CN116656528A - 一种假肠杆菌及利用该微生物制备除臭固氮菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种假肠杆菌及利用该微生物制备除臭固氮菌剂的方法，其制备方法为将假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解磷菌(Agrobacteriumsp.)、解钾菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分别活化后转接至牛肉膏蛋白胨培养基培养至对数期，按复配比例2％：2％：2％：2％：0.5％接种至冷却发酵基质上，于pH6‑7，发酵温度30‑37℃，1d翻拌一次，防止结块，发酵时间10‑14d即得除臭固氮菌剂；该除臭固氮菌剂对鸡粪进行发酵时，相比市面上购买的同类型产品氨气释放量减少了28.8％，含氮量提高了3倍；该菌剂除臭、保氮效果显著，能有效减少氮素损失，提高氮素利用率。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，尤其是一种假肠杆菌及利用该微生物制备除臭固氮菌剂的方法。
背景技术
目前，我国每年工业氮肥产量达到约5000万吨，但当季利用率仅为30.35％，每年损失的氮量相当于1900多吨尿素。施用大量化肥，不仅给环境带来严重污染，而且造成土壤板结、孔隙率下降，使农产品减产且品质下降等问题。大量未被利用的氮素流入水体，导致水体富营养化、水域生态被破坏。其中以氨气的挥发是氮素损失的主要形式，占氮素损失总量的44％-99％。降低氨气挥发味(臭味)即除臭和固氮方法主要是添加物理吸附剂、化学添加剂或者微生物菌剂。
目前，常用除臭固氮方法是通过物理吸附、掩盖或化学氧化还原以及生物除臭法。物理除臭法是依靠固、液、气三相之间的转化消除恶臭气味，能够在一定程度上降低嗅觉对气味的感知程度。化学除臭法则是添加某些化学试剂，与恶臭物质发生化学反应，改变其化学结构以破坏其致臭基团，变为无臭味或臭味较低的物质。而生物除臭法则是阻止源头氮素的流失，相比物理除臭法更能起到保护环境的作用，比化学除臭法更能节约成本，并提高资源利用率。
发明内容
鉴于此，为解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种假肠杆菌及利用该微生物制备除臭固氮菌剂的方法；该方法同时具有除臭固氮特性的菌株筛选、增殖培养基、优化相关工艺参数技术，达到减少氮素损失，提高氮素利用率，可为鸡粪等农业固体废弃物的堆肥利用奠定基础。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种假肠杆菌，所述假肠杆菌为假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)JFN-1，该假肠杆菌具有除臭固氮的作用，并且在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，具有提高硝态氮，减少铵态氮以及减少氮类物质分解的作用；
其中，所述该假肠杆菌JFN-1已于2022年12月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.26337，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
一种利用假肠杆菌JFN-1制备除臭固氮菌剂的方法，步骤如下：
将假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解磷菌(Agrobacteriumsp.)、解钾菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分别活化后转接至牛肉膏蛋白胨培养基培养至对数期，按复配比例2％：2％：2％：2％：0.5％接种至冷却发酵基质上，于pH6-7，发酵温度30-37℃，1d翻拌一次，防止结块，发酵时间10-14d即得除臭固氮菌剂。
所述发酵基质包括将菌糠、麸皮、豆粕、糠醛4种多元辅料粉碎至无明显颗粒状，然后将菌糠15g、麸皮15g、豆粕1g、硫酸铵0.5g、糠醛2g装于250mL组培瓶中，添加无机盐培养基调节含水量至45-50％，121℃灭菌20min即得。
所述无机盐培养基配方如下，磷酸二氢钾1.0g,氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g,氯化钙0.1g，硫酸亚铁0.01g，氯化钴0.01g.蒸馏水1000mL,混合后即得。
所述除臭固氮菌剂的菌剂总氮含量达241.718mg/kg，有效活菌数达5-7×109cfu/g，种子发芽率达80％，符合农用微生物国家标准(GB20287-2006)。
一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于，步骤如下：
采集鲜鸡粪样，称取10-15g鲜鸡粪悬浮于100-150mL无菌水中，在150-180r/min，28-30℃的条件下，振荡培养1-2h；以1％-2％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取20-100ul菌液涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于28-37℃培养1-2d，挑取D/d值为1.2-2.0的单菌落，进行多次的反复平板划线纯化；取3％-5％菌悬液接种至氨气选择培养基中，于150-180r/min，28-30℃培养3-5d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取1％-2％菌液接种至发酵培养基中，150-180r/min，28-30℃培养3-5d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取1-2％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，150-180r/min，28-30℃，培养3-5d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
将已分离纯化的假肠杆菌菌液以1-2％的接种量接种至硝化培养基中，于28-30℃，150-180r/min振荡培养，每隔24h取样，测定铵态氮、硝态氮、总氮指标及硝酸还原酶、亚硝酸还原酶以及脲酶活性；
