WO2022131798A1 - 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 - Google Patents

자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 Download PDF

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WO2022131798A1
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amino acid
polypeptide
variant polypeptide
variant
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양태주
심지현
최은정
손병삼
박재용
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씨제이제일제당 (주)
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Definitions

  • the present application relates to variant polypeptides having Xylanase activity and uses thereof.
  • Xylanase (EC 3.2.1.8) is a hydrolase that randomly degrades the ⁇ -1,4 backbone of xylan, a plant cell wall component. Xylanase is mainly used to break down biomass in animal feed, bakery, pulp bleaching, etc. (Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. Microbial xylanases and their industrial applications: a review Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Aug;56(3-4):326-38.doi:10.1007/s002530100704.PMID:11548999.)
  • One object of the present application is to provide a variant polypeptide having xylanase activity.
  • Another object of the present application is to provide a composition comprising the variant polypeptide.
  • Another object of the present application is to provide a use of the variant polypeptide or the composition for reaction with a xylan-containing material.
  • Another object of the present application is a xylan-containing material, comprising contacting the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide with a xylan-containing material decomposition method; and/or to provide a method for preparing xylooligosaccharide and/or xylose.
  • Another object of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide; a nucleic acid construct comprising the polynucleotide; a vector comprising the polynucleotide or nucleic acid construct; And/or to provide a host cell comprising the polynucleotide, nucleic acid construct or vector.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing the variant polypeptide.
  • the variant polypeptide having xylanase activity of the present application may be usefully used in various industrial fields.
  • One aspect of the present application is a variant polypeptide having xylanase activity.
  • the variant polypeptide is a polypeptide having at least 70% and less than 100% sequence identity to SEQ ID NO: 1; and/or
  • the variant polypeptide is a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 70% and less than 100% sequence identity with the sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; and/or
  • the variant polypeptide comprises (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) cDNA thereof, or (c) the full-length complement sequence of (a) or (b) and low stringency a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under high stringency conditions, medium stringency conditions, medium stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions; and/or
  • said variant polypeptide is a functional fragment of i), ii) or iii) polypeptide having xylanase activity;
  • the variant polypeptide comprises any one of the modifications selected from the following:
  • the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • amino acid 3 is arginine (R); amino acid 5 is serine (S); amino acid 20 is phenylalanine (F); amino acid 34 is serine (S); amino acid number 36 is threonine (T); and/or amino acid 41 may be alanine (A).
  • the variant polypeptide may include a modification of an amino acid at a position selected from the following:
  • the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the modification of each position of the variant polypeptide may include modification of any one or more of the following i) to vi):
  • the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the variant polypeptide may include any one or more modifications selected from the following:
  • the variant polypeptide comprises a substitution of an amino acid at two or more of positions 3, 5, 20, 34, 36, and 41 with a cysteine, It may be to form a disulfide bridge between the two substituted amino acids.
  • the variant polypeptide comprises amino acid pairs 3 and 36; amino acid pairs 5 and 34; and/or substitution of amino acid pairs 20 and 41 with cysteine, and modifications in which the amino acid pair forms a disulfide bridge.
  • the variant polypeptide may have increased heat resistance and/or thermal stability compared to the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • compositions for reaction with the mutant polypeptide of the present application and/or a xylan-containing material including the mutant polypeptide of the present application are also aspects of the present application.
  • variant polypeptide and/or a composition comprising the variant polypeptide for reaction with a xylan-containing material.
  • Another aspect of the present application includes contacting the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide with a xylan-containing material, xylose and / Or a method for preparing xylo-oligosaccharide.
  • Another aspect of the present application is a xylan-containing material comprising treating the variant polypeptide, a host cell expressing the variant polypeptide, and/or a composition comprising the variant polypeptide to a xylan-containing material method to decompose.
  • Another aspect of the present application is a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • nucleic acid construct including the polynucleotide.
  • Another aspect of the present application is a vector including the polynucleotide or the nucleic acid construct.
  • Another aspect of the present application is a host cell comprising the variant polypeptide, the polynucleotide, the nucleic acid construct, and/or the vector.
  • Another aspect of the present application is a method for producing a variant polypeptide comprising the step of culturing the host cell.
  • the term “about” may be presented before a particular numerical value.
  • the term “about” includes not only the exact number recited after the term, but also to a range substantially or close to that number. Considering the context in which the number is presented, it can be determined whether the number is close to or near the specific number mentioned.
  • the term “about” may refer to a range of -10% to +10% of a numeric value.
  • the term “about” may refer to a range from -5% to +5% of a given numerical value. However, it is not limited thereto.
  • the term “consisting essentially of” means that an unspecified component may be present if the characteristics of the subject matter claimed in this application are not substantially affected by the presence of the unspecified component.
  • the term “consisting of” means that the proportion of a particular component(s) totals 100%.
  • An ingredient or feature following the term “consisting of” may be essential or obligatory. In some embodiments, other optional or non-essential components may be excluded, in addition to components or features hereinafter “consisting of.”
  • the term “comprising” means the presence of a feature, step or component described below the term, and does not exclude the presence or addition of one or more features, step or component.
  • Components or features described below “comprising” in the present application may be essential or mandatory, but in some embodiments, other optional or non-essential components or features may be further included.
  • protein or “polypeptide” refers to a polymer or oligomer of consecutive amino acid residues.
  • polypeptide polypeptide
  • protein and “peptide” may be used interchangeably with “amino acid sequence”.
  • amino acid sequence exhibiting activity may be referred to as an “enzyme”.
  • amino acid sequences are described in the N-terminal to C-terminal orientation.
  • a recombinant cell in the context of a cell, nucleic acid, polypeptide, or vector, the term "recombinant" in this application means that the cell, nucleic acid, polypeptide or vector is modified by introduction of a heterologous nucleic acid or polypeptide or alteration of a native nucleic acid or polypeptide; or that the cell is derived from a cell so modified.
  • a recombinant cell can express a gene that is not found in the native (non-recombinant) form of the cell, or it can express a native gene that is expressed or not expressed at all, or is otherwise aberrantly expressed.
  • isolated refers to a substance that exists in a non-naturally occurring environment or in a form that does not exist in nature. This includes at least substantially freeing of the substance (sequence, enzyme or nucleic acid) from at least one other component with which it is associated with nature and is found in nature, e.g., a sequence, enzyme or nucleic acid. .
  • an isolated sequence, enzyme or nucleic acid provided herein may be provided in a form that is substantially free of one or more contaminants.
  • isolated materials include i) any material that is not naturally occurring, ii) any material that has one, more, or all naturally occurring constituents associated with it in its natural state removed. (e.g., enzyme, variant, nucleic acid, protein, peptide or cofactor) of a substance, iii) any substance artificially modified from a substance found in nature, or iv) other constituents with which it is naturally associated Substances that have been modified to change the amount of the substance compared to that (e.g., increase the copy number of a gene encoding a specific substance; modifying a promoter naturally linked to a gene encoding a specific substance with a highly active promoter, etc.) However, it is not limited thereto.
  • wild-type means naturally-occurring without artificial modification.
  • wild-type when used in reference to a polypeptide, it means a naturally occurring polypeptide that does not have artificial mutations (substitutions, insertions, deletions, etc.) at one or more amino acid positions.
  • wild-type when used in reference to a polynucleotide, it means not having artificial modifications (substitutions, insertions, deletions) of one or more nucleotides.
  • the polynucleotide encoding the wild-type polypeptide is not limited to the native polynucleotide, and includes sequences encoding any wild-type polypeptide.
  • the parent sequence or backbone refers to a reference sequence that becomes a variant polypeptide by introducing a modification. That is, the parent sequence may be a target into which mutations such as substitution, insertion and/or deletion are introduced as a starting sequence.
  • the parent sequence may be a naturally occurring or wild type, or a variant in which one or more substitutions, insertions, or deletions have occurred in the natural or wild type, or an artificially synthesized sequence. have.
  • the parent sequence is an amino acid sequence exhibiting activity, that is, an amino acid sequence of an enzyme, it may be referred to as a parent enzyme.
  • reference sequence refers to a sequence used to determine the position of an amino acid in any amino acid sequence. By aligning an arbitrary amino acid sequence with a reference sequence, the position of an amino acid corresponding to a specific position of the reference sequence within any amino acid sequence can be determined.
  • fragment refers to a part of a parent sequence.
  • it may be a polypeptide in which one or more amino acids are removed from the C or N terminus of the parent sequence.
