CN116656470A - 单细胞捕获装置和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于玻璃微电极的单细胞捕获装置和方法,包括一套简便的单细胞捕获装置、污染去除方案和转录组测序前质控方案。其中单细胞捕获装置包括动力系统、微操系统和显微系统。该装置简便有效,大多数实验平台均可搭建。污染去除方案通过有效清除玻璃微电极外壁黏附的组织细胞以提高单细胞制样质量。转录组测序前质控方案提供了一种检测捕获的单个细胞污染程度的方法。总之,本发明提供了一种简便的单细胞捕获装置,同时提供了一种独有的污染去除方法和转录组测序前质控方案,为获取高质量细胞进行下游单细胞分析测试提供了一种新的方案。
Description
技术领域
本发明属于细胞分子生物学领域,具体涉及一种单细胞捕获装置和方法。
背景技术
近年来随着单细胞组学技术的快速兴起,极大地促进了生命科学和医学各个领域的研究进展。单细胞组学技术的首个关键步骤即为获取单个细胞。目前已有多种成熟的技术,包括:流式分选、手动挑选、激光显微切割和基于膜片钳系统的patch-seq等。其中,流式分选依赖于制备单细胞悬液后,进一步对带有特殊标记的细胞进行批量检测和分选,该方法具有通量高、可重复性高等优点,其缺点为仅适合目标细胞含量高的细胞样本;手动挑选同样也需要制备单细胞悬液,然后在显微镜下借助毛细玻璃管对目标细胞进行逐个吸取,相比流式分选,其通量降低,但准确性提高,可人为对目标进行判断,但同样,该方法仅适合目标细胞含量高的细胞样本;激光显微切割技术适用于组织切片,通过在二维组织切片上用激光沿着目标细胞周围切割,进而捕获单个细胞,该技术同样具有准确性高的特点,但需要目标细胞数量足够多才能降低切片难度,而且通量也较低。基于膜片钳系统的patch-seq方案为,在对目标细胞进行高阻封接后和电信号记录后,吸取细胞内含物,进而获得细胞,该方法可以将电信号、神经元形态和测序信息关联起来,但同样面临通量低的缺点,并且膜片钳技术门槛高,整个系统复杂,对于非神经元细胞或者不需要记录电信号和形态的细胞显得有些冗余。此外,对于单个细胞的在体捕获,仅基于膜片钳系统的patch-seq方案有极少的实现案例,而且该方法的一大问题在于容易将引入靶细胞以外的组织细胞成分,对本身含量极少的单细胞样本产生严重污染,干扰后续实验。虽然单细胞测序成本在逐渐降低,但对于样本量需求较大的单细胞测序实验,如果低质量细胞比例较高,成本依然很高。
具体地,目前已报道的patch-seq单细胞捕获方法,是基于膜片钳系统对神经元进行电信号记录后,通过施加负压吸取单个细胞内容物的方法。已发表的工作中大多数patch-seq对神经元进行电信号记录后捕获单个神经元进行高通量测序,但经测序分析发现许多细胞样本均混入了非靶细胞成分,通常的做法是经过测序分析后去除污染较高的样本。虽然高通量测序成本得到了极大地降低,但单细胞测序样本基数大,低比例的污染细胞仍然会加重研究成本。另外基于膜片钳系统的单细胞捕获系统结构组成复杂,不利于缺少膜片钳系统的实验室进行单细胞捕获实验,普适性较低。
除此之外,部分课题组的研究对象为含量十分稀少的细胞,尤其是混杂在组织内部的个别细胞,如何捕获高质量的单个稀有类型细胞仍然是一大难题。
因此,本发明提供一种简便的单细胞捕获装置以及获得高质量单个稀有细胞的方法,同时提供一种污染去除和测序前质控方案,可极大地降低单细胞测序实验成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用性更强的单细胞捕获装置和方法,尤其是基于玻璃微电极在体捕获单个稀有类型的细胞。该在体捕获单个稀有细胞的方法提高捕获的单细胞质量,降低单细胞测序的成本。
为实现上述目的,一方面,本发明提供了一种单细胞捕获装置。
在一个实施方案中,单细胞捕获装置包括动力系统、微操系统和显微系统。动力系统包括:第一和第二医用注射器、三通阀门、橡胶软管、电极夹持器和玻璃微电极;微操系统包括:微操控制器、微操控制中心和微操机械臂;显微系统包括:荧光显微镜、CCD相机和电子计算机。
