JP2023549023A - クルクソンジテルペノイドおよびその使用法 - Google Patents
クルクソンジテルペノイドおよびその使用法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023549023A JP2023549023A JP2023519429A JP2023519429A JP2023549023A JP 2023549023 A JP2023549023 A JP 2023549023A JP 2023519429 A JP2023519429 A JP 2023519429A JP 2023519429 A JP2023519429 A JP 2023519429A JP 2023549023 A JP2023549023 A JP 2023549023A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- optionally substituted
- carbocycle
- formula
- brat1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000004141 diterpene derivatives Chemical class 0.000 title description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 9
- 102100028714 BRCA1-associated ATM activator 1 Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 72
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 28
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 26
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 14
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 9
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims description 4
- 101710184130 BRCA1-associated ATM activator 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002140 halogenating effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 20
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 18
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 abstract description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 abstract description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 12
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 abstract description 10
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 8
- APDZRJZYGWLSEF-UHFFFAOYSA-N cyclohepta-2,4-dien-1-one Chemical group O=C1CCC=CC=C1 APDZRJZYGWLSEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000005882 aldol condensation reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 5
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 5
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 abstract description 4
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003034 chemosensitisation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000011929 asymmetric total synthesis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101000695387 Homo sapiens BRCA1-associated ATM activator 1 Proteins 0.000 abstract 3
- HIHOEGPXVVKJPP-JTQLQIEISA-N 5-fluoro-2-[[(1s)-1-(5-fluoropyridin-2-yl)ethyl]amino]-6-[(5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino]pyridine-3-carbonitrile Chemical compound N([C@@H](C)C=1N=CC(F)=CC=1)C(C(=CC=1F)C#N)=NC=1NC=1C=C(C)NN=1 HIHOEGPXVVKJPP-JTQLQIEISA-N 0.000 abstract 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 abstract 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 abstract 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 96
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 86
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 21
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 16
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 12
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 11
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 10
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 9
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 9
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 8
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 8
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 8
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 8
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 8
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- FORLYQGDAZRKBL-WOCWXWTJSA-N (1R,4aR,5S,8aS)-2',3-dimethyl-8-methylidene-5-prop-1-en-2-ylspiro[5,6,7,8a-tetrahydro-4aH-naphthalene-1,5'-cyclopent-2-ene]-1',2-dione Chemical compound CC(=C)[C@H]1CCC(=C)[C@@H]2[C@@H]1C=C(C)C(=O)[C@]21CC=C(C)C1=O FORLYQGDAZRKBL-WOCWXWTJSA-N 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 238000005821 Claisen rearrangement reaction Methods 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 6
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 6
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 5
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000010379 pull-down assay Methods 0.000 description 5
- 230000028617 response to DNA damage stimulus Effects 0.000 description 5
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000011925 1,2-addition Methods 0.000 description 4
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BUVSBIKCBLHNCG-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;azide Chemical compound [N-]=[N+]=[N-].N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 BUVSBIKCBLHNCG-UFLZEWODSA-N 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 102000018779 Replication Protein C Human genes 0.000 description 4
- 108010027647 Replication Protein C Proteins 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- FJKIXWOMBXYWOQ-UHFFFAOYSA-N ethenoxyethane Chemical compound CCOC=C FJKIXWOMBXYWOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 4
- JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1N1[N+](C=2C=CC(I)=CC=2)=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=N1 JUJBNYBVVQSIOU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005698 Diels-Alder reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000011278 co-treatment Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 229930186960 curcusone Natural products 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- -1 methylenedioxy, ethylenedioxy Chemical group 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 3
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 3
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- FORLYQGDAZRKBL-BOSXTWCSSA-N (1S,4aS,5R,8aR)-2',3-dimethyl-8-methylidene-5-prop-1-en-2-ylspiro[5,6,7,8a-tetrahydro-4aH-naphthalene-1,5'-cyclopent-2-ene]-1',2-dione Chemical compound C([C@@H]1[C@@H]2C(=C)CC[C@H]1C(=C)C)=C(C)C(=O)[C@@]21CC=C(C)C1=O FORLYQGDAZRKBL-BOSXTWCSSA-N 0.000 description 2
- OCJBOOLMMGQPQU-UHFFFAOYSA-N 1,4-dichlorobenzene Chemical compound ClC1=CC=C(Cl)C=C1 OCJBOOLMMGQPQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 1-(1-benzyltriazol-4-yl)-n,n-bis[(1-benzyltriazol-4-yl)methyl]methanamine Chemical compound C=1N(CC=2C=CC=CC=2)N=NC=1CN(CC=1N=NN(CC=2C=CC=CC=2)C=1)CC(N=N1)=CN1CC1=CC=CC=C1 WKGZJBVXZWCZQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YSUIQYOGTINQIN-UZFYAQMZSA-N 2-amino-9-[(1S,6R,8R,9S,10R,15R,17R,18R)-8-(6-aminopurin-9-yl)-9,18-difluoro-3,12-dihydroxy-3,12-bis(sulfanylidene)-2,4,7,11,13,16-hexaoxa-3lambda5,12lambda5-diphosphatricyclo[13.2.1.06,10]octadecan-17-yl]-1H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC2=C(N=CN2[C@@H]2O[C@@H]3COP(S)(=O)O[C@@H]4[C@@H](COP(S)(=O)O[C@@H]2[C@@H]3F)O[C@H]([C@H]4F)N2C=NC3=C2N=CN=C3N)C(=O)N1 YSUIQYOGTINQIN-UZFYAQMZSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 2
- KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N Boron trifluoride etherate Chemical compound FB(F)F.CCOCC KZMGYPLQYOPHEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022204 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Human genes 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N Pentane Chemical compound CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 125000003710 aryl alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical group 0.000 description 2
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N chlorotrimethylsilane Chemical compound C[Si](C)(C)Cl IJOOHPMOJXWVHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- LOGSONSNCYTHPS-UHFFFAOYSA-N cyclopentane-1,3-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)C1 LOGSONSNCYTHPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- FAMRKDQNMBBFBR-BQYQJAHWSA-N diethyl azodicarboxylate Substances CCOC(=O)\N=N\C(=O)OCC FAMRKDQNMBBFBR-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 2
- 125000000567 diterpene group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- FAMRKDQNMBBFBR-UHFFFAOYSA-N ethyl n-ethoxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CCOC(=O)N=NC(=O)OCC FAMRKDQNMBBFBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004446 heteroarylalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003368 label free method Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005839 oxidative dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 2