  • fragment of an enzyme may refer to a "functional fragment”.
  • the “functional fragment” may also be referred to as an active fragment, and refers to a polypeptide that is part of a parent enzyme and has the enzymatic activity of the parent enzyme.
  • a functional fragment of an enzyme may be one comprising a catalytic site of the enzyme.
  • a fragment of an enzyme may comprise a portion of the full length of the parent enzyme.
  • amino acids that are at least about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, or less than 100% of the full length of the parent enzyme. It may include, but is not limited to.
  • altering/modifying means changing or altering. This may be a change from one that occurs naturally.
  • the enzyme can be altered in such a way that it is altered from the parent or reference sequence.
  • the modified enzyme may be an enzyme that does not exist in nature, that is, does not naturally occur.
  • modified means, for example, altered from its naturally occurring form.
  • Modified enzymes of the present application include non-naturally occurring enzymes or naturally occurring variants.
  • the modified enzyme of the present application is a modified enzyme not found in nature.
  • the modified enzyme of the present application may be one that is not spontaneously generated, but is not limited thereto.
  • variant or modified polypeptide of an enzyme refers to a protein that differs from the parent enzyme in conservative substitution and/or modification of one or more amino acids. do. "Variant” or “variant polypeptide” may be used interchangeably. The mutant or variant polypeptide may be non-naturally occurring, but is not limited thereto.
  • Such variants differ from the sequence of the parent enzyme by one or more modifications, for example amino acid substitutions, deletions and/or insertions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the parent enzyme and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the parent enzyme.
  • variants may include variant polypeptides in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant or mutant polypeptide
  • mutant in English, modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant, etc.
  • Variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the secondary structure and properties of the polypeptide.
  • the polypeptide may be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein involved in the transfer of the protein either co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • the term “conservative substitution” means substituting one amino acid for another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • any amino acid can be described as Xaa, X.
  • Amino acids can generally be classified based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. As such, amino acid substitutions may generally occur based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • amino acids with electrically charged amino acids positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and aspartic acid.
  • nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and proline
  • polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine
  • aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • the term “gene” refers to a polynucleotide encoding a polypeptide and a polynucleotide including regions before and after the coding region.
  • a gene may have a sequence (intron) inserted between each coding region (exon).
  • homology refers to the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related, and may be expressed as a percentage.
  • homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used.
  • Substantially, homologous or identical sequences generally have moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes polynucleotides containing common codons in polynucleotides or codons taking codon degeneracy into account.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • mature polypeptide refers to a form of a polypeptide lacking a signal sequence or a propeptide sequence.
  • the mature protein/polypeptide/peptide may be a functional form of the protein/polypeptide/peptide.
  • the mature polypeptide may be in its final form after translation or post-translational modification. Examples of post-translational modifications include, but are not limited to, N- or C-terminal modifications, glycosylation, phosphorylation, removal of a leader sequence, and the like.
  • nucleic acid construct includes one or more regulatory sequences, is artificially synthesized, is engineered to contain a specific sequence in a way that does not exist in nature, or is derived from nature. refers to an isolated single or double-stranded nucleic acid molecule.
  • expression includes, but is not limited to, any step involved in the production of a polypeptide, such as transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • expression vector refers to a linear or circular nucleic acid molecule comprising a coding sequence and a regulatory sequence operably linked for its expression.
  • operably linked refers to a configuration in which regulatory sequences are placed in appropriate positions such that the regulatory sequences direct expression of a coding sequence.
  • operably linked means that a regulatory region of a functional domain with known or desired activity, such as a promoter, terminator, signal sequence or enhancer region, modulates the expression, secretion or function of a target (gene or polypeptide) as described above. attached to or linked to the target so that it can be modulated according to the desired activity.
  • cDNA refers to a DNA sequence that can be prepared through reverse transcription from a mature, spliced mRNA molecule obtainable from a eukaryotic or prokaryotic cell.
  • the cDNA sequence does not include intron sequences that may be present in the corresponding genomic DNA.
  • the nascent primary RNA transcript is the precursor of mRNA before it has been processed through a series of steps including splicing to appear as mature spliced mRNA.
  • regulatory sequence refers to a polynucleotide sequence necessary for the expression of a coding sequence.
  • Each regulatory sequence may be native (identical in origin) or foreign (derived from another gene) to the coding sequence.
  • Examples of the regulatory sequence include a leader sequence, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, a promoter, a signal peptide sequence, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence that regulates transcription and translation termination. contains the sequence.
  • the minimum unit of the regulatory sequence may include a promoter, transcriptional and translation termination sequences.
  • referring to a specific position in an amino acid sequence may include referring to an amino acid present or substituted at that position.
  • Designating an amino acid at a specific position can be described in various ways. For example, “position 003” may be described as “position 3", “amino acid 3", and “third amino acid”. Also, for example, when the amino acid at the 3rd position is arginine (R), it may be described as “R3” or “Arg3”.
  • Substitution of amino acids can be expressed by describing the amino acid before the substitution, the position, and the amino acid to be substituted in the order.
  • the amino acid can be expressed using conventional one-letter and three-letter codes. For example, when serine, an amino acid at position 5 of a specific sequence, is substituted with cysteine, it may be described as “S5C” or “Ser5Cys”.
  • Any amino acid at a particular position may be referred to as "X".
  • X6 refers to any amino acid at position 6.
  • X when the amino acid to be substituted is denoted by X, it means to be substituted with an amino acid different from the amino acid present before the substitution.
  • V6X indicates that V at position 6 is substituted with any amino acid other than V.
  • R3C+T36C means that arginine, the amino acid at position 3, is substituted with cysteine, and threonine, which is the amino acid at position 8, is substituted with cysteine, respectively.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a listed position in a protein or polypeptide, or to an amino acid residue that is similar to, identical to, or homologous to a residue listed in a protein or polypeptide. Identifying the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid of a sequence that refers to the specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • SEQ ID NO: 1 may be used as a reference sequence to determine the position of an amino acid in any amino acid sequence in the present application.
  • SEQ ID NO: 1 disclosed in the present application may be used to determine the corresponding amino acid residue in a polypeptide having any xylanase activity, and unless otherwise indicated in the present application, the residue of a specific amino acid sequence is SEQ ID NO: numbered based on 1.
  • any amino acid sequence is aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 1.
  • a sequence alignment algorithm such as that described in this application can identify the position of an amino acid or a position at which modifications, such as substitutions, insertions, or deletions, occur compared to a query sequence (also referred to as a "reference sequence").
  • Such alignments include the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needle program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000). , Trends Genet. 16: 276-277) and the like, but is not limited thereto.
  • multiple sequence alignments can be used to identify corresponding amino acid residues in different xylanases.
  • multiple sequence alignment programs known in the art include MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation; version 3.5 or higher; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (version 6.857 or higher; Katoh and Kuma, 2002).
  • pairwise sequence comparison algorithms may be used where enzymes cleaved from the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1 fail to detect their relationship by conventional sequence-based comparison (Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615).
  • Higher sensitivity can be achieved in sequence-based searches by using search programs that use probabilistic representations of polypeptide families (profiles) to search databases.
  • the PSI-BLAST program can calculate a profile through an iterative database search process and detect a remote homolog with a low degree of relationship (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
  • proteins of known structure For proteins of known structure, several tools and resources are available to search and create structural alignments.
  • the SCOP superfamily of proteins has been structurally aligned, and this alignment is accessible and downloadable.
  • the structure of two or more proteins is characterized by a variety of different structures, such as distance alignment matrix (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) or CE (Combinatiorial extension) Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747). It can be sorted using an algorithm. Implementations of these algorithms can additionally be used to query structural databases with target structures, to discover possible structural homologues (Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
  • xylanase refers to an enzyme that catalyzes the endohydrolysis of 1,4-beta-D-xylosidic bonds in xylan.
  • it may be an enzyme having an EC number of 3.2.1.8, but is not limited thereto.
  • xylanase activity can be measured and evaluated by using methods known in the art, including the embodiments described in this application.
  • parent xylanase refers to a xylanase to which modification is applied to produce the mutant or variant polypeptide of the present application.
  • the parent xylanase, parent enzyme, or parent sequence may be a naturally occurring polypeptide or wild-type polypeptide, a mature polypeptide thereof, and may include a variant or functional fragment thereof, but may not inhibit xylanase activity. It is not limited thereto as long as it has a polypeptide that can be a parent of a variant.