所述动力系统的1mL医用注射器或10mL医用注射器与三通阀门第一接口相连,用于为吸取细胞提供动力,第一医用注射器和第二医用注射器可以均为1mL医用注射器,或者第一医用注射器为1mL医用注射器,第二医用注射器为10mL医用注射器。
所述动力系统的三通阀门第二接口封闭,第三接口与橡胶软管一端连接,用于控制动力系统内部的气压。
所述动力系统的橡胶软管另一端与电极夹持器相连,起到连接作用。
所述动力系统的电极夹持器与玻璃微电极相连,用于固定玻璃微电极。
所述动力系统的玻璃微电极用于吸取细胞内容物,所述玻璃微电极为通过三步法拉制的电极,电极成品尖端为2-3μm的开口。
所述微操系统的微操控制器与微操控制中心相连,用于将位置移动命令传输到微操控制中心。
所述微操系统的微操控制中心与微操机械臂相连,用于处理位置移动信号并将其输出至微操机械臂。
所述微操系统的微操机械臂与电极夹持器相连,用于提供移动动力,并携带玻璃微电极实现微米层面的位移。
所述显微系统的荧光显微镜与CCD相机相连,用于放大组织细胞,还可通过不同波长的滤光片激发细胞或电极尖端的荧光物质,并将信息传递给CCD相机;
所述显微系统的CCD相机与电子计算机相连,用于将荧光显微镜的光信号转化为电信号传递至电子计算机。
所述显微系统的电子计算机用于处理CCD相机传输的电信号,经过处理可转化为图像信息展示在电子计算机的显示器上。
另一方面,本发明提供了一种获得高质量单细胞的方法。
该方案包括单细胞捕获方案、污染去除方案和转录组测序前质控方案。
单细胞捕获方案提供了采用本申请中的在体捕获单个稀有细胞的装置捕获单个稀有细胞。
污染去除方案提供了一种独有的去除玻璃微电极外壁黏附组织细胞的方法,具体为,在含有裂解细胞的试剂,如碱性溶液,优选50mM氢氧化钠溶液的无菌、无酶的容器内(例如PCR管,商用的RNase-free产品等),反复浸润在体捕获单个稀有细胞的装置中的玻璃微电极的尖端,例如约10次左右,以有效去除玻璃微电极外壁黏附组织细胞。
转录组测序前质控方案提供了一种检测所捕获细胞混入非靶细胞比例的方法,该方法包含cDNA完整性检测和特异性基因表达水平检测。
所述转录组测序前质控方案的cDNA完整性检测是对cDNA长度和含量分布的检测,可以不仅限于使用生物分析仪2100结合高灵敏DNA检测试剂盒对mRNA经smart-seq方案得到的cDNA文库进行检测。
所述转录组测序前质控方案的特异性基因表达水平检测是利用实时荧光定量PCR对cDNA文库中靶细胞和非靶细胞特异性基因表达水平的检测,若细胞没有或混入极少非靶细胞成分,则检测到的非靶细胞特异性基因表达水平占比应极低。
所述转录组测序前质控方案的特异性基因表达水平检测中非靶细胞的确定可通过分析电极接触到靶细胞所经过路径中可能遇到的组织细胞进行确定。
所述转录组测序前质控方案的特异性基因表达水平检测中特异性基因可根据文献和数据库调研确定。
所述转录组测序前质控方案的特异性基因表达水平检测中靶细胞和非靶细胞特异性基因表达比例可通过以下公式转化:
其中,N1、N2、N3分别代表靶细胞与非靶细胞特异性基因的表达水平,cq1、cq2、cq3分别代表对应基因的荧光强度达到阈值时PCR的循环次数。所述转录组测序前质控方案的特异性基因表达水平检测中建议去除非靶细胞特异性基因占比超过5%的细胞。
具体地,本申请采用以下技术方案:
1.一种单细胞捕获装置,其特征在于,包括动力系统、微操系统和显微系统,
其中,所述动力系统包括:第一医用注射器和第二医用注射器;三通阀门,其第二接口封闭,第一接口根据需求连接第一或第二医用注射器;橡胶软管,与所述三通阀门的第三接口连接;电极夹持器,与所述橡胶软管另一端密闭连接;玻璃微电极,与所述电极夹持器的另一端密闭连接,
所述微操系统包括:微操控制器,其与微操控制中心相连,用于将位置移动命令传输到微操控制中心;微操控制中心,其与微操机械臂相连,用于处理位置移动信号并将其输出至微操机械臂;微操机械臂,其一端与电极夹持器相连,另一端与微操控制中心相连以执行移动命令,携带玻璃微电极实现微米层面的位移。
