CN116650625A - 一种纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米胶束及其制备方法和应用，属于药物制剂领域；本发明将疏水性的金属离子‑胰岛素复合纳米粒包裹在聚氧乙烯型非离子型表面活性剂的核心中从而得到所述纳米胶束；所述纳米胶束能够保护被包裹在核内的胰岛素使其免受恶劣的胃环境降解和蛋白酶的侵蚀；所述纳米胶束表面的非离子型表面活性剂的聚乙二醇(PEG)表面显示出高的粘液惰性性能，具有高扩散和肠道表面覆盖率，同时表面活性剂具有促进跨膜渗透、短暂打开紧密连接及抑制P‑gp底物外排作用，促进药物的吸收，实现胰岛素的胃肠道传递；所述纳米胶束为糖尿病的治疗提供了新的方法和思路。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍，引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志。胰岛素广泛应用于糖尿病，特别是1型糖尿病的治疗，目前通过注射方式给药，但是注射给药具有导致较差的依从性。口服给药具有无痛和方便的优点，能够优越的患者依从性和改善疾病预后，但是口服蛋白质药物仍然面临不少难题，比如：胃肠道低pH环境下蛋白的水解、胃肠道酶的降解以及蛋白分子量较大难以通过胃肠道黏膜和上皮细胞层等。口服有效剂量的胰岛素必须沿胃肠道存活，穿过粘液层，通过肠上皮细胞转运，经门静脉进入肝脏，最终到达体循环。
研究人员探索了各种改善胰岛素(rhINS)口服输送的策略，如使用渗透增强剂、粘附增强剂、蛋白酶抑制剂和聚合药物输送载体，现有多种PPs类降糖药物的口服制剂正处于临床研发阶段。现有技术中开发的重组人胰岛素肠溶胶囊(ORMD-0801)由肠溶包衣、蛋白酶抑制剂、吸收促进剂和胰岛素四部分组成，肠溶包衣对pH敏感，可避免胶囊被胃内的强酸环境破坏，使内容物在进入小肠之前保持完整；蛋白酶抑制剂可以减少胃肠道中的蛋白酶对胰岛素的降解；吸收促进剂可以促进肠壁对胰岛素的吸收。但是其仍具有不能克服多重障碍、制作过程复杂、多种添加剂、改变胰岛素活性等等缺陷，因此需要开发一种新的改善胰岛素(rhINS)口服输送的药物制剂。
发明内容
针对现有技术中存在的一些不足，本发明提供了一种纳米胶束及其制备方法和应用；本发明将疏水性的金属离子-胰岛素复合纳米粒包裹在聚氧乙烯型非离子型表面活性剂的核心中从而得到所述纳米胶束；所述纳米胶束能够保护被包裹在核内的胰岛素使其免受恶劣的胃环境降解和蛋白酶的侵蚀；所述纳米胶束表面的非离子型表面活性剂的聚乙二醇(PEG)表面显示出高的粘液惰性性能，具有高扩散和肠道表面覆盖率，同时表面活性剂具有促进跨膜渗透、短暂打开紧密连接及抑制P-gp底物外排作用，促进药物的吸收，实现胰岛素的胃肠道传递；所述纳米胶束为糖尿病的治疗提供了新的方法和思路。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术手段：
本发明首先提供一种纳米胶束，所述纳米胶束呈球形均匀分布，其在金属离子-胰岛素复合纳米粒子表面上包覆聚氧乙烯型非离子型表面活性剂，所述的金属离子-胰岛素复合纳米粒子粒径范围为160-300nm，表面粗糙；所述金属离子为具有沉淀蛋白作用的无毒金属离子。
优选地，所述聚氧乙烯型非离子型表面活性剂亲水端为聚乙二醇的两亲性嵌段共聚物，包括但不限于吐温类、泊洛沙姆、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)；
所述金属离子包括但不限于Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+。
本发明还提供了上述纳米胶束的制备方法，具体包括如下步骤：
将胰岛素溶于稀HCl溶液，然后调节溶液pH值，得到胰岛素溶液，备用；然后在搅拌条件下向胰岛素溶液中添加聚氧乙烯型非离子型表面活性剂，搅拌混合均匀后得到混合溶液，然后向混合溶液中滴加金属离子溶液，搅拌均匀得到纳米胶束。
优选地，所述稀HCl的浓度为0.01M，所述调节pH值为使用NaHCO3溶液将胰岛素溶液pH值调节至7.1～8.2。
优选地，所述胰岛素溶液的终浓度为0.5-20mg/mL。
优选地，所述的非离子型表面活性剂、金属离子溶液、胰岛素溶液的用量比为4mol：1mol：0-3mol且胰岛素溶液的用量不为0。
优选地，所述金属离子溶液浓度为0.5～20mg/mL。
本发明还提供了上述纳米胶束在制备治疗糖尿病药物中的用途。
进一步地，所述的糖尿病包括1型、2型糖尿病。
本发明还提供了上述纳米胶束在制备降低糖尿病患者餐前血糖波动药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明所述纳胶束通过直接溶解法制备得到，其中利用疏水相互作用、静电作用、离子键作用及H键作用等分子间作用力的催使下使用聚氧乙烯型非离子型表面活性剂包封金属离子-胰岛素纳米粒弯曲折叠成胶束内核，成功制备成纳米胶束。