  • Mo xylanase provided in the present application, but is not limited thereto, may be a polypeptide of SEQ ID NO: 1. Also, about 60%, 70%, 75% of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 as long as it has xylanase activity. 80%. It may be a polypeptide having at least 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity, and if it has the same or corresponding activity as the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the parent It may be included without limitation in the scope of xylanase.
  • the parent xylanase of the variant provided in the present application is, Orpinomyces sp., Neocallimastix sp., Piromyces sp., Ruminococcus sp. may be of origin. Specifically, Orpinomyces sp. may be of origin.
  • the aforementioned microorganism is an example of a microorganism from which xylanase provided in the present application can be derived, and includes those derived from a microorganism that is taxonomically homologous to the microorganism, regardless of the name of the microorganism.
  • microorganisms can be purchased from known microbial depository institutions such as ATCC, DSMZ, CBS, NRRL, KCTC, and KCCM.
  • sequence "derived from” in a particular microorganism is not limited to that produced or manufacturable naturally in the microorganism, but also includes sequences encoded by genes produced and isolated in the microorganism containing the gene. do.
  • Orpinomyces sp. Derived xylanase is an enzyme having xylanase activity naturally produced in microorganisms of the genus Orpinomyces, as well as those produced in microorganisms of the genus Orpinomyces, and genetic modifications known in the art (e.g., the sequence encoding the enzyme It also includes those produced in other host cells through transformation into
  • variable polypeptide having xylanase activity may be a mutant of parent xylanase.
  • variable of parent xylanase or “variant of xylanase” refers to a protein having at least one amino acid different from the amino acid sequence of parent xylanase and having activity of xylanase.
  • variable polypeptide having xylanase activity variant of parent xylanase and variant of xylanase can be used interchangeably.
  • the variant provided in the present application may include modification of one or more amino acids in the parent xylanase sequence while having xylanase activity. Such modifications may be substitution of amino acids and/or formation of disulfide bonds.
  • said variant is a polypeptide having at least 70% and less than 100% sequence identity to SEQ ID NO: 1; and/or ii) said variant is a polypeptide encoded by a polynucleotide having at least 70% and less than 100% sequence identity to the sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1; and/or iii) the variant comprises (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) cDNA thereof, or (c) the full-length complement sequence of (a) or (b) and low a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringency conditions, medium stringency conditions, medium stringency conditions, high stringency conditions, or very high stringency conditions; and/or iv) the variant may be a functional fragment of a polypeptide having i), ii) or ii) xylanase activity.
  • the variant provided in the present application may have one or more altered functions or properties compared to the parent xylanase, including modification of one or more amino acids in the parent xylanase sequence, while having xylanase activity. have.
  • the variant provided in the present application has one or more altered functions or properties compared to the parent xylanase, including modification of one or more amino acids in the parent xylanase sequence, while having xylanase activity. , may have one or more conservative substitutions.
  • the variant provided in the present application is a variant of parent xylanase, and may be a polypeptide having xylanase activity.
  • the variant provided in the present application comprises modification at one or more positions corresponding to positions 3, 5, 20, 34, 36, and 41 of SEQ ID NO: 1 may include
  • the variant provided in the present application may include a modification of an amino acid at a position selected from the following i) to vii):
  • the position number is a position corresponding to the position of the polypeptide of SEQ ID NO: 1, and "corresponding" is as described above.
  • the variant provided in the present application may include a modification of an amino acid corresponding to one or more of R3, S5, F20, S34, T36, and A41 of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 before modification provided in the present application is arginine (R);
  • the amino acid corresponding to position 5 is serine (S);
  • the amino acid corresponding to position 20 is phenylalanine (F);
  • the amino acid corresponding to position 34 is serine (S);
  • the amino acid corresponding to position 36 is threonine (T); and/or the amino acid corresponding to position 41 may be alanine (A).
  • the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y of the amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 , N, Q, D, E, K, or H, specifically S, T, C, Y, N, or Q, and more specifically C may include
  • the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N of the amino acid corresponding to position 5 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R, or H, specifically T, C, Y, N, or Q, and more specifically C can
  • the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, Y, N of the amino acid corresponding to position 20 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R, or H, specifically S, T, C, Y, N, or Q, and more specifically C may include
  • the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N of the amino acid corresponding to position 34 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R, or H, specifically T, C, Y, N, or Q, and more specifically C can
  • the variant provided in the present application is G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, C, Y, N of the amino acid corresponding to position 36 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R, or H, specifically with S, C, Y, N, or Q, and more specifically with C can
  • the variant provided in the present application is G, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N of the amino acid corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 1 , Q, D, E, K, R, or H specifically with S, T, C, Y, N, or Q, and more specifically with C.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 3 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 5 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 20 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 34 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 36 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include the substitution of an amino acid corresponding to position 41 of SEQ ID NO: 1 with a polar amino acid.
  • the variant provided in the present application may include substitution of one or more of R3C, S5C, F20C, S34C, T36C and A41C of SEQ ID NO: 1.
  • the variant provided in the present application may include substitution of two or more of R3C, S5C, F20C, S34C, T36C and A41C of SEQ ID NO: 1.
  • the variant provided in the present application may include any one or more substitutions selected from the following:
  • the variant comprising the R3C + T36C substitution of SEQ ID NO: 1 may be represented by SEQ ID NO: 3, and the variant comprising the S5C + S34C substitution of SEQ ID NO: 1 may be represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 1
  • a variant comprising the F20C + A41C substitution of may be represented by SEQ ID NO: 7.
  • the variants provided herein include all possible combinations of the aforementioned modifications.
  • the variant may be one comprising a modification of an amino acid at a position selected from the following by a combination of the aforementioned modifications:
  • the variant may include, but is not limited to, any one or more substitutions of i) to vi) below: i) substitution of amino acid 3 with cysteine; ii) substitution of amino acid 5 with cysteine; iii) substitution of amino acid 20 with cysteine; iv) substitution of amino acid 34 with cysteine; v) substitution of amino acid 36 with cysteine; and vi) substitution of amino acid 41 with cysteine.
  • the variant may include any one or more modifications selected from the following, but is not limited thereto:
  • the variant provided in the present application comprises a cysteine substitution of an amino acid corresponding to two or more positions of 3, 5, 20, 34, 36, and 41 of SEQ ID NO: 1 and forming a disulfide bridge between the two substituted amino acids.
  • the variants provided herein include amino acid pairs 3 and 36; amino acid pairs 5 and 34; and/or amino acid pairs 20 and 41 may be substituted with cysteine to form a disulfide bridge.
  • the variants provided in the present application include, but are not limited to, parent xylanase; at least about 60%, e.g., at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, 93 of a mature polypeptide or functional fragment thereof % or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and less than 100% sequence identity.
  • the variants provided in the present application are SEQ ID NO: 1 and about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more , 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and less than 100% sequence identity. .
  • the variant provided in the present application is about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% of the nucleotide sequence encoding the mature polypeptide of SEQ ID NO: 1 or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more and 100% It may be a polypeptide encoded by a polynucleotide having less than nucleotide sequence identity.
  • the variant provided in the present application comprises (a) the mature polypeptide coding sequence of SEQ ID NO: 1, (b) its cDNA, or (c) the full-length complementary sequence of (a) or (b). -length complement) and low stringency conditions, medium stringency conditions, medium stringency conditions, high stringency conditions, or a polypeptide encoded by a polynucleotide that hybridizes under very high stringency conditions.
  • the variant provided in the present application is a functional fragment of SEQ ID NO: 1 and about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, At least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% and less than 100% sequence identity.
  • the variant provided in the present application is about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 % or greater, 90% or greater, 91% or greater, 92% or greater, 93% or greater, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater and less than 100% nucleotides. It may be a polypeptide encoded by a polynucleotide having sequence identity.
  • the variant provided in the present application is one of amino acids 3, 5, 20, 34, 36 and 41 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7
  • the amino acids at the above positions are fixed, and about 60% or more, for example, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% of the amino acid sequence of SEQ ID NO:, a mature polypeptide or a functional fragment thereof.
  • Polypeptides having at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or at least 100% sequence identity. can be
  • the variant provided in the present application may be encoded by the polynucleotide of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8.
  • the variant comprising the R3C + T36C substitution of SEQ ID NO: 1 of the present application may be encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 4.
  • the variant comprising the S5C + S34C substitution of SEQ ID NO: 1 of the present application may be encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 6.
  • the variant comprising the F20C + A41C substitution of SEQ ID NO: 1 of the present application may be encoded by the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 8.