所述显微系统包括荧光显微镜、CCD相机和电子计算机,CCD相机固定在荧光显微镜指定接口,并且通过数据传输线与电子计算机连接,电子计算机处理CCD相机传输的电信号,经过处理可将荧光显微镜下观察到的画面转化为图像信息展示在电子计算机的显示器上。
2.一种采用项1中的单细胞捕获装置捕获单细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将第一医用注射器连通至三通阀门的第一接口,
使玻璃微电极进入含有单细胞的溶液的液面,
通过观察荧光显微镜的目镜调整第一医用注射器,使电极内溶液流出,并在显微系统的监控下通过微操控制器控制玻璃微电极贴紧目标单细胞的细胞膜,
通过拉动第一医用注射器推进器使动力系统内部形成负压,将细胞内容物吸入玻璃微电极内部,
将第一医用注射器与三通阀门断开连接,并关闭三通阀门的第一接口,
移动玻璃微电极使其移出液面,
其中,所述玻璃微电极的尖端充灌有包含重组RNase抑制剂和荧光染料,例如Alexa Fluor 594的溶液。
3.根据项2所述的方法,其特征在于,还包括将第二医用注射器连接至三通阀门的第一接口,并调整三通阀门为连通第一、三接口,推动第二医用注射器的推进器将玻璃微电极内吸入的细胞内容物进行转移。
4.根据项2所述的方法,其特征在于,还包括用含有裂解细胞的试剂,例如碱性溶液,优选50mM氢氧化钠溶液,反复浸润项2中移出液面的玻璃微电极尖端,以去除黏附组织。
5.一种获得高质量靶细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使用项1所述的单细胞捕获装置捕获细胞,其中所述单细胞捕获装置中的玻璃微电极内含有单细胞内容物;
(2)采用含有裂解细胞的试剂,例如碱性溶液,优选50mM氢氧化钠溶液反复浸润步骤(1)中的玻璃微电极尖端;
(3)检测步骤(2)中的玻璃微电极内吸入的单细胞内容物逆转录得到的cDNA完整性;
(4)检测靶细胞与非靶细胞的特异性基因的表达水平;
(5)通过如下公式计算靶细胞与非靶细胞特异性基因表达比例;
其中,N1、N2、N3分别代表靶细胞与非靶细胞特异性基因的表达水平,cq1、cq2、cq3分别代表对应基因的荧光强度达到阈值时PCR的循环次数,
(6)根据计算结果去除非靶细胞特异性基因占比超过设定比例的细胞。
6.根据项5所述的方法,其特征在于,cDNA完整性的检测是对cDNA长度和含量分布的检测。
7.根据项5所述的方法,其特征在于,cDNA完整性的检测使用生物分析仪2100和高灵敏DNA芯片检测试剂盒进行。
8.根据项5所述的方法,其特征在于,靶细胞与非靶细胞特异性基因表达水平是通过实时荧光定量PCR检测的。
9.根据项5所述的方法,其特征在于,靶细胞与非靶细胞特异性基因表达比例阈值设定的依据为,靶细胞特异性基因表达比例超过95%。
定义:
Fpkm:其是Fragments per kilobase of exon model per million mappedfragments缩写,即每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments。是二代测序中衡量基因表达水平的一个归一化后的指标。
有益的技术效果
本发明提供一种在体捕获单个稀有细胞的技术,极大地简化了基于膜片钳系统的单细胞捕获系统,同时增加了污染去除步骤并提供了一种成本更低的转录组测序前质控方案,不仅提高了普适性,同时也降低了研究成本,使得不具备膜片钳系统的实验室也可以轻易搭建捕获细胞的平台。
附图说明
图1为本发明的在体捕获单个稀有细胞的装置的结构框图。
图2为本发明在体捕获单个稀有细胞的装置的示意图。其中:1-1mL注射器、2-10mL注射器、3-三通阀门、4-橡胶软管、5-电极夹持器、6-玻璃微电极、7-微操控制器、8-微操控制中心、9-微操机械臂、10-显微镜物镜、11-显微镜载物台、12-CCD相机、13-电子计算机、14-显示器、15-毛特纳细胞胞体。