- IUBQJLUDMLPAGT-UHFFFAOYSA-N potassium bis(trimethylsilyl)amide Chemical compound C[Si](C)(C)N([K])[Si](C)(C)C IUBQJLUDMLPAGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012746 preparative thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004063 proteosomal degradation Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000006798 ring closing metathesis reaction Methods 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- FORLYQGDAZRKBL-UHFFFAOYSA-N spirocurcasone Natural products CC(=C)C1CCC(=C)C2C1C=C(C)C(=O)C21CC=C(C)C1=O FORLYQGDAZRKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051423 streptavidin-agarose Proteins 0.000 description 2
- 150000003509 tertiary alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N (1R,9R,10S,11R,12R,15S,18S,21R)-10,11,21-trihydroxy-8,8-dimethyl-14-methylidene-4-(prop-2-enylamino)-20-oxa-5-thia-3-azahexacyclo[9.7.2.112,15.01,9.02,6.012,18]henicosa-2(6),3-dien-13-one Chemical compound C([C@@H]1[C@@H](O)[C@@]23C(C1=C)=O)C[C@H]2[C@]12C(N=C(NCC=C)S4)=C4CC(C)(C)[C@H]1[C@H](O)[C@]3(O)OC2 UAOUIVVJBYDFKD-XKCDOFEDSA-N 0.000 description 1
- GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N (1s,2s,3r,4r)-3-[[5-chloro-2-[(1-ethyl-6-methoxy-2-oxo-4,5-dihydro-3h-1-benzazepin-7-yl)amino]pyrimidin-4-yl]amino]bicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2-carboxamide Chemical compound CCN1C(=O)CCCC2=C(OC)C(NC=3N=C(C(=CN=3)Cl)N[C@H]3[C@H]([C@@]4([H])C[C@@]3(C=C4)[H])C(N)=O)=CC=C21 GLGNXYJARSMNGJ-VKTIVEEGSA-N 0.000 description 1
- DBPPEQIYWCILTJ-DNUKQYJSSA-N (2s,6as)-2-hydroxy-2,5-dimethyl-10-methylidene-7-prop-1-en-2-yl-3,6a,7,8,9,10a-hexahydrobenzo[h]azulene-1,4-dione Chemical compound C([C@@H]1C2C(=C)CCC1C(=C)C)=C(C)C(=O)C1=C2C(=O)[C@@](C)(O)C1 DBPPEQIYWCILTJ-DNUKQYJSSA-N 0.000 description 1
- KZPYGQFFRCFCPP-UHFFFAOYSA-N 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene Chemical compound [Fe+2].C1=CC=C[C-]1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1.C1=CC=C[C-]1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KZPYGQFFRCFCPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDKCHWVGPNQSQK-UHFFFAOYSA-N 1,1-bis(ethenyl)cyclopropane Chemical compound C=CC1(C=C)CC1 UDKCHWVGPNQSQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NPRYCHLHHVWLQZ-TURQNECASA-N 2-amino-9-[(2R,3S,4S,5R)-4-fluoro-3-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-7-prop-2-ynylpurin-8-one Chemical compound NC1=NC=C2N(C(N(C2=N1)[C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H]1O)F)CO)=O)CC#C NPRYCHLHHVWLQZ-TURQNECASA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ICGYBJNONRDZOP-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-4-ium-4-ylacetic acid;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)CN1CCOCC1 ICGYBJNONRDZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGRCWJPBLWGNPX-UHFFFAOYSA-N 3-(2-chlorophenyl)-n-(4-chlorophenyl)-n,5-dimethyl-1,2-oxazole-4-carboxamide Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1N(C)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl IGRCWJPBLWGNPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 4-(4-chlorophenyl)-4,5,6,7-tetrahydrothieno[3,2-c]pyridine Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(C=CS2)=C2CCN1 CSDQQAQKBAQLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUDJFFQZIISQJB-UHFFFAOYSA-N 4-cyano-5-(3,5-dichloropyridin-4-yl)sulfanyl-n-(4-methylsulfonylphenyl)thiophene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1NC(=O)C(S1)=CC(C#N)=C1SC1=C(Cl)C=NC=C1Cl GUDJFFQZIISQJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JJXUHRONZVELPY-NHCYSSNCSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-prop-2-ynylpentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCC#C)SC[C@@H]21 JJXUHRONZVELPY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical group [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UCWWPDUTCLFCQK-UHFFFAOYSA-N C=CC1(C=C)CC1.C1CC=CC=CC1 Chemical compound C=CC1(C=C)CC1.C1CC=CC=CC1 UCWWPDUTCLFCQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCBAMQOKOLXLOX-BSZYMOERSA-N CC1=C(SC=N1)C2=CC=C(C=C2)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](CN3C(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)CCCCCCCCCCNCCCONC(=O)C4=C(C(=C(C=C4)F)F)NC5=C(C=C(C=C5)I)F)O Chemical compound CC1=C(SC=N1)C2=CC=C(C=C2)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]3C[C@H](CN3C(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)CCCCCCCCCCNCCCONC(=O)C4=C(C(=C(C=C4)F)F)NC5=C(C=C(C=C5)I)F)O KCBAMQOKOLXLOX-BSZYMOERSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBPPEQIYWCILTJ-UHFFFAOYSA-N Curcusone C Natural products CC(=C)C1CCC(=C)C2C1C=C(C)C(=O)C1=C2C(=O)C(C)(O)C1 DBPPEQIYWCILTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010485 C−C bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004128 D cell Anatomy 0.000 description 1
- 102100024829 DNA polymerase delta catalytic subunit Human genes 0.000 description 1
- 101710157074 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000002706 Discoidin Domain Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010043648 Discoidin Domain Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100028022 E3 ubiquitin-protein ligase TRIM47 Human genes 0.000 description 1
- 102100026545 Fibronectin type III domain-containing protein 3B Human genes 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034533 Histone H2AX Human genes 0.000 description 1
- 101000950656 Homo sapiens DEP domain-containing protein 1B Proteins 0.000 description 1
- 101000909198 Homo sapiens DNA polymerase delta catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000619536 Homo sapiens DNA-dependent protein kinase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000649007 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase TRIM47 Proteins 0.000 description 1
- 101000913642 Homo sapiens Fibronectin type III domain-containing protein 3B Proteins 0.000 description 1
- 101001067891 Homo sapiens Histone H2AX Proteins 0.000 description 1
- 101000871869 Homo sapiens Lys-63-specific deubiquitinase BRCC36 Proteins 0.000 description 1
- 101000652472 Homo sapiens Tubulin beta-6 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000759994 Homo sapiens Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 47 Proteins 0.000 description 1
- 101000814304 Homo sapiens WW domain-binding protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001048891 Jatropha curcas Species 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100033638 Lys-63-specific deubiquitinase BRCC36 Human genes 0.000 description 1
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical class CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006751 Mitsunobu reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003799 Mukaiyama Aldol addition reaction Methods 0.000 description 1
- SGXDXUYKISDCAZ-UHFFFAOYSA-N N,N-diethylglycine Chemical compound CCN(CC)CC(O)=O SGXDXUYKISDCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylglycine Chemical compound CN(C)CC(O)=O FFDGPVCHZBVARC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001204 N-oxides Chemical group 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012661 PARP inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229940121906 Poly ADP ribose polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710179684 Poly [ADP-ribose] polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 229920000776 Poly(Adenosine diphosphate-ribose) polymerase Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005700 Stille cross coupling reaction Methods 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003721 Triple Negative Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100030303 Tubulin beta-6 chain Human genes 0.000 description 1
- 102100025029 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 47 Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100039412 WW domain-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 238000007110 [4+3]-cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- WLLIXJBWWFGEHT-UHFFFAOYSA-N [tert-butyl(dimethyl)silyl] trifluoromethanesulfonate Chemical compound CC(C)(C)[Si](C)(C)OS(=O)(=O)C(F)(F)F WLLIXJBWWFGEHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012300 argon atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000002102 aryl alkyloxo group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033590 base-excision repair Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007623 carbamidomethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 230000006315 carbonylation Effects 0.000 description 1
- 238000005810 carbonylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- VYLVYHXQOHJDJL-UHFFFAOYSA-K cerium trichloride Chemical compound Cl[Ce](Cl)Cl VYLVYHXQOHJDJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 229940125758 compound 15 Drugs 0.000 description 1