其中，硝化培养基为葡萄糖5g/L，硝酸钾0.722g/L，氯化钠1g/L，七水合硫酸亚铁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，活化培养基为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
增殖培养基的碳、氮源及金属离子的优化，将已分离纯化的假肠杆菌株菌液接入增殖培养基中摇床培养；
增殖培养基为牛肉膏5g/L，葡萄糖6g/L，氯化钠5g/L，氯化钙3.3g/L，pH为6.8-7.2，蒸馏水1000mL。
增殖培养基碳、氮源及金属离子的正交优化，在碳、氮源及金属离子优化基础上，对碳、氮源和金属离子进行三因素三水平的正交试验。
用接种环从固体平板上挑取1-3环接种到种子培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养24h；用无菌枪头将种子液接种到增殖培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养；
分别用500g/100L的蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素、氯化铵、牛肉膏作为氮源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用600g/100L的蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖作为碳源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用330g/100L的硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙作为金属离子，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、利用本发明公开的具有除臭固氮活性的菌株筛选及增殖优化方法，从鲜鸡粪中筛选到除臭固氮菌株，对该菌株的遗传特性和生理生化特性进行测定，确定该菌株为假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)，并对其除臭固氮机理初探，对菌体增殖培养基进行优化，结果表明，该菌株为在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，提高硝态氮，减少铵态氮以及减少氮类物质分解。
2、利用本发明优化后的增殖培养基对具有除臭固氮活性的菌株进行培养，活菌数提高了10-15倍，固氮量提高了1.5-3倍；该除臭固氮菌在生物固氮技术领域有广泛的应用前景。
3、本发明采用鸡粪筛选的方法，再应用于鸡粪除臭当中，使得菌种更加容易适应环境，提高生物活性。
4、利用本发明制备的除臭固氮菌剂对鸡粪进行发酵时，相比市面上购买的同类型产品氨气释放量减少了28.8％，含氮量提高了3倍；该菌剂除臭、保氮效果显著，能有效减少氮素损失，提高氮素利用率。
5、本发明利用麸皮、豆粕等农业有机固废物作为菌剂固态辅料，利用糠醛渣调整pH，不仅减少了资源的浪费，而且能够保护环境。
6、本发明制备的固态菌剂相比液态，保存时间更久，且菌落存活率高。
附图说明
图1为本发明假肠杆菌JFN-1菌落形态；
图2为本发明假肠杆菌JFN-1固氮效果图；
图3为本发明假肠杆菌JFN-1与相关菌株的16SrDNA进化树；
图4为本发明假肠杆菌JFN-1的优化前、后生长曲线对比；
图5为本发明假肠杆菌JFN-1液态发酵72h各指标变化；
图6为本发明不同碳源种类的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD600值；
图7为本发明不同可溶性淀粉浓度的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD600值；
图8为本发明不同氮源种类的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD600值；
图9为本发明不同牛肉膏浓度的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD6000值；
图10为本发明不同金属离子的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD600值；
图11为本发明不同硫酸镁浓度的假肠杆菌JFN-1发酵72h发酵液OD600值；
图12为本发明不同微生物菌剂配比在发酵过程中总氮变化对比图；
图13为本发明不同菌剂基质在发酵过程中总氮变化对比图；
图14为本发明不同处理组对鸡粪发酵含氮量影响的对比图；
图15为本发明不同处理组对鸡粪发酵NH3释放量影响的对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种假肠杆菌的筛选方法，步骤如下：
采集鲜鸡粪样，称取10g鲜鸡粪悬浮于100mL无菌水中，在150r/min，28℃的条件下，振荡培养1小时；以1％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取20μL菌液，涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于28℃培养1d，挑取D/d值为1.2的单菌落，进行50次的反复平板划线纯化；取3％-5％菌悬液接种至氨气选择培养基中，于150r/min，28℃培养3d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取1％菌液接种至发酵培养基中，150r/min，28℃培养3d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取1％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，150r/min，28℃，培养3d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
实施例2
