MS分析样品(参见以上)，并使用MaxQuant处理MS数据(参见以上)并在Perseus中分析。如上所述，通过Western印迹测量在1d(3μM)处理HeLa细胞24小时之后的BRAT1表达。
Transwell迁移测定
对于化合物处理，将MCF-7(1e5)、HeLa(5e4)或MDA-MB-231(3e4)细胞接种在transwell迁移室(Greiner Bio-One 07-000-396)中不含FCS但含1μM 1d(1:1000，来自DMSO储备液)或DMSO(最终0.1％)的DMEM(最终体积200μL)中。将含有1μM 1d(1:1000，来自DMSO储备液)或DMSO(最终0.1％)的含FCS的DMEM(最终体积700μL)置于下室中。对于敲低遗传对照，将BRAT1敲低或非靶向对照HeLa(5e4)细胞接种在transwell迁移室中不含FCS的DMEM(最终体积200μL)中；将含FCS的DMEM(最终体积700μL)置于下室中。在孵育24小时之后，小心地除去培养基，并将细胞用100％ MeOH固定10分钟并然后用0.5％w/v结晶紫(H2O中的20％ MeOH)染色10分钟。物理地去除室内部的细胞，并然后对迁移的细胞进行成像(Olympus IX51倒置显微镜)，用ImageJ计数，并在GraphPad Prism 7中作图。
通过γH2AX荧光显微术使DNA双链断裂显现
将BRAT1敲低(1e5)或非靶向对照(7e4)HeLa细胞接种在包含盖玻片的24孔板中。在孵育过夜之后，将细胞在含FCS的DMEM中用3μM1d(1:1000，来自DMSO储备液)、30μM依托泊苷、与30μM依托泊苷组合的3μM 1d、或DMSO(最终0.2％)处理24小时。将细胞用PBS洗涤一次，并用甲醇在-20℃下固定10分钟。将细胞再次用PBS洗涤两次，并将盖玻片转移至湿盒中。用PBS中的5％牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)溶液封闭30分钟。将细胞用PBS中的0.1％ BSA洗涤一次，并添加针对H2AX pS139的兔抗体(Sigma Aldrich H5912，在PBS 0.1％BSA中1:400)，并在室温下孵育1小时。将细胞用PBS 0.1％ BSA洗涤三次，并用抗兔IgG Alexa Fluor 488(Jackson，在PBS 0.1％ BSA中1:200)孵育1小时。将细胞用PBS0.1％ BSA洗涤三次，用PBS洗涤一次，用水洗涤一次，并然后用含DAPI的ProLong Goldantifade封固剂(Life Technologies)封固在载片上。使用BX53荧光显微镜(Olympus)使细胞显现。每个重复使用ImageJ测量>50个细胞的强度。
与依托泊苷的协同毒性
对于化合物处理，将HeLa(1e4)、MCF-7(3e4)或MDA-MB-231(1.5e4)细胞接种在96孔板中，并放置过夜以附着。将细胞用DMSO(最终0.2％)、1d(如指示的1或3μM)、依托泊苷(50μM)、或1d(如指示的1或3μM)和依托泊苷(50μM)二者的组合(从1:1000DMSO储备液中稀释的化合物)进行处理。对于敲低遗传对照，接种了BRAT1敲低或非靶向对照HeLa(1e4)细胞。在孵育过夜之后，将细胞用DMSO(最终0.1％)或50μM依托泊苷(1:1000DMSO储备液)进行处理。在24小时之后，如上所述，对细胞进行成像，用5％v/v WST1处理，并进行定量。
在一个实施方案中，本公开内容提供了式I化合物：
或任何立体异构体，其中R1是H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代。
在关于式I化合物的一个实施方案中，其中R1是H、I或甲基。
在关于式I化合物的一个实施方案中，其中式I化合物是式II手性化合物：
在一个实施方案中，本公开内容提供了式III化合物：
或其任何可药用盐，其中R1和R3各自独立地是CN、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，R2是H、-(SO2)-R7或-(C＝O)-R7，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R7是任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R7是NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子，
前提是所述化合物不是：
或其任何立体异构体。
在关于式III化合物的一个实施方案中，其中R2是-(C＝O)-CH2-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
在关于式III化合物的一个实施方案中，其中所述化合物是式IV化合物：
或其任何可药用盐。
在关于式III或式IV化合物的一个实施方案中，其中所述化合物选自：
和其任何可药用盐。
在一个实施方案中，本公开内容提供了用于制备curcusone化合物D或其异构体的合成方法，其中所述方法包括：
提供式A化合物并在卤化条件下处理式A化合物以提供式B化合物；
在第一甲基化条件下处理式B化合物以提供式C化合物或其任何异构体；以及
在第二甲基化条件下处理式C化合物以提供式D化合物或其异构体，其中X是Cl、Br或I。
在关于用于制备curcusone化合物D或其异构体的合成方法的一个方面中，其中X是I。