- 229940125833 compound 23 Drugs 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006880 cross-coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- FQQOMPOPYZIROF-UHFFFAOYSA-N cyclopenta-2,4-dien-1-one Chemical compound O=C1C=CC=C1 FQQOMPOPYZIROF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 239000007862 dimeric product Substances 0.000 description 1
- 108700003601 dimethylglycine Proteins 0.000 description 1
- AASUFOVSZUIILF-UHFFFAOYSA-N diphenylmethanone;sodium Chemical compound [Na].C=1C=CC=CC=1C(=O)C1=CC=CC=C1 AASUFOVSZUIILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012039 electrophile Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 150000002081 enamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N epalrestat Chemical compound C=1C=CC=CC=1\C=C(/C)\C=C1/SC(=S)N(CC(O)=O)C1=O CHNUOJQWGUIOLD-NFZZJPOKSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- JXMLAPZRDDWRRV-UHFFFAOYSA-N ethyl n-(ethoxycarbonylamino)carbamate Chemical compound CCOC(=O)NNC(=O)OCC JXMLAPZRDDWRRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000004820 halides Chemical group 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 150000002443 hydroxylamines Chemical group 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K lanthanum(iii) chloride Chemical compound Cl[La](Cl)Cl ICAKDTKJOYSXGC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UBJFKNSINUCEAL-UHFFFAOYSA-N lithium;2-methylpropane Chemical compound [Li+].C[C-](C)C UBJFKNSINUCEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N methanesulfonyl chloride Chemical compound CS(Cl)(=O)=O QARBMVPHQWIHKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 1
- FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N olaparib Chemical compound FC1=CC=C(CC2=C3[CH]C=CC=C3C(=O)N=N2)C=C1C(=O)N(CC1)CCN1C(=O)C1CC1 FAQDUNYVKQKNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000572 olaparib Drugs 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- MLBYLEUJXUBIJJ-UHFFFAOYSA-N pent-4-ynoic acid Chemical compound OC(=O)CCC#C MLBYLEUJXUBIJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000000565 sulfonamide group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001174 sulfone group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000003375 sulfoxide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- VXKWYPOMXBVZSJ-UHFFFAOYSA-N tetramethyltin Chemical compound C[Sn](C)(C)C VXKWYPOMXBVZSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N triethyl orthoformate Chemical compound CCOC(OCC)OCC GKASDNZWUGIAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FIQMHBFVRAXMOP-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphane oxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1P(C=1C=CC=CC=1)(=O)C1=CC=CC=C1 FIQMHBFVRAXMOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022679 triple-negative breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
- C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
- C07C49/613—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring polycyclic
- C07C49/617—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring polycyclic a keto group being part of a condensed ring system
- C07C49/643—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring polycyclic a keto group being part of a condensed ring system having three rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
- C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
- C07C49/703—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing hydroxy groups
- C07C49/743—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing hydroxy groups having unsaturation outside the rings, e.g. humulones, lupulones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
- C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
- C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
- C07C229/10—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
- C07C229/12—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to acyclic carbon atoms or to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings to carbon atoms of acyclic carbon skeletons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
- C07C45/63—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by introduction of halogen; by substitution of halogen atoms by other halogen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
- C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
- C07C45/67—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
- C07C45/68—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton by increase in the number of carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
- C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
- C07D265/30—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines not condensed with other rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
- C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms
- C07D295/14—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
- C07D295/145—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings
- C07D295/15—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals with the ring nitrogen atoms and the carbon atoms with three bonds to hetero atoms attached to the same carbon chain, which is not interrupted by carbocyclic rings to an acyclic saturated chain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
- C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
- C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
- C07C2603/36—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing eight-membered rings
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本開示は、クルクソン天然物の最初の不斉全合成および標的同定を提供する。この新規の収束合成は、安価で豊富なキラルプール分子(8)に基づいており、重要なシクロヘプタジエノンコアを迅速に構築するための熱的[3,3]-シグマトロピー転位およびFeCl3促進グローバル加水分解/アルドール縮合カスケードを特徴とする。アルキンプローブ37を用いてケモプロテオミクスを行うことによって、本発明者らは、以前は「創薬不可能な」発がん性タンパク質BRAT1を1dの重要な細胞標的として同定した。さらに、1dはがん細胞におけるBRAT1を阻害し、それによって、がん細胞遊走を減少させ、DNA損傷に対する感受性を高め、そして承認薬エトポシドに対する化学増感を誘導する。化合物1dは、DDRおよびDNA修復のマスターレギュレーターであるBRAT1に対する最初に知られた小分子阻害物質である。組成物および使用方法は本開示の範囲内にある。TIFF2023549023000053.tif106165
Description
関連出願の相互参照
本米国特許出願は、2020年9月29日に出願された、米国仮特許出願第63/084,594号に関連し、その優先権の恩典を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本米国特許出願は、2020年9月29日に出願された、米国仮特許出願第63/084,594号に関連し、その優先権の恩典を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所(NIH)によって授与されたCA023168およびGM128570の下で政府の支援を受けてなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所(NIH)によって授与されたCA023168およびGM128570の下で政府の支援を受けてなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
技術分野
本開示は、新規のクルクソンジテルペノイド類似体に、クルクソンジテルペノイドおよび類似体の新規の合成に、ならびにクルクソンジテルペノイドおよび類似体を使用する方法に関する。
本開示は、新規のクルクソンジテルペノイド類似体に、クルクソンジテルペノイドおよび類似体の新規の合成に、ならびにクルクソンジテルペノイドおよび類似体を使用する方法に関する。
背景
このセクションは、本開示のよりよい理解を促進するのを助け得る局面について述べる。したがって、これらの記述はこの観点から読まれ、何が先行技術であるかまたは先行技術でないかについての承認として理解されるものではない。
このセクションは、本開示のよりよい理解を促進するのを助け得る局面について述べる。したがって、これらの記述はこの観点から読まれ、何が先行技術であるかまたは先行技術でないかについての承認として理解されるものではない。
天然物は、命を救ことができる薬物分子の貴重な供給源およびインスピレーションとなっている。それらの蓄積された進化的知恵は、それらの構造的複雑さ、新規性、多様性と共に、それらを新しい治療法開発について比類のないものにする。さらに、天然物は、基本的生物学的経路の解明および新規疾患標的の同定のための重要なプローブ分子として役立ち得る。しかし、それらの自然的希少性および構造的複雑さは、包括的な生物学的評価およびそれらの作用機序の解明をしばしば妨げる。後者はまた、天然物ベースの創薬の主要なボトルネックと考えられている。これらの障害を克服するために、全合成を用いて重要な物質および類似体を供給することができる。その一方で、特にがんにおける、多くの魅力的で生物学的に確認された疾患標的は、酵素活性および／または小分子結合部位の欠如に起因して化学的観点から「創薬不可能」と考えられている。BRCA1関連ATM活性化因子1（BRCA1-associated ATM activator 1）(BRAT1)タンパク質は、発がん性タンパク質と確認されたが、「創薬不可能」カテゴリーに属し、BRAT1を標的とする小分子阻害物質は同定されていない。
したがって、クルクソン天然物の全合成およびケモプロテオミクスプロファイリングにおける共同努力が依然として必要とされている。
概要
本開示は、新規のクルクソンジテルペノイド類似体に、クルクソンジテルペノイドおよび類似体の新規の合成に、ならびにクルクソンジテルペノイドおよび類似体を使用する方法に関する。
本開示は、新規のクルクソンジテルペノイド類似体に、クルクソンジテルペノイドおよび類似体の新規の合成に、ならびにクルクソンジテルペノイドおよび類似体を使用する方法に関する。
一態様において、本開示は、式I：
の化合物または任意の立体異性体を提供し、式中、R1は、H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得る。
別の態様において、本開示は、クルクソン化合物A、B、C、およびDまたはそれらの異性体を調製するための合成方法を提供し、方法は、
式Aの化合物を提供し、かつ、式Aの化合物をハロゲン化条件下で処理して式Bの化合物を提供する工程；
式Bの化合物を第1メチル化条件下で処理して、式Cの化合物、またはその任意の異性体を提供する工程；および
式Cの化合物を第2メチル化条件下で処理して、式Dの化合物またはその異性体を提供する工程
を含み、ここで、XがCl、Br、またはIである：
。
式Aの化合物を提供し、かつ、式Aの化合物をハロゲン化条件下で処理して式Bの化合物を提供する工程；
式Bの化合物を第1メチル化条件下で処理して、式Cの化合物、またはその任意の異性体を提供する工程；および
式Cの化合物を第2メチル化条件下で処理して、式Dの化合物またはその異性体を提供する工程
を含み、ここで、XがCl、Br、またはIである：
詳細な説明
本開示の原理の理解を容易にする目的のために、図面に示された態様を次に参照し、同じものを説明するために特定の用語を使用する。それにもかかわらず、それによって本開示の範囲の限定は意図されないことが理解されるであろう。
本開示の原理の理解を容易にする目的のために、図面に示された態様を次に参照し、同じものを説明するために特定の用語を使用する。それにもかかわらず、それによって本開示の範囲の限定は意図されないことが理解されるであろう。
本明細書において使用される用語「置換された」は、官能基に含まれる1つまたは複数の水素原子が1つまたは複数の非水素原子によって置き換えられている官能基を指す。本明細書において使用される用語「官能基」または「置換基」は、分子上へ置換され得るかまたは置換されている基を指す。置換基または官能基の例としては、ハロゲン(例えば、F、Cl、Br、およびI)；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ(カルボニル)基、カルボキシル基(カルボン酸、カルボン酸塩、およびカルボン酸エステルを含む)などの基中の酸素原子；チオール基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニル基、およびスルホンアミド基などの基中の硫黄原子；アミン、アジド、ヒドロキシルアミン、シアノ、ニトロ基、N-オキシド、ヒドラジド、およびエナミンなどの基中の窒素原子；ならびに様々な他の基中の他のヘテロ原子が挙げられるが、これらに限定されない。
