CN116634885A - 具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽 - Google Patents

Abstract

本公开涉及具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽及其用途。

Description

具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽

技术领域

本公开涉及具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽及其用途。

背景技术

木聚糖酶(EC3.2.1.8)是随机降解木聚糖(植物细胞壁的组分)的β-1,4主链的水解酶。木聚糖酶主要用于分解诸如动物饲料、烘焙、纸浆漂白等领域中的生物质(Beg QK,Kapoor M,Mahajan L,HoondalGS.Microbial xylanases and their industrialapplications:a review.Appl Microbiol Biotechnol.2001Aug；56(3-4):326-38.doi:10.1007/s002530100704.PMID:11548999)。

发明内容

技术问题

虽然为了方便木聚糖酶在各个领域中使用，需要其在严苛条件(高温、碱性条件)下的抗性和活性，但大多数木聚糖酶具有低pH条件(4.0-6.0)和低热稳定性。因此，难以在各个领域中应用木聚糖酶。

技术方案

本公开的一个目的是提供一种具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽。

本公开的另一个目的是提供一种包含经修饰的多肽的组合物。

本公开的另一个目的是提供经修饰的多肽或组合物用于与含木聚糖的材料反应的用途。

本公开的另一个目的是提供一种降解含木聚糖的材料的方法；和/或一种生产低聚木糖或木糖的方法，包括：使经修饰的多肽、表达该经修饰的多肽的宿主细胞和/或包含该经修饰的多肽的组合物与含木聚糖的材料接触。

本公开的另一个目的是提供一种编码经修饰的多肽的多核苷酸；包含该多核苷酸的核酸构建体；含有该多核苷酸或核酸构建体的载体；和/或含有该多核苷酸、核酸构建体或载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供一种制备经修饰的多肽的方法。

有益效果

具有木聚糖酶活性的本公开的经修饰的多肽可有效地用于各种工业领域。

附图说明

图1显示了证实本公开的经修饰的多肽的热稳定性的结果。

优选实施方案的详细描述

本公开的一个方面提供了一种具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽。

在一个实施方案中，i)经修饰的多肽是与SEQ ID NO:1具有70％或更多且小于100％的序列同一性的多肽；和/或

ii)经修饰的多肽是由与编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的序列具有70％或更多且小于100％的序列同一性的多核苷酸编码的多肽；和/或

iii)经修饰的多肽是由(a)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(b)其cDNA或(c)在低严格性条件、中严格性条件、中高严格性条件、高严格性条件或非常高严格性条件下与(a)或(b)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽；和/或

iv)经修饰的多肽是具有木聚糖酶活性的i)、ii)或iii)的多肽的功能性片段；以及

经修饰的多肽包含选自以下的任一种或多种修饰：

用其他氨基酸取代在位置3、5、20、34、36和41处的一个或多个氨基酸；形成二硫键；及其组合，

其中位置编号是对应于SEQ ID NO:1的多肽位置的位置。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，在修饰之前，在位置3处的氨基酸可以是精氨酸(R)；在位置5处的氨基酸可以是丝氨酸(S)；在位置20处的氨基酸可以是苯丙氨酸(F)；在位置34处的氨基酸可以是丝氨酸(S)；在位置36处的氨基酸可以是苏氨酸(T)；和/或在位置41处的氨基酸可以是丙氨酸(A)。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，经修饰的多肽可包括在选自以下的位置处的氨基酸修饰：

i)3+36；

ii)5+34；

iii)20+41；

iv)3+36+5+34；

v)3+36+20+41；

vi)5+34+20+41；和

vii)3+36+5+34+20+41；

其中位置编号是对应于SEQ ID NO:1的多肽位置的位置。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，经修饰的多肽在每个位置处的修饰可包括以下i)至vi)的任一个或多个修饰；

i)用半胱氨酸取代在位置3处的氨基酸；

ii)用半胱氨酸取代在位置5处的氨基酸；

iii)用半胱氨酸取代在位置20处的氨基酸；

iv)用半胱氨酸取代在位置34处的氨基酸；

v)用半胱氨酸取代在位置36处的氨基酸；和

vi)用半胱氨酸取代在位置41处的氨基酸；

其中位置编号是对应于SEQ ID NO:1的多肽位置的位置。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，经修饰的多肽可包含选自以下的任一个或多个修饰：

R3C+T36C；

S5C+S34C；

F20C+A41C；

R3C+T36C+S5C+S34C；

R3C+T36C+F20C+A41C；

S5C+S34C+F20C+A41C；和

R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，经修饰的多肽可包括用半胱氨酸取代在位置3、5、20、34、36和41处的两个或更多个氨基酸，并且可以在两个取代的氨基酸之间形成二硫桥。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，经修饰的多肽可包括用半胱氨酸取代在位置3和36处的氨基酸；用半胱氨酸取代在位置5和34处的氨基酸对；和/或用半胱氨酸取代在位置20和41处的氨基酸对；以及修饰氨基酸对以形成二硫桥。

在上述任一实施方案的一个实施方案中，与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽相比，经修饰的多肽可具有增加的热耐受性和/或热稳定性。

本公开的另一个方面提供了用于与本公开的多肽和/或包含本公开的经修饰的多肽的含木聚糖的材料反应的组合物。

本公开的另一方面提供了经修饰的多肽和/或包含经修饰的多肽的组合物用于与含木聚糖的材料反应的用途。

本公开的另一方面提供了用于生产低聚木糖或木糖的方法，包括：使经修饰的多肽、表达该经修饰的多肽的宿主细胞和/或包含该经修饰的多肽的组合物与含木聚糖的材料接触。

本公开的又一方面提供了降解含木聚糖的材料的方法，包括：将经修饰的多肽、表达该经修饰的多肽的宿主细胞和/或包含该经修饰的多肽的组合物处理成含木聚糖的材料。

本公开的另一个方面提供了编码经修饰的多肽的多核苷酸。

本公开的又一个方面提供了包含多核苷酸的核酸构建体。

本公开的另一个方面提供了含有多核苷酸或核酸构建体的载体。

本公开的又一个方面提供了包含经修饰的多肽、多核苷酸、核酸构建体和/或载体的宿主细胞。

本公开的另一个方面提供了制备经修饰的多肽的方法，包括培养宿主细胞。

具体实施方式

在下文中，将详细描述本公开。同时，本文公开的每个描述和实施方案可以分别应用于其他描述和实施方案。即，本文公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。此外，本公开的范围不受以下描述的具体描述的限制。

另外，本领域普通技术人员仅使用常规实验就能够认识或确认本文所述的本发明的特定方面的许多等同物。此外，这些等同物也旨在包括在本公开中。

如说明书和所附权利要求中使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式(“一种(a、an)”和“该(the)”)包括复数指示物。除非上下文另有说明，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。如说明书和所附权利要求中所使用的，除非另有说明，“或”的使用可用于包括“和/或”。

如本文所用，术语“约”可在特定数值之前呈现。如本文所用，术语“约”不仅包括该术语后所列举的确切数字，而且包括接近或靠近该数字的范围。考虑呈现数字的上下文，可以确定任何数字是否接近或靠近所呈现的特定数字。在一个实例中，术语“约”可指数值的-10％至+10％的范围。在另一个实例中，术语“约”可指给定数值的-5％至+5％的范围，但不限于此。

如本文所用，诸如术语“第一、第二、第三……”、“i)、ii)、iii)……”或“(a)、(b)、(c)、(d)……”的描述用于区分类似的构成，并且这些术语不意味着连续地或顺序地执行构成。例如，当术语用于指方法、用途或测定的步骤时，这些步骤之间可以没有时间间隔，或者它们可以同时进行，或者可以间隔几秒、几分钟、几小时、几天或几个月进行。

如本文所用，术语“基本上由…组成”可以指在本文要求保护的对象的特征基本上不受未指定组分的存在影响的情况下，可能存在未指定组分。

如本文所用，术语“由…组成”是指组分的总比率为100％。在术语“由…组成”之后列举的组分或特征可以是必要的或强制性的。在一些实施方案中，除了在术语“由…组成”之后列举的组分或特征之外，可以排除任何其他组分或非必需组分。

如本文所用，术语“包含/包括”是指在该术语之后列举的特征、步骤或组分的存在，并且不排除一个或多个特征、步骤或组分的存在或添加。在本文的术语“包含/包括”之后列举的组分或特征可以是必要的或强制性的。然而，在一些实施方案中，该术语还可以包括任何其他或非必要的部件或特征。

如本文所用，术语“包含/包括”在一些实施方案中可被修饰为指“基本上由…组成”或“由…组成”。

关于本公开中的氨基酸序列，尽管其被描述为“包含/包括”由特定序列号描述的氨基酸序列的多肽、“由特定序列号描述的氨基酸序列组成”的多肽、或“具有”由特定序列号描述的氨基酸序列的蛋白质或多肽，但显然，具有其中序列的一部分被缺失、修饰、取代、保守取代或添加的氨基酸序列的任何蛋白质，如果其具有与由相应序列号的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性，则其可以用于本公开。例如，可能是这样的情况，其中氨基酸序列的N-末端和/或C-末端添加了不改变蛋白质功能的序列、天然存在的突变、其沉默突变或保守取代，但不限于此。

如本文所用，术语“蛋白质”或“多肽”是指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。在本公开中，“多肽”、“蛋白质”和“肽”可与“氨基酸序列”互换使用。