  • the variants provided herein have one or more properties or properties of a polypeptide that can be selected or detected as compared to other xylanases, for example, wild-type xylanase, parental xylanase, other xylanase variants, and the like. may have been changed.
  • Such properties or attributes include, oxidative stability, substrate specificity, catalytic activity, thermal stability, alkali stability, pH activity profile, resistance to proteolysis, Km, k cat , k cat /Km ratio, protein folding, induction of an immune response, ability to bind ligand, ability to bind receptor, ability to be secreted, ability to be displayed on the surface of cells, ability to form oligomers, ability to signal, ability to promote cell proliferation, ability to inhibit cell proliferation, cell including, but not limited to, the ability to induce apoptosis, the ability to be modified by phosphorylation or glycosylation, and/or the ability to treat a disease.
  • the variant provided in the present application may have increased heat resistance and/or thermal stability compared to the parent sequence.
  • enzyme activity refers to at least one catalytic activity. Specifically, it may be the conversion efficiency of the enzyme mainly expressed as k cat /Km, but is not limited thereto.
  • k cat means a catalytic constant for conversion to a product in a unit time by one enzyme when the enzyme is completely saturated with a substrate, also called a turnover number.
  • Km is the substrate concentration at which the reaction rate is half of the maximum value (Vmax).
  • Examples of methods for expressing enzyme activity include specific activity (umol of converted substrate x mg -1 x min -1 ) or volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1 ). .
  • enzyme activity is not limited to the above, Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979; A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003; A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981; Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H.
  • the variant provided in the present application is about 100%, about 110%, about 120%, about 130%, about 140%, about 150%, about 160%, about 170%, about 180 compared to the parent enzyme. %, about 190%, or about 200% or more.
  • the variant provided in the present application is about 99%, about 95%, about 90%, about 80%, about 70%, about 60%, about 50%, about 40%, or It may have a reduced enzyme activity of about 20% or less.
  • the term “specific activity” refers to the activity of an enzyme per unit weight of a protein, and can be expressed in unit/mg. Quantification of the protein can be performed using, for example, SDS-PAGE or Bradford assay.
  • Enzyme stability means that enzyme activity is preserved during storage or reaction time. In order to measure this change in stability, the initial enzyme activity is measured and compared for 0 hours (time zero) (100%) and after a certain period of time (x%) under predetermined conditions, the level at which enzyme activity is lost or enzyme stability can express
  • Factors affecting enzyme activity include, for example, pH, heat, the presence of other substances (eg, oxidizing agents, chelating agents), and the like.
  • pH stability refers to the ability of a protein to function in a specific pH range.
  • the variant provided in the present application may have activity at about pH 4.0 to about pH 12.0, but is not limited thereto.
  • a protein When a protein maintains a function in a specific pH range, it may be defined as having “pH stability”, and may be defined as having “acid resistance”, “alkali resistance”, etc. according to the pH range.
  • thermal stability refers to the ability of a protein to function in a specific temperature range.
  • the variant provided in the present application may have activity in the range of about 20 °C to about 120 °C, specifically, it may have activity in the range of about 60 °C to about 100 °C, but is not limited thereto .
  • thermal tolerance refers to the ability of a protein to function after exposure to a specific temperature, for example, high or low temperature.
  • a protein having heat resistance may not function at an exposed temperature, but may function again when returned to an optimal temperature environment.
  • the increase in stability may include maintaining high enzymatic activity compared to other enzymes, eg, wild-type enzyme, the parent enzyme and/or other variants; including increasing ranges such as pH, temperature and/or time at which the protein retains its function.
  • Reduction of stability may include maintaining low enzyme activity compared to other enzymes, eg, wild-type enzyme, the parent enzyme and/or other variants; including reduction of ranges such as pH, temperature and/or time at which the protein remains functional.
  • the term “substrate specificity” refers to the ability of an enzyme to discriminate between a substrate and molecules competing with the substrate. Substrate specificity can be determined by measuring the activity of an enzyme on different substrates.
  • the change in substrate specificity may be a change in the direction of increasing specificity for a substrate capable of producing a desired product. In another embodiment, the change in substrate specificity may be a change in a direction in which specificity for a substrate capable of producing a desired product decreases.
  • the altered properties of the variant provided in the present application may be an activity suitable for application in various industrial fields, including feed, baking, pulp bleaching, and the like, and improved activity.
  • the polynucleotide encoding the variant of the present application may include the coding sequence of the variant described above.
  • various modifications can be made in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or considering codons preferred in the organism to express the polypeptide. .
  • polynucleotide of the present application is a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence encoding a variant of the present application by hybridizing under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the nucleotide sequence. can be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are described in, for example, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • polynucleotides with high homology or identity are 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and more specifically 99% or more.
  • Conditions in which polynucleotides having homology or identity hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize, or wash conditions of conventional southern hybridization at 60° C., 1XSSC, 0.1% SDS , specifically at a salt concentration and temperature equivalent to 60° C., 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1XSSC, 0.1% SDS, to enumerate the conditions of one wash, specifically two to three washes.
  • wash conditions of conventional southern hybridization at 60° C., 1XSSC, 0.1% SDS , specifically at a salt concentration and temperature equivalent to 60° C., 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68° C., 0.1XSSC, 0.1% SDS
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • the term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenosine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the purpose.
  • “high stringency” occurs at about 5-10° C. below the Tm of the probe; “moderate stringency” occurs at about 10-20°C below the Tm of the probe; “Low stringency” can occur, but is not limited to, about 20-25° C. below the Tm.
  • low stringency condition is 5X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured salmon for a probe of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to Southern blotting standard procedures.
  • Sperm DNA at 200 micrograms/ml and 25% formamide, prehybridization and hybridization at 42°C.
  • the carrier material can finally be washed 2 to 3 times each for 15 minutes at 50° C. using 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS.
  • "medium stringency condition” is 5X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured salmon for a probe of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to Southern blotting standard procedures.
  • Sperm DNA at 200 micrograms/ml and 35% formamide, prehybridization and hybridization at 42°C.
  • the carrier material may finally be washed 2 to 3 times each for 15 minutes using 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS at 55° C.
  • “medium-high stringency condition” "Silver blotting in 5X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured salmon sperm DNA 200 micrograms/ml and 35% formamide for probes at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to Southern blotting standard procedures, It may be prehybridization and hybridization at 42°C.
  • the carrier material can finally be washed 2 to 3 times each for 15 minutes at 60° C. using 1 to 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS.
  • high stringency condition is 5 X SSPE, 0.3% SDS, sheared and denatured, for a probe of at least 100 nucleotides in length, for 12-24 hours according to standard Southern blotting procedures. Salmon sperm DNA at 200 micrograms/ml and 35% formamide, prehybridization and hybridization at 42°C. The carrier material can finally be washed 2 to 3 times each for 15 minutes at 65° C. using 2 X SSC, 0.1 to 0.2% SDS.
  • a nucleic acid construct provided herein comprises a polynucleotide encoding a variant provided herein, operably linked to one or more regulatory sequences that direct expression of the coding sequence in an appropriate host cell under conditions suitable for the regulatory sequence. do.
  • Polynucleotides can be engineered in a variety of ways to allow expression of variants. Depending on the expression vector, it may be desirable or necessary to manipulate the polynucleotide prior to insertion of the polynucleotide into the vector. For such operation, methods known in the art may be used.
  • the "vector" provided in the present application is a nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the variant operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so that the variant of the present application can be expressed in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • a vector that can be used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as a phage vector or a cosmid vector
  • pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based plasmid vectors may be used as plasmid vectors.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a variant provided in the present application may be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto. It may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and to confer a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophicity, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface polypeptide. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the host cell of the present application may be included without limitation as long as it is capable of expressing the mutant of the present application.
  • the host cell of the present application may include the above-described variant, a polynucleotide encoding the variant, a nucleic acid construct comprising the same, and/or a vector.
  • the nucleic acid construct or vector may be integrated into the chromosome as described above, or maintained as a self-replicating extrachromosomal vector.
  • a host cell of the present application includes any progeny of a parental cell that is not identical to the parental cell due to mutations occurring during replication.
  • the host cell may be any cell useful for recombinant production of a variant, eg, a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • the prokaryotic host cell may be any Gram-positive or Gram-negative bacterium.
  • Gram-positive bacteria include, but are not limited to, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus and Streptomyces.
  • Gram-negative bacteria include Campylobacter, Escherichia coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Iliobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, Vibrio (e.g., Vibrio natriegens) ) and ureaplasma.