置換された炭素(または例えば窒素)原子へ結合され得る置換基の非限定的な例としては、F、Cl、Br、I、OR、OC(O)N(R)2、CN、NO、NO2、ONO2、アジド、CF3、OCF3、R、O (オキソ)、S (チオノ)、C(O)、S(O)、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、N(R)2、SR、SOR、SO2R、SO2N(R)2、SO3R、(CH2)0-2P(O)OR2、C(O)R、C(O)C(O)R、C(O)CH2C(O)R、C(S)R、C(O)OR、OC(O)R、C(O)N(R)2、OC(O)N(R)2、C(S)N(R)2、(CH2)0-2N(R)C(O)R、(CH2)0-2N(R)C(O)OR、(CH2)0-2N(R)N(R)2、N(R)N(R)C(O)R、N(R)N(R)C(O)OR、N(R)N(R)CON(R)2、N(R)SO2R、N(R)SO2N(R)2、N(R)C(O)OR、N(R)C(O)R、N(R)C(S)R、N(R)C(O)N(R)2、N(R)C(S)N(R)2、N(COR)COR、N(OR)R、C(=NH)N(R)2、C(O)N(OR)R、またはC(=NOR)Rが挙げられ、ここで、Rは、水素または炭素ベースの部分であり得、ここで、炭素ベースの部分自体はさらに置換され得；例えば、Rは、水素、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはヘテロアリールアルキルであり得、ここで、任意のアルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、もしくはヘテロアリールアルキル、もしくはRは、独立して、一置換または多置換され得るか；または、窒素原子もしくは隣接する窒素原子へ結合された2つのR基は、1つもしくは複数の窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成することができ、これは一置換または独立して多置換され得る。
用語「ハロ」、「ハロゲン」、または「ハロゲン化物」基は、本明細書において使用される場合、それ自体によって、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。本明細書に記載される化合物は、1つまたは複数のキラル中心を含んでもよいか、または別の方法で複数の立体異性体として存在することができる場合もある。一態様において、本明細書に記載される本発明は、任意の特定の立体化学要件に限定されず、化合物、ならびにそれらを含む組成物、方法、使用、および医薬は、光学的に純粋であってもよいか、または、ラセミ体および鏡像異性体の他の混合物、ジアステレオマーの他の混合物などを含む、様々な立体異性体混合物のいずれであってもよいことが理解されるべきである。立体異性体のそのような混合物は、1つまたは複数のキラル中心における単一の立体化学的配置を含み得る一方、1つまたは複数の他のキラル中心における立体化学的配置の混合物を含み得ることもまた理解されるべきである。
同様に、本明細書に記載される化合物は、幾何学的中心、例えば、シス、トランス、E、およびZ二重結合を含み得る。別の態様において、本明細書に記載される本発明は、任意の特定の幾何異性体要件に限定されず、化合物、ならびにそれらを含む組成物、方法、使用、および医薬は、純粋であってもよいか、または様々な幾何異性体混合物のいずれであってもよいことが理解されるべきである。幾何異性体のそのような混合物は、1つまたは複数の二重結合における単一の立体配置を含み得る一方、1つまたは複数の他の二重結合における幾何学の混合物を含み得ることもまた理解されるべきである。
用語「置換されていてもよい」または「任意選択の置換基」は、本明細書において使用される場合、問題の基が非置換であるか、または指定された置換基のうちの1つまたは複数で置換されていることを意味する。問題の基が2つ以上の置換基で置換されている場合、置換基は同一でもあっても異なっていてもよい。「独立して」、「独立して…である」、および「独立して…より選択される」という用語を使用する場合、問題の基は同一でもあっても異なっていてもよいことを意味する。本明細書において定義された用語のいくつかは、構造内で複数回出現する場合があり、そのような出現時は、各用語は互いに独立して定義されるものとする。
現在、包括的な生物学的調査および治療法開発のためにクルクソンジテルペン天然物およびそれらの類似体などの十分な量の天然物にアクセスすることは、依然として重大な課題であり、それらの作用機序に関する研究を妨げる。本明細書において、本発明者らは、このクルクソン天然物の全合成および標的同定における共同努力について報告し、これは、9ステップにおけるクルクソンAおよびB、10ステップにおけるCおよびD、ならびに12ステップにおけるジメリクルソンAの最初の全合成をもたらし、クルクソンの重要な細胞標的としてのBRAT1を明らかにした。
クルクソンジテルペン(図1A)は、ナンヨウアブラギリ（Jatropha curcas）から単離され、がんを含む様々な病気に対する伝統療法において広く使用されている成分であった。構造的には、それらはダフナンおよびチグリアンジテルペンと特徴的な[6-7-5]三環式炭素骨格を共有している。1986年にClardyおよび共同研究者によって単離されたクルクソンA～D(1a～d)は、C2位での2つのエピマー対として明確に同定された。それ以来、七員環中のジエノン部分を欠くクルクソンF～Jを含む約30種類のクルクソン分子が単離された。スピロクルカソン(3)のような構造的に再配置された類似体ならびにジメリクルソンA(2a)およびジメリクルソンB(2b)などの二量体類似体が最近発見された。その中でも、クルクソンA～D(1a～1d)は、広範囲のヒトがん細胞株に対して低マイクロモルIC50値を示した。しかし、クルクソンA～D(1a～1d)およびそれらの二量体産物(2aおよび2b)の全合成は、本研究の前に報告されておらず、また、それらの作用機序は不明のままであった。
密接に関連しているダフナンおよびチグリアンジテルペンはかなりの量の合成的関心を集めているが、クルクソン分子は、その治療可能性にもかかわらず、驚くべきことに、ほとんど注目されていない。2017年に、本発明者らは、21ステップにおけるクルクソンIおよびJ(1iおよび1j)の推定構造の最初の全合成を報告し(図1B)、最終的に、1iおよび1jの両方の最初に提案された構造が正しくないという結論に至った。Li, Y.; Dai, M. Total Syntheses of the Reported Structures of Curcusones I and J through Tandem Gold Catalysis. Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 11624-11627を参照のこと。本発明者らの合成は、オキサ架橋を有する5,7-縮合環系を構築するための金触媒タンデムフラン形成およびフラン-アレン[4+3]付加環化、ならびに6員環を構築するためのディールス-アルダー反応を伴う。2019年に、Stoltzおよび共同研究者は1a～1dの合成に関する研究を報告した(図1C)。(a) Lee, C. W.; Taylor, B. L. H.; Petrova, G. P.; Patel, A.; Morokuma, K.; Houk, K. N.; Stoltz, B. M. An Unexpected Ireland-Claisen Rearrangement Cascade During the Synthesis of the Tricyclic Core of Curcusone C: Mechanistic Elucidation by Trial-and-Error and Automatic Artificial Force-Induced Reaction (AFIR) Computations. J. Am. Chem. Soc. 2019, 141, 6995-7004. (b) Wright, A. C.; Lee, C. W.; Stoltz, B. M. Progress toward the Enantioselective Synthesis of Curcusones A-D via a Divinylcyclopropane Rearrangement Strategy. Org. Lett. 2019, 21, 9658-9662. (c) Wright, A. C.; Stoltz, B. M. Enantioselective construction of the tricyclic core of curcusones A-D via a cross-electrophile coupling approach. Chem. Sci. 2019, 10, 10562-10565を参照のこと。彼らのアプローチは、7員環を築くためのエレガントなジビニルシクロプロパン-シクロヘプタジエン転位を特徴とし、12ステップ後に8から高度中間体14に到達した。
細胞タンパク質を共有結合的に修飾することができる天然物に対する本発明者らの継続的な関心は、求電子性シクロヘプタジエノン部分を有するクルクソンA～D(1a～1d)の全合成および標的同定を追求し続けるよう本発明者らに促した。このユニークな構造的特徴は、それらが特定の細胞タンパク質の求核性残基と共有結合を形成することを可能にし得る。以前の細胞毒性研究では、C6-C7二重結合の還元および／または酸化が抗がん活性を大幅に低下させることがわかった。そのため、C6およびC7置換基の変動を可能にするアプローチが非常に望ましいであろう。本発明者らは、15を高度中間体として想定した(図1D)。α-ハロゲン化とそれに続く2回のメチル化反応が1aおよび1bをもたらすであろう。これらは、α-ヒドロキシル化によって1cおよび1dへ酸化され得る。閉環メタセシス(RCM)または分子内アルドール縮合を、7員ジエノンを形成するために計画した(16/17→15)。16および17は両方とも、Pd触媒カルボニル化クロスカップリングを介してトリフル酸ビニル18から調製することができた。この段階で、C9-C10結合の切断は18を2つの単純な断片に分割する可能性があるが、そのような結合を構築するための直接分子間C-C結合形成は困難である。したがって、本発明者らは、このC-C結合を立体選択的に築くためにクライゼン転位を選択し、クライゼン転位前駆体としてマスクされたアルデヒドを有する19を設計した。19は、単純なビルディングブロック20a/20bおよび21から組み立てることができた。後者は、安価なキラルプール分子(S)-(-)-ペリルアルデヒド8から誘導することができた。
結果
全合成。本発明者らの合成は、3ステップ、つまり、伸長シリルエノールエーテル形成、ビニロガス向山アルドール反応、およびNaBH4還元において8から合成される公知の化合物である、23(図2)を調製することから始めた。最初の2つのステップを組み合わせてワンポット反応にし；次いで、粗製22をNaBH4還元へ直接供して、1つのバッチにおいてマルチデカグラムスケールの23を生成した。次に、本発明者らは、クライゼン転位のために24を調製する必要があった。23および20bの間のNaH促進付加-脱離は、低収率(35%)ではあるが、24をもたらした。本発明者らは、次いで、23および20aの間の光延反応を用いて24を調製したが、アゾジカルボン酸ジエチルに由来するヒドラジン副生成物を24から分離できなかった。最近報告された酸化還元中性有機触媒光延条件も探索したが、24を提供することができなかった。幸いなことに、ヒドラジン副生成物はクライゼン転位において許容されることができた。24をDMF中で140～150℃にて18時間加熱した後、クライゼン転位が起こり、しかし、転位生成物25はさらに環化して、三環式化合物26(CCDC 2033828)が23から収率48%で単一のジアステレオマーとして得られた。
全合成。本発明者らの合成は、3ステップ、つまり、伸長シリルエノールエーテル形成、ビニロガス向山アルドール反応、およびNaBH4還元において8から合成される公知の化合物である、23(図2)を調製することから始めた。最初の2つのステップを組み合わせてワンポット反応にし；次いで、粗製22をNaBH4還元へ直接供して、1つのバッチにおいてマルチデカグラムスケールの23を生成した。次に、本発明者らは、クライゼン転位のために24を調製する必要があった。23および20bの間のNaH促進付加-脱離は、低収率(35%)ではあるが、24をもたらした。本発明者らは、次いで、23および20aの間の光延反応を用いて24を調製したが、アゾジカルボン酸ジエチルに由来するヒドラジン副生成物を24から分離できなかった。最近報告された酸化還元中性有機触媒光延条件も探索したが、24を提供することができなかった。幸いなことに、ヒドラジン副生成物はクライゼン転位において許容されることができた。24をDMF中で140～150℃にて18時間加熱した後、クライゼン転位が起こり、しかし、転位生成物25はさらに環化して、三環式化合物26(CCDC 2033828)が23から収率48%で単一のジアステレオマーとして得られた。
次いで、本発明者らは、26を継続し、隠されたシクロペンタン-1,3-ジオン対称性を探索して17を合成することにした。本発明者らは、グローバル加水分解がメチルケトンおよびアルデヒドを一度に放出してアルドール縮合のための17を形成するという理論を立てて、26へのリチウム化エチルビニルエーテル(27)の1,2-付加を調べることから始めた。この1,2-付加は非自明であることが判明した。2当量の27を用いた場合、収率10%未満の28しか得られなかった。それらの好酸素性（oxophilicity）のために、塩化セリウムおよび塩化ランタンは1,2-付加を促進するために使用されてきた。残念ながら、本発明者らの場合、両方とも失敗した。最終的に、27の量を10当量に増加させることによって1,2-付加が改善され、28が収率57%で調製された。次いで、28をTsOHでの処理時に加水分解へ供し、17が26から収率51%で得られた。その一方で、本発明者らは、収率は非常に低い(＜5%)にもかかわらず、同じ反応で15の形成を観察してうれしく思った。本発明者らは、28から15を1ステップにおいて合成するためのグローバル加水分解／アルドール縮合カスケードを達成するように奨励され、TMSClと組み合わせたFeCl3を最適条件として特定した。粗製28を室温にてトルエン中の予め混合したFeCl3 (2-メチルテトラヒドロフラン中0.2 M)およびTMSClで処理すると、所望の生成物15が21%の30bと共に26から収率32%で生成された。FeCl3で17を15へ変換できず、30bを単離したため、本発明者らは、FeCl3/TMSCl促進カスケードプロセスは、中間体29および30aを通過して15を1ステップにおいて形成することを提案した。中間体30aにおいて、α-HaおよびEtO基はアンチペリプラナーであり、したがって、その後の1,2-脱離は容易であり、FeCl3/TMSCl条件下で起こった。中間体30bにおいて、α-HbおよびEtO基はどちらも疑似エクアトリアル位にあり、これは、NMR分析および計算モデリングによって裏付けられた。したがって、15へのその変換はより困難である。15の全収率を最大化するために、本発明者らは、30bの1,2-脱離を促進する条件を調べ、トルエン中でTsOHと共に50℃で加熱することによって、それを収率65%で15へ変換でき、これは26からの15の全収率を46%へもっていく。
[6-7-5]三環式炭素骨格をわずか6ステップにおいて迅速に組み立て、本発明者らは、次に、2つのメチル基を導入する必要があった。ジョンソンα-ヨウ素化は15をヨードエノン31に変換し、これは驚くほど不安定であった。したがって、迅速な後処理の後、粗製31を直ちにテトラメチルスタンナンとの次のスティルクロスカップリングへ供し、2ステップによって収率57%で32が得られた。最後に、C2位でのエノン32のα-メチル化により、分離可能な(-)-クルクソンA(1a)および(-)-クルクソンB(1b)の1:1混合物が収率63%(合計9ステップ)で得られた。KHDMSおよびMoOPHによる1aのα-ヒドロキシル化により、分離可能な(-)-クルクソンC(1c)および(-)-クルクソンD(1d)が収率63%で得られた(d.r. 1:1; 84% brsm; 合計10ステップ)。さらに、生物学的活性比較について類似体を得るために、本発明者らは、報告されたワンステップ手順に従うことによって、(-)-1bを(+)-スピロクルカソン(3)および(-)-33(ピラクルカソン（pyracurcasone）と名付けられた合成誘導体)へ変換した。本発明者らの合成試料の1H、13C NMR、および他の分析データは、報告されたものとよく一致し、これはまた、1986年にClardyらによって割り当てられた1a～1dの絶対立体配置は実際のものとは反対であると結論付けている。
本発明者らは、次いで、生体模倣二量体化を介して1a～1dからジメリクルソンA(2a)を合成することに着手した。2aの提案された生合成は、反応性シクロペンタジエノン中間体を形成するための1a/1bの酸化的脱水素または1c/1dの脱水、続いてのディールス-アルダー二量体化および一酸化炭素のキレトロピー押出のシーケンスからなる8。そこから、2aは別の酸化的脱水素および二重結合異性化を介して2bに変換することができた。本発明者らは、1cおよび1dから始めた。高温でそれらを直接加熱することによって2aを合成するという実を結ばない試みの後、それらの1:1混合物を最初にそれらのメシレート(34)へ変換した。広範な探索の結果、本発明者らは、150℃で1,4-ジクロロベンゼン中の塩基としてトリエチルアミンを使用すると、(-)-2aが2ステップによって収率18%で生成されたことを確認し、これは、提案された生合成経路を裏付けるための直接的な証拠を提供する。本発明者らの条件下では、2bの形成は観察されなかった。
プローブ合成。抗がんメカニズムを解明し、クルクソンの潜在的な細胞標的を同定するために、アルキンタグ付きプローブ分子37をケモプロテオミクス研究のために設計した。ジエノンはタンパク質反応性である可能性が高く、観察された活性にとって重要であるため、本発明者らは、この部分の構造摂動を最小限に抑えることを決定し、末端アルキンと連結するためのハンドルとして第3級アルコールを使用した。37は、36とのDCC促進カップリングを介して(-)-1dから収率59%で合成された。
細胞毒性および標的同定。本発明者らは、WST-1アッセイを用いて乳がんMCF-7細胞におけるクルクソンおよびそれらの類似体の細胞毒性を評価した(図3A)。合成1a～1d、天然1bおよび1d、ならびに中間体15および32は、MCF-7細胞に対してマイクロモルEC50値を示し、1dが最も強力なクルクソンであった。重要なことに、合成1bおよび1dについての細胞毒性値は、それらの天然に単離された対応物の値と実質的に同一であった。類似体33は、効力を改善するためにシクロヘプタジエノン部分を微調整する実行可能性を示すわずかに良好な抗増殖活性を示したが、2aは100μMでも活性ではなかった。試験されたMCF-7細胞の完全なコンフルエンシーに恐らく起因して、本発明者らが得たEC50値は、以前に報告された(1a～1dについて1.6～3.1μM EC50値)よりも約1桁高かった。嬉しいことに、37は1dと同様の抗がん特性を保持しており、したがって、競合ケモプロテオミクス研究におけるその使用を保証する。