在一些情况下，表现出活性的氨基酸序列可称为“酶”。在本公开中，除非另有说明，氨基酸序列以N-末端至C-末端的方向描述。

如本文所用，关于细胞或核酸、多肽或载体的术语“重组”是指该细胞、核酸、多肽或载体已通过引入异源核酸或多肽或改变天然核酸或多肽而被修饰，或该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可以表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或者可以表达在其他方面异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。

如本文所用，术语“分离的”是指存在于非天然存在的环境中或不是天然存在的物质。它包括从天然相关的并在自然界中发现的物质中大量分离一种物质(序列、酶或核酸)，例如，至少一种具有序列、酶或核酸的其他组分。

例如，本文提供的分离的序列、酶或核酸可以以基本上不含一种或多种污染物的形式提供。

分离的物质的实例包括i)任何非天然存在的物质；ii)任何已从其中去除一种或多种或所有天然存在的天然相关组分的物质(例如，酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子)；iii)任何从自然界中发现的物质人工修饰的物质；或iv)任何经过修饰以改变该物质相对于自然界中相关的其他组分的量的物质(例如，增加编码特定物质的基因的拷贝数；将天然连接于编码特定物质的基因的启动子修饰成高活性启动子等)，但不限于此。

如本文所用，术语“野生型”是指未经人工修饰的天然存在的状态。当术语“野生型”用于指多肽时，它是指天然存在的多肽，其在一个或多个氨基酸位置不具有人工突变(取代、插入、缺失等)。类似地，当术语“野生型”用于指多核苷酸时，它是指在一个或多个核苷酸中没有人工修饰(取代、插入、缺失)。然而，编码野生型多肽的多核苷酸不限于野生型多核苷酸，并且包括编码任何野生型多肽的序列。

如本文所用，术语“亲本序列”或“主链”是指引入修饰以产生经修饰的多肽的参考序列。即，亲本序列可用作起始序列，其中可引入修饰如取代、添加和/或缺失。亲本序列可以是天然存在的或野生型的，或在天然或野生型中已经发生一个或多个取代、插入或缺失的变体，或可以是人工合成的序列。当亲本序列是表现出活性的氨基酸序列，即酶的氨基酸序列时，可称为亲本酶。

如本文所用，术语“参考序列”是指用于确定任何氨基酸序列内的氨基酸位置的序列。任何氨基酸序列可以与参考序列比对，以确定任何氨基酸序列中对应于参考序列中特定位置的氨基酸的位置。

关于本公开中的氨基酸或核酸序列，术语“片段”是指亲本序列的一部分。例如，它可以是其中从亲本序列的C-或N-末端去除一个或多个氨基酸的形式的多肽。

如本文所用，术语酶的“片段”可指“功能性片段”。“功能性片段”也可称为活性成分，并且是指作为亲本酶的一部分并具有亲本酶的酶活性的多肽。例如，酶的功能性片段可以包括酶的催化位点。

酶的片段可以包括亲本酶全长的一部分。例如，酶的片段可包括亲本酶全长的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或更多或少于100％的氨基酸，但不限于此。

如本文所用，术语“修饰(modifying)”是指改造(change)或改变(alternation)。这可能是从自然发生状态的改变。在一个实例中，可以这样的方式改变酶，使得该酶与亲本或参考序列不同。

在本公开中，经修饰的酶可以是不以其天然形式存在的酶，即非天然存在的酶。

如本文所用，术语“经修饰的”是指例如从其天然存在的形式的改变。本公开的经修饰的酶包括非天然存在的酶或天然存在的变体。在一个实例中，本公开的经修饰的酶是在自然界中未发现的经修饰的酶。在一个实例中，本公开的经修饰的酶可以不是自发存在的酶，但不限于此。

如本文所用，当针对氨基酸/核酸序列使用时，术语“修饰(modification)”可包括在氨基酸序列的一个或多个位置用不同的氨基酸/核酸残基取代亲本序列的氨基酸/核酸残基；在一个或多个位置缺失亲本序列的氨基酸/核酸残基(或氨基酸/核酸残基系列)；在一个或多个位置插入亲本序列的氨基酸/核酸残基(或氨基酸/核酸残基系列)；或截短N-末端和/或C-末端氨基酸序列、或5'和/或3'核酸序列，及其任何组合。

如本文所用，术语酶的“变体”或“经修饰的多肽(modifiedpolypeptide)”是指具有通过保守取代和/或修饰而不同于亲本酶的一个或多个氨基酸的蛋白质。“变体”或“经修饰的多肽”可以互换使用。变体或经修饰的多肽可以是非天然存在的，但不限于此。

变体与亲本酶的序列的不同之处在于一个或多个修饰，例如氨基酸的取代、缺失和/或插入。

这些变体通常可以通过修饰亲本酶的一个或多个氨基酸并评价修饰蛋白的性质来鉴定。也就是说，变体的能力可以相对于亲本酶增强、不变或降低。

另外，一些变体可包括经修饰的多肽，其中一个或多个区域如N-末端前导序列或跨膜结构域已被去除。

此外，其他变体可包括其中从成熟蛋白质的N-和/或C-末端去除一个区域的变体。

术语“变体”或“经修饰的多肽”可以与术语如修饰、修饰的蛋白质、突变体、突变蛋白、趋异体(divergent)、变体等互换使用，并且不受限制，只要这些术语用于指示突变。

变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，变体可以在N-末端与参与蛋白质共翻译或翻译后易位的信号(或前导)序列缀合。此外，多肽还可以与另一序列或接头缀合以鉴定、纯化或合成该多肽。

如本文所用，术语“保守取代”是指用具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代氨基酸。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。

在本公开的整个说明书中，使用天然存在的氨基酸的常规单字母和三字母代码。另外，本文提及的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则缩写如下：

丙氨酸 Ala，A 精氨酸 Arg，R

天冬酰胺 Asn，N 天冬氨酸 Asp，D

半胱氨酸 Cys，C 谷氨酸 Glu，E

谷氨酰胺 Gln，Q 甘氨酸 Gly，G

组氨酸 His，H 异亮氨酸 Ile，I

亮氨酸 Leu，L 赖氨酸 Lys，K

蛋氨酸 Met，M 苯丙氨酸 Phe，F

脯氨酸 Pro，P 丝氨酸 Ser，S

苏氨酸 Thr，T 色氨酸 Trp，W

酪氨酸 Tyr，Y 缬氨酸 Val，V

同时，任何氨基酸可以描述为Xaa或X。

另外，通常三字母代码不仅允许用于天然存在的氨基酸，而且允许用于其他氨基酸，如2-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)、α-甲基-谷氨酸等。

氨基酸通常可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性来分类。因此，氨基酸取代通常可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性而发生。

例如，在具有带电荷侧链的氨基酸(带电荷氨基酸)中，带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷的(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。此外，在具有不带电荷侧链的氨基酸(不带电荷的氨基酸)中，非极性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和脯氨酸；极性或亲水性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；在非极性氨基酸中，芳族氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。

如本文所用，术语“基因”是指编码多肽的多核苷酸和包括编码区上游和下游区域的多核苷酸。在一些实施方案中，基因可具有插入各编码区(外显子)之间的序列(内含子)。

如本文所用，术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的相关程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可以彼此互换使用。

保守的多核苷酸或多肽的序列同源性或同一性可以通过标准的比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，同源或相同的序列通常可在中度或高严格性条件下与该序列的全长或全长的至少约50％、60％、70％、80％或90％或更多杂交。显然，也包括与含有杂交多核苷酸中的通用密码子或简并密码子的多核苷酸的杂交。

任何两个多核苷酸或多肽序列是否具有同源性、相似性或同一性可以例如通过已知的计算机算法如“FASTA”程序(Pearson等人，(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85]:2444)使用默认参数来确定。或者，可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定，该算法通过使用EMBOSS软件包的Needleman程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)(5.0.0版或其后的版本)(GCG程序包(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research 12:387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,[S.][F.,][ET AL.,J MOLEC BIOL 215]:403(1990)；Guide to Huge Computers,MartinJ.Bishop,[ED.,]Academic Press,San Diego,1994和[CARILLO等人](1988)SIAM JApplied Math 48:1073)来执行。例如，同源性、相似性或同一性可以使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST或ClustalW来确定。

多核苷酸或多肽的同源性、相似性或同一性可以例如通过使用例如GAP计算机程序(如Needleman等人，(1970),J Mol Biol.48:443)比较序列信息来确定，如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math(1981)2:482中所公开的。总之，GAP程序将同源性、相似性或同一性定义为通过将相似比对的符号(即，核苷酸或氨基酸)的数目除以两条序列中较短序列中符号的总数而获得的值。GAP程序的默认参数可包括(1)单一比较矩阵(包含用于身份的值1和用于非身份的值0)和Gribskov等人，(1986),Nucl.Acids Res.14:6745的加权比较矩阵，如Schwartz和Dayhoff编著，Atlas of Protein Sequence and Structure,NationalBiomedical Research Foundation,第353-358页(1979)中所公开的(或EDNAFULL替换矩阵(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本))；(2)每个空位的罚分为3.0，每个空位中每个符号的附加罚分为0.10(或空位开放罚分为10，且空位延伸罚分为0.5)；和(3)对末端空位没有罚分。

