CN116656862A - 一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用。分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。试剂盒包括上述分子标记引物。应用包括：将分子标记引物用于鉴定橡胶树云研3003。利用标记的测序结果来区分品种，如不同序列之间存在一个或多个碱基的差异，或替换，或插入，或缺失，或重复等，从而实现对云研3003的鉴定，并可对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分，可准确地对橡胶树品种进行鉴定。
Description
技术领域
本公开涉及分子生物学及遗传育种领域，特别涉及一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用。
背景技术
橡胶树是一种典型的多年生热带雨林树种，原产于南美洲亚马逊河流域的巴西、委内瑞拉和圭亚那等国，后来引入我国，现主要种植于我国的海南、云南和广东等地。天然橡胶是由橡胶树割胶时流出的胶乳经凝固及干燥而制得的。近年我国天然橡胶需求持续增长，供需缺口不断加大。据产业信息网数据，2021年我国天然橡胶产量85.1吨，需求量594.9吨，自给率仅为14.30％。
当前国际形势下，供给安全面临诸多挑战，国内生产需长期发挥“压舱石”的作用。天然橡胶在武器装备、飞机轮胎、高弹减震和高空探测等领域具有独特的优良性状，未来天然橡胶树产业发展前景广阔。
目前，橡胶树品种鉴定、授权与选育的直接对象是性状，性状测试仍然是许多植物品种特异性测试的行业标准。但性状的表现易受环境和人为因素的影响，且需要几年的时间才能准确鉴定。橡胶树种质资源、重要的选育种材料以及生产中推广应用的品种，存在“同名异物”、“同物异名”的现象，这不利于橡胶树品种选育、授权、快速推广和知识产权的保护。尤其是在实际生产中对橡胶树品种的不确定性，会严重限制橡胶产业的健康持续发展，橡胶树种苗品种不纯甚至错误将严重影响胶农的经济利益。
公开内容
为了橡胶树云研3003鉴定不准确的问题，本公开实施例提供了一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用。所述技术方案如下：
一方面，本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物，所述分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。
另一方面，本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的试剂盒，所述试剂盒包括上述分子标记引物。
又一方面，本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物的应用，所述应用包括：将分子标记引物用于鉴定橡胶树云研3003，所述分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。
进一步地，所述应用还包括：所述分子标记引物可对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分。
本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用，该分子标记引物通过扩增产物测序结果来区分品种，如不同序列之间存在一个或多个碱基的差异，或替换，或插入，或缺失，或重复等，从而实现对橡胶树云研3003的鉴定，并可对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分，且鉴定结果不受环境和其他人为因素的影响，进而准确地对橡胶树品种进行鉴定。
附图说明
为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本公开实施例三提供的命名为a～g的序列对比图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本公开实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物，该引物包括上游引物和下游引物，上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。具体地，上游引物的序列为：CAAGATTGGCTAAATCAACCAGGTC，下游引物的序列为：TGTAATGGCTTTGTGAAAGAGCATT。
实施例二
本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的试剂盒，该试剂盒包括实施例一提供的分子标记引物。
实施例三
本公开提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物的应用，该应用包括：将实施例一提供的分子标记引物用于鉴定橡胶树云研3003。
进一步地，该应用还包括：此分子标记引物可对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分。
具体地，将42个橡胶树品种作为待测样本，品种名称见表1。
表1为待测样本品种名称
提取上述42个待测样本的DNA，在实现时，采用天根生化科技(北京)有限公司生产的新型植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的DNA。具体操作按照该新型植物基因组DNA提取试剂盒的说明书进行。
利用本发明实施例一提供的标记引物扩增42个待测样本。具体地，扩增体系包括：50ng待测样本的DNA、0.5μL 10mM的dNTP(deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，2.5μL Tap Buffer缓冲液，0.2μL Taq酶，加入ddH2O将扩增体系补足至20μL，扩增程序包括：95℃ 3min；(95℃ 30sec，60℃ 30sec)×30个循环；72℃ 6min。扩增后的产物通过二代高通量测序，获得测序数据。利用Bowtie2软件将测序数据比对到橡胶树参考基因组(NCBI：PRJNA587314)上，获得每个待测样本的测序结果。
利用Microsoft Office Excel软件对测序结果进行分析，共有7种不同的序列类型。把7种不同的序列类型，分别命名为a、b、c、d、e、f和g，如表2所示。
表2为分子标记引物对42个待测样本扩增后测序得到的不同序列
利用软件DNASTAR lasergene 11对7种不同的序列类型进行比对，比对结果如图1所示，在图1中，7种不同序列有18个碱基位点存在差异，具体地序列的差异包括：第23个碱基位置C/T，第24个碱基位置C/A，第38个碱基位置序列e插入了一个碱基A，第45个碱基位置G/A，第67个碱基位置C/T，第69个碱基位置G/A，第79个碱基位置A/G，第83个碱基位置T/G，第87个碱基位置C/T，第90个碱基位置G/A，第103个碱基位置C/G，第124个碱基位置A/G，第127个碱基位置G/A，第128个碱基位置G/T，第138个碱基位置C/T，第149个碱基位置T/A，第167个碱基位置A/C，第168个碱基位置G/A，第169个碱基位置A/T。
本实施例提供的42个待测样本中，利用本实施例提供的引物对能有效区分9个待测样本，9个待测样本的不同序列组合见表3。
表3为区分出的9个待测样本的不同序列组合
由表3可知，上述9个待测样本具有不同的序列组合方式，可见本发明实施例一提供的引物能够扩增出云研3003的序列，且序列组合方式为efg，亦可根据序列组合的不同，实现对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917的区分。
橡胶树分子标记引物鉴定的准确性分析
利用三次重现性实验来做准确性分析，在本实施例中采用不同人员、不同批次试剂和不同实验室做三次独立实验，从而模拟了不同批次橡胶树的鉴定，重现率高意味着不同实验室的鉴定结果可以相互进行准确的比较。
对9个橡胶树待测样本进行了重现性实验，9个待测样本具体为：云研3003、RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917，每份待测样品分别做了三次重复实验，记录每次结果的序列组合，具体结果见表4。
表4为三次重复实验结果
由表4可知，3次重复实验的序列组合都一样。由此可知，本发明实施例提供的分子标记引物鉴定的准确率为100％。可见，本发明实施例采用不同实验室或者同一实验室的不同批次间的品种鉴定结论具有较高的一致性，从而不必采用平行实验来降低实验误差，这对于橡胶树品种鉴定提供了极大的方便。
本发明实施例提供了橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物、试剂盒及应用，利用标记的测序结果来区分品种，如不同序列之间存在一个或多个碱基的差异，或替换，或插入，或缺失，或重复等，从而实现对云研3003的鉴定，橡胶树云研3003为重要的三倍体，同时可对橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分，且鉴定结果不受环境和其他人为因素的影响，进而准确地对橡胶树品种进行鉴定。
以上所述仅为本公开的可选实施例，并不用以限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物，其特征在于，所述分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。
2.一种橡胶树云研3003鉴定的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的分子标记引物。
3.一种橡胶树云研3003鉴定的分子标记引物的应用，其特征在于，所述应用包括：将分子标记引物用于鉴定橡胶树云研3003，所述分子标记引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述下游引物如序列表中SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用还包括：所述分子标记引物也可以对：橡胶树RRIM600、云研3089、热研106、RRIC52、RRII105、热垦525、IAN873和热研917进行区分。
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