本发明所述纳米胶束表面的非离子型表面活性剂为亲水端为聚乙二醇的两亲性嵌段共聚物，包括但不限于吐温类、泊洛沙姆、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)等可以形成稳定的胶束。所述纳米胶束表面的非离子型表面活性剂具有一定的空间位阻，可以一定程度的保护被包裹在核内的胰岛素使其免受恶劣的胃环境降解和蛋白酶的侵蚀，而在胰岛素主要吸收部位小肠下它发生解聚，释放胰岛素，聚氧乙烯型非离子型表面活性剂发挥膜粘附作用、短暂打开紧密连接及抑制P-gp底物外排作用，促进药物的吸收，实现胰岛素的胃肠道传递。所述非离子型表面活性剂能保护胰岛素免受胃部恶劣酸性环境和酶降解的影响，不影响胰岛素的构象和生物活性。并且，所述纳米胶束无细胞毒性，显著增加胰岛素在肠上皮细胞的摄取和跨细胞转运，能够克服口服给药的多重障碍，提高口服胰岛素浓度及生物利用度。
本发明所述纳米胶束制备过程简单，条件温和，不易改变胰岛素的活性。所述纳米胶束结构稳定，尺寸分布窄，具有良好的临床转化前景，解决了给予胰岛素的替代方案的需求。
附图说明
图1是TW-Zn-rhINS纳米胶束和Zn-rhINS纳米粒的透射电镜图；图中，a为TW-Zn-rhINS纳米胶束，b为Zn-rhINS纳米粒。
图2是制备得到的TW-Zn-rhINS纳米胶束和Zn-rhINS纳米粒的粒径分布图；图中，a为TW-Zn-rhINS纳米胶束，b为Zn-rhINS纳米粒。
图3是rhINS、TW-80、Zn-rhINS、TW-Zn-rhINS的FTIR光谱比较图。
图4是TW-Zn-rhINS胶束在pH 1.2(a)和6.8(b)的模拟胃肠液中的释放曲线。
图5是rhINS溶液及TW-Zn-rhINS胶束中胰岛素被胰蛋白酶(a)和糜蛋白酶(b)降解的曲线。
图6是细胞毒性图对比图，a是TW-Zn-rhINS胶束，b是TW-80，c是ZnCL2，d是rhINS。
图7是rhINS、TW-Zn-rhINS与细胞共孵育后的细胞药物摄取图；其中，绿色：FITC-rhINS；蓝色：Hoechst 33342染色细胞核。
图8是流式细胞术分析空白细胞组(a)FITC-rhINS(b)和TW-Zn-rhINS(c)中Caco-2细胞对FITC-rhINS的摄取，(d)每组三个平行实验总图。
图9是rhINS及TW-Zn-rhINS在离体小肠中的rhINS渗透量。
图10为原位小肠用FITC-rhINS和TW-Zn-FITC-rhINS处理后小肠绒毛的荧光图像。第一排是原位小肠用FITC-rhINS处理后的荧光图像，从左至右分别是总图，FITC图，DAPI染色图，第二排是原位小肠用TW-Zn-FITC-rhINS处理后的荧光图像，从左至右分别是总图，FITC图，DAPI染色图。
图11是降糖治疗效果对比图：a是TW-Zn-rhINS胶束给药后1型糖尿病小鼠血糖水平(与皮下注射组、生理盐水组、胰岛素生理盐水溶液组对比)，b是TW-Zn-rhINS随餐给药后1型糖尿病小鼠血糖水平(与生理盐水组对比)。
图12是不同胰岛素制剂给予糖尿病小鼠后体内rhINS的血药浓度-时间曲线图。
图13是口服生理盐水和经过TW-Zn-rhINS灌胃的不同组小鼠血清生化指标(a)AST、ALT、ALP、γ-GT(b)尿素(c)肌酐。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：TW-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以吐温80-锌-胰岛素(TW-Zn-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素(rhINS)溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.7，得到浓度为0.5mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将15mg吐温80(TW-80)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加200μL浓度为2mg/mL的ZnCl2溶液，混合均匀后得到TW-Zn-rhINS胶束。
本实施例中还制备了不含有吐温80的Zn-rhINS纳米粒，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.7，得到浓度为0.5mg/mL的胰岛素溶液，备用；然后向胰岛素溶液中缓慢滴加200μL浓度为2mg/mL的ZnCl2溶液，混合均匀后得到Zn-rhINS纳米粒。
本实施例分别采用TEM对所制TW-Zn-rhINS及Zn-rhINS纳米粒的形貌进行表征，进而考察TW-Zn-rhINS胶束、Zn-rhINS纳米粒的粒径形态，并对两者的粒径形态进行分析。
具体步骤如下所述：
分别将TW-Zn-rhINS胶束、Zn-rhINS纳米粒取稀释至一定浓度，超声5-10min，用移液枪精确吸取约10μL样品滴在TEM专用的碳支持膜铜网上，室温下进行干燥后用于TEM分析，TEM分析如图1所示。
由图1可见，TW-Zn-rhINS胶束的粒径在129±8.48nm左右，粒度分布比较均匀。在TEM图中可以观察到Zn-rhINS的形态为约197.65±9.65nm的大尺寸分布的表面毛刺状不规则颗粒。与未包封的Zn-rhINS纳米颗粒相比，TW-80通过降低表面疏水性、增加静电和空间斥力来有效抑制Zn-rhINS纳米粒的聚集、控制颗粒形状，并将颗粒生长限制在窄范围内，进而改变原本Zn-rhINS纳米颗粒形状不规则，分布较宽的缺陷。