采集鲜鸡粪样，称取15g鲜鸡粪悬浮于150mL无菌水中，在180r/min，30℃的条件下，振荡培养2小时；以2％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取100μL菌液，涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于37℃培养2d，挑取D/d值为2.0的单菌落，进行200次的反复平板划线纯化；取5％菌悬液接种至氨气选择培养基中，于180r/min，30℃培养5d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取2％菌液接种至发酵培养基中，180r/min，30℃培养5d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取2％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，180r/min，30℃，培养5d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
实施例3
采集鲜鸡粪样，称取15g鲜鸡粪悬浮于150mL无菌水中，在180r/min，29℃的条件下，振荡培养2小时；以2％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取80μL菌液，涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于35℃培养2d，挑取D/d值为2.0的单菌落，进行200次的反复平板划线纯化；取4％菌悬液接种至氨气选择培养基中，于180r/min，29℃培养4d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取2％菌液接种至发酵培养基中，180r/min，29℃培养5d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取2％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，180r/min，29℃，培养5d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
实施例4
采集鲜鸡粪样，称取15g鲜鸡粪悬浮于150mL无菌水中，在180r/min，29℃的条件下，振荡培养2h；以2％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取80ul菌液涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于35℃培养2d，挑取D/d值为2.0的单菌落，进行多次的反复平板划线纯化；取4％菌悬液接种至氨气选择培养基中，于180r/min，29℃培养4d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取2％菌液接种至发酵培养基中，180r/min，29℃培养5d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取2％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，180r/min，29℃，培养5d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
假肠杆菌菌种形态观察及分子鉴定
菌落及细胞形态观察：将筛选得到的菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体平板上，在28-30℃下培养24-48h，观察其菌落形态，在光学显微镜下观察该菌个体形态。
从纯化后的除臭固氮菌菌株提取DNA作为模板，16SrDNA通用引物为引物，对16SrDNA核苷酸片段进行扩增，将扩增的片段直接进行序列测定，对上述菌株进行生理生化测定，根据测定结果得出除臭固氮菌菌株的名称并保藏于公共保藏中心。
分子鉴定：16SrDNA序列的聚合酶链式反应扩增采用细菌通用引物为GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增条件为95℃10min，95℃45s，55℃30s，72℃60s，30个循环，72℃，5min。
假肠杆菌除臭固氮机理
将已分离纯化的除臭固氮菌株菌液以1％-2％的接种量接种至硝化培养基中，于28-30℃，150-180r/min振荡培养，每隔24h取样，测定铵态氮、硝态氮、总氮指标及硝酸还原酶、亚硝酸还原酶以及脲酶活性。
硝化培养基为葡萄糖5g/L，硝酸钾0.722g/L，氯化钠1g/L，七水合硫酸亚铁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
活化培养基为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
已分离纯化的假肠杆菌菌株菌液的制备步骤为：将得到的单一菌落菌株进行活化，随后放入恒温摇床12-36h，振荡摇匀后取出，所述假肠杆菌菌株的除臭固氮机理为在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，提高硝态氮，减少铵态氮以及减少氮类物质分解。
增殖培养基的碳、氮源及金属离子的优化：
将已分离纯化的除臭固氮菌株菌液接入增殖培养基中摇床培养。
增殖培养基为牛肉膏5g/L，葡萄糖6g/L，氯化钠5g/L，氯化钙3.3g/L，蒸馏水1000mL。增殖培养基碳、氮源及金属离子的正交优化：
在对碳、氮源及金属离子单因素优化基础上，对碳、氮源和金属离子进行三因素三水平的正交试验。
所述增殖培养基碳、氮源与无机盐的优化方法包括：
用接种环从固体平板上挑取1-3环接种到种子培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养24h；用无菌枪头将种子液接种到增殖培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养；
分别用500g/100L的蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素、氯化铵、牛肉膏作为氮源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用600g/100L的蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖作为碳源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用330g/100L的硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙作为金属离子，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600。