此外，任何两个多核苷酸或多肽序列是否彼此具有同源性、相似性或同一性可以通过在如所定义的严格条件下在Southern杂交实验中比较序列来识别，并且所定义的适当杂交条件在本领域技术人员的技能范围内，并且可以通过本领域技术人员熟知的方法(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；F.M.Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，约翰威立国际出版公司，纽约)来确定，但不限于此。

如本文所用，术语“成熟多肽”是指没有信号序列或前肽序列形式的多肽。成熟蛋白质/多肽/肽可以是蛋白质/多肽/肽的功能形式。成熟多肽可以是翻译或翻译后修饰后的最终形式。翻译后修饰的实例包括N-或C-末端修饰、糖基化、磷酸化、前导序列去除等，但不限于此。

如本文所用，术语“核酸构建体”是指单链或双链核酸分子，其包括一个或多个调控序列，并且其是人工合成的，或以自然界中不存在的方式被工程化以包括特定序列，或从自然界中分离。

如本文所用，术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，例如转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌等，但不限于此。

如本文所用，术语“表达载体”是指线性或环状核酸分子，其包括编码序列和用于其表达的可操作连接的调控序列。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指将调控序列置于适当位置以调节编码序列表达的构成。因此，术语“可操作地连接”包括在具有已知或所需活性的功能结构域的调节区(例如，启动子、终止密码子、信号序列或增强子)和靶(基因或多肽)之间的附着或连接，使得靶的表达、分泌或功能可根据已知或所需活性进行调节。

如本文所用，术语“cDNA”是指可通过从获自真核或原核细胞的成熟、剪接的mRNA分子反转录制备的DNA序列。cDNA序列缺少可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。最初的初级RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列步骤加工，包括在作为成熟剪接mRNA出现之前剪接。

如本文所用，术语“调控序列(regulatory sequence)”是指编码序列表达所必需的多核苷酸序列。每个调控序列对于编码序列可以是天然的(衍生自相同的来源)或外源的(衍生自不同的基因)。调控序列的实例可包括前导序列，聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、操纵子序列、编码核糖体结合结构域的序列和调节转录和翻译终止的序列。调控序列的最小单位可以包括启动子和用于终止转录和翻译的序列。

为了描述本公开提供的变体，使用以下命名法。

在本公开中，提及氨基酸序列中的特定位置可包括提及在该位置存在或取代的氨基酸。可以以各种方式描述特定位置的氨基酸。例如，“位置003(position 003)”可描述为“位置3”、“氨基酸3”、“第3个氨基酸”。另外，例如，当在位置3处的氨基酸是精氨酸(R)时，它可以被描述为“R3”或“Arg3”。

氨基酸取代可通过依此描述取代前的氨基酸、位置和待取代的氨基酸来表示。氨基酸可以使用常规的单字母和三字母代码表示。在一个实例中，当特定序列在位置5处氨基酸丝氨酸被半胱氨酸取代时，其可被描述为“S5C”或“Ser5Cys”。

在特定位置的任何氨基酸可称为“X”。例如，X6是指在位置6处的任何氨基酸。此外，当将被取代的氨基酸表示为X时，意味着其被不同于取代前存在的氨基酸的氨基酸取代。例如，“V6X”表示在位置6处的V被除V以外的任何氨基酸取代。

通过使用符号如“/”或“,”同时描述几种类型的氨基酸，可以表达不同的改变。例如，当在位置20处的氨基酸(F)被S或C取代时，它可以描述为F20S/C或F20S,C的组合。作为另一个实例，F/S20C是指取代前在位置20处的氨基酸F或S被C取代。

可以使用“+”描述多重突变。例如，描述如“R3C+T36C”分别是指在位置3处的氨基酸精氨酸被半胱氨酸取代，且在位置8处的氨基酸苏氨酸被半胱氨酸取代。

如本文所用，术语“对应于”是指蛋白质或肽中所述位置处的氨基酸残基，或与蛋白质或肽中所述残基类似、相同或同源的氨基酸残基。识别对应位置的氨基酸可以是确定一个序列(指的是一个特定的序列)中的特定氨基酸。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似或相应位置。

在本公开中，SEQ ID NO:1可用作参考序列以确定任何氨基酸序列中氨基酸的位置。

即，本文公开的SEQ ID NO:1可用于确定具有木聚糖酶活性的任何多肽中的相应氨基酸残基。除非在本公开中另有说明，特定氨基酸序列的残基相对于SEQ ID NO:1进行编号。

例如，任何氨基酸序列与SEQ ID NO:1比对，并且基于该比对，氨基酸序列的每个氨基酸残基可以参照对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基的氨基酸残基的数字位置进行编号。例如，如本文所述的序列比对算法可以识别氨基酸的位置或与查询序列(也称为“参考序列”)相比发生修饰如取代、插入或缺失的位置。

算法的实例可以通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定，该算法通过使用EMBOSS软件包的Needleman程序(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等人，2000,Trends Genet.16:276-277)等来执行，但不限于此。

另外，另一种木聚糖酶中相应氨基酸残基的识别可通过多重序列比对确定。本领域已知的多序列比对的实例包括，但不限于，使用他们各自默认参数的程序，例如MUSCLE(通过对数预期的多序列比对；3.5版或更高版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research32:1792-1797)、MAFFT(6.857版或更高版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic Acids Research30:3059-3066；Katoh等人，2005,Nucleic Acids Research 33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics 23:372-374；Katoh等人，2009,Methods in Molecular Biology537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics 26:1899-1900)以及应用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83或更高版本；Thompson等人，1994,Nucleic Acids Research 22:4673-4680)。

此外，当与SEQ ID NO:1的成熟多肽不同的酶不能通过传统的基于序列的比较来检测它们的关系时，可以使用其他双序列比较算法(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.295:613-615)。使用利用多肽家族(谱图)的概率表示来搜索数据库的搜索程序可以获得基于序列的搜索中更高的灵敏度。例如，PSI BLAST程序通过迭代数据库搜索过程产生谱图，并且能够检测远程同源物(Atschul等人，1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402)。如果肽的家族或超家族在蛋白质结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更高的灵敏度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics 19:874-881)利用来自各种来源的信息，如PSI BLAST、二级结构预测、结构比对图谱和溶剂化潜力，作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人，2000,J.Mol.Biol.313：903-919的方法可用于将未知结构的序列与SCOP数据库中存在的超家族模型比对。这些比对可以用于序列中以产生肽的同源性模型，并且可以使用为该目的开发的多种工具评估这些模型的准确性。

对于已知结构的蛋白质，有几种工具和资源可用于检索和产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行了比对，并且这些比对是可访问和可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander，1998，Proteins 33:88-96)或组合扩展(Shindyalov和Bourne，1998，Protein Engineering 11:739-747)来比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库以发现可能的结构同源物(Holm和Park，2000,Bioinformatics 16:566-567)。

上述方法是一个示例性的，并且不限于此。

在下文中，将更详细地描述本公开的具体实施方案。

如本文所用，木聚糖酶是指催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的酶。例如，它可以是EC编号为3.2.1.8的酶，但不限于此。

在本公开中，可使用本领域已知的方法(包括本文所述的实施方案)测量和评价木聚糖酶活性。

如本文所用，术语“亲本木聚糖酶”是指应用修饰以产生本公开的变体或经修饰的多肽的木聚糖酶。具体地，亲本木聚糖酶、亲本酶或亲本序列可以是天然存在的多肽或野生型多肽，可以是其成熟多肽，并且可以包括其变体或功能性片段，但不限于此，只要该多肽具有木聚糖酶活性并且可以是该变体的亲本。

本公开提供的亲本木聚糖酶可以是SEQ ID NO:1的多肽，但不限于此。另外，它可以是与SEQ ID NO:1的多肽具有约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多序列同一性的多肽，只要其具有木聚糖酶活性，并且任何多肽可包括在亲本木聚糖酶的范围内，只要其具有与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的多肽相同或相应的活性。

本文提供的变体的亲本木聚糖酶可衍生自根囊鞭菌属(Orpinomycessp.)、新美鞭菌属(Neocallimastix sp.)、梨囊鞭菌属(Piromyces sp.)或瘤胃球菌属(Ruminococcussp.)。具体地，它可以衍生自根囊鞭菌属。

同时，上述微生物是可衍生自本文提供的木聚糖酶的微生物的示例，并且包括衍生自分类上与该微生物同源的微生物的那些，而与微生物的名称无关。

上述微生物可以从已知的微生物保藏单位获得，例如ATCC、DSMZ、CBS、NRRL、KCTC和KCCM。

如本文所用，“衍生自”特定微生物的序列不限于在该微生物中天然产生或可产生的那些序列，还包括由从含有该基因的微生物产生和分离的基因编码的序列。

例如，衍生自根囊鞭菌属的木聚糖酶不仅可以包括由根囊鞭菌属微生物天然产生的具有木聚糖酶活性的酶，还可以包括通过本领域已知的遗传修饰(例如，转化为编码该酶的序列)在其他宿主细胞中产生的酶。

如本文所用，“具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽”可以是亲本木聚糖酶的变体。

如本文所用，术语“亲本木聚糖酶的变体”或“木聚糖酶变体”是指具有木聚糖酶活性的蛋白质，其具有至少一个不同于亲本木聚糖酶的氨基酸序列的氨基酸。

“具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽”、“亲本木聚糖酶的变体”和“木聚糖酶变体”可以互换使用。