图3为利用本发明的方法获得高质量单细胞的流程图。
图4为实施例2中用于评估污染去除方案和测序前质控方案有效性的统计图。其中:a图代表未经污染去除方案和测序前质控方案筛选的64例单细胞转录组测序结果中的靶细胞和非靶细胞特异性基因表达比例的统计图。b图代表使用qPCR检测的106例单细胞的靶细胞和非靶细胞特异性基因表达比例的统计图,其中白色虚线对应95%比例,黄色高亮细胞代表经筛选去除的污染较高的9例细胞。c图代表经过污染去除方案和测序前质控方案筛选的97例单细胞转录组测序结果中的靶细胞和非靶细胞特异性基因表达比例的统计图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优势更加清晰,以下结合附图和实施案例对本发明进行详细说明。需要注意的是,此处所描述的具体实施案例仅用于协助解释本发明,并不用于限定本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法,下述实施例中使用的化学药品和原料如无特别说明均为市售所得或通过公知的制备方法自制得到。
此处实施例主要针对斑马鱼幼鱼稀有神经元—毛特纳(Mauthner)细胞的在体捕获,但本发明实际上适用于任何可在显微镜下看到的细胞的捕获,例如非神经元细胞,线虫、果蝇等小型透明模式生物的细胞,在小鼠和大鼠等大型模式动物的在体捕获中,可借助双光子穿透力强的特点,捕获超过200μm深度的部分区域细胞,以及培养的离体细胞等,如果有荧光标记则更容易识别,如果没有荧光标记可借助相差显微镜辅以经验对靶细胞进行识别,因此本发明的单细胞捕获装置在单细胞的捕获方面具有可行性、可靠性、准确性的特点。
实施例1
如图1示出了在体捕获单个稀有细胞的装置的结构框图,包括动力系统、微操系统和显微系统。
具体的如图2所示,动力系统包括1mL医用注射器1和10mL医用注射器2、三通阀门3、橡胶软管4、电极夹持器5和玻璃微电极6,玻璃微电极6颈部较短、锥形角度较大、尖端直径约为2-3μm。较大的锥形角度可以更容易地穿越组织,同时有利于细胞顺利被吸入电极。医用注射器1或10mL医用注射器2与三通阀门第一接口相连。三通阀门3的第二接口封闭,第三接口与橡胶软管4相连。橡胶软管4的第二接口与电极夹持器5的一端相连。电极夹持器5的另一端用于夹持玻璃微电极6。整个动力系统内部形成密闭连通系统,通过医用注射器的推进器可控制玻璃微电极6释放或吸取物质。
微操系统包括微操控制器7、微操控制中心8和微操机械臂9。通过微操控制器7的按键向微操控制中心8传输命令,微操控制中心8可控制具有上下、前后、左右及斜进和斜退移动能力的微操机械臂9。微操机械臂9与电极夹持器5相连,由此可通过微操控制器7精确控制玻璃微电极6的移动。
显微系统包括荧光显微镜(其包括显微镜物镜10和显微镜载物台11)、CCD相机12和电子计算机13。CCD相机12固定在荧光显微镜10指定接口(通常显微镜都会提供),并且通过数据传输线与电子计算机13连接。荧光显微镜可以提供不同放大倍数的视野以寻找目标细胞和监控玻璃微电极位置,CCD相机12可将荧光显微镜的画面实时传输到计算机屏幕从而反馈玻璃微电极的位置。
实施例2
本发明的实施案例所捕获的毛特纳细胞表达绿色荧光蛋白,实验动物是一种转基因品系斑马鱼透明幼鱼,并且该细胞在一条鱼中仅有两个。其中,该实验动物受赠于日本埼玉大学(Saitama University),本课题组长期繁育该品系斑马鱼。
在本实施例中,我们结合捕获带有绿色荧光标记的斑马鱼幼鱼毛特纳细胞的方案,展开对本发明在体捕获单个稀有细胞的方法的阐述。
如图2所示,我们将转基因斑马鱼幼鱼固定于自制琼脂糖培养皿中,并且使用眼科剪将毛特纳细胞前上方的脑膜剪破,以避免玻璃微电极刺穿脑膜造成堵塞。然后向培养皿中加入终浓度为133-200mg/L的MS-222(3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸酯)麻醉剂的等渗溶液,在维持麻醉状态的同时,给予暴露细胞合适的渗透压(渗透压与物种及组织类型有关,此处使用了DMEM F12低糖细胞培养液)。该细胞培养液中特定组分比例提供了适合活细胞的pH(7.0-7.5)和渗透压(320-340mOsmol/kg)。理论上,此处用生理盐水、PBS或人工脑脊液均可,主要是使得细胞不会吸水涨破。