  • the bacterial host cell may be a Bacillus genus host cell, specifically Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus latus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus steathermophilus, Bacillus subtilis and Bacillus thuringiensis cells, including but not limited to. does not
  • the bacterial host cell may be a Streptococcus genus host cell, specifically Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis) and Streptococcus equi subspecies Zooepidemicus cells.
  • the bacterial host cell may be a Streptomyces genus host cell, specifically Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces Coelicola, Streptomyces griseus and Streptomyces lividans cells, but are not limited thereto.
  • the bacterial host cell may be a host cell of the genus Corynebacterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium stationis Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli , Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris, or Corynebacterium flavescens, but is not limited thereto.
  • the host cell may be a microorganism of the genus Escherichia, Escherichia coli, (Escherichia coli), Escherichia albertii, Escherichia fergusonii ), Escherichia hermannii, Escherichia vulneris, or Escherichia blattae, but is not limited thereto.
  • the host cell may be a eukaryote such as a mammalian, insect, plant or fungal cell.
  • the host cell may be a fungal cell.
  • fungi includes Ascomycetes, Basidiomycetes, Fungiforms and zygotes, as well as Oomyceta and all imperfect fungi.
  • the fungal host cell may be a yeast cell.
  • yeast in the present application refers to yeast belonging to ascosporogenous yeast (Endomycetales), basidiosporogenous yeast and Fungi imperfecti (Blastomycetes). includes However, this classification can be changed, and the classification can be defined as described in Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980). .
  • Yeast host cells include Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Komagataella, Saccharomyces, Schizocharomyces ( Schizosaccharomyces or Yarrowia cells, for example, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces Saccharomyces oviformis, Komagataella phaffii or Yarrowia lipolytica cells.
  • the fungal host cell may be a filamentous fungal cell.
  • “Filamented fungi” include all filamentous forms of the subphyla Mycobacterium and Ogymyota (as defined in Hawksworth et al., supra (1995)). Filamentous fungi are generally characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan and other complex polysaccharides. Vegetative growth is due to mycelial elongation, and carbon catabolism is absolutely aerobic. In contrast, vegetative growth by yeasts, such as Saccharomyces cerevisiae, is by germination of unicellular thallus, and carbocation can be fermentative.
  • Filamentous fungal host cells include Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus ( Coprinus), Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Mycelioptora, Neocalimastics (Neocallimastix), Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus ), Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes or Trichoderma cells can be
  • filamentous fungal host cells include Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus ), Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis Curry Guena (Ceriporiopsis caregiea), Ceriporiopsis gilvescens (Ceriporiopsis gilvescens), Ceriporiopsis pannocinta (Ceriporiopsis pannocinta), Ceriporiopsis ribulosa (Ceriporiopsis rivulosa), Ceriporiopsis sublupa (Ceriporiopsis) subrufa), Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chryso
  • the method for preparing the variant of the present application may include culturing a host cell.
  • the term "cultivation” means growing the host cell in an appropriately regulated environmental condition.
  • the culture process of the present application may be made according to an appropriate medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain. Specifically, the culture may be batch, continuous, and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term “medium” refers to a material in which nutrients required for culturing the host cells are mixed as a main component, and supplies nutrients and growth factors, including water, which are essential for survival and growth.
  • any medium and other culture conditions used for culturing the host cells of the present application may be used without particular limitation as long as they are conventionally used for culturing host cells. It can be cultured under aerobic conditions in a conventional medium containing phosphorus, inorganic compounds, amino acids and/or vitamins while controlling temperature, pH, and the like.
  • carbon source in the present application, carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrient sources such as starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sugar cane offal and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pre-treated molasses (i.e., converted to reducing sugar). molasses) may be used, and other appropriate amounts of carbon sources may be variously used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, and organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fish or its degradation products, defatted soybean cake or its degradation products can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but is not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt
  • the phosphorus may include potassium monobasic phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • potassium monobasic phosphate dipotassium phosphate
  • sodium-containing salt corresponding thereto.
  • sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and in addition, amino acids, vitamins and/or suitable precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, the present invention is not limited thereto.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like may be added to the medium in an appropriate manner to adjust the pH of the medium during culturing of the host cell.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester may be used to suppress bubble formation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injection of gas or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions. it is not
  • the temperature of the medium may be 20 °C to 55 °C, specifically 25 °C to 40 °C, but is not limited thereto.
  • the incubation period may be continued until a desired production amount of a useful substance is obtained, and specifically, it may be 24 hours to 196 hours, but is not limited thereto.
  • the method for producing the mutant polypeptide having the xylanase activity of the present application may further include recovering the mutant polypeptide having the xylanase activity of the present application expressed in the culturing step. have.
  • the mutant expressed in the culturing step may be recovered using a method known in the art to which the present invention pertains.
  • variants can be recovered from the nutrient medium by conventional procedures including, but not limited to, collection, centrifugation, filtration, extraction, spray-drying, evaporation or precipitation.
  • the recovery method may be to collect mutants using a suitable method known in the art according to the culture method of the host cell of the present application, for example, a batch, continuous, or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a crystallized protein precipitant (salting out method), extraction, ultrasonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity
  • chromatography methods such as island chromatography, HPLC, and methods thereof may be used in combination, and mutants may be recovered from the medium or host cells using a suitable method known in the art.
  • the mutant expressed by the host cell in the culture step may not be recovered.
  • the host cell itself expressing the variant may be used as a source of the variant.
  • composition of the present application may be used to decompose a xylan-containing material.
  • composition of the present application may be used to convert a xylan-containing material into xylose and/or xylo-oligosaccharide.
  • composition of the present application may further include other components in addition to the variant provided in the present application.
  • a person skilled in the art can appropriately select components to be added to the composition of the present application.
  • composition of the present application may further include any component suitable for converting a xylan-containing material into xylose and/or xylo-oligosaccharide.
  • composition of the present application may further include any component suitable for application in various industrial fields, such as animal feed, baking, biomass saccharification, and pulp bleaching.
  • substances that may be added include stabilizers, surfactants, builders, chelating agents, dispersants, enzymes, enzyme stabilizers, catalysts, activators, carriers, mixtures, lubricants, disintegrants, excipients, solubilizers, suspending agents, coloring agents, flavoring agents, buffering agents, preservatives, soothing agents, solubilizing agents, isotonic agents, stabilizing agents, diluents, lubricants, preservatives, and the like.
  • composition provided in the present application may further include a naturally occurring material or a non-naturally occurring material in addition to the variant provided in the present application.
  • composition provided in the present application further comprises an additional enzyme commonly used in various industrial fields, including animal feed, baking, biomass saccharification, pulp bleaching, etc. in addition to the variants provided in the present application.
  • an additional enzyme commonly used in various industrial fields including animal feed, baking, biomass saccharification, pulp bleaching, etc. in addition to the variants provided in the present application.
  • the additional enzymes are beta-amylase, cellulase (betaglucosidase, cellobiohydrolase and endoglucanase), glucoamylase, hemicellulase (endo-xylanase, ⁇ -xylosidase).
  • ⁇ -L-arabinofuranosidase ⁇ -D-glucuronidase
  • feruloyl esterase coumaroyl esterase
  • ⁇ -galactosidase ⁇ -gal those useful in commercial processes with lactosidase, ⁇ -mannanase or ⁇ -mannosidase
  • isoamylase isomerase
  • lipase phytase
  • protease pullulanase and/or alpha-amylase
  • Any one or more enzymes selected from the group consisting of outside enzymes may be further included.
  • the xylanase variant of the present application or a composition comprising the xylanase variant of the present application can be used to degrade any xylan-containing material.
  • a xylan-containing substance is any substance that can be degraded by xylanase.
  • the xylan-containing material may be hemicellulose.
  • the xylan-containing material may be a material selected from xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan, and xyloglucan.
  • the xylan-containing material may be xylan, but is not limited thereto.
  • the present application provides a method of degrading (or disintegrating) a xylan-containing material. This may also be referred to as solubilization of xylan and/or solubilization of pentosan.
  • the method relates to degradation (eg, degradation) of a polymer derived from xylan degradation.
  • Decomposition products eg, glucose
  • biofuel eg, bioethanol
  • biochemicals eg, biobased isoprene
  • Xylan may be degraded using the mutant of the present application, a host cell expressing the same, and a composition including the mutant and/or host cell.
  • a cofactor, a coenzyme, etc. may be added together in addition to the mutant of the present application.