本公开提供的变体可在亲本木聚糖酶的序列中包括一个或多个氨基酸修饰，同时具有木聚糖酶活性。修饰可以是氨基酸取代和/或二硫键形成。

另外，i)变体可以是与SEQ ID NO:1具有70％或更多且小于100％的序列同一性的多肽；和/或

ii)变体可以是由与编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的序列具有70％或更多且小于100％的序列同一性的多核苷酸编码的多肽；和/或

iii)变体可以是由(a)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(b)其cDNA或(c)在低严格性条件、中严格性条件、中高严格性条件、高严格性条件或非常高严格性条件下与(a)或(b)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽；和/或

iv)变体可以是具有木聚糖酶活性的i)、ii)或iii)的多肽的功能性片段；

具体地讲，本公开提供的变体包括亲本木聚糖酶序列中的一个或多个氨基酸的修饰，同时具有木聚糖酶活性，并且因此与亲本木聚糖酶相比可具有一个或多个经修饰的功能或性质。

在一个实施方案中，本公开提供的变体包括亲本木聚糖酶序列中的一个或多个氨基酸的修饰，同时具有木聚糖酶活性，并且因此与亲本木聚糖酶相比可具有一个或多个经修饰的功能或性质，以及一个或多个保守取代。

本公开提供的变体(亲本木聚糖酶的变体)可以是具有木聚糖酶活性的多肽。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括对应于SEQ ID NO:1在位置3、5、20、34、36和41处的一个或多个位置处的修饰。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括在选自以下i)至vii)的位置处的氨基酸的修饰：

i)3+36；

ii)5+34；

iii)20+41；

iv)3+36+5+34；

v)3+36+20+41；

vi)5+34+20+41；和

vii)3+36+5+34+20+41。

在本公开中，位置编号是对应于SEQ ID NO:1的多肽位置的位置，以及术语“对应”如上所述。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括对应于SEQ ID NO:1的R3、S5、F20、S34、T36和A41中的一个或多个的氨基酸修饰。

在一个实施方案中，在修饰本公开提供的变体之前，在位置3处的氨基酸可以是精氨酸(R)；在位置5处的氨基酸可以是丝氨酸(S)；在位置20处的氨基酸可以是苯丙氨酸(F)；在位置34处的氨基酸可以是丝氨酸(S)；在位置36处的氨基酸可以是苏氨酸(T)；和/或在位置41处的氨基酸可以是丙氨酸(A)，

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置3处的氨基酸。具体地，其可包括用S、T、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、A、V、L、I、M、F、W、P、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置5处的氨基酸。具体地，其可包括用T、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、A、V、L、I、M、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置20处的氨基酸。具体地，其可包括用S、T、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、A、V、L、I、M、F、W、P、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置34处的氨基酸。具体地，其可包括用T、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置36处的氨基酸。具体地，其可包括用S、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用G、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H取代对应于SEQ ID NO:1在位置41处的氨基酸。具体地，其可包括用S、T、C、Y、N或Q取代，更具体地，用C取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置3处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置5处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置20处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置34处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置36处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用极性氨基酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置41处的氨基酸。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括SEQ ID NO:1的R3C、S5C、F20C、S34C、T36C和A41C中的一个或多个取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括SEQ ID NO:1的R3C、S5C、F20C、S34C、T36C和A41C中的两个或更多个取代。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可包括选自以下的任一个或多个取代：

R3C+T36C；

S5C+S34C；

F20C+A41C；

R3C+T36C+S5C+S34C；

R3C+T36C+F20C+A41C；

S5C+S34C+F20C+A41C；和

R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C。

具体地，包括SEQ ID NO:1的R3C+T36C取代的变体可以由SEQ ID NO:3表示，包括SEQ ID NO:1的S5C+S34C取代的变体可以由SEQ IDNO:5表示，以及包括SEQ ID NO:1的F20C+A41C取代的变体可以由SEQ ID NO:7表示。

在一个实施方案中，本公开提供的变体包括上述修改的所有可能组合。

例如，变体可包括通过上述修饰的组合对选自以下位置处的氨基酸进行修饰：

3

5

20

34

36

41

3+5

3+20

3+34

3+36

3+41

5+20

5+34

5+36

5+41

20+34

20+36

20+41

34+36

34+41

36+41

3+5+20

3+5+34

3+5+36

3+5+41

3+20+34

3+20+36

3+20+41

3+34+36

3+34+41

3+36+41

5+20+34

5+20+36

5+20+41

5+34+36

5+34+41

5+36+41

20+34+36

20+34+41

20+36+41

34+36+41

3+5+20+343+5+20+363+5+20+413+5+34+363+5+34+413+5+36+413+20+34+363+20+34+413+20+36+413+34+36+415+20+34+365+20+34+41

5+20+36+41

5+34+36+41

20+34+36+41

3+5+20+34+36

3+5+20+34+41

3+5+20+36+41

3+5+34+36+41

3+20+34+36+41

5+20+34+36+41,和

3+5+20+34+36+41。

在另一个实例中，变体可以包括以下i)至vi)的任一个或多个取代：i)用半胱氨酸取代在位置3处的氨基酸；ii)用半胱氨酸取代在位置5处的氨基酸；iii)用半胱氨酸取代在位置20处的氨基酸；iv)用半胱氨酸取代在位置34处的氨基酸；v)用半胱氨酸取代在位置36处的氨基酸；和vi)用半胱氨酸取代在位置41处的氨基酸，但不限于此。

在又一个实例中，变体可以包括选自以下的任一个或多个修饰，但不限于此：

R3C

S5C

F20C

S34C

T36C

A41C

R3C+S5C

R3C+F20C

R3C+S34C

R3C+T36C

R3C+A41C

S5C+F20C

S5C+S34C

S5C+T36C

S5C+A41C

F20C+S34C

F20C+T36C

F20C+A41C

S34C+T36C

S34C+A41C

T36C+A41 C

R3C+S5C+F20C

R3C+S5C+S34C

R3C+S5C+T36C

R3C+S5C+A41C

R3C+F20C+S34C

R3C+F20C+T36C

R3C+F20C+A41C

R3C+S34C+T36C

R3C+S34C+A41C

R3C+T36C+A41 C

S5C+F20C+S34C

S5C+F20C+T36C

S5C+F20C+A41C

S5C+S34C+T36C

S5C+S34C+A41C

S5C+T36C+A41C

F20C+S34C+T36C

F20C+S34C+A41C

F20C+T36C+A41C

S34C+T36C+A41C

R3C+S5C+F20C+S34CR3C+S5C+F20C+T36C

R3C+S5C+F20C+A41C

R3C+S5C+S34C+T36C

R3C+S5C+S34C+A41C

R3C+S5C+T36C+A41C

R3C+F20C+S34C+T36C

R3C+F20C+S34C+A41C

R3C+F20C+T36C+A41C

R3C+S34C+T36C+A41C

S5C+F20C+S34C+T36C

S5C+F20C+S34C+A41C

S5C+F20C+T36C+A41C

S5C+S34C+T36C+A41C

F20C+S34C+T36C+A41C

R3C+S5C+F20C+S34C+T36C

R3C+S5C+F20C+S34C+A41C

R3C+S5C+F20C+T36C+A41C

R3C+S5C+S34C+T36C+A41C

R3C+F20C+S34C+T36C+A41C

S5C+F20C+S34C+T36C+A41C,和

R3C+S5C+F20C+S34C+T36C+A41C。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括用半胱氨酸取代对应于SEQ IDNO:1在位置3、5、20、34、36和41处的两个或更多个氨基酸，并且可以在两个取代的氨基酸之间形成二硫桥。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以包括位用半胱氨酸取代在位置3和36处的氨基酸对；在位置5和34处的氨基酸对；和/或在位置20和41处的氨基酸对；并且氨基酸对可以形成二硫桥。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可与亲本木聚糖酶、其成熟多肽或其功能性片段具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高、但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以与SEQ ID NO:1具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高、但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以是由一种多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的核苷酸序列具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高、但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以是由(a)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(b)其cDNA或(c)在低严格性条件、中严格性条件、中高严格性条件、高严格性条件或非常高严格性条件下与(a)或(b)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以与SEQ ID NO:1的功能性片段具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高、但小于100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以是由一种多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、或99％或更高、但小于100％核苷酸序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以是这样的多肽，其中SEQ ID NO:3、SEQID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列中在位置3、5、20、34、36和41处的一个或多个位置处的氨基酸是固定的，并且其与以上SEQ ID NO的氨基酸序列、其成熟多肽或其功能性片段具有约60％或更高，例如65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高或100％的序列同一性。

在一个实施方案中，本公开提供的变体可以由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQID NO:8表示的多核苷酸编码。