玻璃微电极尖端充灌有约0.3μL含重组RNase抑制剂和红色荧光染料(如AlexaFluor 594)的溶液(Van den Hurk,Mark,et al."Patch-seq protocol to analyze theelectrophysiology,morphology and transcriptome of whole single neuronsderived from human pluripotent stem cells."Frontiers in molecularneuroscience 11(2018):261.),以减少捕获细胞后RNA的降解,同时依赖荧光染料为玻璃微电极尖端的位置和动力系统内部压强提供反馈。由于毛特纳细胞被绿色荧光蛋白标记,此处选用红色荧光染料,但不限于红色,可根据靶细胞的荧光标记类型加以选择。在玻璃微电极进入液面之前,将1mL医用注射器连通至三通阀门的第一接口,此时动力系统内部会产生一个正压,待玻璃微电极进入液面后,通过显微镜目镜观察由绿色荧光激发的玻璃微电极内部红色染料的流出速度,通过调整医用注射器,使红色染料的溶液以较慢的速度流出,可防止外部污染物倒吸入玻璃微电极内部。通过微操控制器控制玻璃微电极从剪破的脑膜处进入幼鱼脑组织,同时通过显微镜目镜观察,移动显微镜的载物台及调节焦距,使得玻璃微电极始终在视野中,在此状态下,控制玻璃微电极缓慢靠近毛特纳细胞。当玻璃微电极即将接触到毛特纳细胞时,切换至CCD相机成像,此时原来在目镜下的像将通过CCD相机传输到电子计算机显示器上,借助CCD相机成像软件的放大功能,将玻璃微电极与毛特纳细胞即将接触的部位局部放大,然后继续移动玻璃微电极,直至在毛特纳细胞膜上形成一个微小的凹陷。此时,通过拉动医用注射器推进器使动力系统内部形成负压,进而将细胞内容物吸入玻璃微电极内部。然后立即将医用注射器与三通阀门断开连接,使得动力系统内部与大气压保持平衡,并关闭三通阀门第一接口。之后,移动玻璃微电极使其拔出脑组织,并移出液面。
由于玻璃微电极在脑组织中穿梭可能会在玻璃微电极外壁黏附组织细胞,此时若直接将细胞转移至裂解液,可能会导致这些非靶细胞混入裂解液,对单细胞样本造成极大的污染。本发明的污染去除方案使用碱性溶液(此处使用50mM氢氧化钠溶液)在转移细胞前反复浸润电极尖端,可有效去除电极外壁黏附的组织细胞。具体地,手动控制含有氢氧化钠溶液的PCR管反复浸润电极尖端约10次左右,可有效去除电极外壁组织细胞。之后,将10mL医用注射器连接至三通阀门的第一接口,并调整三通阀门为连通第一、三接口,通过推动医用注射器的推进器将玻璃微电极内已捕获的细胞转移至裂解液,必要时可将电极尖端轻轻折入裂解液。
为了在进行价格昂贵的高通量测序等实验前,排查污染严重的细胞,还采用了转录组测序前质控的方案。具体地,将收集在裂解液中的单细胞通过smart-seq2策略进行逆转录和线性扩增(Picelli,Simone,et al."Full-length RNA-seq from single cellsusing Smart-seq2."Nature protocols9.1(2014):171-181.)。取纯化好的cDNA1μL使用安捷伦生物分析仪2100结合高灵敏DNA检测芯片试剂盒进行cDNA完整性检测。有较多小片段峰和浓度非常低的细胞样本丢弃。为了不浪费宝贵的cDNA文库,通过cDNA完整性检测的样本,取1μL cDNA进行新一轮线性扩增,作为实时荧光定量PCR(qPCR)的模板。转录组测序前质控方案的核心是检测单细胞cDNA文库中是否混有大量的非靶细胞特异性基因。具体地,如果捕获的目标细胞中非靶细胞特异性基因占比高,提示该细胞在捕获时混入较多的非靶细胞,该细胞则属于污染严重细胞。相反,如果非靶细胞特异性基因占比很低或检测不到,则提示该细胞混有极少或未混有非靶细胞。检测哪些非靶细胞取决于靶细胞所在部位的细胞组成和接触到该细胞过程中电极跨越组织的细胞组成。靶细胞和非靶细胞的特异性基因(指仅在特定类型细胞表达的基因,又称为marker genes)相对表达水平通过qPCR检测,并根据以下公式:
其中,N1、N2、N3分别代表靶细胞与非靶细胞特异性基因的表达水平,cq1、cq2、cq3分别代表对应基因的荧光强度达到阈值时PCR的循环次数。
将cq值转化为特异性基因相对表达水平的比例,以此过滤掉污染严重的细胞。污染是否严重可通过阈值设定界定。在本实施例中,我们通过检测少突胶质细胞和血细胞的特异性基因的相对表达水平来评估污染程度。少突胶质细胞是中枢神经系统中广泛分布的细胞,血细胞代表了循环系统。此处可以增加对其他类型非靶细胞的检测。少突胶质细胞特异性表达mbpa基因,血细胞特异性表达hbae3基因,而毛特纳细胞特异性表达基因未知,但据调查,其一定表达nefmb基因(可以被3A10抗体识别),而该基因在少突胶质细胞和血细胞中均不表达,因而nefmb可以作为毛特纳特细胞异性表达基因。阈值设定为nefmb相对表达占比大于95%。表1为测试的10个细胞(举例)。左侧为原始cq值,右侧为使用公式转化为相对表达水平N的比值,其中细胞6-10为污染较严重的细胞。原始cq值只是一个数值,与表达水平成反比。由于不同细胞间相同基因表达水平也并非完全相同,因此cq值只能反映同一个样本中不同基因的相对表达水平。此处转化为比值关系后,可更加直观地看出污染程度,并且设置阈值去除污染严重细胞。
表1
本发明还通过外部的测序公司进行了二代高通量测序,对污染去除和测序前质控的效果进行了实测。在没有经过污染去除和测序前质控的64例细胞中,有较大比例的细胞具有严重非靶细胞污染,而经过污染去除和测序前质控的97例细胞中,几乎所有细胞的非靶细胞污染比例都很小。表2示例64例细胞测序结果,左侧为靶细胞和非靶细胞特异性基因的表达水平,右侧为三个基因的相对表达水平比例,nefmb表达比例超过95%的仅占26.6%。表3示例97例细胞测序结果,左侧为靶细胞和非靶细胞特异性基因的表达水平,右侧为三个基因的相对表达水平比例,nefmb表达比例超过95%的高达92%,并且没有污染非常严重的细胞。
具体地,污染去除方案是针对电极外壁的污染,测序前质控是针对电极内部混入和电极外壁未去除干净的总污染的检测。
去除污染方案的效果可以通过两次测序的结果进行反映,即表2和表3,其中表2未经污染去除步骤,非靶细胞污染比例高(不论从单个样本中非靶基因所占比例,还是整体不合格细胞的比例看);而表3是经过污染去除和测序前质控步骤的,可以看出非靶细胞污染比例明显降低。
图4为表2、表3以及qPCR检测污染程度的统计图,对比a图和c图,可看出增加污染去除方案和测序前质控方案的筛选后,非靶细胞特异性基因所占比例名明显降低,也代表了单细胞质量的明显提高。
表2无污染去除和测序前质控的单细胞测序结果
/>
表3有污染去除和测序前质控的单细胞测序结果
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/>
由此,本发明提供了一种捕获单细胞的简便装置,一种获得高质量单细胞的方法,其中包括污染去除方案和转录组测序前质控方案。本发明的独特之处在于简化了patch-seq装置,使得普适性大大提高;提供了一种前所未有的污染去除方案以及一种转录组测序前质控方案。在继承了patch-seq“所见即所得”的优势下,提供了一种更为简便的单细胞捕获装置,污染去除和转录组测序前质控方案,提高了单细胞的质量,进一步降低了单细胞测序的成本。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种单细胞捕获装置,其特征在于,包括动力系统、微操系统和显微系统,