本实施例还分别将制备得到的TW-Zn-rhINS胶束及Zn-rhINS纳米粒用去离子水稀释，通过动态光散射粒径仪(DLS)检测粒径分布情况，检测结果如图2所示。
图2是制备得到的TW-Zn-rhINS胶束及Zn-rhINS纳米粒的粒径分布图；图中，a为TW-Zn-rhINS胶束，b为Zn-rhINS纳米粒；由图2可见，所制得的TW-Zn-rhINS胶束的水合粒径在149.29±10.38nm左右，粒度分布较均匀(PDI＝0.182±0.023)，未经TW-80修饰的Zn-rhINS纳米粒的水合粒径在208.96±16.70nm左右，PDI＝0.300±0.035。这说明TW-80有效抑制Zn-rhINS纳米粒的聚集、控制颗粒形状，并将颗粒生长限制在窄范围内，从而形成表面光滑，呈近球形，分布较窄的颗粒。
实施例2：TW-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以吐温80-锌-胰岛素(TW-Zn-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.7，得到浓度为20mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将150mg吐温80(TW-80)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加400μL浓度为20mg/mL的ZnCl2溶液，搅拌15～30min后混合均匀，得到TW-Zn-rhINS胶束。
本实施例中通过比较rhINS、TW-80、Zn-rhINS、TW-Zn-rhINS傅里叶红外光谱仪(FTIR)在4000-500cm-1内记录的光谱，来评价不同的振动峰和功能峰来验证TW-80的包裹，考察结果如图3所示。
图3是rhINS、TW-80、Zn-rhINS、TW-Zn-rhINS的FTIR光谱比较图，由图3可见，纯rhINS的主要峰分别与氨基酸在1537cm-1和1651cm-1处的对称和不对称的N-H弯曲有关。在TW-Zn-rhINS的光谱中观察到这些峰的轻微位移。纯TW-80的情况下，在1458cm-1处的吸收可归因于-CH3的对称和不对称的弯曲振动，1249cm-1来自酯基，在1105cm-1处的吸收峰是C-O-C的拉伸变化，在TW-Zn-rhINS的光谱中可以观察到这些峰，这些结果表明，rhINS被成功地包裹在胶束中。
实施例3：TW-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以吐温80-锌-胰岛素(TW-Zn-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.1～8.2，得到浓度为1mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将4mg吐温80(TW-80)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加200μL浓度为0.5mg/mL的ZnCl2溶液，搅拌15～30min后混合均匀，得到TW-Zn-rhINS胶束。
实施例4：TPGS-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯-锌-胰岛素(TPGS-Zn-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.1～8.2，得到浓度为1mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将15mg维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加200μL浓度为2mg/mL的ZnCl2溶液，搅拌15～30min后混合均匀，得到TPGS-Zn-rhINS胶束。
实施例5：TPGS-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以吐温80-钙-胰岛素(TW-Ca-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.1～8.2，得到浓度为1mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将15mg吐温80(TW-80)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加200μL浓度为2mg/mL的CaCl2溶液，混合均匀后得到TW-Ca-rhINS胶束。
实施例6：TPGS-Zn-rhINS胶束的制备
本实施例中以维生素E聚乙二醇琥珀酸酯-钙-胰岛素(TPGS-Ca-rhINS)胶束为例进行纳米胶束的制备，具体制备方法如下所示：
将胰岛素溶于浓度为0.01M的稀HCl中，然后用0.1M NaHCO3溶液调节pH值7.1～8.2，得到浓度为1mg/mL的胰岛素溶液，备用；