  • the step of hydrolyzing the substrate may be performed under optimum pH, temperature conditions, etc., and appropriate conditions may be selected by a person skilled in the art.
  • xylanase variants of the present application can be used in any of the following applications:
  • grain-based substances eg they may be whole grains or parts of grains.
  • the xylanase variant of the present application may be used as a feedstock.
  • the xylan-containing material may be a feed ingredient or a feed ingredient.
  • the feed composition of the present application may mean any natural or artificial diet, one meal, etc. or components of the one meal meal suitable for or suitable for animal eating, ingestion, and digestion, and may be prepared in various forms known in the art. can be manufactured
  • the xylanase variant of the present application may be used in a food composition or its preparation.
  • the xylan-containing material may be a grain-based material (including whole grains or partial grains or malted grains such as malted barley).
  • the xylan-containing material may be wheat flour (eg, wheat, oat, rye or barley flour).
  • the xylan-containing material may be barley malt or saccharification liquid, or malted barley or a combination thereof.
  • the food composition may be a fermented beverage including beer and wine.
  • the food composition may be a bakery product including lobes, rolls, buns, pizzas, pretzels, tortillas, cakes, cookies, biscuits, and crackers. However, it is not limited thereto.
  • the xylanase variant of the present application can be used for wheat gluten-starch separation.
  • fractionation of wheat endosperm meal into starch and gluten fractions can be utilized to obtain high quality ⁇ -starch and by-products ⁇ -starch and active gluten.
  • the method comprises mixing wheat flour (eg wheat flour), water and a xylanase variant.
  • wheat flour eg wheat flour
  • the flour, water and xylanase variants may be mixed simultaneously or sequentially.
  • flour eg, wheat flour
  • water may be mixed prior to mixing with the xylanase variant.
  • Higher ⁇ -starch yields and/or higher quality gluten can be produced by applying the xylanase variants of the present application to wheat gluten-starch separation.
  • the xylanase variants of the present application can be used for the degradation of grain-based materials and used as part of a biofuel (eg, bioethanol) production process.
  • a biofuel eg, bioethanol
  • the xylanase variants of the present application may improve the production of biofuels (eg, bioethanol) and the use of grain-based materials in the biofuel industry.
  • biofuels eg, bioethanol
  • the biofuel and the xylanase variant may be used including mixing in liquefaction, saccharification, fermentation, simultaneous saccharification and before or during fermentation, and after fermentation, or a combination thereof.
  • the xylanase variant of the present application When the xylanase variant of the present application is applied to a biofuel production process, more dry matter saccharification solution can be used in the process; to obtain a higher solids content in the final syrup; better heat transfer; lower energy requirements; evaporator adhesion contamination is reduced; cleaning costs are reduced; the final fuel yield is increased; by-product quality is improved; easier separation of the solid and liquid fractions of the residue after distillation; or a combination of the above-mentioned advantages.
  • the xylanase variants of the present application can be used for pulp bleaching.
  • treatment with a xylanase variant with the colored lignin in the pulp linked to crystalline cellulose via the xylan can promote pulp bleaching by breaking down the xylan and releasing the colored lignin.
  • Orpinomyces Orpinomyces (Orpinomyces) sp.
  • the xylanase mutant (hereinafter, described as Op Xyn, SEQ ID NO: 1) gene (SEQ ID NO: 2) from the genomic DNA of the PC-2 strain was amplified and cloned into the pHCE vector (Takara) It was used as a template.
  • the xylanase mutant was prepared by PCR using a template, a primer, and a PCR premix (iNtRON, cat no. 25185). PCR was performed using an Eppendorf Mastercycler Nexus GX2, and reaction conditions were as follows.
  • the seven types of mutants made were ligated using the In-Fusion HD cloning kit (Takara, Cat. No. 639650), and then, the sequence mutation was confirmed by sequencing after transformation into the E. coli Dh5 ⁇ strain. .
  • the E. coli Dh5 ⁇ strain each transformed with the mutant prepared in Example 1 and the Op Xyn gene, was inoculated into a sterile LB medium (BD Difco), cultured at 37° C. and 180 rpm for 24 hours, and then centrifuged through centrifugation. was recovered. 20 ml of lysis buffer (lysis buffer: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM imidazole) was added to the recovered cells for redispersion, and then the crude enzyme solution was obtained through sonication and centrifugation. The crude enzyme solution was flowed to Ni-NTA resin (Qiagen, Cat no.
  • the concentration of the enzyme was obtained by mixing 4 ⁇ l of diluted enzyme solution + 196 ⁇ l of Bradford solution (Quick StartTM Bradford 1x Dye Reagent, #5000205) and then measuring absorbance at 595 nm.
  • the enzyme titer was obtained by mixing 4 ⁇ l of 1M pH 6.5 phosphate buffer in 96 ⁇ l of 1% xylan from beachwood, Megazyme, P-XYLNBE-10G, and then mixing 100 ⁇ l of the diluted enzyme solution, 37°C. The reaction was carried out for 15 minutes and measured. The reaction was stopped by mixing 300 ⁇ l of DNS solution with the reaction solution, boiled for 7 minutes to develop color, and then cooled in ice water. Herein, the absorbance at 550 nm of the solution mixed with 500 ⁇ l distilled water was measured, and the titer was measured using a standard curve made of xylose (xylose, Sigma-Aldrich, X1500).
  • the DNS solution preparation method is as follows. In a beaker containing 500 ml of distilled water, 6.3 g of 3,5-dinitrosalicylic acid (3,5-dinitrosalicylic acid, samchun, D1267) was added, the temperature was adjusted to 50 °C, and 21 g of sodium hydroxide (Daejung, 7571) -4400) was added.
  • the purified enzyme was diluted to a concentration of 0.5 mg/ml, incubated in a water bath at 70° C. for 10 minutes, and then the residual titer was measured.

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Abstract

본 출원은 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드
본 출원은 자일라나제(Xylanase) 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
자일라나제(Xylanase; EC 3.2.1.8)는 식물 세포벽 성분인 자일란(xylan)의 β-1,4 backbone을 무작위적으로 분해하는 가수분해효소이다. 자일라나제는 주로 동물 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등의 분야에서 바이오매스를 분해하는 데 사용된다(Beg QK, Kapoor M, Mahajan L, Hoondal GS. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Aug;56(3-4):326-38. doi: 10.1007/s002530100704. PMID: 11548999.)
이와 같이, 다양한 분야에서 사용되는 자일라나제의 사용 편리를 위해, 가혹조건(고온, 염기성 조건)에서의 내성 및 활성이 요구되고 있으나, 대부분의 자일라나제는 낮은 pH 조건(4.0 ~ 6.0) 및 낮은 열안정성으로 인해 다양한 분야에 적용하기 어려운 문제점이 있다.
본 출원의 하나의 목적은 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 자일란-함유 물질과 반응을 위한, 상기 변이형 폴리펩티드 또는 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 자일란-함유 물질과 접촉시키는 것을 포함하는, 자일란-함유 물질 분해 방법; 및/또는 자일로올리고당 및/또는 자일로스를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 구조체를 포함하는 벡터; 및/또는 상기 폴리뉴클레오티드, 핵산 구조체 또는 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 상기 변이형 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드는 다양한 산업 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 출원의 변이형 폴리펩티드의 열안정성을 확인한 결과이다.
본 출원의 하나의 양태는 자일라나제의 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드이다.
하나의 구체예로서, i) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1과 70% 이상, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이고; 및/또는
ii) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
iii) 상기 변이형 폴리펩티드는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
iv) 상기 변이형 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 iii) 폴리펩티드의 기능적 단편이고; 및
상기 변이형 폴리펩티드는 하기에서 선택된 어느 하나의 변형(modification)을 포함한다:
3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 하나 이상의 위치의 아미노산에서의 다른 아미노산으로의 치환(substitution), 디설파이드(disulfide) 결합 형성, 및 이의 조합;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변형 전 3번 아미노산은 아르기닌(R); 5번 아미노산은 세린(S); 20번 아미노산은 페닐알라닌(F); 34번 아미노산은 세린(S); 36번 아미노산은 쓰레오닌(T); 및/또는 41번 아미노산은 알라닌(A)인 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것일 수 있다:
i) 3+36;
ii) 5+34;
iii) 20+41;
iv) 3+36+5+34;
v) 3+36+20+41;
vi) 5+34+20+41; 및
vii) 3+36+5+34+20+41;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드의 각 위치의 변형은 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있다:
i) 3번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
ii) 5번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
iii) 20번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
iv) 34번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
v) 36번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및
vi) 41번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치이다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것일 수 있다:
R3C+T36C;
S5C+S34C;
F20C+A41C;
R3C+T36C+S5C+S34C;
R3C+T36C+F20C+A41C;
S5C+S34C+F20C+A41C; 및
R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 2개 이상의 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드(disulfide) 브리지를 형성하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 3번 및 36번 아미노산 쌍; 5번 및 34번 아미노산 쌍; 및/또는 20번 및 41번 아미노산 쌍의 시스테인으로의 치환, 및 상기 아미노산 쌍이 디설파이드 브리지를 형성하는 변형을 포함하는 것일 수 있다.