在一个实施方案中，本公开内容提供了使用式III化合物作为BRCA1相关ATM激活剂1(BRAT1)抑制剂的方法，其中式III化合物是：
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或其任何立体异构体、任何可药用盐，
其中R1和R3各自独立地是CN、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，R2是H、-(SO2)-R7或-(C＝O)-R7，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R7是任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R7是NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
在关于使用式III化合物作为BRCA1相关ATM激活剂1(BRAT1)抑制剂的方法的一个实施方案中，其中所述化合物具有式IV：
或其任何可药用盐，其中R1至R3与式III中限定的相同。
在关于使用式III化合物作为BRCA1相关ATM激活剂1(BRAT1)抑制剂的方法的一个实施方案中，其中R2是-(C＝O)-CH2-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
在关于使用式III化合物作为BRCA1相关ATM激活剂1(BRAT1)抑制剂的方法的一个实施方案中，其中所述化合物选自：
和其任何可药用盐。
本领域技术人员将认识到可以对上述具体实施方式进行多种修改。实施方式不应限于所描述的特定限制。其他实施方式也是可能的。
旨在本方法和装置的范围由所附权利要求书限定。然而，必须理解，在不脱离本公开内容的精神或范围的情况下，本公开内容可以以不同于具体解释和举例说明的方式来实践。本领域的技术人员应理解，在不脱离如所附权利要求书中限定的精神和范围的情况下，本文中所述的一些实施方案的多种替代可用于实践本权利要求。

Claims (13)

1.式I化合物：
或者其任何立体异构体或可药用盐，其中R1是H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代。
2.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式II：
3.权利要求1所述的化合物，其中R1是H、I或甲基。
4.使用式III化合物作为BRCA1相关ATM激活剂1(BRAT1)抑制剂的方法，其中所述式III化合物是：
或其任何立体异构体、任何可药用盐，
其中R1和R3各自独立地是CN、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，R2是H、-(SO2)-R7或-(C＝O)-R7，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R7是任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R7是NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
5.权利要求4所述的方法，其中所述化合物具有式IV：
或其任何可药用盐。
6.权利要求4所述的方法，其中R2是-(C＝O)-CH2-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
7.权利要求4所述的方法，其中所述化合物选自：
8.式III化合物：
或其可药用盐，
其中R1和R3各自独立地是CN、CO2R4、CONR5R6、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，R2是H、-(SO2)-R7或-(C＝O)-R7，其中R4、R5和R6各自独立地是H、或任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，其中R7是任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R7是NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子，
前提是所述化合物不是：
或其任何立体异构体。
9.权利要求8所述的化合物，其中R2是-(C＝O)-CH2-NR8R9，其中R8和R9各自独立地是H、任选地经取代的C1-C6直链或支链烷基、或任选地经取代的C3-C6碳环，其中所述C3-C6碳环的1或2个碳可被N、O或其组合替代，或者R8和R9可共同形成含氮的3至8元环，其中所述环可具有1至3个选自O、N和S的杂原子。
10.权利要求8所述的化合物，其中所述化合物是式IV化合物：
或其任何可药用盐。
11.权利要求8所述的化合物，其中所述化合物选自：
和其任何可药用盐。
12.用于制备curcusone化合物D或其异构体的合成方法，其包括：
提供式A化合物并在卤化条件下处理所述式A化合物以提供式B化合物；
在第一甲基化条件下处理所述式B化合物以提供式C化合物或其任何异构体；以及
在第二甲基化条件下处理所述式C化合物以提供式D化合物或其异构体，其中X是Cl、Br或I，
13.权利要求12所述的方法，其中X是I。
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