在700-900r/min的搅拌速度下将15mg维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)添加到1mL胰岛素溶液中，然后向其中缓慢滴加200μL浓度为2mg/mL的CaCl2溶液，搅拌15～30min后混合均匀，得到TPGS-Ca-rhINS。
实施例7：TW-Zn-rhINS胶束的体外释放
本实施例中通过体外模拟胃肠道环境实验初步考察了TW-Zn-rhINS胶束体内释放性能，具体方法如下：
分别配制pH值为1.2的模拟胃液和pH值为6.8的模拟肠液，备用。在12支10mL的离心管中准确称取12份重量均为5mg的胰岛素纳米胶束，然后向其中6支离心管中加入5mL模拟胃液，剩下6支离心管中加入5mL的模拟肠液。
将12支离心管迅速放置于37℃、振荡频率为60次/min的摇床中进行胰岛素的释放实验，然后在15、30、45、60、90、120min时分别将加入了模拟肠液和模拟胃液的离心管各取出一个，离心之后使用0.45μm滤头过滤，再用高效液相色谱法(HPLC)测出其释放出的胰岛素的峰面积，计算出被释放的胰岛素的百分率，将结果绘制成释放曲线图，结果如图4所示。
图4是TW-Zn-rhINS胶束在pH 1.2(a)、6.8(b)的模拟胃肠液中的释放曲线；由图4可见，制备的胰岛素负载胶束配方具有早期爆发效应，在此期间胰岛素表现出双相释放，即在前15min内快速开始释放，然后在较长一段时间内逐渐或缓慢释放胰岛素。这是因为被包裹的纳米颗粒表面通常吸附着一些未被包裹的纯药物分子，这些被吸附的药物分子在释放开始时容易脱落和解离。经过TW-80修饰的胰岛素胶束出现了明显缓释的现象，在pH＝1.2的体系中，胶束经过2h溶解解离其胰岛素约90％释放出，而在pH＝6.8的体系中释放较慢，经过2h，约60％的胰岛素被释放。TW-80的粘附性阻止了纳米颗粒的结构变形，从而减少了在各种pH时内部基质暴露于溶解流体的机会。
因此，本发明制备的纳米胶束达到了一定的缓释效果，这些结果表明该纳米胶束在不同pH溶液中具有缓慢释放的能力，有一定的pH稳定性，在及时的释放同时又保证了药物的吸收。
实施例8：TW-Zn-rhINS抵抗主要蛋白酶降解的能力
本实施例中通过体外模拟胃肠道环境实验考察了实施例1中制备的TW-Zn-rhINS纳米胶束抵抗主要蛋白酶降解的能力，具体考察方法如下所示：
配制浓度为250IU/mL和50IU/mL的胰蛋白酶和糜蛋白酶，将其溶于Hank's平衡盐溶液(HBSS)。用HBSS稀释rhINS溶液及TW-Zn-rhINS至胰岛素浓度为10IU/mL，取50μL的蛋白酶溶液与950μL制剂分别混匀，置于恒温摇床孵育，孵育条件设置为37℃，60次/min。
然后在15、30、45、60、90和120min各取样200μL，加入含0.1％三氟乙酸的200μL冷乙腈溶液终止酶反应，最后用0.01M的稀盐酸200μL释放出纳米粒中的胰岛素，使用HPLC测定剩余的胰岛素含量，以初始胰岛素含量为100％，绘制剩余胰岛素百分数变化图，测定结果如图5所示。
图5是rhINS溶液及TW-Zn-rhINS胶束中胰岛素被胰蛋白酶(a)和糜蛋白酶(b)降解的曲线；由图5可见，在含胰蛋白酶的缓冲液中，游离的胰岛素仅2h就降解至20％。而TW-Zn-rhINS胶束中的胰岛素起始的15min下降到79.91％后，含量几乎保持不变，在2h时仍然有约74.21％的剩余。接近80％的rhINS在含有糜蛋白酶的缓冲液中2h内被降解，而TW-Zn-rhINS胶束中的rhINS含量在起始的15min下降到84.86％后在2小时后的残留量高达77.63％，可见，胶束中起始的胰岛素含量下降较快考虑可能与胶束表面的胰岛素降解有关。这是因为将胰岛素包载进入胶束后，胰岛素与蛋白酶之间会形成空间位阻，该空间位阻会妨碍蛋白酶接触胰岛素，进而有效抵抗蛋白酶的降解。同时图5进一步的证明了rhINS被包裹在胶束中。
实施例9：TW-Zn-rhINS胶束的细胞毒性作用
本实施例中采用MTT法来测定不同浓度TW-Zn-rhINS胶束、负载材料TW-80、氯化锌及rhINS分别与Caco-2细胞(购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所)作用24h后的Caco-2细胞活力，进而进行TW-Zn-rhINS胶束的细胞毒性作用的考察。
具体考察方法如下所示：
将Caco-2细胞以每孔8×103个的密度接种在96孔板中，每孔加入100μL DMEM完全培养基后置于温度为37℃，通入5％CO2的二氧化碳培养箱中培养24h。24h后，吸走旧培养基，然后将100μL不同浓度TW-Zn-rhINS胶束、负载材料TW-80、氯化锌及rhINS加入培养基中，并将Caco-2细胞加入到上述分别含有不同浓度TW-Zn-rhINS胶束、负载材料TW-80、氯化锌及rhINS的培养基中作用24h。
其中，TW-Zn-rhINS胶束按照0、12、25、50、100、150、200、250μg/mL浓度梯度分组；TW-80按照0、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、15mg/mL浓度梯度分组；胰岛素按照25、50、100、200、250、500、1000μg/mL浓度梯度分组；氯化锌按照13、25、50、100、200、250、500μg/mL浓度梯度分组加入到培养基中，每组设置6个平行样。