通过单因素试验确定合适的碳源、氮源，金属离子，再通过正交实验确定对应的碳源、氮源与金属离子的浓度。
通过比较在增殖基础培养基中的生长曲线和优化培养基中的生长曲线及固氮能力，评价优化后的培养基。
表1三因素三水平正交试验表
结论
表2正交结果表
由表2可以看出，可溶性淀粉浓度的改变对JFN-1菌体增殖的影响最大，牛肉膏浓度次之，硫酸镁浓度对JFN-1菌体增殖的影响最小。根据表的结果得出最佳组合为A1B1C1，即可溶性淀粉浓度800g/100L，牛肉膏浓度为2000g/100L，硫酸镁浓度为400g/100L。由表2可得出，正交组合中OD600值最高组即为A1B1C1，OD600值为40-60。考虑发酵罐发酵成本，故选择可溶性淀粉浓度为600-800g/100L，牛肉膏浓度为1800-2200g/100L，硫酸镁浓度为320-480g/100L。
本研究从鲜鸡粪中分离纯化得到的菌株JFN-1，通过形态、生理生化试验、16SrDNA序列分析鉴定，确定其为假肠杆菌(Empedobacterfalseni)。通过定性初筛和定量复筛，确定其具有除臭固氮的功能。JFN-1的除臭固氮机理初探为在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，提高硝态氮，减少铵态氮以及减少氮类物质分解。通过单因素和正交优化试验获得JFN-1增殖培养最优培养基：可溶性淀粉浓度为600-800g/100L，牛肉膏浓度为1800-2200g/100L，硫酸镁浓度为320-480g/100L，氯化钠500-600g/100L。培养24-48h，活菌数提高了10-15倍，固氮量提高了1.5-3倍。
实施例5
一种利用假肠杆菌JFN-1制备除臭固氮菌剂的方法，步骤如下：
(1)培养基的配制：
保藏培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，蒸馏水1000mL。
活化培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，蒸馏水1000mL。
发酵基质：菌糠15g、麸皮15g、豆粕1g、硫酸铵0.5g、糠醛2g装于250mL组培瓶中，添加无机盐培养基调节含水量至45％-50％，121℃灭菌20min即得。
无机盐培养基：磷酸二氢钾1.0g/L；氯化钠0.5g/L；硫酸镁0.5g/L；氯化钙0.1g/L；硫酸亚铁0.01g/L；氯化钴0.01g/L，蒸馏水1000mL。
将假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解磷菌(Agrobacteriumsp.)、解钾菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分别活化后转接至牛肉膏蛋白胨培养基培养至对数期，按复配比例2％：2％：2％：2％：0.5％接种至冷却发酵基质上，于pH6-7，发酵温度30-37℃，1d翻拌一次，防止结块，发酵时间10-14d即得除臭固氮菌剂。
优选地，本除臭固氮菌剂在发酵完成之后，可压制成菌砖便于保存。
本发明中所使用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)购买于中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCCNo：22252；解磷菌(Agrobacteriumsp.)购买于中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCCNo.21306；解钾菌(Paenibacilluspolymyxa)购买于中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCCNO.22842；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)购买于中国微生物菌种保藏中心，编号：CGMCCNo.21731。
如图13所示：1组为最优组，假肠杆菌：解淀粉芽孢杆菌：解磷菌：解钾菌：枯草芽孢杆菌＝2％：2％：2％：2％：0.5％；2组为假肠杆菌：解淀粉芽孢杆菌：解磷菌：解钾菌：枯草芽孢杆菌＝1％：0.5％：2％：0.5％：2％；3组为假肠杆菌：解淀粉芽孢杆菌：解磷菌：解钾菌：枯草芽孢杆菌＝0.5％：0.5％：2％:1％:1％。在菌剂复配试验过程中，1组总氮显著增加(P<0.05)，增量为172.637mg/kg，2组总氮增量为64.616mg/kg，而3组总氮减少，减少量为17.495mg/kg。
如图14所示：1组为最优组，菌糠：麸皮：豆粕：硫酸铵：糠醛＝15％:15％:1％:0.5％:2％；2组为菌糠：麸皮：豆粕：硫酸铵：糠醛＝15％：20％：3％：0.3％：2％；3组为菌糠：麸皮：豆粕：硫酸铵：糠醛＝5％：20％：2％：0.5％：2％。在发酵基质筛选试验过程中，1组总氮增量显著(P<0.05)，为226.620mg/kg，3组增加，增加了76.091mg/kg，而2组总氮减少，减少了90.429mg/kg。
如图15所示，购买菌剂为市售根腾微生物菌剂，物理处理为菌糠7.5g、麸皮7.5g、豆粕0.5g、硫酸铵0.25g、糠醛1g，35g鸡粪，加45％-55％左右的水，35-37℃静态发酵10-15d。自制菌剂组在鸡粪发酵过程中总氮含量显著增加(P<0.05)，整个发酵过程中，自制菌剂组总氮含量增加了674.377mg/kg；而纯鸡粪发酵组增加了57.244mg/kg；购买菌剂组的总氮量增加了166.711mg/kg；物理处理组增加了104.064mg/kg。发酵结束总氮增量比为自制菌剂组>购买菌剂组>物理处理组>纯鸡粪发酵组。
如图15所示，购买菌剂为市售根腾微生物菌剂，物理处理为菌糠7.5g、麸皮7.5g、豆粕0.5g、硫酸铵0.25g、糠醛1g，35g鸡粪，加45％-55％左右的水，35-37℃静态发酵10-15d。自制菌剂组在鸡粪发酵过程中氨气释放量显著减少(P<0.05)，发酵结束时，氨气总释放量为5.986μg，而纯鸡粪发酵组氨气释放量达到36.781μg，添加购买的菌剂，氨气释放量为8.409μg，物理处理组氨气释放量为21.227μg，发酵结束氨气释放量比为纯鸡粪发酵组>物理处理组>购买菌剂组>自制菌剂组。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种假肠杆菌，其特征在于：所述假肠杆菌为假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)JFN-1，该假肠杆菌具有除臭固氮的作用，并且在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，具有提高硝态氮、减少铵态氮以及减少氮类物质分解的作用；