상기 구체예 중 어느 하나의 구체예로서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 비하여 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이형 폴리펩티드 및/또는 본 출원의 변이형 폴리펩티드를 포함하는 자일란-함유 물질과의 반응용 조성물이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 자일란-함유 물질과의 반응을 위한, 상기 변이형 폴리펩티드 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물의 용도이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 자일란-함유 물질을 접촉시키는 것을 포함하는, 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)을 제조하는 방법이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 자일란-함유 물질에 처리시키는 것을 포함하는, 자일란-함유 물질을 분해하는 방법이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 핵산 구조체를 포함하는 벡터이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 핵산 구조체, 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주세포이다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는, 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법이다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 관사("a", "an", 및 "the")에는 문맥상 명백하게 다르게 언급되지 않는 한 복수의 참조대상이 포함된다. 문맥상 달리 언급되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고 복수형 용어는 단수형을 포함한다. 본 출원의 명세서 및 첨부된 청구범위에서, 달리 언급되지 않는 한, "또는"의 사용은 "및/또는"을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약(about)"은 특정 숫자 값 앞에 제시될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서, 용어 "제1, 제2, 제3…" "i), ii), iii)…" 또는 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 기재는 유사한 구성을 구별하기 위해 사용되었으며, 이들 용어는 연속적이거나 순서대로 수행되는 것을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 상기 용어가 방법, 용도 또는 분석의 단계(step)와 관련하여 사용되었을 경우, 이들 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간, 수 일, 또는 수 개월 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 본 출원에서 청구하는 대상의 특징이 불특정 성분의 존재에 실질적으로 영향을 받지 않는 경우, 상기 불특정 성분이 존재할 수 있음을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "이루어지는(consisting of)"은 특정 성분(들)의 비율이 총 100%인 것을 의미한다. 용어 "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있다. 일부 구체예에서, "이루어지는" 이하에 오는 성분 또는 특징 외에, 다른 임의의 성분 또는 필수적이지 않은 성분은 배제될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 용어 이하에 기재되는 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재를 의미하며, 하나 이상의 특징, 단계 또는 구성 요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 본 출원에서 "포함하는" 이하에 기재되는 성분 또는 특징은 필수적이거나 의무적인 것일 수 있으나, 일부 구체예에서는 다른 임의의 혹은 필수적이지 않은 성분 또는 특징을 더 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "포함하는" 은, 일부 구체예에서, "본질적으로 이루어지는" 또는 "이루어지는"을 지칭하는 것으로 수정될 수 있다.
본 출원에서 아미노산 서열과 관련하여, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "포함하는" 폴리펩티드, 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열로 "이루어진" 폴리펩티드, 또는 특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 "갖는" 폴리펩티드 또는 단백질이라고 기재되어 있더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단 그리고/또는 C-말단에 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 연속적인 아미노산 잔기의 폴리머 또는 올리고머를 의미한다. 본 출원에서, "폴리펩티드", "단백질", 및 "펩티드"는 "아미노산 서열"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
경우에 따라, 활성을 나타내는 아미노산 서열은 "효소"로 지칭할 수 있다. 본 출원에서, 아미노산 서열은 달리 표시되지 않는 한, N-말단 → C-말단 배향으로 기재된다.
세포, 핵산, 폴리펩티드, 또는 벡터와 관련하여, 본 출원에서 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 폴리펩티드 또는 벡터가 이종(heterologous) 핵산 또는 폴리펩티드의 도입 또는 천연 핵산 또는 폴리펩티드의 변경에 의해 변형된 것, 또는 세포가 그렇게 변형된 세포로부터 유도되는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 발현되거나 전혀 발현되지 않는, 다르게는 비정상적으로 발현되는 천연 유전자를 발현할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "분리된(isolated)"은 자연적으로 발생하지 않는 환경에 존재하거나 혹은 자연적으로 존재하지 않는 형태의 물질을 지칭한다. 이는 자연에서 자연적으로 회합되어 있고 자연에서 발견되는 것과 같은 물질, 예를 들어 서열, 효소 또는 핵산을 갖는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 상기 물질(서열, 효소 또는 핵산)이 적어도 실질적으로 유리되는 것을 포함한다.
예를 들어, 본 출원에서 제공하는 분리된 서열, 효소 또는 핵산은 하나 이상의 오염물질이 실질적으로 없는 형태로 제공될 수 있다.
분리된 물질의 예시는 i) 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 임의의 물질, ii) 자연 상태에서 결합되어(associated) 있는 하나, 그 이상, 또는 모든 자연적으로 발생하는 구성이 제거된 임의의 물질(예를 들어, 효소, 변이체, 핵산, 단백질, 펩타이드 또는 보조인자(cofactor)), iii) 자연에서 발견되는 물질이 인위적으로 변형된 임의의 물질, 또는 iv) 자연적으로 결합된 다른 구성성분에 비해 그 물질의 양을 변경하도록 변형된 물질(예를 들어, 특정 물질을 코딩하는 유전자 카피수 증가; 특정 물질을 코딩하는 유전자와 자연적으로 연결된 프로모터를 활성이 강한 프로모터로 변형 등)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, 용어 "야생형"은 인위적인 변형을 가지지 않는 천연형(naturally-occurring)인 것을 의미한다. 상기 용어 "야생형"이 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 천연형(naturally occurring) 폴리펩티드로, 하나 이상의 아미노산 위치에서 인위적인 변이(치환, 삽입, 결실 등)를 갖지 않는 것을 의미한다. 이와 유사하게, 용어 "야생형"이 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용되는 경우, 하나 이상의 뉴클레오티드의 인위적인 변형(치환, 삽입, 결실)을 갖지 않는 것을 의미한다. 그러나 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연형 폴리뉴클레오티드에 제한되지 않으며, 임의의 야생형 폴리펩티드를 코딩하는 서열도 포함한다.
본 출원에서, 모서열(parent sequence) 또는 골격(backbone)이란 변형(modification)를 도입하여 변이형 폴리펩티드가 되는 기준 서열을 의미한다. 즉, 모서열은 시작 서열(starting sequence)로서 치환, 삽입 및/또는 결실 등의 변이를 도입하는 대상일 수 있다. 상기 모서열은 천연형(naturally occurring) 혹은 야생형(wild type)일 수 있고, 또는 상기 천연형 또는 야생형에 하나 이상의 치환, 삽입 또는 결실이 발생한 변이체(variant)이거나, 또는 인위적으로 합성된 서열일 수 있다. 상기 모서열이 활성을 나타내는 아미노산 서열, 즉 효소의 아미노산 서열인 경우 모효소(parent enzyme)로 칭할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "참조 서열(reference sequence)"은 임의의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 사용되는 서열을 의미한다. 임의의 아미노산 서열과 참조 서열을 정렬(align)하여, 임의의 아미노산 서열 내에서 참조 서열의 특정 위치에 대응하는 아미노산의 위치를 결정할 수 있다.
본 출원에서 아미노산 또는 핵산 서열과 관련하여, 용어 "단편"은 모서열(parent sequence)의 일부를 의미한다. 예를 들어, 모서열에서 하나 이상의 아미노산이 C 또는 N 말단에서 제거된 형태의 폴리펩티드일 수 있다.
본 출원에서, 효소의 "단편"은 "기능적 단편(functional fragment)"을 지칭하는 것일 수 있다. "기능적 단편"은 활성 단편(active fragment)으로도 지칭될 수 있으며, 모효소의 일부이면서 모효소의 효소 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 효소의 기능적 단편은 효소의 활성 부위(catalytic site)를 포함하는 것일 수 있다.
효소의 단편은 모효소의 전장(full length)의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 모효소의 전장의 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상, 100% 미만의 아미노산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서, "변이/변형시키는(modifying)"은 변화(changing) 또는 변경(altering)시키는 것을 의미한다. 이는 자연적으로 발생하는 것으로부터의 변경일 수 있다. 일 예로, 효소가 모서열 또는 참조 서열로부터 변경되게 하는 방식으로 효소를 변화시킬 수 있다.