24h后去除分别含有不同浓度TW-Zn-rhINS胶束、负载材料TW-80、氯化锌及rhINS的培养基，用PBS清洗3遍，接着避光向每孔加入100μL(1mg/mL)的MTT完全培养基溶液并继续培养4h，然后小心吸走液体，不要破坏结晶，并向每孔中加入100μL DMSO，在摇床上振荡直到结晶完全溶解。最后使用酶标仪读取每孔在492nm处的吸光度并计算细胞的存活率，计算结果如图6所示。
图6是细胞毒性图对比图，a是TW-Zn-rhINS胶束，b是TW-80，c是ZnCL2，d是rhINS；由图6可见，当TW-Zn-rhINS胶束浓度范围为0μg/mL至200μg/mL(以胰岛素计)时，细胞均维持几乎100％的活力，表明在该浓度范围使用时TW-Zn-rhINS胶束毒性非常低，在250μg/mL时细胞活性有所下降为83.73％但并不确定是纳米胶束中的哪一种物质造成。
为了进一步的探究是纳米胶束中哪一种物质造成的上述结果，继续使用不同浓度的TW-80、氯化锌、胰岛素与细胞共孵育。研究发现，当采用TW-80与细胞共孵育时，TW-80浓度范围为0-7.5mg/mL时，细胞可以维持几乎100％的细胞活力，浓度达到15mg/mL时，细胞活力下降至41.89％，此时所对应的胰岛素浓度为1000μg/mL，因此纳米粒的毒性并非由TW-80造成。当采用氯化锌与细胞共孵育时，氯化锌使用浓度的范围内未见细胞活性的明显下降，因而纳米粒的毒性也不是氯化锌造成。当采用胰岛素与细胞共孵育时，随着胰岛素浓度升高至250μg/mL，细胞活力值下降至87.47％，这表明TW-Zn-rhINS胶束随着浓度升高，细胞活力下降是由于本身药物胰岛素浓度升高而导致，并非载体材料。
综上，基于TW-80和氯化锌的胶束载体即本发明制备的纳米胶束有优良的细胞相容性，适宜于体内应用。
实施例10.TW-Zn-rhINS胶束在Caco-2细胞单层模型(CCM)的转运
本实施例基于Caco-2细胞建立体外小肠吸收模型来研究胰岛素溶液和TW-Zn-rhINS胶束能否被小肠吸收，以及两者之间的吸收差异。
具体考察方法如下所示：
使用24孔Transwell平板接种Caco-2细胞，浓度为2.0-5.0×105/mL，常规培养孵化。孵化21-28天后，Caco-2细胞单层膜已经产生分化，在符合实验条件的Transwell小室中小心地吸弃基底内侧(AP)和基底外侧(BL)的原有液体，将0.4mL和1mL的HBSS缓冲液分别加入AP侧及BL侧，设置孵育条件为37℃，5％ CO2，放置20min，吸弃。然后在AP侧分别加入0.4mL的rhINS溶液，TW-Zn-rhINS溶液，使得胰岛素终浓度为100μg/mL，在BL侧加入1mL空白HBSS，孵育条件为37℃，5％ CO2，培养2h，收集BL侧液体，跨膜转运的胰岛素量用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定。
Papp代表了相应药物穿过CCM的能力。经测定，游离rhINS的Papp很低，仅为1.53×10-7cm/s，约0.1％的胰岛素渗透过Caco-2细胞层，说明上皮细胞很难吸收游离的rhINS，这与以前的研究结果相一致。TW-Zn-rhINS将胰岛素的Papp提高至7.60×10-7，提高至4.97倍，进一步证明了TW-Zn-rhINS促进rhINS跨胞转运的能力。
实施例11：TW-Zn-rhINS胶束的体外细胞摄取情况
由于TW-Zn-rhINS胶束本身不具有荧光性质，本实施例中通过异硫氰酸荧光素(FITC)对rhINS进行荧光标记来考察TW-Zn-rhINS胶束的体外细胞摄取情况。
具体操作方法如下所示：
将0.53g Na2CO3溶解在50mL的去离子水中，得到0.1M Na2CO3溶液；称取40mgrhINS溶于10mL的0.1M Na2CO3溶液中，得到浓度为4mg/mL rhINS溶液。称取10mg FITC溶于2mL DMSO溶液中，完全溶解后得到FITC溶液，备用。
将FITC溶液加入到10mL浓度为4mg/mL的rhINS溶液中，在4℃遮光条件下搅拌反应12h，反应结束后，向其中加入2.5mL浓度为1M的NH4Cl溶于中，4℃遮光条件下持续搅拌2h后停止反应并将反应液装入MW 3500Da透析袋，在去离子水中遮光透析，去离子水每隔4h更换一次，连续透析3天，直到透析液变成无色，冷冻干燥后得到FITC-rhINS，4℃遮光保存备用。
TW-Zn-FITC-rhINS为将制备TW-Zn-rhINS过程中的rhINS更换成FITC-rhINS，同样过程制备的胶束。
以每孔1×106个的密度将Caco-2细胞接种于6孔板中，然后将6孔板放置于二氧化碳培养箱中，设置温度为37℃、通入5％CO2培养2-3d，直至细胞贴壁完全。将包覆FITC-rhINS的纳米胶束载体以胰岛素100μg/mL的浓度配成培养基，按照空白细胞组、FITC-rhINS组、TW-Zn-FITC-rhINS制剂组分组，每组三个平行样。
其中，空白细胞组为不添加任何制剂的培养基；
FITC-rhINS组为实施例11中所述FITC标记rhINS使用培养基配置成以胰岛素100μg/mL的浓度；