在一个实施方案中，包括SEQ ID NO:1的R3C+T36C取代的变体可以由SEQ ID NO:4表示的多核苷酸编码；

在一个实施方案中，包括SEQ ID NO:1的S5C+S34C取代的变体可以由SEQ ID NO:6表示的多核苷酸编码。

在一个实施方案中，包含SEQ ID NO:1的F20C+A41C取代的变体可以由SEQ ID NO:8表示的多核苷酸编码。

在本公开提供的变体中，与其他木聚糖酶(例如，野生型木聚糖酶、亲本木聚糖酶、其他木聚糖酶变体等)相比，多肽的一种或多种任何可选择的或可检测的性质或属性可被改变。

所述性质或属性可包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性曲线、蛋白水解降解的抗性、k_M、k_cat、k_cat/k_M比率、蛋白质折叠，诱导免疫应答、结合配体的能力、结合受体的能力、被分泌的能力、在细胞表面上展示的能力、寡聚化的能力、传导信号的能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导细胞凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化修饰的能力和/或治疗疾病的能力等。

在一个实施方案中，与亲本序列相比，本公开提供的变体可以具有增加的热耐受性和/或热稳定性。

如本文所用，“酶活性”表现出至少一种催化活性。具体地，它可以是主要以k_cat/k_M表示的酶的转化效率，但不限于此。

当酶被底物完全饱和时，k_cat是指在单位时间内通过一种酶将底物转化为产物的速率常数(催化常数)，也称为转换数。k_M是当反应速率为最大值(Vmax)的一半时的底物浓度。

表达酶活性的方式的实例包括比活性(转化的底物的umol x mg^-1xmin^-1)或体积活性(转化的底物的umol x mL^-1x min^-1)等。

然而，酶活性的定义不限于上述描述，并且酶活性可以基于以下文献中公开的关于酶活性等信息来定义和评价：Irwin H.Segel,Enzyme kinetics,John Wiley&Sons,1979；A.G.Marangoni,Enzyme kinetics,Wiley-Interscience,2003；A.Fersht,Enzymestructure and mechanisms,John Wiley&Sons,1981；Structure and Mechanism inProtein Science:A guide to enzyme catalysis and protein folding,Alan Fersht,W.H.Freeman,1999；Fundamentals of Enzyme Kinetics,Athel Cornish-Bowden,Wiley-Blackwell 2012and Voet etal.,"Biochemie"[Biochemistry],1992,VCH-Verlag,第13章,第331-332页。

在一个实施方案中，与亲本酶相比，本公开提供的变体可以具有增加约100％、约110％、约120％、约130％、约140％、约150％、约160％、约170％、约180％、约190％、或约200％或更多的酶活性。

在另一个实施方案中，与亲本酶相比，本公开提供的变体可以具有降低约99％、约95％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％或约20％或更少的酶活性。

如本文所用，术语“比活性”是每单位重量蛋白质的酶活性，可以表示为单位/mg。蛋白质的定量可以使用例如SDS-PAGE或Bradford测定进行。

酶稳定性是指在储存或反应时间期间保持酶活性。为了测量这种稳定性的变化，可以在规定的条件下在时间零点(100％)以及在一定的时间段(x％)之后测量和比较初始酶活性，因而可以表示酶活性丧失的水平或酶的稳定性。

影响酶活性的因素包括例如pH、热、其他物质(例如，氧化剂、螯合剂)的存在等。

如本文所用，术语“pH稳定性”是指蛋白质在特定pH范围内起作用的能力。在一个实施方案中，本公开提供的变体可以在约pH 4.0至约pH

12.0具有活性，但不限于此。

当蛋白质在特定pH范围内保持其功能时，它可以定义为具有“pH稳定性”，根据pH范围，还可以定义为具有“耐酸性”、“耐碱性”等。

如本文所用，术语“热稳定性”是指蛋白质在特定温度范围内发挥作用的能力。在一个实施方案中，本公开提供的变体可具有在约20℃至约120℃范围内的活性，并且具体地可具有在约60℃至约100℃范围内的活性，但不限于此。

如本文所用，术语“热耐受性”是指蛋白质在暴露于特定温度(例如，高热或低温)后发挥功能的能力。例如，耐热蛋白质在它们所暴露的温度可能不发挥作用，但当返回到最佳温度环境时可能会发挥作用。

稳定性的增加可以包括维持高酶活性；通过与其他酶，例如野生型酶、亲本酶和/或其他变体比较，增加蛋白质维持其功能的pH、温度和/或时间等的范围。

稳定性的降低可以包括维持低的酶活性；通过与其他酶例如野生型酶、亲本酶和/或其他变体比较，降低蛋白质维持其功能的pH、温度和/或时间等的范围。

如本文所用，术语“底物特异性(substrate specificity)”是指酶识别底物和与该底物竞争的分子的能力。底物特异性可以通过测量酶对不同底物的活性来确定。在一个实施方案中，底物特异性的改变可以是能够产生所需产物的底物的特异性增加的方向的改变。在另一个实施方案中，底物特异性的改变可以是能够产生所需产物的底物的特异性降低的方向的改变。

本公开提供的变体的改变的性质可以是适合的或改进的用于各种工业领域的活性，包括饲料、烘焙、纸浆漂白等。

编码本公开的变体的多核苷酸可包括上述变体的编码序列。由于密码子简并性或考虑到待表达多肽的生物体中优选的密码子，多核苷酸可以在不改变多肽氨基酸序列的范围内在编码区中进行各种修饰。

另外，本公开的多核苷酸可包括探针，该探针可由已知基因序列(例如，通过在非限制性严格条件下与互补于上述核苷酸序列的全部或部分的序列进行杂交而编码本公开的变体的任何序列)制备。

“严格条件(stringent condition)”是指允许多核苷酸之间特异性杂交的条件。此类条件具体描述于文献(例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning,A LaboratoryManual,第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港,纽约，1989；F.M.Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，约翰威立国际出版公司，纽约)。

例如，严格条件可包括这样的条件，在该条件下，具有40％或更高、具体地90％或更高、更具体地95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、甚至更具体地99％或更高的高同源性或同一性的多核苷酸彼此杂交，以及具有低于上述同源性或同一性的同源性或同一性的多核苷酸彼此不杂交；或者常规Southern杂交的洗涤条件，即，在盐浓度和对应于60℃、1×SSC、0.1％ SDS，具体地60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS，并且更具体地68℃、0.1×SSC、0.1％ SDS的温度下洗涤一次，具体地两次或三次。

杂交需要两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间的错配可能取决于杂交的严格性。术语“互补”用于描述可彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，以及胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开的多核苷酸可包括与整个序列互补的分离的核苷酸片段以及基本上与其相似的核酸序列。

具体地，与本公开的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用包括在上述条件下T_m值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测。此外，T_m值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地调节。

用于杂交多核苷酸的适当的严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量是本领域熟知的(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51,11.7-11.8)。

例如，“高严格性(high stringency)”可以在比探针的Tm低约5-10℃下发生；“中度严格性(medium stringency)”可以在比探针的Tm低约10-20℃下发生；并且“低严格性(low stringency)”可以在比Tm低约20-25℃下发生，但严格性不限于此。

在一个实例中，对于长度为至少约100个核苷酸的探针，“低严格性条件”可以是指根据标准Southern印迹程序在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12-24小时。最后将运载体材料(carrier material)在50℃下在2×SSC、0.1-0.2％ SDS中洗涤两次或三次，每次15分钟。

在一个实例中，对于长度为至少约100个核苷酸的探针，“中严格性条件”可以是指根据标准Southern印迹程序在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12-24小时。最后将运载体材料在55℃下在2×SSC、0.1-0.2％ SDS中洗涤两次或三次，每次15分钟。

在一个实例中，对于长度为至少约100个核苷酸的探针，“中高严格性条件”可以是指根据标准Southern印迹程序在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12-24小时。最后将运载体材料在60℃下在2×SSC、0.1-0.2％ SDS中洗涤两次或三次，每次15分钟。

在一个实例中，对于长度为至少约100个核苷酸的探针，“高严格性条件”可以是指根据标准Southern印迹程序在42℃下在5×SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12-24小时。最后将运载体材料在65℃下在2×SSC、0.1-0.2％ SDS中洗涤两次或三次，每次15分钟。

本公开提供的核酸构建体可包括编码本文提供的变体的多核苷酸，其可操作地连接至一个或多个调控序列，该调控序列在适合于该调控序列的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中表达。

可以以多种方式对多核苷酸进行工程改造以允许变体的表达。根据表达载体，在插入载体之前操纵多核苷酸可能是期望的或必需的。这种操作可以使用本领域已知的方法进行。

本公开提供的“载体”是指含有编码变体的多核苷酸的核苷酸序列的DNA构建体，该核苷酸序列可操作地连接至合适的表达调控区(表达调控序列)以便能够在合适的宿主细胞中表达本公开的变体。表达调控区可以包括能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列和用于调节转录和翻译终止的序列。一旦转化到合适的宿主细胞中，载体可以独立于宿主基因组复制或发挥功能，或者可以整合到其基因组中。

可以在本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或粘粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等；作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的载体。具体地，可以使用pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC载体等。

在一个实例中，编码本公开提供的变体的多核苷酸可以通过用于细胞内染色体插入的载体插入到染色体中。可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸插入到染色体中，例如通过同源重组，但不限于此。该载体还可以包括选择性标志物以确认插入到染色体中。选择性标志物用于选择用载体转化的细胞，即用于确认靶核酸分子是否已经插入，并且可以使用提供可选择的表型(例如，药物抗性、营养缺陷型、对细胞毒性剂的抗性或表面多肽的表达)的标志物。只有表达选择性标志物的细胞能够在用选择剂处理的环境下存活或显示不同的表型，因此可以选择转化的细胞。