其中，所述该假肠杆菌JFN-1已于2022年12月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.26337，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种利用如权利要求1所述的假肠杆菌JFN-1制备除臭固氮菌剂的方法，其特征在于：
步骤如下：
将假肠杆菌(Empedobacterfalsenii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、解磷菌(Agrobacteriumsp.)、解钾菌(Paenibacilluspolymyxa)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分别活化后转接至牛肉膏蛋白胨培养基，培养至对数期，按复配比例2％：2％：2％：2％：0.5％接种至发酵基质上，于pH6-7，发酵温度30-37℃，1d翻拌一次，防止结块，发酵时间10-14d即得除臭固氮菌剂。
3.根据权利要求2所述的制备除臭固氮菌剂的方法，其特征在于：所述发酵基质包括将菌糠、麸皮、豆粕、糠醛4种多元辅料粉碎至无明显颗粒状，然后将菌糠15g、麸皮15g、豆粕1g、硫酸铵0.5g、糠醛2g装于250mL组培瓶中，添加无机盐培养基调节含水量至45％-50％，121℃灭菌20min即得。
4.根据权利要求3所述的除臭固氮菌剂的方法，其特征在于：所述无机盐培养基配方如下，磷酸二氢钾1.0g,氯化钠0.5g，硫酸镁0.5g,氯化钙0.1g，硫酸亚铁0.01g，氯化钴0.01g.蒸馏水1000mL,混合后即得。
5.根据权利要求2所述的除臭固氮菌剂的方法，其特征在于：所述除臭固氮菌剂的菌剂总氮含量达241.718mg/kg，有效活菌数达5-7×109cfu/g，种子发芽率达80％，符合农用微生物国家标准(GB20287-2006)。
6.一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于，步骤如下：
采集鲜鸡粪样，称取10-15g鲜鸡粪悬浮于100-150mL无菌水中，在150-180r/min，28-30℃的条件下，振荡培养1-2h；以1％-2％的接种量接种到富集培养基中，待明显浑浊后，再接种于新鲜培养液中，相同条件下连续培养4代以上，完成驯化；取20-100μL菌液，涂布在阿须贝无氮固体平板上进行筛选培养，于28-37℃培养1-2d，挑取D/d值为1.2-2.0的单菌落，进行多次的反复平板划线纯化；取3％-5％菌悬液，接种至氨气选择培养基中，于150-180r/min，28-30℃培养3-5d，观察菌液变化，得到单一菌落具有除臭固氮活性的菌株；
取1％-2％菌液接种至发酵培养基中，150-180r/min，28-30℃培养3-5d，测定稀硫酸溶液中的氨气变化量；取1％-2％菌液接种至阿须贝无氮培养基中，150-180r/min，28-30℃，培养3-5d，测定发酵液中的总氮变化量；
其中，富集培养基为硫酸铵2g/L，氯化钠0.3g/L，七水合硫酸亚铁0.03g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁0.03g/L，氯化钙7.5g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，氨气选择培养基为蔗糖50g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水合硫酸镁0.5g/L，七水合硫酸亚铁0.1g/L，氯化钠2.0g/L，氨水10mL/L，1％硫酸锌5mL/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，阿须贝无氮培养基为磷酸二氢钾0.2g/L，氯化钠0.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，碳酸钙5g/L，硫酸钙0.1g/L，甘露醇10g/L，琼脂20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中发酵培养基为糠醛渣10g/L，磷酸氢二钾1g/L，七水合硫酸镁5g/L，七水合硫酸亚铁0.05g/L，硫酸镁0.02g/L，酵母浸出液0.2g/L，鲜鸡粪(风干重)20g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
7.根据权利要求6所述的一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于：将已分离纯化的假肠杆菌菌液以1-2％的接种量接种至硝化培养基中，于28-30℃，150-180r/min震荡培养，每隔24h取样，测定铵态氮、硝态氮、总氮指标及硝酸还原酶、亚硝酸还原酶以及脲酶活性；
其中，硝化培养基为葡萄糖5g/L，硝酸钾0.722g/L，氯化钠1g/L，七水合硫酸亚铁0.5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min；
其中，活化培养基为蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，pH为6.8-7.2，加蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。
8.根据权利要求6所述的一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于：
增殖培养基的碳、氮源及金属离子的优化，将已分离纯化的假肠杆菌株菌液接入增殖培养基中摇床培养；
增殖培养基为牛肉膏5g/L，葡萄糖6g/L，氯化钠5g/L，氯化钙3.3g/L，蒸馏水1000mL。
9.根据权利要求6所述的一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于：