TW-Zn-FITC-rhINS制剂组为将制备TW-Zn-rhINS过程中的rhINS更换成FITC-rhINS，同样过程制备的胶束，使用培养基配置成以胰岛素100μg/mL的浓度。
将三组培养基各1mL加入6孔板中与细胞共孵育，培养2h后，吸弃培养基，用PBS清洗3次细胞，每孔加入1mL Hoechst 33342(10μg/mL)，细胞核染色15min。除去Hoechst33342溶液，再用PBS清洗3次细胞，加2mL PBS，设定激发和发射波长分别为495nm和525nm后在激光共聚焦显微镜20倍水镜下观察，观察结果如图7所示。
图7是FITC-rhINS组、TW-Zn-FITC-rhINS制剂组与细胞共孵育2h后，通过CLSM对细胞中相关物质进行定位的细胞药物摄取图。绿色：FITC-rhINS；蓝色：Hoechst 33342染色细胞核；由图7可见，游离rhINS溶液组图中仅仅能够观察到很微弱的绿色荧光，这是由于胰岛素的分子量大同时亲水性强，不易被动扩散被细胞摄取。而在TW-Zn-FITC-rhINS组图中，即便经过多次冲洗，FITC-rhINS仍然处于细胞中，细胞胞内出现明显的绿色荧光。显著强于FITC-rhINS组，证明TW-80在促进细胞摄取及吸收中发挥了重要的作用。
综上，非离子型表面活性剂TW-80作为吸收促进剂通过细胞膜特性的改善、流动性的增加、黏液黏度减少、连接蛋白降解增多，多机制促进药物的透膜吸收，或是抑制外排蛋白的活性，进而抑制机体外排已经吸收药物，而显著增加药物的胃肠道吸收，有效地提高药物的血药浓度和生物利用度。
实施例12：Caco-2细胞对FITC-rhINS的摄取考察
本实施例中通过流式细胞仪来定量地表征细胞摄取纳米胶束的量，具体考察方法如下所示：
以每孔2×105个的密度将Caco-2细胞接种于6孔板中，然后将6孔板置于37℃，通入5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2-3d，至细胞完全贴壁。在使用前，细胞经Hank's缓冲液清洗3次，按照空白细胞组、FITC-rhINS组、TW-Zn-FITC-rhINS制剂组分组，每组3个平行样。
其中，空白细胞组的制备为：在孔中加入2mL培养基，然后培养2h；
FITC-rhINS组的制备为：在孔中加入2mL培养基，并加入终浓度为100μg/mL的FITC-rhINS，然后培养2h；
TW-Zn-FITC-rhINS制剂组的制备为：在孔中加入2mL培养基，并加入终浓度为100μg/mL的TW-Zn-FITC-rhINS，然后培养2h。
培养结束后弃去孵育液，D-Hank's缓冲液清洗细胞3次，加入600μL的细胞消化液，放入细胞培养箱中消化5min，再加入0.5mL的D-Hank's缓冲液，用移液枪反复轻轻吹打细胞至单个细胞球。在760r/min离心4min细胞悬液，接着用0.5mL的D-Hank's缓冲液重新混悬细胞后进行流式细胞分析，分析结果如图8所示。
图8是流式细胞术分析空白细胞(a)FITC-rhINS(b)和TW-Zn-rhINS(c)中Caco-2细胞对FITC-rhINS的摄取；由图8可见，FITC-rhINS组与TW-Zn-rhINS胶束组之间存在显著差异，FITC-rhINS组1.59％的胰岛素被细胞摄取，而TW-Zn-rhINS胶束组5.06％被摄取，这证明了由TW-80，氯化锌组成的TW-Zn-rhINS胶束在存在更强的细胞摄取，TW-80的添加不仅仅包裹胰岛素起到抵抗胃酸恶劣环境及蛋白酶的代谢作用，同时其增强了胰岛素纳米胶束的细胞摄取率。
实施例13：TW-Zn-rhINS胶束体外肠渗透量
由于肠上皮层被认为是最具挑战性的障碍纳米载体的口腔吸收障碍，在本实施例中通过体外肠模型考察TW-Zn-rhINS胶束的渗透促进作用，具体方法如下：
取ICR雄性小鼠(购于江苏大学实验动物中心)6只禁食12小时，不禁水，然后实施安乐死。取两端结扎的小肠4cm，取100μL游离rhINS、TW-Zn-rhINS(10IU/ml)注入肠腔。然后在5mL PBS缓冲液中，37℃，60次/min摇床温和摇动，接着分别在30、60、90、120min取100μL缓冲液用ELISA试剂盒定量rhINS的释放量，并且在每次5mL PBS缓冲液中取出100μL后立即补充100μLPBS，测定结果如图9所示。
图9为rhINS及TW-Zn-rhINS在离体小肠中的rhINS渗透量；由图9可见，不同制剂的rhINS渗透量与时间有关。与游离rhINS组相比，TW-Zn-rhINS在小肠中释放rhINS的累积量更高。2h时，TW-Zn-rhINS组在小肠的rhINS浸润量约为1711.34μIU，是游离胰岛素的2.23倍。因此，相对于胰岛素组，胶束明显提高了胰岛素在小肠上皮的渗透性。
实施例14：TW-Zn-rhINS胶束原位肠吸收
本实施例中通过原位方法考察TW-Zn-rhINS胶束区域吸收增强效应，具体方法如下：
使用雄性ICR小鼠进行实验，实验前小鼠禁食12小时以上，自由饮水。用20mg/mL的三溴乙醇麻醉(500mg/kg)小鼠，之后将麻醉小鼠置于加热灯下，在加热板上保持体温约37℃。用手术刀将小鼠腹部中线切口暴露小肠，将小肠结扎3cm长度，将实施例11中得到的FITC-rhINS和TW-Zn-FITC-rhINS(100μL)注入结扎的小肠，然后缝合腹腔。1h后打开腹腔，将结扎的肠断取出，用冰生理盐水冲洗，将水分吸干，4％多聚甲醛固定。经DAPI染色石蜡包埋处理切片，用荧光显微镜观察药物的吸收与渗透，观察结果如图10所示。