任何宿主细胞可以包括在本公开的宿主细胞中，只要其可以无限制性地表达本公开的变体。

本公开的宿主细胞可包括上述变体、编码该变体的多核苷酸、含有该变体的核酸构建体和/或载体。

核酸构建体或载体可以如前所述整合到染色体中，或者可以保持为自我复制的染色体外载体。

本公开的宿主细胞包括由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

宿主细胞可以是用于重组产生变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)和链霉菌属(Streptomyces)。

革兰氏阴性菌包括但不限于弯曲菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)，黄杆菌属(Flavobacterium)，梭杆菌属(Fusobacterium)，螺杆菌属(Helicobacter)，泥杆菌属(Ilyobacter)，奈瑟氏菌属(Neisseria)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，弧菌属(Vibrio)(例如，需钠弧菌(Vibrio natriegens))和脲原体属(Ureaplasma)。

在一个实施方案中，细菌宿主细胞可以是属于芽孢杆菌属(Bacillus)的宿主细胞，具体包括嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞，但不限于此。

在一个实施方案中，细菌宿主细胞可以是属于链球菌属(Streptococcus)的宿主细胞，具体包括似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种(Streptococcusequi subsp.Zooepidemicus)，但不限于此。

在一个实施方案中，细菌宿主细胞可以是属于链霉菌属(Streptomyces)的宿主细胞、具体包括产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces avermitilis)、灰色链霉菌(Streptomycesavermitilis)和浅青紫链霉菌(Streptomyces avermitilis)，但不限于此。

在一个实施方案中，细菌宿主细胞可以是属于棒杆菌属(Corynebacterium)的宿主细胞、并且可以是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、Corynebacteriumcrudilactis、荒漠棒杆菌(Corynebacterium deserti)、有效棒杆菌(Corynebacteriumefficiens)、帚石南棒杆菌(Corynebacterium efficiens)、停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis)、单一棒杆菌(Corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(Corynebacteriumhalotolerans)、纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、污染棒状杆菌(Corynebacterium pollutisoli)、模仿棒杆菌(Corynebacterium imitans)、睾丸素棒杆菌(Corynebacterium testudinoris)或微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)，但不限于此。

在一个实施方案中，宿主细胞可以是属于埃希氏杆菌属(Escherichia)的微生物，并且可以是大肠杆菌(Escherichia coli)、艾伯特埃希氏菌(Escherichia albertii)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、赫氏埃希菌(Escherichia hermannii)、伤害埃希杆菌(Escherichia vulneris)或蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)，但不限于此。

宿主细胞可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌。

真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))，产担子孢子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungiimperfecti)的酵母(芽孢菌纲(Blastomycetes))。然而，酵母的分类可以改变，并且可以描述于Biology and Activities of Yeast(Skinner、Passmore和Davenport编著，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、Komagataella、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)细胞，例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉斯酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺贝酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)、法夫驹形氏酵母(Komagataella phaffii)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。如本文所用，“丝状真菌(filamentousfungi)”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚门的所有丝状形式(如Hawksworth等人，1995，同上)。丝状真菌的特征通常是由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。真菌的营养生长是通过菌丝伸长进行的，碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行的，并且碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉属真菌(Aspergillus)、金黄担子菌属(Aureobasidium)、黑管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、巨座壳属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、耐热囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporium pannicola、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛云芝菌(Coriolus hirsutus)、Fusarium bactridioides、Fusarium cerealis、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum、Fusarium graminum、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、福斯氏镰刀菌(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Phiebia radiata、杏鲍菇(Pleurotus eryngii)、Thielavia terrestris、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)，但不限于此。

制备本公开的变体的方法可包括培养宿主细胞。

如本文所用，术语“培养”是指宿主细胞在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养方法可以在本领域已知的合适的培养基和培养条件中进行。本领域技术人员可以根据待选择的菌株很容易地调整这种培养方法以供使用。具体地，培养可以是分批培养、连续培养和分批补料培养，但不限于此。

如本文所用，术语“培养基”是指含有培养宿主细胞所需的营养物质作为主要成分的材料混合物，并且其提供了营养物质和生长因子，以及存活和生长所必需的水。具体地，用于培养本公开的宿主细胞的培养基和其他培养条件可以是用于宿主细胞的常规培养的任何培养基，而没有任何特别的限制。然而，本公开的宿主细胞可在有氧条件下在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中培养，同时调节温度、pH等。

在本公开中，碳源可包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，例如甘露醇、山梨醇等；有机酸，例如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，例如谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸等。此外，碳源可包括天然有机营养物，例如淀粉水解产物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗糖蜜和玉米浆等。具体地，可以使用碳水化合物如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即，转化为还原糖的糖蜜)，此外，可以使用适当量的各种其他碳源而没有限制。这些碳源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。

氮源可包括无机氮源，例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵等；氨基酸，例如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；以及有机氮源，例如蛋白胨、NZ-胺、肉提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用或以两种或更多种的组合使用，但不限于此。

磷源可包括磷酸一钾、磷酸二钾或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。另外，可包括氨基酸、维生素和/或合适的前体。这些组成成分或前体可以分批或连续方式加入到培养基中，但这些磷源不限于此。

另外，培养基的pH可以通过在培养宿主细胞期间以合适的方式加入化合物如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等来调节。此外，在培养过程中使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可以防止气泡形成。此外，可以将氧气或含氧气体注入培养基中以维持培养基的有氧条件；或者可以注入氮气、氢气或二氧化碳以维持厌氧或微需氧条件，而不注入气体，但气体不限于此。

本公开的培养期间的温度可以在20℃-55℃、具体地25℃-40℃的范围内，但不限于此。可以继续培养直至获得所需量的有用物质，并且可以特别地进行24-196小时，但不限于此。

在一个实施方案中，用于制备本公开的具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽的方法还可包括回收在培养步骤中表达的本公开的具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽。

在另一个实施方案中，可以使用本公开所属领域中已知的方法回收在培养步骤中表达的变体。例如，可以通过常规方法从营养培养基中回收变体，该常规方法包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

在回收步骤中，可以使用本公开的培养宿主细胞的方法收集变体，例如，根据分批培养、连续培养或分批补料培养方法使用本领域已知的合适方法。例如，可以使用诸如离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、提取、超声破碎、超滤、透析、各种层析诸如分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、亲和层析等、HPLC及其组合的方法，并且可以使用本领域已知的合适方法从培养基或宿主细胞中回收变体。

在另一个实施方案中，可以不回收在培养步骤中由宿主细胞表达的变体。在该实施方案中，表达变体的宿主细胞可用作变体的来源。

本公开的组合物可用于降解含木聚糖的材料。

本公开的组合物可用于将含木聚糖的材料转化为木糖和/或低聚木糖。

除了本公开提供的变体之外，本公开的组合物还可包括其他组分。添加到本公开的组合物中的组分可以由本领域技术人员适当地选择。

在一个实施方案中，本公开的组合物还可包括适于将含木聚糖的材料转化为木糖和/或低聚木糖的任何组分。

在一个实施方案中，本公开的组合物还可包括适合应用于各种工业领域如动物饲料、烘焙、生物质糖化、纸浆漂白等的任何组分。

可以添加的材料的实例包括稳定剂、表面活性剂、助洗剂(builders)、螯合剂、分散剂、酶、酶稳定剂、催化剂、活化剂、运载体(carriers)、粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、悬浮剂、着色剂、调味剂、缓冲剂、防腐剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂、稀释剂、润滑剂、防腐剂等，但不限于此。

在一个实施方案中，除了本公开提供的变体之外，本公开提供的组合物还可包括天然存在的材料或非天然存在的材料。

在一个实施方案中，除了本公开提供的变体之外，本公开提供的组合物还可包括通常用于各种工业领域包括动物饲料、烘焙、生物质糖化、纸浆漂白等的另外的酶。

例如，另外的酶还可包括选自下组的任一种或多种酶，该组由以下各项组成：β-淀粉酶、纤维素酶(例如，β-葡糖苷酶、纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶)、葡糖淀粉酶、半纤维素酶(例如，内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabionofuranosidase)、α-D-葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶、香豆酰酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶)、异淀粉酶、异构酶、脂肪酶、植酸酶、蛋白酶、支链淀粉酶和/或可用于与α-淀粉酶结合的商业方法中的其他酶。

本公开的木聚糖酶变体或包含本公开的木聚糖酶变体的组合物可用于降解任何含木聚糖的材料。

如本文所用，含木聚糖的材料是可被木聚糖酶降解的任何材料。在一个实例中，含木聚糖的材料可以是半纤维素。具体地，含木聚糖的材料可以是选自木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯糖木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的材料。在一个实例中，含木聚糖的材料可以是木聚糖，但不限于此。

在一个实施方案中，本公开提供了用于降解(或分解)含木聚糖的材料的方法。这也可称为木聚糖的溶解和/或戊聚糖的溶解。

在本公开的另一个实施方案中，该方法涉及衍生自木聚糖降解的聚合物的降解(例如，分解)。

分解产物(例如，葡萄糖)可以用作任何发酵过程如生物燃料(例如，生物乙醇)生产中或其他产物例如生物化学品(例如，生物基异戊二烯)的生产中的原料。

可以使用本公开的变体、表达该变体的宿主细胞和/或包含该变体和/或该宿主细胞的组合物来降解木聚糖。除了本公开的变体之外，可以在木聚糖的水解步骤中组合加入辅因子、辅酶等。底物的水解步骤可以在最佳pH、温度条件等下进行，本领域技术人员可以选择合适的条件。