本発明者らは、次いで、プローブ37を用いた競合ケモプロテオミクスによってクルクソンの細胞標的を同定した。MCF-7細胞を1dまたはDMSOで4時間処理し、続いて、溶解、37での処理、ビオチンアジドでのCuAAC、濃縮、消化、およびラベルフリー定量化を用いたLC-MS/MS分析を行った(図3B)。最も競合した標的はBRAT1であり、これは、DNA損傷後に、BRCA1へ結合し、ATMおよびPRKDC(DNA-PKcs)などのDDRキナーゼを活性化することによって、DNA損傷応答(DDR)およびDNA修復のマスターレギュレーターとして作用する。BRAT1のノックダウンは、ヒト骨肉腫細胞においてアポトーシスの構成的レベルを増加させ、インビトロおよびマウス腫瘍異種移植片においてがん細胞増殖および腫瘍形成性を減少させた。BRAT1は、腎臓がんおよび肝臓がんの予後不良マーカーでもある。したがって、BRAT1を標的とすることは、がん治療のための有望な戦略である。
本発明者らは、次に、1dとBRAT1との間の物理的相互作用を特徴付けた。本発明者らは、HEK-293T細胞中でFLAG-BRAT1を過剰発現させ、ライセートを1dで処理し、示されるように加熱し、残存する可溶性FLAG-BRAT1をウエスタンブロッティングによりプロービングすることによって、熱シフトアッセイを実施した(図3C)。本発明者らは、直接的な相互作用を示す1d処理BRAT1の熱不安定化を観察した。生細胞中での1dの標的としての内因性BRAT1を検証するために、本発明者らは競合プルダウン実験を用いた。MCF-7細胞を1dまたはDMSOで4時間処理し、その後、溶解、プローブ37での処理、ビオチンアジドでのCuAAC、ストレプトアビジン濃縮、溶出、およびウエスタンブロット可視化を行った。実際に、天然BRAT1は37によって濃縮され、1dによって競合された(図3D)。さらに、1dは、子宮頸がんHeLaおよびトリプルネガティブ乳がんMDA-MB-231細胞からのBRAT1の濃縮と競合し、したがって、これらの細胞株全体にわたる1dの細胞標的としての天然BRAT1を確認した。HeLa生細胞における1dのインサイチュ処理は、低マイクロモル濃度で37によるBRAT1濃縮と競合した(EC50 = 2.7μM; 図4E)。結合可逆性を評価するために、本発明者らは、不可逆的なシステイン反応性プローブであるヨードアセトアミド(IAA)を用いて競合BRAT1プルダウンアッセイを実施した。HeLaライセートを、IAA(30 mM)での1時間の前処理または後処理を伴って37(10μM)で1時間処理し、続いて、上述のように濃縮およびウエスタンブロット分析を行った。実際に、IAAによる前処理および後処理の両方が、37によるBRAT1濃縮と競合し、これは、クルクソンプローブがBRAT1中のシステインと共有結合を形成し、この結合が可逆的であることを示している。本発明者らは、さらに、HeLa生細胞を異なる濃度の1dで4時間処理して、本発明者らの競合プルダウンアッセイを介してBRAT1標的占有率を評価し、これは、1dが2.7μM濃度で50%分画占有率(f occ. (50))に達することを明らかにした(図3E)。まとめると、これらの結果は、1dがBRAT1の最初の小分子結合剤であることを実証している。
BRAT1調節。1dが細胞内のBRAT1を阻害するかどうかを決定するために、本発明者らは、shRNAレトロウイルス形質導入を介して安定したBRAT1 KD HeLa細胞を作製した。本発明者らは、次いで、グローバルプロテオミクス解析によってBRAT1 KD細胞と1d処理細胞(3μM、24時間)のタンパク質発現プロファイルを比較した。化合物処理細胞中の3347個の定量化されたタンパク質のうち、本発明者らは、わずか36個のアップレギュレートされたタンパク質および42個のダウンレギュレートされたタンパク質を見出した。重要なことに、78個の調節不全タンパク質のうち31個がBRAT1 KD細胞でも調節不全であり、したがって、1dが細胞内のBRAT1を機能的に阻害することを示している。特に、がん遊走を媒介するTRIM47、真正がんタンパク質および潜在的なバイオマーカーWBP2、ならびに頻繁に高度に増幅されるがん遺伝子FNDC3Bを含む、いくつかの周知のがん遊走および進行ドライバーがダウンレギュレーションされた。これらのタンパク質はいずれも、これまでBRAT1と機能的に関連付けられていなかった。本発明者らは、次いで、WTおよびBRAT1 KD HeLa細胞、ならびにWT MCF-7およびMDA-MB-231細胞におけるがん細胞遊走に対する1d処理およびBRAT1 KDの効果を調べた。予想通り、BRAT1ノックダウンはHeLa細胞の遊走を大幅に減少させ、1μM濃度での1dによる処理もまた、すべての細胞株の遊走を約4倍減少させた。
本発明者らのグローバルプロテオミクス実験はまた、(i)修復中にDNAを合成するPOLD1、(ii)塩基除去修復を促進するUSP47、(iii)DNA二本鎖切断および鎖間架橋の修復を媒介するFANCI、および(iv)DNA切断時のBRCA1の蓄積を安定化させるBRCC3などの、いくつかの一般的にダウンレギュレートされた重要なDNA修復タンパク質を明らかにした。これらのタンパク質もまた、これまでBRAT1に関連付けられていなかった。最も注目すべきことに、1d処理(24時間)は、ウエスタンブロッティングで確認されたように、実際の物理的標的であるBRAT1を有意にダウンレギュレーションした(比率0.18)。この効果がプロテアソーム分解によるものか、遺伝子発現の変化によるものかを評価するために、本発明者らは、1d処理の最後の4時間にプロテアソーム阻害物質MG132を添加し、これはBRAT1タンパク質レベルを回復させた。対照的に、本発明者らが24時間の1d処理後にRT-qPCRによってBRAT1 mRNAレベルを測定した場合、差は見られなかった。まとめると、これらの知見は、DDRのマスターレギュレーターとしてのBRAT1の重要性、および細胞におけるBRAT1の1d阻害が経時的にプロテアソーム分解を誘導することを実証している。
本発明者らは、次いで、1dがBRAT1阻害を介して臨床薬およびトポイソメラーゼ阻害物質エトポシドのDNA損傷効果を増強するかどうかを調べた。WTまたはBRAT1 KD HeLa細胞を、DMSO、エトポシド、1d、または組み合わせたエトポシドおよび1dで処理した。その後のDNA損傷を、次いで、γH2AX染色を用いて蛍光顕微鏡によって測定した。1d(3μM)またはBRAT1のKD単独での処理はγH2AXシグナルを増加させなかった。しかし、1dとエトポシドとの同時処理は2倍の増加をもたらした。同様に、エトポシド処理はBRAT1 KD細胞においてγH2AXシグナルを有意に増加させ、1d/エトポシド同時処理結果を再現した。重要なことに、1d処理は、エトポシド処理BRAT1 KD細胞においてγH2AXシグナルを増加させず、1d-エトポシド相乗作用がBRAT1不活性化に関連していることを確認した。さらに、1dとエトポシドとの同時処理はまた、HeLa、MCF-7、およびMDA-MB-231細胞における細胞毒性を増加させた。同様に、WT細胞と比較して、エトポシド処理後のBRAT1 KD HeLa細胞において細胞死が増加した。全体として、これらの結果は、1dでBRAT1を標的とすることが、DNA損傷薬に対する化学増感のための有望な抗がん戦略であることを実証している。
類似体合成。さらに3つの類似体(41～43)を、アミノ酸38～40とカップリングすることによって(-)-クルクソンD(1d)から合成した(図4)。これらの類似体は、クルクソンの抗がん活性を有意に変化させることなく第3級アルコール位置を修飾することができるという概念を検証するのに役立ち、それらの薬物様特性を改善するための将来の類似体設計および調製を導くための情報を提供し得る。
がん細胞増殖阻害。本発明者らは、乳がんMCF-7細胞における(-)-クルクソン1a～1d、(-)-ジメリクルクソン((-)-dimericurcusone）2a、(+)-スピロクルカソン(3)、(-)-ピラクルカソン(33)、および半合成類似体41～43、ならびに2つの合成中間体(15および32)の細胞毒性を試験することによって生物学研究を開始した。細胞を様々な濃度の化合物で24時間処理し、細胞生存率を細胞の画像化およびWST-1アッセイによって測定した(図4a)。試験されたMCF-7細胞の完全なコンフルエンシーに恐らく起因して、本発明者らが得たIC50値は、以前に報告された(天然1a～1dについて1.6～3.1μM IC50値)よりも約1桁高かった。それにもかかわらず、合成クルクソン1a～1d、天然1bおよび1d、ならびに合成中間体15および32は、MCF-7細胞に対してマイクロモルEC50値を示し、クルクソンD(1d)がクルクソンの中で最も強い細胞傷害効果(13.8μM)を示した。最も重要なことは、本発明者らの手の中で、合成クルクソンB(1b)およびD(1d)についての細胞毒性値は、それらの天然に単離された対応物の細胞毒性値と実質的に同一であり、本発明者らのものと報告されたものとの間のIC50値の差が試料の起源(合成対天然)によって引き起こされた可能性を排除する。さらに、スピロクルカソン(3)およびピラクルカソン(33)のIC50値は、同様に、報告されたものよりも約1桁高かった21。3の高IC50値(62.7μM)は、クルクソンのシクロヘプタジエノン部分の重要性を強調し、33のわずかに良好な抗増殖活性(8.0μM)は、効力を改善するためにシクロヘプタジエノン部分を微調整することができることを示している。興味深いことに、ジメリクルソンA(2a)はMCF-7細胞において毒性を示さなかった。嬉しいことに、本発明者らのアルキンプローブ37および半合成クルクソン類似体41～43は、親分子1dの抗がん特性を保持しており、したがって、クルクソンD細胞標的発見のためのプロテオミクスプローブとしての37の使用を保証する。
要約すると、本発明者らは、クルクソン天然物の最初の不斉全合成および標的同定を完成させた。本発明者らの収束合成は、安価で豊富なキラルプール分子(8)に基づいており、重要なシクロヘプタジエノンコアを迅速に構築するための熱的[3,3]-シグマトロピー転位およびFeCl3促進グローバル加水分解/アルドール縮合カスケードを特徴とする。この効率的な合成経路は、クルクソンAおよびB(1aおよび1b)をわずか9ステップにおいて、クルクソンCおよびD(1cおよび1d)を10ステップにおいて、ジメリクルソンA(2a)を12ステップにおいて(S)-(-)-8から生じさせた。1c/1dからの2aの合成の成功は、提案されたディールス-アルダー二量体化およびキレトロピー押出生合成を実験的に裏付ける。アルキンプローブ37を用いてケモプロテオミクスを行うことによって、本発明者らは、以前は「創薬不可能な」発がん性タンパク質BRAT1を1dの重要な細胞標的として同定した。さらに、1dはがん細胞におけるBRAT1を阻害し、それによって、がん細胞遊走を減少させ、DNA損傷に対する感受性を高め、そして承認薬エトポシドに対する化学増感を誘導する。本発明者らの知る限り、1dは、DDRおよびDNA修復のマスターレギュレーターであるBRAT1の最初に知られた小分子阻害物質である。単剤療法としてまたは他の処置と組み合わせてPARP、ATR、ATM、CHK、およびDNA-PKなどのDDRタンパク質を標的とする多くの有望な臨床試験が進行中である。PARP阻害物質であるオラパリブは、生殖細胞系列BRCA1/2変異卵巣がんを処置するための単剤療法として2014年にFDAによって承認された。本発明者らの簡潔で収束的な全合成は、クルクソン類似体合成および構造活性最適化への門戸を開き、これは、したがって、単剤療法または併用療法についての潜在的なリード医薬品として新規のBRTAT1阻害物質を生じさせ得る。
一般的な方法。NMRスペクトルをBruker分光計で記録した(400 MHz, 500 MHz, 800 MHzで1Hおよび100 MHz, 125 MHz, 200 MHzで13C)。化学シフト(δ)は、溶媒シグナルを参照してppmで与えられた[1H NMR: CHCl3 (7.26); 13C NMR: CDCl3 (77.16), C6D6 (128.02), CD3OD (49.0)]。カラムクロマトグラフィーをシリカゲルにおいて行った。空気または湿気に敏感なすべての反応は、特に断りのない限り、無水条件下にて乾燥しておりかつ新たに蒸留された溶媒中でアルゴン雰囲気下にて行った。無水THFおよびトルエンをアルゴン下にてベンゾフェノンケチルナトリウムで蒸留した。無水CH2Cl2をアルゴン下にて水素化カルシウムで蒸留した。他のすべての溶媒および試薬は、さらなる精製無しに市販の供給源から得られたままで使用した。室温(r.t.)は約23℃である。
実験手順およびスペクトルデータ
CH2Cl2 (500 mL)中の(S)-(-)-ペリルアルデヒド8 (7.8 mL, 50 mmol)の溶液へ、トリエチルアミン(10.5 mL, 75.0 mmol)およびトリフルオロメタンスルホン酸tert-ブチルジメチルシリル(13.8 mL, 60.0 mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温へ加温し、25分間撹拌した。反応混合物を次いで0℃へ冷却し、続いてオルトギ酸トリエチル(33.3 mL, 200 mmol)および三フッ化ホウ素ジエチルエーテラート(8.0 mL, 65 mmol)を添加した。反応混合物を0℃で25分間撹拌し、その後、それを飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(250 mL)でクエンチし、CH2Cl2 (2×100 mL)で抽出した。合わせた有機層を乾燥し(Na2SO4)、濾過し、濃縮し、粗製22が得られ、これを次のステップにおいて直接使用した。
上記粗残渣22を、CH2Cl2 (500 mL)およびEtOH (100 mL)の混合物中に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム(4.73 g, 125 mmol)を0℃で添加した。反応混合物を室温で2時間激しく撹拌し、その後、それを水(200 mL)でクエンチし、CH2Cl2 (3×100 mL)で抽出した。合わせた有機層を鹹水(200 mL)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、濾過し、真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/EtOAc = 4/1→2/1)によって精製し、公知の化合物23 (10.1 g, 73%)が淡黄色液体として得られた。
FeCl3 (2-Me-THF中0.2 M, 3.5 mL, 0.69 mmol)およびTMSCl (37 mg, 0.35 mmol)を、室温にてトルエン(5 mL)と反応フラスコ中で前もって混合した。トルエン(3 mL)中の粗製化合物28 (上記で調製)を、2時間でシリンジポンプによって反応混合物へ徐々に滴下した。反応物を室温で20時間さらに撹拌した。反応混合物を次いでH2O (5 mL)でクエンチし、分離した。水相をEt2O (15 mL)で抽出した。合わせた有機相を鹹水で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中10% EtOAc)によって精製し、15 (59 mg, 26から、2ステップによって収率32%)が白色固体としておよび30b (45 mg, 26から21%)が無色オイルとして得られた。
化合物15：
化合物30b：
室温でDMF (2 mL, アルゴンで脱気)中の粗製31 (上記で調製)の溶液に、Pd(dppf)Cl2 (3 mg, 0.0034 mmol)、CuI (2 mg, 0.01 mmol)およびMe4Sn (2滴)を添加した。反応混合物をアルゴンで10分間バブリングし、次いでオイルバス(60℃で予熱)中に置いた。混合物を60℃で1時間撹拌し、その後、室温へ冷却し、次いでEt2O (6 mL)およびH2O (2 mL)で希釈した。有機層をH2O (2 mL)、鹹水(2 mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、濾過し、真空濃縮した。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中10% EtOAc)によって精製し、エノン32 (4.7 mg, 15から、2ステップによって45%)が白色固体として得られた。
(-)-クルクソンA(1a)：
(-)-クルクソンB(1b)：
(-)-クルクソンC(1c)：
(-)-クルクソンD(1d)：
上記粗生成物をp-ジクロロベンゼン(2 mL)中に溶解し、続いてEt3N (4.5 uL, 0.03 mmol)を添加した。混合物を次いで150℃で2時間加熱した。反応混合物を室温へ冷却し、真空濃縮した。粗残渣をカラムクロマトグラフィー(SiO2, ヘキサン中10% EtOAc)によって精製し、(□)-ジメリクルソンA (2a, 1.25 mg, 2ステップによって18%)が黄色固体として得られた。
(-)-ジメリクルソンA 2a：
(+)-スピロクルカソン(3)：
(-)-ピラクルカソン(33)：
類似体45～47は以下のスキームに基づいて調製される。
類似体41：(-)-クルクソンD (1d, 24.0 mg, 0.077mmol)を、CH2Cl2 (0.8 mL)、続いてジメチルグリシン(18.0 mg, 0.15 mmol)中に溶解した。溶液を5分間撹拌した後、EDC塩酸塩(15.3 mg, 0.08 mmol)を一度に、続いてDMAP (38 mg, 0.31 mmol)を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をprep TLC (ヘキサン中40% EtOAc)上にロードして精製し、生成物41が白色固体(6.7 mg, 収率22%)として得られた。
類似体42：(-)-クルクソンD (1d, 16.0 mg, 0.05 mmol)を、CH2Cl2 (0.8 mL)、続いてジエチルグリシン(13.1 mg, 0.10 mmol)中に溶解した。溶液を5分間撹拌した後、EDC塩酸塩(22.0 mg, 0.11 mmol)を一度に、続いてDMAP (29 mg, 0.15 mmol)を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をprep TLC (ヘキサン中40% EtOAc)上にロードして精製し、生成物42が白色固体(9.0 mg, 収率42%)として得られた。
類似体43：(-)-クルクソンD (1d, 16.0 mg, 0.05 mmol)を、CH2Cl2 (0.8 mL)、続いてモルホリン-4-イル-酢酸塩酸塩(18.0 mg, 0.10 mmol)中に溶解した。溶液を5分間撹拌した後、EDC塩酸塩(19.0 mg, 0.10 mmol)を一度に、続いてDMAP (31 mg, 0.25 mmol)を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。反応混合物をprep TLC (ヘキサン中40% EtOAc)上にロードして精製し、生成物43が白色固体(6.7 mg, 収率15%)として得られた。
生物学的方法
細胞培養およびライセートの調製