图10为原位小肠用FITC-rhINS和TW-Zn-FITC-rhINS处理，DAPI染色切片，小肠绒毛的荧光图像；由图10可见，TW-Zn-FITC-rhINS的小肠绒毛的外缘及内部的绿色荧光信号强度更高，这表明相对于胰岛素组，TW-Zn-FITC-rhINS对肠绒毛上皮细胞的通透性更强。这说明本发明制备的纳米胶束明显提高了胰岛素在小肠上皮的渗透性。
实施例15：TW-Zn-rhINS胶束的降糖作用
本实施例中通过比较皮下注射胰岛素溶液组(阳性对照组)、口服生理盐水组(空白对照组)、口服胰岛素生理盐水溶液组(阴性对照组)和TW-Zn-rhINS胶束组(实验组)降糖差异考察TW-Zn-rhINS胶束的降糖作用，同时考察口服TW-Zn-rhINS对于餐后血糖的降糖效果。具体考察方法如下所示：
1型糖尿病小鼠造模：ICR雄性实验小鼠饲养在21-24℃的无病原体条件下，安排12小时的光/暗循环，食物和水可自由支配。使用冰生理盐水(0.9％ NaCL)溶解四氧嘧啶，制成20mg/mL的溶液，过滤除菌，现用现配。将小鼠禁食12小时后，将浓度为20mg/mL的四氟嘧啶过0.22μm滤膜滤菌，对小鼠腹腔注射200mg/kg四氧嘧啶，诱导其产生1型糖尿病。连续注射7天，每天监测小鼠空腹血糖及体重，当空腹血糖高于11.1mmol/L则判定为1型糖尿病高血糖模型小鼠。
筛选符合实验要求的1型糖尿病小鼠(空腹血糖高于11.1mol/L)，断食12h，自由饮水。将小鼠分为以下几组，每组平行5只：皮下注射胰岛素溶液组(阳性对照组)、口服生理盐水组(空白对照组)、口服胰岛素生理盐水溶液组(阴性对照组)和胰岛素纳米胶束组(实验组)，各组别中皮下注射胰岛素溶液组(阳性对照组)皮下给药剂量为5IU/kg，口服生理盐水组(空白对照组)、口服胰岛素生理盐水溶液组(阴性对照组)和胰岛素纳米胶束组(实验组)分别口服灌胃组均为30IU/kg。
实验过程中各组小鼠同样均禁食，自由饮水，用罗氏血糖仪及试纸测定给药前和给药后1、2、3、4、6、8、10、12h各时间点各组小鼠血糖值(剪尾取血)。将每只小鼠的初始血糖值计为100％，计算各个时间点小鼠的血糖值相对于初始血糖值的百分数，并绘制血糖变化的曲线，比较各组的差异，考察结果如图11(a)所示。
图11(a)是TW-Zn-rhINS胶束给药后1型糖尿病小鼠血糖水平(与皮下注射组、生理盐水组、胰岛素生理盐水溶液组对比)。由图11a可见，皮下注射胰岛素的小鼠注射后血糖水平快速下降，在给药后的1h内血糖快速下降至初始水平16％的左右，2h以内仍旧维持血糖较低状态，于第3个小时开始反弹，在第6小时反弹至初始血糖的60％左右。口服生理盐水组由于长时间连续的空腹，虽然小鼠有糖尿病，但是血糖趋于缓慢下降，至实验结束，12h，小鼠的血糖降至初始血糖的60％左右。由于胃肠道内酶对胰岛素降解作用显著，在生理条件下，胰岛素在一小时内几乎完全被胰蛋白酶、无乳蛋白酶和弹性蛋白酶降解，使得胰岛素生理盐水溶液组几乎无效，与给予生理盐水组的血糖变化水平相差无几。TW-Zn-rhINS组小鼠血糖显著降低，给药后3-4h逐渐降至初始水平的57.23％左右，至6h后，血糖缓慢下降，至12h，血糖降至初始的43.32％，这可能是由于非离子型表面活性剂TW-80保护胰岛素免受胃酸及酶的侵蚀作用，并且通过短暂打开紧密连接，黏液粘附等等作用促进了胰岛素的吸收。
进一步地，将符合要求的糖尿病小鼠禁食12小时，自由饮水后，在口服给药前半小时给予模型小鼠食物，并且在实验过程中一直供于食物。用罗氏血糖仪及试纸测定药前和给药后1、2、3、4、6、8、10、12h各时间点的血糖值(剪尾取血)。将各只小鼠的初始血糖值计为100％，计算各个时间点的血糖值相对于初始血糖值的百分数，并绘制血糖变化曲线，考察结果如图11(b)所示。
图11(b)为TW-Zn-rhINS随餐给药后1型糖尿病小鼠血糖水平(与生理盐水组对比)；由图11b可见，口服生理盐水组(空白对照)中，进食1h内小鼠血糖快速上升至初始血糖的200％左右，2h后血糖继续上升至250％左右维持；口服30IU/kg TW-Zn-rhINS组进食1h内血糖一样上升至195.18％，第2h开始下降至165.45％，此后第3小时降至132.29％，后缓慢上升，至12h血糖值为初始的165.04％，显著地抑制了进食后血糖的升高。
综上，口服TW-Zn-rhINS胶束可以有效保护胰岛素并促进其吸收，体内产生显著的降糖效果，同时胶束显著降低进食后3-4小时的餐后血糖。
实施例16：TW-Zn-rhINS胶束口服生物利用度
本实施中通过重组人胰岛素ELISA试剂盒检测给药后不同时间点血清胰岛素浓度，以研究不同给药方式下不同制剂组胰岛素的血药浓度，具体制备方法如下所示：
将四氧嘧啶1型糖尿病小鼠(禁食12小时，不禁水)随机分为三组，分别为TW-Zn-rhINS胶束组(实验组)、口服胰岛素生理盐水溶液组(阴性对照组)和皮下注射胰岛素溶液组(阳性对照组)，每组24只，每个时间点3只平行。
其中，TW-Zn-rhINS胶束组(实验组)：灌胃口服给药剂量均为30IU/kg；