其中,所述动力系统包括:第一医用注射器和第二医用注射器;三通阀门,其第二接口封闭,第一接口根据需求连接第一或第二医用注射器;橡胶软管,与所述三通阀门的第三接口连接;电极夹持器,与所述橡胶软管另一端密闭连接;玻璃微电极,与所述电极夹持器的另一端密闭连接,
所述微操系统包括:微操控制器,其与微操控制中心相连,用于将位置移动命令传输到微操控制中心;微操控制中心,其与微操机械臂相连,用于处理位置移动信号并将其输出至微操机械臂;微操机械臂,其一端与电极夹持器相连,另一端与微操控制中心相连以执行移动命令,携带玻璃微电极实现微米层面的位移。
所述显微系统包括荧光显微镜、CCD相机和电子计算机,CCD相机固定在荧光显微镜指定接口,并且通过数据传输线与电子计算机连接,电子计算机处理CCD相机传输的电信号,经过处理可将荧光显微镜下观察到的画面转化为图像信息展示在电子计算机的显示器上。
2.一种采用权利要求1中的单细胞捕获装置捕获单细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
将第一医用注射器连通至三通阀门的第一接口,
使玻璃微电极进入含有单细胞的溶液的液面,
通过观察荧光显微镜的目镜调整第一医用注射器,使电极内溶液流出,并在显微系统的监控下通过微操控制器控制玻璃微电极贴紧目标单细胞的细胞膜,
通过拉动第一医用注射器推进器使动力系统内部形成负压,将细胞内容物吸入玻璃微电极内部,
将第一医用注射器与三通阀门断开连接,并关闭三通阀门的第一接口,
移动玻璃微电极使其移出液面,
其中,所述玻璃微电极的尖端充灌有包含重组RNase抑制剂和荧光染料,例如AlexaFluor 594的溶液。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,还包括将第二医用注射器连接至三通阀门的第一接口,并调整三通阀门为连通第一、三接口,推动第二医用注射器的推进器将玻璃微电极内吸入的细胞内容物进行转移。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,还包括用含有裂解细胞的试剂,例如碱性溶液,优选50mM氢氧化钠溶液,反复浸润权利要求2中移出液面的玻璃微电极尖端,以去除黏附组织。
5.一种获得高质量靶细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)使用权利要求1所述的单细胞捕获装置捕获细胞,其中所述单细胞捕获装置中的玻璃微电极内含有单细胞内容物;
(2)采用含有裂解细胞的试剂,例如碱性溶液,优选50mM氢氧化钠溶液反复浸润步骤(1)中的玻璃微电极尖端;
(3)检测步骤(2)中的玻璃微电极内吸入的单细胞内容物逆转录得到的cDNA完整性;
(4)检测靶细胞与非靶细胞的特异性基因的表达水平;
(5)通过如下公式计算靶细胞与非靶细胞特异性基因表达比例;
其中,N1、N2、N3分别代表靶细胞与非靶细胞特异性基因的表达水平,cq1、cq2、cq3分别代表对应基因的荧光强度达到阈值时PCR的循环次数,
(6)根据计算结果去除非靶细胞特异性基因占比超过设定比例的细胞。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,cDNA完整性的检测是对cDNA长度和含量分布的检测。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,cDNA完整性的检测使用生物分析仪2100和高灵敏DNA芯片检测试剂盒进行。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,靶细胞与非靶细胞特异性基因表达水平是通过实时荧光定量PCR检测的。
9.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,靶细胞与非靶细胞特异性基因表达比例阈值设定的依据为,靶细胞特异性基因表达比例超过95%。
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