HeLa、MCF-7、およびMDA-MB-231細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS, Gibco 10437028)、1x MEM非必須アミノ酸溶液(100x Gibco 11140050)、および1xペニシリン-ストレプトマイシン(pen-strep, 100x Sigma-Aldrich P4333)が補われたDMEM (Corning MT10013CV)中で維持した。細胞を5% CO2雰囲気下にて37℃で増殖させた。細胞をコンフルエンスまで増殖させ、こすり取り、4℃にて5分間1,500 x gで遠心分離し、PBS中に再懸濁することによって採取した。細胞を超音波処理によって溶解して細胞ライセートを形成し、タンパク質濃度を、特に断りのない限りBradfordアッセイ(Biorad)を使用して決定し、BioTek Synergy H1マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
細胞培養およびライセートの調製
HeLa、MCF-7、およびMDA-MB-231細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS, Gibco 10437028)、1x MEM非必須アミノ酸溶液(100x Gibco 11140050)、および1xペニシリン-ストレプトマイシン(pen-strep, 100x Sigma-Aldrich P4333)が補われたDMEM (Corning MT10013CV)中で維持した。細胞を5% CO2雰囲気下にて37℃で増殖させた。細胞をコンフルエンスまで増殖させ、こすり取り、4℃にて5分間1,500 x gで遠心分離し、PBS中に再懸濁することによって採取した。細胞を超音波処理によって溶解して細胞ライセートを形成し、タンパク質濃度を、特に断りのない限りBradfordアッセイ(Biorad)を使用して決定し、BioTek Synergy H1マイクロプレートリーダーを使用して測定した。
様々な細胞株におけるクルクソンの細胞毒性
MCF-7(3e4)細胞を、96ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、FCSを含むDMEM中、示される化合物(DMSOストックから1:1000)、DMSO(0.1%最終)、または陽性対照としての10% v/v DMSOで処理した。24時間後、細胞を画像化し(Olympus IX51倒立顕微鏡)、次いで5% v/v WST1 (Sigma-Aldrich)で処理し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、420 nmおよび630 nmでの吸光度を、BioTek Synergy H1マイクロプレートリーダーを使用して取得した。細胞生存率の結果をGraphPad Prism 7にプロットした。
MCF-7(3e4)細胞を、96ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、FCSを含むDMEM中、示される化合物(DMSOストックから1:1000)、DMSO(0.1%最終)、または陽性対照としての10% v/v DMSOで処理した。24時間後、細胞を画像化し(Olympus IX51倒立顕微鏡)、次いで5% v/v WST1 (Sigma-Aldrich)で処理し、37℃で1時間インキュベートした。次いで、420 nmおよび630 nmでの吸光度を、BioTek Synergy H1マイクロプレートリーダーを使用して取得した。細胞生存率の結果をGraphPad Prism 7にプロットした。
インサイチュ競合MSベース標的同定
MCF-7 (8e6)細胞を10 cmペトリ皿に播種し、一晩インキュベートした。細胞を翌日DPBSで1回洗浄し、37℃にてFCSを含まないDMEM中で4時間、DMSOまたは30μM 1d (DMSOストックから1:1000)のいずれかで処理した。ライセートを上述のように調製した。ライセート(2 mg/mL, 0.75 mL)をr.t.にて1時間10μM 37 (DMSO中50xストック)で処理し、次いで、クリックケミストリーへ供した。ビオチンアルキン(Click Chemistry Tools, 50μM, DMSO中50xストック)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP) (1 mM, Sigma-Aldrich C4706-2G, 水中50x新鮮なストック)、トリス[(1-ベンジル-1H1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA) (100μM, Click Chemistry Tools, DMSO:tBuOH 1:4中16xストック)、および硫酸銅(II)(Sigma-Aldrich, 1 mM, 水中50xストック)をプロテオームへ添加し、r.t.で1時間反応させた。反応混合物へMeOH (4体積)、CHCl3 (1体積)、および水(3体積)を添加することによってタンパク質を沈殿させ、濁った混合物を4℃にて20,000 x gで5分間遠心分離し、水層と有機層の間にタンパク質層が生じた。タンパク質層を単離し、乾燥し、超音波処理を介してPBS中2% SDS中に可溶化した。チューブを4,700 x gで5分間遠心分離し、可溶性画分を新しいチューブへ移した。PBSを添加し、最終SDS濃度を0.2%とした。160μLのストレプトアビジンアガロースビーズ(ProteoChem)を添加し、混合物をr.t.で4時間回転させた。ビーズをPBS中1% SDS (1x 10 mL)、PBS (3x 10 mL)、および水(3x 10 mL)で洗浄した。ビーズをPBS中6 M尿素(500μL)中に再懸濁し、r.t.にて30分間10 mM中和TCEP (水中20x新鮮なストック)で還元し、暗所でr.t.にて30分間25 mMヨードアセトアミド(水中400 mM新鮮なストック)でアルキル化した。ビーズを遠心分離(1,400 x g, 2分間)によってペレット化し、50 mM NH4HCO3中の2 M尿素、1 mM CaCl2 (水中100xストック)およびトリプシン(Thermo Scientific, 1.5μLの0.5μg/μL)の150μLに再懸濁した。消化を37℃で6時間行った。試料を最終濃度5%酢酸まで酸性化し、自己充填C18スピンカラム上で脱塩し、乾燥した。試料をLC-MS/MSによって分析し(下記参照)、MSデータをMaxQuantで処理した(下記参照)。
MCF-7 (8e6)細胞を10 cmペトリ皿に播種し、一晩インキュベートした。細胞を翌日DPBSで1回洗浄し、37℃にてFCSを含まないDMEM中で4時間、DMSOまたは30μM 1d (DMSOストックから1:1000)のいずれかで処理した。ライセートを上述のように調製した。ライセート(2 mg/mL, 0.75 mL)をr.t.にて1時間10μM 37 (DMSO中50xストック)で処理し、次いで、クリックケミストリーへ供した。ビオチンアルキン(Click Chemistry Tools, 50μM, DMSO中50xストック)、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP) (1 mM, Sigma-Aldrich C4706-2G, 水中50x新鮮なストック)、トリス[(1-ベンジル-1H1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA) (100μM, Click Chemistry Tools, DMSO:tBuOH 1:4中16xストック)、および硫酸銅(II)(Sigma-Aldrich, 1 mM, 水中50xストック)をプロテオームへ添加し、r.t.で1時間反応させた。反応混合物へMeOH (4体積)、CHCl3 (1体積)、および水(3体積)を添加することによってタンパク質を沈殿させ、濁った混合物を4℃にて20,000 x gで5分間遠心分離し、水層と有機層の間にタンパク質層が生じた。タンパク質層を単離し、乾燥し、超音波処理を介してPBS中2% SDS中に可溶化した。チューブを4,700 x gで5分間遠心分離し、可溶性画分を新しいチューブへ移した。PBSを添加し、最終SDS濃度を0.2%とした。160μLのストレプトアビジンアガロースビーズ(ProteoChem)を添加し、混合物をr.t.で4時間回転させた。ビーズをPBS中1% SDS (1x 10 mL)、PBS (3x 10 mL)、および水(3x 10 mL)で洗浄した。ビーズをPBS中6 M尿素(500μL)中に再懸濁し、r.t.にて30分間10 mM中和TCEP (水中20x新鮮なストック)で還元し、暗所でr.t.にて30分間25 mMヨードアセトアミド(水中400 mM新鮮なストック)でアルキル化した。ビーズを遠心分離(1,400 x g, 2分間)によってペレット化し、50 mM NH4HCO3中の2 M尿素、1 mM CaCl2 (水中100xストック)およびトリプシン(Thermo Scientific, 1.5μLの0.5μg/μL)の150μLに再懸濁した。消化を37℃で6時間行った。試料を最終濃度5%酢酸まで酸性化し、自己充填C18スピンカラム上で脱塩し、乾燥した。試料をLC-MS/MSによって分析し(下記参照)、MSデータをMaxQuantで処理した(下記参照)。
LC-MS/MS分析
ペプチドを、0.1%ギ酸(FA)を含む水中に再懸濁し、Q Exactive HF-X Quadrupole-Orbitrap質量分析計(Thermo Scientific)へ連結されたEASY-nLC 1200 nano-UHPLCを用いて分析した。クロマトグラフィーカラムは、5μmチップによってキャップされ、ReproSil-Pur 120 C18-AQ 2.4μmビーズ(Dr. Maisch GmbH)が詰められた、50 cm長、75μm i.d.マイクロキャピラリーからなった。LC溶媒は、H2O中0.1% FA (バッファーA)および90% MeCN: 10% H2O中0.1% FA (バッファーB)であった。ペプチドを、65℃で240分間の線形勾配(5～35%バッファーB)にわたって300 nL/分の流速で質量分析計中へ溶出した。データを、S25フルMSスキャン(R = 60’000, m/z 400-1’300)後にデータ依存モード(top-20, NCE 28, R = 7’500)で取得した。動的排除を10 sに設定し、ペプチドの一致を優先し、同位体排除を可能にした。
ペプチドを、0.1%ギ酸(FA)を含む水中に再懸濁し、Q Exactive HF-X Quadrupole-Orbitrap質量分析計(Thermo Scientific)へ連結されたEASY-nLC 1200 nano-UHPLCを用いて分析した。クロマトグラフィーカラムは、5μmチップによってキャップされ、ReproSil-Pur 120 C18-AQ 2.4μmビーズ(Dr. Maisch GmbH)が詰められた、50 cm長、75μm i.d.マイクロキャピラリーからなった。LC溶媒は、H2O中0.1% FA (バッファーA)および90% MeCN: 10% H2O中0.1% FA (バッファーB)であった。ペプチドを、65℃で240分間の線形勾配(5～35%バッファーB)にわたって300 nL/分の流速で質量分析計中へ溶出した。データを、S25フルMSスキャン(R = 60’000, m/z 400-1’300)後にデータ依存モード(top-20, NCE 28, R = 7’500)で取得した。動的排除を10 sに設定し、ペプチドの一致を優先し、同位体排除を可能にした。
MaxQuant分析
MSデータをMaxQuant9 (V1.6.1.0)7で分析し、ヒトプロテオーム(Uniprot)および夾雑物の共通リスト(MaxQuantに含まれる)に対して検索した。第1ペプチド検索許容差を20 ppmに設定し、10 ppmをメインペプチド検索に使用し、フラグメント質量許容差を0.02 Daに設定した。ペプチド、タンパク質および部位同定についての偽発見率を1%に設定した。最小ペプチド長を6アミノ酸に設定し、ペプチド再定量化、ラベルフリー定量化(MaxLFQ)および「実行間の一致」を可能にした。1タンパク質当たりのペプチドの最小数を2に設定した。メチオニン酸化を可変修飾として検索し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として検索した。
MSデータをMaxQuant9 (V1.6.1.0)7で分析し、ヒトプロテオーム(Uniprot)および夾雑物の共通リスト(MaxQuantに含まれる)に対して検索した。第1ペプチド検索許容差を20 ppmに設定し、10 ppmをメインペプチド検索に使用し、フラグメント質量許容差を0.02 Daに設定した。ペプチド、タンパク質および部位同定についての偽発見率を1%に設定した。最小ペプチド長を6アミノ酸に設定し、ペプチド再定量化、ラベルフリー定量化(MaxLFQ)および「実行間の一致」を可能にした。1タンパク質当たりのペプチドの最小数を2に設定した。メチオニン酸化を可変修飾として検索し、システインのカルバミドメチル化を固定修飾として検索した。
HEK-293TにおけるFLAG-BRAT1の過剰発現
HEK-293T (8e6)細胞を、pen-strepを含まないDMEM中の10 cm皿に播種した。一晩インキュベートした後、24μgのFLAG-BRAT1 pExpプラスミドを、2 mL Opti-MEM (Gibco 11058021)の最終体積で96μLのPEI MAX（商標）40K (Polysciences 24765-1)と共にr.t.で15分間インキュベートした。次いで、混合物を細胞に注意深く添加した。24時間後、細胞をPBSで2回注意深く洗浄し、ライセートを上述のようにPBS中での超音波処理によって調製した。
HEK-293T (8e6)細胞を、pen-strepを含まないDMEM中の10 cm皿に播種した。一晩インキュベートした後、24μgのFLAG-BRAT1 pExpプラスミドを、2 mL Opti-MEM (Gibco 11058021)の最終体積で96μLのPEI MAX（商標）40K (Polysciences 24765-1)と共にr.t.で15分間インキュベートした。次いで、混合物を細胞に注意深く添加した。24時間後、細胞をPBSで2回注意深く洗浄し、ライセートを上述のようにPBS中での超音波処理によって調製した。
ウエスタンブロッティングを介したFLAG-BRAT1の熱シフトアッセイ
過剰発現されたFLAG-BRAT1ライセート(2 mg/mL)を、r.t.にて1時間DMSOまたは1d (DMSO中25xストックから30μM)で処理し、示される温度(34℃～61℃)で3分間加熱し、r.t.で3分間冷却し、次いで氷上で3分間冷却し、その後、4℃にて17,000 x gで20分間遠心分離した。SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)を、単離された上清へ添加し、タンパク質を、トリス-グリシン転写バッファー(20%メタノール)による湿式転写を使用して、PVDF (0.2μm)膜へ350 mAで1時間転写した。膜を、r.t.にて30～60分間、0.1% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBST)中の5%ミルクでブロッキングし、次いで、4℃で振盪しながら一晩、一次ウサギポリクローナルBRAT1抗体(Novus NB100-2256, TBST中5%ミルク中1:2000)と共にインキュベートした。膜を、TBSTで5分間3回洗浄し、r.t.にて1時間、抗ウサギAlexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., TBST中5%ミルク中1:500)と共にインキュベートした。次いで、膜をTBSTで3回洗浄し、Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imagerで可視化した。膜を次いでTBSTで洗浄し、r.t.で2時間または4℃で一晩、マウスモノクローナルβ-チューブリン抗体(Proteintech 66240-1-Ig; TBST中5%ミルク中1:10,000)と共にインキュベートした。膜を洗浄し、抗マウスAlexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Inc., TBST中5%ミルク中1:500)と共にインキュベートし、上述のようにスキャンした。
過剰発現されたFLAG-BRAT1ライセート(2 mg/mL)を、r.t.にて1時間DMSOまたは1d (DMSO中25xストックから30μM)で処理し、示される温度(34℃～61℃)で3分間加熱し、r.t.で3分間冷却し、次いで氷上で3分間冷却し、その後、4℃にて17,000 x gで20分間遠心分離した。SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)を、単離された上清へ添加し、タンパク質を、トリス-グリシン転写バッファー(20%メタノール)による湿式転写を使用して、PVDF (0.2μm)膜へ350 mAで1時間転写した。膜を、r.t.にて30～60分間、0.1% Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBST)中の5%ミルクでブロッキングし、次いで、4℃で振盪しながら一晩、一次ウサギポリクローナルBRAT1抗体(Novus NB100-2256, TBST中5%ミルク中1:2000)と共にインキュベートした。膜を、TBSTで5分間3回洗浄し、r.t.にて1時間、抗ウサギAlexa Fluor 647 (Jackson ImmunoResearch Inc., TBST中5%ミルク中1:500)と共にインキュベートした。次いで、膜をTBSTで3回洗浄し、Azure Biosystems Sapphire Biomolecular Imagerで可視化した。膜を次いでTBSTで洗浄し、r.t.で2時間または4℃で一晩、マウスモノクローナルβ-チューブリン抗体(Proteintech 66240-1-Ig; TBST中5%ミルク中1:10,000)と共にインキュベートした。膜を洗浄し、抗マウスAlexa Fluor 488 (Jackson ImmunoResearch Inc., TBST中5%ミルク中1:500)と共にインキュベートし、上述のようにスキャンした。
ウエスタンブロッティングを介したインサイチュ競合プルダウンアッセイ