本发明的木聚糖酶变体可用于以下应用中的任一种：

a)动物饲料添加剂；和/或

b)动物饲料补充剂；和/或

c)基于谷物的材料(例如，这可以是全谷物或谷物的部分)的分解。

在一个实施方案中，本公开的木聚糖酶变体可用于饲料中。

在一个实施方案中，含木聚糖的材料可以是饲料或饲料组分。

本公开的饲料组合物可以指任何天然或人工膳食、单餐等，或动物进食、摄入和消化的单餐组分，或适于进食、摄入和消化的单餐组分，并且饲料组合物可以以本领域已知的各种形式制备。

在一个实施方案中，本公开的木聚糖酶变体可用于食品组合物或其制剂。

在一个实施方案中，含木聚糖的材料可以是基于谷物的材料(包括谷物的全部或部分，或发芽的谷物，例如发芽的大麦)。

在一个实施方案中，含木聚糖的材料可以是谷类面粉(例如，小麦、燕麦、黑麦或大麦面粉)。

在一个实施方案中，含木聚糖的材料可以是大麦麦芽或醪液，或发芽的大麦或其组合。

在一个实例中，食品组合物可以是发酵饮料，包括啤酒和葡萄酒。

在另一个实例中，食品组合物可以是烘焙产品，包括面包块(loaves)、面包卷、小圆面包、比萨饼、椒盐卷饼、玉米粉圆饼、蛋糕、曲奇饼、饼干和薄饼干，但不限于此。

本公开的木聚糖酶变体可用于小麦麸质-淀粉分离。

在将麸皮和胚芽从胚乳中初步分离后，可将小麦胚乳粉分级成淀粉和麸质级分，以获得高品质的α-淀粉、β-淀粉副产物和活性麸质。

在将谷类面粉(例如，小麦面粉)分离成淀粉和麸质级分的方法中，该方法包括将谷类面粉(例如，小麦面粉)、水和木聚糖酶变体混合。谷类面粉、水和木聚糖酶变体可以同时或依此混合。在一些实施方案中，谷物面粉(例如，小麦面粉)和水可在与木聚糖酶变体混合之前混合。

当本公开的木聚糖酶变体应用于小麦麸质-淀粉分离时，其产生了更高的α-淀粉产率和/或更好品质的麸质(例如，更好品质的活性麸质)。

在另一个实施方案中，本公开的木聚糖酶变体可用于降解基于谷物的材料并且可用作生物燃料(例如，生物乙醇)生产工艺的一部分。

在一个实例中，本公开的木聚糖酶变体可改善生物燃料(例如，生物乙醇)的生产和基于谷物的材料在生物燃料工业中的用途。

在一个实例中，该方法可包括在液化、糖化、发酵、同时糖化和发酵、后发酵或其组合之前或期间将生物燃料与木聚糖酶变体混合。

当本公开的木聚糖酶变体应用于生物燃料生产工艺时，可以获得以下优点：在该工艺中可以使用较高含量的干物质醪液(mash)；可以获得较高的最终糖浆的固体含量；较高的传热；较低的能量需求；减少的蒸发器结垢；降低的清洁成本；增加的最终燃料产量；改进的副产物品质；蒸馏后釜馏物的固液部分之间更好的分离；或其组合。

本公开的木聚糖酶变体可用于纸浆漂白。

例如，当处理木聚糖酶变体而纸浆中的着色木质素通过木聚糖与结晶纤维素连接时，木聚糖可被降解并且着色木质素可被释放，从而促进纸浆漂白。

实施例

在下文中，将通过实施例和实验实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例和实验实施例仅出于说明性目的给出，并且本公开的范围不旨在受这些实施例和实验实施例的限制。

实施例1：木聚糖酶变体的制备

1-1.模板的制备

在根囊鞭菌属PC-2菌株的基因组DNA中，将木聚糖酶变体(下文称为Op Xyn，SEQID NO:1)的基因(SEQ ID NO:2)扩增并克隆到pHCE载体(Takara)中，然后用作模板。

1-2.木聚糖酶变体的制备

选择用于在Op Xyn中产生二硫键的氨基酸对的位点，并设计用于将相应的氨基酸序列突变为半胱氨酸的引物以制备如下表1所示的7种变体。在下表1的突变描述中，依次描述了突变前的氨基酸、基于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的突变位置和突变后的氨基酸。

表1

具体地，使用模板、引物和PCR预混物(iNtRON，货号25185)通过PCR制备木聚糖酶变体。使用Eppendorf Mastercycler Nexus GX2进行PCR，反应条件如下：

初始变性-94℃，2min

变性-94℃，20s

退火-50℃，10s

延伸-72℃，10min(从变性到延伸30个循环)

最后延伸-72℃，5min

使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Takara，货号639650)连接所得的7种变体，然后转化到大肠杆菌Dh5α菌株中，随后测序以确认序列突变。

实施例2.具有改进的热耐受性的变体的选择和热耐受性效果的确认

将用实施例1中制备的变体和Op Xyn基因转化的大肠杆菌Dh5α菌株各自接种到灭菌的LB培养基(BD Difco)中，并在37℃和180rpm培养24小时，然后通过离心回收细胞。将20ml裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，10mM咪唑)加入到回收的细胞中并再分散，然后通过超声处理和离心获得粗酶溶液。使粗酶溶液流过Ni-NTA树脂(Qiagen，目录号30230)以被吸附，随后依次流过洗涤缓冲液(在裂解缓冲液组合物中仅20mM咪唑)和洗脱缓冲液(在裂解缓冲液组合物中仅250mM咪唑)以纯化酶，并使用纯化的酶来评价活性和热耐受性。

通过混合4μl稀释的酶溶液+196μl的Bradford溶液(Quick Start^TMBradford 1x染料试剂，#5000205)获得酶浓度，然后测量595nm处的吸光度。

通过将4μl的1M pH6.5磷酸盐缓冲液与96μl的1％来自beachwood(Megazyme，P-XYLNBE-10G)的木聚糖混合，然后向其中加入100μl稀释的酶溶液，随后在37℃进行反应15分钟来测量酶活性。将300μl的DNS溶液与反应溶液混合以停止反应，将混合物煮沸7分钟以显色，然后在冰水中冷却。在550nm处测量与500μl蒸馏水混合的溶液的吸光度，并且使用由木糖(Sigma-Aldrich，X1500)制成的标准曲线测量活性。

制备DNS溶液的方法如下：

将6.3g的3,5-二硝基水杨酸(samchun，D1267)加入到含有500ml蒸馏水的烧杯中，并将混合物的温度调节至50℃，然后向其中加入21g氢氧化钠(Daejung，7571-4400)。向混合物中加入300ml水和182g酒石酸钾钠四水合物(Daejung，6618-4400)后，加入5g苯酚(Sigma-Aldrich，P1037)和5g无水亚硫酸钠(Daejung，7634-4405)，搅拌混合物直至溶解，然后冷却。将蒸馏水加入到混合物中以调节总体积至1000ml并过滤，然后在使用前在棕色瓶中储存7天或更长时间。

为了评价热耐受性，将纯化的酶稀释至0.5mg/ml的浓度并在70℃的水浴中孵育10分钟，然后测量残余活性。

表2

因此，当以比率测量酶活性时，选择了，相对于Op Xyn，具有高于5倍以上的改善的热耐受性(残余活性)同时具有50-300％的酶活性的三种变体(DS1、DS2和DS5)。

根据DS1、DS2和DS5在70℃的孵育时间，额外确认了所选择的变体菌株的残余活性的变化并示于图1中。结果证实，即使增加处理时间，DS1、DS2和DS5的残余活性几乎没有变化。

根据前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本公开的技术概念或基本特征的情况下，本公开可以以其他特定形式体现。在这点上，本文公开的示例性实施方案仅用于说明的目的，而不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开旨在不仅涵盖示例性实施方案，而且涵盖可包括在由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其他实施方案。

<110> CJ第一制糖公司（CJ CHEILJEDANG CORPORATION）

<120> 具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽

<130> OPA21371

<150> KR 10-2020-0175800

<151> 2020-12-15

<160> 36

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Op Xyn

<400> 1

Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val

1 5 10 15

Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser

35 40 45

Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu

100 105 110

Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln

130 135 140

Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr

165 170 175

Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly

180 185 190

Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser

210 215 220

Ala Pro Arg

225

<210> 2

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Op Xyn nt

<400> 2

ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60

agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120

gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180

ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240

gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300

tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360

tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420

aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480

cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540

ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cacactgaac 600

gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660

aagcagggtt cggcccctcg ttag 684

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS1(R3C+T36C)

<400> 3

Gly Gln Cys Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val

1 5 10 15

Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Met Cys Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser

35 40 45

Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu

100 105 110

Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln

130 135 140

Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr

165 170 175

Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly

180 185 190

Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser

210 215 220

Ala Pro Arg

225

<210> 4

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DS1(R3C+T36C) nt

<400> 4

ggccagtgtt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60

agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgtgtct gggtaaggga 120

gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180

ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240

gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300

tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360

tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420

aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480

cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540

ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cacactgaac 600

gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660

aagcagggtt cggcccctcg ttag 684

<210> 5

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS2(S5C+S34C)