增殖培养基碳、氮源及金属离子的正交优化，在碳、氮源及金属离子优化基础上，对碳、氮源和金属离子进行三因素三水平的正交试验。
10.根据权利要求6所述的一种假肠杆菌的筛选及增殖优化方法，其特征在于：
用接种环从固体平板上挑取1-3环接种到种子培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养24h；用无菌枪头将种子液接种到增殖培养基中，28-30℃，150-180r/min摇床培养；
分别用500g/100L的蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、尿素、氯化铵、牛肉膏作为氮源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用600g/100L的蔗糖、果糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖作为碳源，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600；分别用330g/100L的硫酸铵、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钙作为金属离子，每个变量各做三个平行组，测定菌体OD600。
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| CN (1) | CN116656528B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148246A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-11-23 | 蓝德环保科技集团股份有限公司 | 净化黑臭水体的复配菌剂及其制备方法 |
| WO2018083128A2 (en) * | 2016-11-02 | 2018-05-11 | Wageningen Universiteit | Microbial genome editing |
| CN108841765A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-11-20 | 江苏师范大学 | 稳杆菌及其在转化红薯秸秆生产生物絮凝剂中的应用 |
| CN110295128A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-10-01 | 广东实验中学 | 一株四环素类抗生素降解菌及其应用 |
| CN112625960A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-09 | 山东大学 | 一株土壤杆菌dp3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用 |
| CN113583895A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-11-02 | 杨凌未来中科环保科技有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌、有机肥、生产方法及应用 |
| CN113817640A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一株多粘类芽孢杆菌hz-9及其应用 |
| CN114480205A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-13 | 千禾味业食品股份有限公司 | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在固态发酵食醋酿造中的应用 |
-
2023
- 2023-03-15 CN CN202310249275.8A patent/CN116656528B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106148246A (zh) * | 2016-08-30 | 2016-11-23 | 蓝德环保科技集团股份有限公司 | 净化黑臭水体的复配菌剂及其制备方法 |
| WO2018083128A2 (en) * | 2016-11-02 | 2018-05-11 | Wageningen Universiteit | Microbial genome editing |
| CN108841765A (zh) * | 2018-07-24 | 2018-11-20 | 江苏师范大学 | 稳杆菌及其在转化红薯秸秆生产生物絮凝剂中的应用 |
| CN110295128A (zh) * | 2019-06-21 | 2019-10-01 | 广东实验中学 | 一株四环素类抗生素降解菌及其应用 |
| CN112625960A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-09 | 山东大学 | 一株土壤杆菌dp3、其菌剂及在制备生物肥料领域的应用 |
| CN113583895A (zh) * | 2021-06-28 | 2021-11-02 | 杨凌未来中科环保科技有限公司 | 一株枯草芽孢杆菌、有机肥、生产方法及应用 |
| CN113817640A (zh) * | 2021-09-26 | 2021-12-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一株多粘类芽孢杆菌hz-9及其应用 |
| CN114480205A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-13 | 千禾味业食品股份有限公司 | 一株解淀粉芽孢杆菌及其在固态发酵食醋酿造中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 陈春兰;张建华;张靖;徐东伟;尚慧;兰晓君;: "1株分离自矽肺合并肺部感染患者痰液中Empedobacter falsenii 5-1的鉴定", 甘肃医药, no. 07, 15 July 2017 (2017-07-15) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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