MCF-7 (8e6)およびHeLa (4e6)細胞を10 cm皿に播種し、MDA-MB-231 (14e6)細胞を15 cm皿に播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDPBSで1回洗浄し、FCSを含まないDMEM中で4時間、10μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)で処理した。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL, 0.5 mL)を、r.t.にて1時間、10μM 37 (DMSO中50xストック)またはDMSOで処理し、次いで、r.t.にて1時間、上述のようにビオチンアジドでのクリックケミストリーへ供した。タンパク質を、上述のようにMeOH (4体積)、CHCl3 (1体積)および水(3体積)を使用して沈殿させた。タンパク質層を単離し、乾燥し、超音波処理を介してPBS中0.2% SDS(1 mL)に可溶化し；70μLのストレプトアビジンアガロースビーズ(ProteoChem)を添加し、混合物を暗所でr.t.にて一晩回転させた。ビーズをPBS中1% SDS(2x 1 mL)、PBS中6 M尿素(2x 1 mL)、およびPBS (3x 1 mL)で洗浄した。ビーズを遠心分離(1’400 x g, 2分間)によってペレット化し、上清を注意深く除去した。濃縮されたタンパク質を35μL SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)でビーズから溶出し、次いで、10分間熱変性(95℃)へ供し、11% SDS-PAGEゲルを用いて分離した。ウエスタンブロッティングを上述のように行った。β-チューブリンをローディング対照として使用し、何故ならばそれは競合MSベース標的同定において検出されたが1dによって競合されなかったためであった(TUBB6のLFQ比率は1.02 ± 0.17であった)。
MCF-7 (8e6)およびHeLa (4e6)細胞を10 cm皿に播種し、MDA-MB-231 (14e6)細胞を15 cm皿に播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDPBSで1回洗浄し、FCSを含まないDMEM中で4時間、10μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)で処理した。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL, 0.5 mL)を、r.t.にて1時間、10μM 37 (DMSO中50xストック)またはDMSOで処理し、次いで、r.t.にて1時間、上述のようにビオチンアジドでのクリックケミストリーへ供した。タンパク質を、上述のようにMeOH (4体積)、CHCl3 (1体積)および水(3体積)を使用して沈殿させた。タンパク質層を単離し、乾燥し、超音波処理を介してPBS中0.2% SDS(1 mL)に可溶化し；70μLのストレプトアビジンアガロースビーズ(ProteoChem)を添加し、混合物を暗所でr.t.にて一晩回転させた。ビーズをPBS中1% SDS(2x 1 mL)、PBS中6 M尿素(2x 1 mL)、およびPBS (3x 1 mL)で洗浄した。ビーズを遠心分離(1’400 x g, 2分間)によってペレット化し、上清を注意深く除去した。濃縮されたタンパク質を35μL SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)でビーズから溶出し、次いで、10分間熱変性(95℃)へ供し、11% SDS-PAGEゲルを用いて分離した。ウエスタンブロッティングを上述のように行った。β-チューブリンをローディング対照として使用し、何故ならばそれは競合MSベース標的同定において検出されたが1dによって競合されなかったためであった(TUBB6のLFQ比率は1.02 ± 0.17であった)。
競合プルダウンアッセイを介したインサイチュ用量反応および動態
HeLa (2.0e6)細胞を60 mm皿に播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDPBSで洗浄し、37℃にて1、2、または4時間、FCSを含まないDMEM中で1、3、10、もしくは30μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を用いて処理した。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL, 140μL)を、r.t.にて1時間、10μM 37 (DMSO中50xストック)で処理し、次いで、r.t.にて1時間、上述のようにビオチンアジドでのクリックケミストリーへ供した。タンパク質を、上述のように、沈殿させ、PBS中0.2% SDS中に再可溶化し、50μLストレプトアビジンビーズで濃縮し、洗浄した。タンパク質を30μL SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)を用いて溶出し、10分間加熱変性(95℃)へ供し、11% SDS-PAGEゲルを用いて分離し、上述のようにウエスタンブロッティングを介して可視化した。画像をImageJで定量化した。EC50およびKitz-Wilson結合定数を、GraphPad Prism 7を用いて計算した。
HeLa (2.0e6)細胞を60 mm皿に播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDPBSで洗浄し、37℃にて1、2、または4時間、FCSを含まないDMEM中で1、3、10、もしくは30μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を用いて処理した。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL, 140μL)を、r.t.にて1時間、10μM 37 (DMSO中50xストック)で処理し、次いで、r.t.にて1時間、上述のようにビオチンアジドでのクリックケミストリーへ供した。タンパク質を、上述のように、沈殿させ、PBS中0.2% SDS中に再可溶化し、50μLストレプトアビジンビーズで濃縮し、洗浄した。タンパク質を30μL SDS-PAGE還元ローディングバッファー(4x)を用いて溶出し、10分間加熱変性(95℃)へ供し、11% SDS-PAGEゲルを用いて分離し、上述のようにウエスタンブロッティングを介して可視化した。画像をImageJで定量化した。EC50およびKitz-Wilson結合定数を、GraphPad Prism 7を用いて計算した。
BRAT1 shRNAノックダウン細胞株の作製
BRAT1レトロウイルスshRNAおよび非ターゲッティング対照プラスミド(transOMIC)は、The Scripps Research InstituteのGenetic Perturbation Screening施設によって供給された。HEK-293T (4e6)細胞を、pen-strepを含まない10 mLのDMEM中の10 cmプレートに播種した。約70%コンフルエンシーで、細胞を、トランスフェクション試薬をr.t.で15分間一緒にインキュベートした後、Opti-MEM (Gibco 11058021)中950μLの最終体積で、80μLのPEIMAX-40 (Polysciences 24765-1)と共の各々10μgのBRAT1 shRNAまたは非ターゲッティング対照プラスミドおよびpCL-ECOプラスミド(Addgene 12371)でのトランスフェクションへ供した。6～8時間のトランスフェクション後、培地を、pen-strepを含まない8 mLのDMEMと交換した。上清を48時間および72時間で収集し、0.45μmシリンジフィルターで濾過し、合わせた。6ウェル皿中のHeLa細胞(0.2e6)を一晩インキュベートし、次いで、穏やかでゆっくりとした遠心分離でレトロウイルス形質導入へ供した。24時間後、細胞を2μg/mLのピューロマイシンで2週間選択し、BRAT1ノックダウンを上述のようにウエスタンブロッティングによってモニターした。
BRAT1レトロウイルスshRNAおよび非ターゲッティング対照プラスミド(transOMIC)は、The Scripps Research InstituteのGenetic Perturbation Screening施設によって供給された。HEK-293T (4e6)細胞を、pen-strepを含まない10 mLのDMEM中の10 cmプレートに播種した。約70%コンフルエンシーで、細胞を、トランスフェクション試薬をr.t.で15分間一緒にインキュベートした後、Opti-MEM (Gibco 11058021)中950μLの最終体積で、80μLのPEIMAX-40 (Polysciences 24765-1)と共の各々10μgのBRAT1 shRNAまたは非ターゲッティング対照プラスミドおよびpCL-ECOプラスミド(Addgene 12371)でのトランスフェクションへ供した。6～8時間のトランスフェクション後、培地を、pen-strepを含まない8 mLのDMEMと交換した。上清を48時間および72時間で収集し、0.45μmシリンジフィルターで濾過し、合わせた。6ウェル皿中のHeLa細胞(0.2e6)を一晩インキュベートし、次いで、穏やかでゆっくりとした遠心分離でレトロウイルス形質導入へ供した。24時間後、細胞を2μg/mLのピューロマイシンで2週間選択し、BRAT1ノックダウンを上述のようにウエスタンブロッティングによってモニターした。
LC-MS/MSを用いたグローバルプロテオミクスプロファイリング
1d化合物処理のために、HeLa (0.8e6)細胞を6ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、10% FCSを含むDMEM培地中で24時間、3μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)で処理した。BRAT1ノックダウンのために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照(WT)HeLa細胞を、24時間にわたって完全なコンフルエンシーまで増殖させた。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL;1リプリケート当たりPBS中15μL)を、100 mM NH4HCO3中の新鮮な9 M尿素を使用して最終濃度6 M尿素へ引き上げ、次いで、回転させながらr.t.で30分間10 mM TCEPと共にインキュベートした。アルキル化のために、25 mM IAAを添加し、暗所において回転下でr.t.にて30分間インキュベートした。溶液を、50 mM NH4HCO3および1 mM CaCl2で2 M尿素へ希釈し、次いで、1.5μトリプシン(Thermo Scientific)を添加した。トリプシン消化を37℃で一晩行った。ペプチドを自己充填C18スピンカラム上で脱塩し、乾燥した。試料をLC-MS/MSによって分析し(上記参照)、MSデータをMaxQuantで処理し(上記参照)、Perseusにおいて分析した。HeLa細胞を1d (3μM)で24時間処理した後のBRAT1発現を、上述のようにウエスタンブロットを介して測定した。
1d化合物処理のために、HeLa (0.8e6)細胞を6ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、10% FCSを含むDMEM培地中で24時間、3μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)で処理した。BRAT1ノックダウンのために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照(WT)HeLa細胞を、24時間にわたって完全なコンフルエンシーまで増殖させた。ライセートを上述のように調製および定量化した。ライセート(2 mg/mL;1リプリケート当たりPBS中15μL)を、100 mM NH4HCO3中の新鮮な9 M尿素を使用して最終濃度6 M尿素へ引き上げ、次いで、回転させながらr.t.で30分間10 mM TCEPと共にインキュベートした。アルキル化のために、25 mM IAAを添加し、暗所において回転下でr.t.にて30分間インキュベートした。溶液を、50 mM NH4HCO3および1 mM CaCl2で2 M尿素へ希釈し、次いで、1.5μトリプシン(Thermo Scientific)を添加した。トリプシン消化を37℃で一晩行った。ペプチドを自己充填C18スピンカラム上で脱塩し、乾燥した。試料をLC-MS/MSによって分析し(上記参照)、MSデータをMaxQuantで処理し(上記参照)、Perseusにおいて分析した。HeLa細胞を1d (3μM)で24時間処理した後のBRAT1発現を、上述のようにウエスタンブロットを介して測定した。
トランスウェル遊走アッセイ
化合物処理のために、MCF-7 (1e5)、HeLa (5e4)、またはMDA-MB-231 (3e4)細胞を、FCSを含まず(最終体積200μL)しかし1μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を含むDMEM中のトランスウェル遊走チャンバ(Greiner Bio-One 07-000-396)に播種した。1μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を含有するFCSを含むDMEM(最終体積700μL)を下部チャンバ中に配置した。ノックダウン遺伝子対照のために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照HeLa (5e4)細胞を、FCSを含まないDMEM(最終体積200μL)中のトランスウェル遊走チャンバに播種し；FCSを含むDMEM(最終体積700μL)を下部チャンバ中に配置した。24時間のインキュベーション後、培地を注意深く除去し、細胞を100% MeOHで10分間固定し、次いで、0.5% w/vクリスタルバイオレット(H2O中20% MeOH)で10分間染色した。チャンバ内の細胞を物理的に除去し、次いで、遊走した細胞を画像化し(Olympus IX51 倒立顕微鏡)、ImageJでカウントし、GraphPad Prism 7にプロットした。
化合物処理のために、MCF-7 (1e5)、HeLa (5e4)、またはMDA-MB-231 (3e4)細胞を、FCSを含まず(最終体積200μL)しかし1μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を含むDMEM中のトランスウェル遊走チャンバ(Greiner Bio-One 07-000-396)に播種した。1μM 1d (DMSOストックから1:1000)またはDMSO (0.1%最終)を含有するFCSを含むDMEM(最終体積700μL)を下部チャンバ中に配置した。ノックダウン遺伝子対照のために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照HeLa (5e4)細胞を、FCSを含まないDMEM(最終体積200μL)中のトランスウェル遊走チャンバに播種し；FCSを含むDMEM(最終体積700μL)を下部チャンバ中に配置した。24時間のインキュベーション後、培地を注意深く除去し、細胞を100% MeOHで10分間固定し、次いで、0.5% w/vクリスタルバイオレット(H2O中20% MeOH)で10分間染色した。チャンバ内の細胞を物理的に除去し、次いで、遊走した細胞を画像化し(Olympus IX51 倒立顕微鏡)、ImageJでカウントし、GraphPad Prism 7にプロットした。
γH2AX蛍光顕微鏡を介したDNA二本鎖切断の可視化
BRAT1ノックダウン(1e5)または非ターゲッティング対照(7e4)HeLa細胞を、カバーガラスを含む24ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、FCSを含むDMEM中で24時間、3μM 1d (DMSOストックから1:1000)、30μMエトポシド、30μMエトポシドと組み合わされた3μM 1d、またはDMSO (0.2%最終)で処理した。細胞をPBSで1回洗浄し、-20℃にて10分間メタノールで固定した。細胞をPBSで再度2回洗浄し、カバーガラスをウェットボックスへ移した。ブロッキングを、PBS中5%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液で30分間行った。細胞をPBS中0.1% BSAで1回洗浄し、H2AX pS139に対するウサギ抗体(Sigma Aldrich H5912, PBS 0.1% BSA中1:400)を添加し、r.t.で1時間インキュベートした。細胞をPBS 0.1% BSAで3回洗浄し、抗ウサギIgG Alexa Fluor 488 (Jackson, PBS 0.1% BSA中1:200)と共に1時間インキュベートした。細胞をPBS 0.1% BSAで3回、PBSで1回、水で1回洗浄し、次いで、DAPIを含むProLong Gold褪色防止用封入剤(Life Technologies)でスライド上に載せた。細胞をBX53蛍光顕微鏡(Olympus)で可視化した。1リプリケート当たり50を超える細胞の強度を、ImageJを用いて測定した。
BRAT1ノックダウン(1e5)または非ターゲッティング対照(7e4)HeLa細胞を、カバーガラスを含む24ウェルプレートに播種した。一晩インキュベートした後、細胞を、FCSを含むDMEM中で24時間、3μM 1d (DMSOストックから1:1000)、30μMエトポシド、30μMエトポシドと組み合わされた3μM 1d、またはDMSO (0.2%最終)で処理した。細胞をPBSで1回洗浄し、-20℃にて10分間メタノールで固定した。細胞をPBSで再度2回洗浄し、カバーガラスをウェットボックスへ移した。ブロッキングを、PBS中5%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液で30分間行った。細胞をPBS中0.1% BSAで1回洗浄し、H2AX pS139に対するウサギ抗体(Sigma Aldrich H5912, PBS 0.1% BSA中1:400)を添加し、r.t.で1時間インキュベートした。細胞をPBS 0.1% BSAで3回洗浄し、抗ウサギIgG Alexa Fluor 488 (Jackson, PBS 0.1% BSA中1:200)と共に1時間インキュベートした。細胞をPBS 0.1% BSAで3回、PBSで1回、水で1回洗浄し、次いで、DAPIを含むProLong Gold褪色防止用封入剤(Life Technologies)でスライド上に載せた。細胞をBX53蛍光顕微鏡(Olympus)で可視化した。1リプリケート当たり50を超える細胞の強度を、ImageJを用いて測定した。
エトポシドとの相乗毒性
化合物処理のために、HeLa (1e4)、MCF-7 (3e4)、またはMDA-MB-231 (1.5e4)細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩接着させるために放置した。細胞を、DMSO (0.2%最終)、1d (示される通り1または3μM)、エトポシド(50μM)、または組み合わされた1d (示される通り1または3μM)およびエトポシド(50μM)の両方で処理した(1:1000 DMSOストックから希釈された化合物)。ノックダウン遺伝子対照のために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照HeLa (1e4)を播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDMSO (0.1%最終)または50μMエトポシド(1:1000 DMSOストック)で処理した。24時間後、上述のように、細胞を画像化し、5% v/v WST1で処理し、定量化した。