口服胰岛素生理盐水溶液组(阴性对照组)：口服胰岛素生理盐水溶液，剂量为30IU/kg；
和皮下注射胰岛素溶液组(阳性对照组)：皮下注射剂5IU/kg胰岛素溶液。
分别于给药后0.5、1、2、3、4、6、8、10、12h摘眼球取血0.2ml，放入2ml抗凝管中，室温静置1小时以上后，3000r/min离心10min，取上层血清30μL置于2ml离心管中。用ELISA试剂盒定量不同时间点rhINS的血浆浓度，测定结果如图12所示。
图12为不同胰岛素制剂给予糖尿病小鼠后体内rhINS的血药浓度-时间曲线图，由图12可见，胰岛素溶液组血清胰岛素水平持续较低，且无明显峰值浓度，说明口服游离胰岛素吸收量非常低，可能是由于在胰岛素降解之前对一小部分胰岛素的吸收。而皮下注射胰岛素溶液后可以被机体迅速吸收，在1小时左右达峰，峰浓度为109.46±11.85μIU/ml。口服TW-Zn-rhINS组的胰岛素吸收较为缓慢，在3小时达峰，其峰浓度为30.45±9.43μIU/ml，AUC为104.55μIU*h/mL，相对于皮下注射胰岛素溶液组的药理生物利用度和相对生物利用度分别为7.68％和7.95％，是胰岛素灌胃组的4.60和7.80倍。
因此，口服游离胰岛素吸收量非常低，口服TW-Zn-rhINS组的胰岛素吸收较为缓慢，在3小时达峰，相对于口服胰岛素溶液组相对生物利用度明显提高。
实施例17：TW-Zn-rhINS胶束体内初步安全性评估
本实施例中通过肝酶及肾功能指标评估胶束对于小鼠肝、肾功能的影响，以评估胶束的急性毒性，具体方法如下所示：
取6只ICR雄性小鼠，分为2组，I组小鼠饮水(作为对照)，II组口服TW-Zn-rhINS30IU/kg，每日一次，连续三天。最后一次给药77小时后采集血样，经上述的方法取得血液后，在EP管中室温静置一小时以上以3000r/min离心10min，上清即为血清。使用全自动生化仪分析肝酶及肾功能相关指标的变化，分析结果如图13所示。
图13为口服生理盐水和经过TW-Zn-rhINS灌胃的不同组小鼠血清生化指标(a)AST、ALT、ALP、γ-GT(b)尿素(c)肌酐；由图13可见，血清中这些酶标记物(即AST、ALT、ALP、γ-GT)的数量与对照组无显著性差异，而肾功能相关标记物尿素、肌酐同样。总的来说，这些值表明TW-Zn-rhINS是安全的，没有肝、肾毒性作用。
综上所述，本发明所述纳米胶束无细胞毒性，显著增加胰岛素在肠上皮细胞的摄取和跨细胞转运，能够克服口服给药的多重障碍，提高口服胰岛素浓度及生物利用度，在制备治疗糖尿病药物中具有很好的应用，能够用于降低患有糖尿病者的餐前血糖波动。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种纳米胶束，其特征在于，所述纳米胶束呈球形均匀分布，其在金属离子-胰岛素复合纳米粒子表面上包覆聚氧乙烯型非离子型表面活性剂，所述的金属离子-胰岛素复合纳米粒子粒径范围为160-300nm，表面粗糙；所述金属离子为具有沉淀蛋白作用的无毒金属离子。
2.根据权利要求1所述的纳米胶束，其特征在于，所述聚氧乙烯型非离子型表面活性剂亲水端为聚乙二醇的两亲性嵌段共聚物，包括但不限于吐温类、泊洛沙姆、维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)；
所述金属离子包括但不限于Zn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+。
3.权利要求1或2所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
将胰岛素溶于稀HCl溶液，然后调节溶液pH值，得到胰岛素溶液，备用；然后在搅拌条件下向胰岛素溶液中添加聚氧乙烯型非离子型表面活性剂，搅拌混合均匀后得到混合溶液，然后向混合溶液中滴加金属离子溶液，搅拌均匀得到纳米胶束。
4.根据权利要求3所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述稀HCl的浓度为0.01M，所述调节pH值为使用NaHCO3溶液将胰岛素溶液pH值调节至7.1～8.2。
5.根据权利要求3所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述胰岛素溶液的终浓度为0.5-20mg/mL。
6.根据权利要求3所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述的非离子型表面活性剂、金属离子溶液、胰岛素溶液的用量比为4mol：1mol：0-3mol且胰岛素溶液用量不为0。
7.根据权利要求3所述的纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述金属离子溶液浓度为0.5～20mg/mL。
8.权利要求1或2所述的纳米胶束在制备治疗糖尿病药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的糖尿病包括1型、2型糖尿病。
10.权利要求1或2所述的纳米胶束在制备降低糖尿病患者餐前血糖波动药物中的应用。
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