<400> 5

Gly Gln Arg Leu Cys Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val

1 5 10 15

Phe Asp Gly Phe Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Cys Met Thr Leu Gly Lys Gly Ala Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser

35 40 45

Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu

100 105 110

Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln

130 135 140

Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr

165 170 175

Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly

180 185 190

Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser

210 215 220

Ala Pro Arg

225

<210> 6

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DS2(S5C+S34C) nt

<400> 6

ggccagaggt tgtgtgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggcttc 60

agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt gtatgaccct gggtaaggga 120

gctaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180

ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240

gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300

tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360

tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420

aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480

cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540

ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cacactgaac 600

gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660

aagcagggtt cggcccctcg ttag 684

<210> 7

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DS5(F20C+A41C)

<400> 7

Gly Gln Arg Leu Ser Val Gly Gly Gly Gln Asn Gln His Lys Gly Val

1 5 10 15

Phe Asp Gly Cys Ser Tyr Glu Ile Trp Leu Asp Asn Thr Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Ser Met Thr Leu Gly Lys Gly Cys Thr Phe Lys Ala Glu Trp Ser

35 40 45

Ala Ala Val Asn Arg Gly Asn Phe Leu Ala Arg Arg Gly Leu Asp Phe

50 55 60

Gly Ser Thr Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Glu Tyr Ile Gly Leu Asp Tyr

65 70 75 80

Glu Ala Ser Tyr Arg Gln Thr Ala Ser Ala Ser Gly Asn Ser Arg Leu

85 90 95

Cys Val Tyr Gly Trp Phe Gln Asn Arg Gly Val Gln Gly Val Pro Leu

100 105 110

Val Glu Tyr Tyr Ile Ile Glu Asp Trp Val Asp Trp Val Pro Asp Ala

115 120 125

Gln Gly Lys Met Val Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Lys Ile Phe Gln

130 135 140

Met Asp His Thr Gly Pro Thr Ile Asn Gly Gly Asn Glu Thr Phe Lys

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Val Arg Gln Gln Lys Arg Thr Ser Gly His Ile Thr

165 170 175

Val Ser Asp His Phe Lys Ala Trp Ala Asn Gln Gly Trp Gly Ile Gly

180 185 190

Asn Leu Tyr Glu Val Thr Leu Asn Ala Glu Gly Trp Gln Ser Ser Gly

195 200 205

Val Ala Asp Val Thr Lys Leu Asp Val Tyr Thr Thr Lys Gln Gly Ser

210 215 220

Ala Pro Arg

225

<210> 8

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DS5(F20C+A41C) nt

<400> 8

ggccagaggt tgagcgtcgg tggtggccag aaccagcaca agggcgtctt cgatggctgt 60

agctacgaga tctggctgga taacaccggc ggtagcggtt ccatgaccct gggtaaggga 120

tgtaccttca aggctgagtg gagcgcagct gtcaaccggg gtaacttcct ggcccgacgc 180

ggtctggatt tcggctccac caagaaggcc accgcttacg agtacatcgg cctggattac 240

gaggcaagct acaggcagac tgccagcgca agcggtaaca gccgcctctg cgtctacggc 300

tggttccaga accggggagt gcagggcgtc cccctggtcg agtactacat catcgaggat 360

tgggtcgact gggtcccgga tgcgcaggga aagatggtca ccatcgatgg cgcccagtac 420

aagatcttcc agatggatca cactggcccg accatcaacg gcggtaacga gaccttcaag 480

cagtacttca gcgtccgcca gcagaagcgc actagcggcc acatcaccgt cagcgatcac 540

ttcaaggcgt gggccaacca gggctggggc atcggcaacc tctacgaggt cacactgaac 600

gcagagggtt ggcagagcag tggtgtcgcc gacgtcacca agctggatgt ctacaccacc 660

aagcagggtt cggcccctcg ttag 684

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ggccagtgtt tgagcgtcgg 20

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gctcaaacac tggcccatat gg 22

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

aagggatgta ccttcaaggc tgag 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

acccagacac atggaaccgc tacc 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

aggttgtgtg tcggtggtgg 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

accgacacac aacctctggc c 21

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

agcggttgta tgaccctggg taag 24

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ggtcatacaa ccgctaccgc c 21

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ccggattgtc agggaaagat ggtcac 26

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

tccctgacaa tccgggaccc ag 22

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

aagatctgtc agatggatca cactgg 26

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

catctgacag atcttgtact gggcg 25

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

ttcggctgta ccaagaaggc c 21

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

cttggtacag ccgaaatcca gacc 24

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

atcggctgtc tctacgaggt cgca 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

gtagagacag ccgatgcccc 20

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

gatggctgta gctacgagat ctgg 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

gtagctacag ccatcgaaga cgc 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

aagggatgta ccttcaaggc tgag 24

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gaaggtacat cccttaccca ggg 23

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

aaggcctgtg cttacgagta catcg 25

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

gtaagcacag gccttcttgg tgg 23

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

tggggctgtg gcaacctcta cg 22

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gttgccacag ccccagccc 19

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

cgcggttgtg atttcggctc cac 23

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gaaatcacaa ccgcgtcggg c 21

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ctggattgtt acaccaccaa gcagg 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ggtgtaacaa tccagcttgg tgacg 25

Claims (13)

1.一种具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽，其中：

i)所述经修饰的多肽与SEQ ID NO:1具有70％或更多且小于100％的序列同一性；和/或

ii)所述经修饰的多肽是由与编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的序列具有70％或更多且小于100％的序列同一性的多核苷酸编码的多肽；和/或

iii)所述经修饰的多肽是由(a)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(b)其cDNA或(c)在低严格性条件、中严格性条件、中高严格性条件、高严格性条件或非常高严格性条件下与(a)或(b)的全长互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽；和/或

iv)所述经修饰的多肽是具有木聚糖酶活性的i)、ii)或iii)的多肽的功能性片段；以及

所述经修饰的多肽包含选自以下的任一种或多种修饰：

用其他氨基酸取代在位置3、5、20、34、36和41处的一个或多个氨基酸；形成二硫键；及其组合，

其中所述位置编号是对应于SEQ ID NO:1的所述多肽位置的位置。

2.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中在对具有木聚糖酶活性的所述经修饰的多肽进行修饰之前，在位置3处的所述氨基酸是精氨酸(R)；在位置5处的所述氨基酸是丝氨酸(S)；在位置20处的所述氨基酸是苯丙氨酸(F)；在位置34处的所述氨基酸是丝氨酸(S)；在位置36处的所述氨基酸是苏氨酸(T)；和/或在位置41处的所述氨基酸是丙氨酸(A)。

3.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽包含在选自以下i)至vii)的位置处的氨基酸修饰：

i)3+36；

ii)5+34；

iii)20+41；

iv)3+36+5+34；

v)3+36+20+41；

vi)5+34+20+41；和

vii)3+36+5+34+20+41；

其中所述位置编号是对应于SEQ ID NO:1的所述多肽位置的位置。

4.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽在每个位置处的所述修饰包含以下i)至vi)中的任一个或多个修饰；

i)用半胱氨酸取代在位置3处的氨基酸；

ii)用半胱氨酸取代在位置5处的氨基酸；

iii)用半胱氨酸取代在位置20处的氨基酸；

iv)用半胱氨酸取代在位置34处的氨基酸；

v)用半胱氨酸取代在位置36处的氨基酸；和

vi)用半胱氨酸取代在位置41处的氨基酸；

其中所述位置编号是对应于SEQ ID NO:1的所述多肽位置的位置。

5.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽包含选自以下的任一个或多个修饰：

R3C+T36C；

S5C+S34C；

F20C+A41C；

R3C+T36C+S5C+S34C；

R3C+T36C+F20C+A41C；

S5C+S34C+F20C+A41C；和

R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C。

6.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽包含用半胱氨酸取代在位置3、5、20、34、36和41处的两个或更多个氨基酸，并在所述两个取代的氨基酸之间形成二硫桥。

7.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽包含用半胱氨酸取代在位置3和36处的氨基酸对；用半胱氨酸取代在位置5和34处的氨基酸对；和/或用半胱氨酸取代在位置20和41处的氨基酸对；以及修饰所述氨基酸对以形成二硫桥。

8.根据权利要求1所述的经修饰的多肽，其中所述经修饰的多肽与由SEQ ID NO:1的所述氨基酸序列组成的多肽相比具有增加的热耐受性和/或热稳定性。

9.一种生产低聚木糖或木糖的方法，其包含使权利要求1-8中任一项所述的经修饰的多肽、表达所述经修饰的多肽的宿主细胞和/或包含所述经修饰的多肽的组合物与含木聚糖的材料接触。

10.一种降解含木聚糖的材料的方法，其包含将权利要求1-8中任一项所述的经修饰的多肽、表达所述经修饰的多肽的宿主细胞和/或包含所述经修饰的多肽的组合物处理为含木聚糖的材料。

11.一种编码权利要求1-8中任一项所述的经修饰的多肽的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其包含权利要求1-8中任一项所述的经修饰的多肽和/或权利要求11所述的多核苷酸。

13.一种制备具有木聚糖酶活性的经修饰的多肽的方法，其包含培养权利要求12所述的宿主细胞。