化合物処理のために、HeLa (1e4)、MCF-7 (3e4)、またはMDA-MB-231 (1.5e4)細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩接着させるために放置した。細胞を、DMSO (0.2%最終)、1d (示される通り1または3μM)、エトポシド(50μM)、または組み合わされた1d (示される通り1または3μM)およびエトポシド(50μM)の両方で処理した(1:1000 DMSOストックから希釈された化合物)。ノックダウン遺伝子対照のために、BRAT1ノックダウンまたは非ターゲッティング対照HeLa (1e4)を播種した。一晩インキュベートした後、細胞をDMSO (0.1%最終)または50μMエトポシド(1:1000 DMSOストック)で処理した。24時間後、上述のように、細胞を画像化し、5% v/v WST1で処理し、定量化した。
一態様において、本開示は、式I：
の化合物または任意の立体異性体を提供し、式中、R1は、H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得る。
式Iの化合物に関する一態様において、R1はH、I、またはメチルである。
式Iの化合物に関する一態様において、式Iの化合物は、式II：
のキラル化合物である。
一態様において、本開示は、式III：
の化合物またはその任意の薬学的に許容される塩を提供し、
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得、
但し、化合物は、
でもその任意の立体異性体でもない。
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得、
但し、化合物は、
式IIIの化合物に関する一態様において、R2は-(C=O)-CH2-NR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る。
式IIIの化合物に関する一態様において、化合物は、式IV：
の化合物またはその任意の薬学的に許容される塩である。
式IIIまたはIVの化合物に関する一態様において、化合物は、
、およびその任意の薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
一態様において、本開示は、クルクソン化合物Dまたはその異性体を調製するための合成方法を提供し、方法は、
式Aの化合物を提供し、かつ、式Aの化合物をハロゲン化条件下で処理して式Bの化合物を提供する工程；
式Bの化合物を第1メチル化条件下で処理して式Cの化合物、またはその任意の異性体を提供する工程；および
式Cの化合物を第2メチル化条件下で処理して式Dの化合物またはその異性体を提供する工程
を含み、ここで、XはCl、Br、またはIである：
。
式Aの化合物を提供し、かつ、式Aの化合物をハロゲン化条件下で処理して式Bの化合物を提供する工程；
式Bの化合物を第1メチル化条件下で処理して式Cの化合物、またはその任意の異性体を提供する工程；および
式Cの化合物を第2メチル化条件下で処理して式Dの化合物またはその異性体を提供する工程
を含み、ここで、XはCl、Br、またはIである：
クルクソン化合物Dまたはその異性体を調製するための合成方法に関する一局面において、XはIである。
一態様において、本開示は、BRCA1関連ATM活性化因子1(BRAT1)阻害物質として式IIIの化合物を使用する方法を提供し、式IIIの化合物は、
またはその任意の立体異性体、任意の薬学的に許容される塩であり、
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る。
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る。
BRCA1関連ATM活性化因子1(BRAT1)阻害物質として式IIIの化合物を使用する方法に関する一態様において、化合物は、式IV：
またはその任意の薬学的に許容される塩を有し、式中、R1～R3は、式IIIにおいて定義されるものと同じである。
BRCA1関連ATM活性化因子1(BRAT1)阻害物質として式IIIの化合物を使用する方法に関する一態様において、R2は-(C=O)-CH2-NR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る。
BRCA1関連ATM活性化因子1(BRAT1)阻害物質として式IIIの化合物を使用する方法に関する一態様において、化合物は、
、およびその任意の薬学的に許容される塩からなる群より選択される。
当業者は、上述の具体的な実施に対して多数の改変を加えることができることを認識するであろう。実施は、記載されている特定の限定に限定されるべきではない。他の実施も可能であり得る。
本方法および装置の範囲は以下の特許請求の範囲によって規定されることが意図される。しかしながら、本開示は、その精神または範囲から逸脱することなく、具体的に説明および図示される以外の方法で実施され得ることが理解されなければならない。本明細書に記載される態様の様々な代替物が、以下の特許請求の範囲に規定される精神および範囲から逸脱することなく特許請求の範囲を実施する際に採用され得ることが、当業者によって理解されるべきである。
Claims (13)
- 式I：
の化合物もしくは任意の立体異性体またはその薬学的に許容される塩であって、
式中、R1は、H、F、Cl、Br、I、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得る、
前記化合物もしくは任意の立体異性体またはその薬学的に許容される塩。 - 式II：
を有する、請求項1記載の化合物。
- R1がH、I、またはメチルである、請求項1記載の化合物。
- BRCA1関連ATM活性化因子1（BRCA1-associated ATM activator 1）(BRAT1)阻害物質として式IIIの化合物を使用する方法であって、
式IIIの化合物が、
またはその任意の立体異性体、任意の薬学的に許容される塩であり、
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、前記環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る、
前記方法。 - 前記化合物が、式IV：
またはその任意の薬学的に許容される塩を有する、請求項4記載の方法。
- R2が-(C=O)-CH2-NR8R9であり、ここで、R8およびR9が、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素が、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9が、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、前記環が、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る、請求項4記載の方法。
- 前記化合物が、
からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
- 式III：
の化合物またはその薬学的に許容される塩であって、
式中、R1およびR3は、各々独立して、CN、CO2R4、CONR5R6、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R2は、H、-(SO2)-R7、または-(C=O)-R7であり、R4、R5、およびR6は、各々独立して、H、または置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得、R7は、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR7はNR8R9であり、ここで、R8およびR9は、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素は、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9は、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、前記環は、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得、
但し、前記化合物は、
でもその任意の立体異性体でもない、
前記化合物またはその薬学的に許容される塩。 - R2が-(C=O)-CH2-NR8R9であり、ここで、R8およびR9が、各々独立して、H、置換されていてもよいC1～C6直鎖もしくは分岐鎖アルキル基、または置換されていてもよいC3～C6炭素環であり、ここで、前記C3～C6炭素環の1もしくは2個の炭素が、N、O、もしくはその組み合わせによって置き換えられ得るか、またはR8およびR9が、窒素含有3～8員環を一緒に形成し得、ここで、前記環が、O、N、およびSからなる群より選択される1～3個のヘテロ原子を有し得る、請求項8記載の化合物。
- 式IV：
の化合物またはその任意の薬学的に許容される塩である、請求項8記載の化合物。
- 、およびその任意の薬学的に許容される塩からなる群より選択される、請求項8記載の化合物。
- 式Aの化合物を提供し、かつ、式Aの化合物をハロゲン化条件下で処理して式Bの化合物を提供する工程；
式Bの化合物を第1メチル化条件下で処理して、式Cの化合物またはその任意の異性体を提供する工程；および
式Cの化合物を第2メチル化条件下で処理して、式Dの化合物またはその異性体を提供する工程
を含み、ここで、XがCl、Br、またはIである、
クルクソン化合物Dまたはその異性体を調製するための合成方法：
。
- XがIである、請求項12記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063084594P | 2020-09-29 | 2020-09-29 | |
| US63/084,594 | 2020-09-29 | ||
| PCT/US2021/052148 WO2022072266A1 (en) | 2020-09-29 | 2021-09-27 | Curcusone diterpenoids and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023549023A true JP2023549023A (ja) | 2023-11-22 |
Family
ID=80951789
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023519429A Pending JP2023549023A (ja) | 2020-09-29 | 2021-09-27 | クルクソンジテルペノイドおよびその使用法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230250042A1 (ja) |
| EP (1) | EP4221697A1 (ja) |
| JP (1) | JP2023549023A (ja) |
| CN (1) | CN116669713A (ja) |
| CA (1) | CA3194116A1 (ja) |
| WO (1) | WO2022072266A1 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3146067A1 (en) * | 2014-05-20 | 2017-03-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Method for the treatment of multiple myeloma |
| JP2020524149A (ja) * | 2017-06-20 | 2020-08-13 | デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | Ａｐｒｉｌ−ｔａｃｉ間相互作用のモジュレーターを用いた制御性ｔ細胞、制御性ｂ細胞、及び免疫応答の調節方法 |
-
2021
- 2021-09-27 JP JP2023519429A patent/JP2023549023A/ja active Pending
- 2021-09-27 CA CA3194116A patent/CA3194116A1/en active Pending
- 2021-09-27 EP EP21876254.0A patent/EP4221697A1/en active Pending
- 2021-09-27 CN CN202180079302.0A patent/CN116669713A/zh active Pending
- 2021-09-27 WO PCT/US2021/052148 patent/WO2022072266A1/en active Application Filing
- 2021-09-27 US US18/445,087 patent/US20230250042A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA3194116A1 (en) | 2022-04-07 |
| US20230250042A1 (en) | 2023-08-10 |
| CN116669713A (zh) | 2023-08-29 |
| WO2022072266A1 (en) | 2022-04-07 |
| EP4221697A1 (en) | 2023-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11518770B2 (en) | Sesquiterpenoid analogs | |
| EP1363909B1 (en) | Tricyclic androgen receptor modulator compounds | |
| CZ20012878A3 (cs) | Cyklické substituované kondenzované pyrrolokarbazoly a isoindolony | |
| US7214690B2 (en) | Tricyclic quinolinone and tricyclic quinoline androgen receptor modulator compounds and methods | |
| Puppala et al. | 4H-Chromene-based anticancer agents towards multi-drug resistant HL60/MX2 human leukemia: SAR at the 4th and 6th positions | |
| JP7353281B2 (ja) | 大環状化合物およびそれらの使用 | |
| WO2019085933A1 (zh) | 作为Wee1抑制剂的大环类化合物及其应用 | |
| CN113939518A (zh) | 作为激酶抑制剂的稠合三环化合物 | |
| NO312464B1 (no) | Utvalgte derivater av K-252a og anvendelse derav | |
| Ding et al. | Development of novel phenoxy-diketopiperazine-type plinabulin derivatives as potent antimicrotubule agents based on the co-crystal structure | |
| Guo et al. | Molecular hybrid design, synthesis, in vitro and in vivo anticancer evaluation, and mechanism of action of N-acylhydrazone linked, heterobivalent β-carbolines | |
| EP3684754A1 (en) | Pentafluorophenyl sulfonamide compounds, compositions and uses thereof | |
| Pandey et al. | Synthesis and computational studies of potent antimicrobial and anticancer indolone scaffolds with spiro cyclopropyl moiety as a novel design element | |
| Grillet et al. | Intramolecular isomünchnone cycloaddition approach to the antitumor agent camptothecin | |
| JP2023549023A (ja) | クルクソンジテルペノイドおよびその使用法 | |
| Kamal et al. | Conversion of Amines to Imines Employing Polymer‐Supported Sulfoxide (PSS) and Polymer‐Supported Perruthenate (PSP): Synthesis of Pyrrolo [2, 1‐c][1, 4] benzodiazepines | |
| CN115197167B (zh) | 1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮化合物及其制备方法和应用 | |
| Wang et al. | Garcinol and its analogues: Synthesis, cytotoxic activity and mechanistic investigation | |
| Li et al. | Studies on the synthesis and biological evaluation of the metabolite of clausenamide CM2 and its stereoisomers | |
| Bo-Ru et al. | Diversity-oriented synthesis of marine sponge derived hyrtioreticulins and their anti-inflammatory activities | |
| CN111848573B (zh) | 苯并噻吩酰胺类化合物及其制备方法和用途 | |
| JP5343129B2 (ja) | 水に対する溶解度が改善された新規のシンナムアルデヒド誘導体、その製造方法、それを含む抗癌剤組成物およびそれを用いた癌治療方法 | |
| Cui et al. | Total synthesis and chemoproteomics connect curcusone diterpenes with oncogenic protein BRAT1 | |
| EP4269388A1 (en) | Dipyrromethene-1-one compound and preparation method therefor | |
| WO2014061821A1 (en) | Grb10 interacting gyf protein 2 modulator |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230403 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20230831 |