본 출원에서, 변형된 효소는 그 자체로 자연에 존재하지 않는, 즉 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring) 효소일 수 있다.
본 출원에서 용어, "변형된(modified)"은, 예를 들어 그의 자연적으로 발생하는 형태로부터 변경된 것을 의미한다. 본 출원의 변형된 효소는 자연적으로 발생하지 않는 효소 또는 자연적으로 발생하는 변이체를 포함한다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자연에서 발견되지 않은 변형된 효소이다. 일 예로, 본 출원의 변형된 효소는 자발적으로(spontaneously) 발생되지 않은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "변형(modification)"이 아미노산/핵산 서열과 관련하여 사용되는 경우, 아미노산 서열에서 하나 이상의 부위에서 상이한 아미노산/핵산 잔기에 대한 모서열의 아미노산/핵산 잔기의 치환(substitution), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 결실(deletion), 하나 이상의 부위에서 모서열의 아미노산/핵산 잔기(또는 일련의 아미노산/핵산 잔기)의 삽입(insertion), N-말단 및/또는 C-말단의 아미노산 서열 또는 5' 및/또는 3' 핵산 서열의 절단(truncation), 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 효소의 "변이체(variant)" 또는 "변이형 폴리펩티드(modified polypeptide)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 모효소와 상이한 단백질을 지칭한다. "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 상기 변이체 또는 변이형 폴리펩티드는 자연적으로 발생하지 않는(non-naturally occurring)것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 변이체는 하나 이상의 변형, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 모효소의 서열과 상이하다.
이러한 변이체는 일반적으로 상기 모효소에서 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 모효소에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다.
또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다.
용어 "변이체" 또는 "변이형 폴리펩티드"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다.
변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
본 출원 명세서 전반에서, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 출원에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 라이신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
한편, 임의의 아미노산은 Xaa, X로 기재할 수 있다.
또한, 천연적으로 존재하는 아미노산뿐만 아니라 Aib(2-Aminoisobutyric acid), Sar(N-methylglycine), 알파-메틸-글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용될 수 있다.
아미노산은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 분류할 수 있다. 이에, 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다.
예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 비극성 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
본 출원에서 용어, "유전자(gene)"는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 상기 코딩 영역의 앞뒤의 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 구체예에서, 유전자는 각각의 코딩 영역(엑손; exon) 사이에 삽입되는 서열(인트론; intron)을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성(homology)" 또는 "동일성(identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO et al.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 츨원에서, 용어 "성숙 폴리펩티드(mature polypeptide)"는 신호 서열(signal sequence) 또는 프로펩타이드 서열(propeptide sequence)이 없는 형태의 폴리펩티드를 의미한다. 성숙 단백질/폴리펩티드/펩티드는, 단백질/폴리펩티드/펩티드의 기능적 형태일 수 있다. 성숙 폴리펩티드는 번역 이후, 또는 번역 후 변형을 거친 최종(final form) 형태일 수 있다. 번역 후 변형의 예시로는 N-또는 C-말단 변형, 글리코실화, 인산화, 리더 서열(leader sequence) 제거 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 용어, "핵산 구조체(nucleic acid construct)"는, 하나 이상의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하고, 인위적으로 합성되거나, 자연계에 존재하지 않는 방법으로 특정 서열을 포함하도록 조작되거나, 자연으로부터 분리된 단일 혹은 이중가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 용어, "발현"은 폴리펩티드의 생성에 관여하는 임의의 단계, 예를 들어 전사, 전사 후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "발현 벡터"는 코딩 서열 및 이의 발현을 위해 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 선형 혹은 환형 핵산 분자를 의미한다.
본 출원에서 용어, "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 조절 서열이 적절한 위치에 배치되는 구성을 의미한다. 따라서 "작동가능하게 연결된"은, 프로모터, 종결자, 신호 서열 또는 인핸서 영역과 같이 알려진 혹은 원하는 활성을 가진 기능적 도메인의 조절 영역이 타겟(유전자 또는 폴리펩티드)의 발현, 분비 또는 기능을 상기의 알려진 혹은 원하는 활성에 따라 조절할 수 있도록 그 타겟에 부착되거나 연결된 것을 포함한다.
본 출원에서 용어, "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 얻을 수 있는 성숙된, 스플라이싱된 mRNA 분자로부터 역전사를 통해 제조될 수 있는 DNA 서열을 의미한다. cDNA 서열은 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열을 포함하지 않는다. 초기 1차 RNA 전사체는 스플라이싱을 포함한 일련의 단계를 통해 처리되어 성숙된 스플라이싱된 mRNA로 나타나기 전 mRNA의 전구체이다.
본 출원에서 용어, "조절 서열(regulatory sequence)"은 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 각각의 조절 서열은 코딩 서열에 대해 천연형이거나(기원이 동일함) 또는 외래(foreign; 다른 유전자에서 유래함) 서열일 수 있다. 상기 조절 서열의 예시는 리더 서열(leader sequence), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 프로펩타이드 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 번역 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 조절 서열의 최소 단위는 프로모터, 전사 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체를 기재하기 위해, 하기의 명명법이 사용된다.
본 출원에서 아미노산 서열의 특정 위치를 지칭하는 것은, 그 위치에 존재하거나 치환되는 아미노산을 지칭하는 것을 포함할 수 있다. 특정 위치의 아미노산을 지칭하는 것은 다양하게 기재할 수 있다. 예를 들어, "003번 위치"는 "3번 위치", "3번 아미노산", "3번째 아미노산"과 같이 기재할 수 있다. 또한, 예를 들어, 3번째 위치에 있는 아미노산이 아르기닌(R)인 경우 이를 "R3" 또는 "Arg3"와 같이 기재할 수 있다.
아미노산의 치환은 치환 전의 아미노산, 위치, 치환되는 아미노산 순으로 기재함으로써 표현할 수 있다. 상기 아미노산은 통상의 1문자 및 3문자 코드를 사용하여 표현할 수 있다. 일 예로, 특정 서열의 5번 위치의 아미노산인 세린이 시스테인으로 치환되는 경우 "S5C" 또는 "Ser5Cys"와 같이 기재할 수 있다.
특정 위치에서 임의의 아미노산은 "X"로 지칭할 수 있다. 예를 들어 X6은 6번 위치의 임의의 아미노산을 칭한다. 또한 치환되는 아미노산을 X로 표기하는 경우, 치환 전에 존재하는 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어 "V6X"는 6번 위치에서 V가 V가 아닌 임의의 아미노산으로 치환되는 것을 나타낸다.
"/" 또는 "," 기호를 이용해 여러 종류의 아미노산을 동시에 기재함으로써 서로 다른 변형(different alternation)을 표현할 수 있다. 예를 들어 20번 위치의 아미노산(F)이 S 또는 C로 치환된 것은 F20S/C 또는 F20S,C 로 혼용되어 기재될 수 있다. 다른 예로, F/S20C는 치환 전의 20번 위치의 아미노산 F 또는 S가 C로 치환되는 것을 의미한다.
다중 변이는 "+"를 이용하여 기재할 수 있다. 예를 들어, "R3C+T36C"와 같은 기재는 각각 3번 위치의 아미노산인 아르기닌이 시스테인으로, 8번 위치의 아미노산인 쓰레오닌이 시스테인으로 치환되는 것을 의미한다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
본 출원에서 임의의 아미노산 서열 내 아미노산의 위치(position)를 결정하는 데 서열번호 1이 참조 서열(reference sequence)로 사용될 수 있다.
즉, 본 출원에서 개시하는 서열번호 1는 임의의 자일라나제 활성을 가지는 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기를 결정하기 위해 사용될 수 있으며, 본 출원에서 달리 지칭하지 않는 한, 특정 아미노산 서열의 잔기는 서열번호 1을 기준으로 넘버링된다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한 다중 서열 정렬(Multiple sequence alignment)을 통해 다른 자일라나제에서 상응하는 아미노산 잔기를 식별할 수 있다. 당업계에 알려진 다중 서열 정렬 프로그램의 예시로 MUSCLE (multiple sequence comparison by log-expectation; 3.5 버전 이상; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (6.857 버전 이상; Katoh and Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900) 등의 프로그램 및 ClustalW를 사용하는 EMBOSS EMMA (1.83 이상; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22 : 4673-4680) 등이 있으며, 상기 프로그램 각각의 기본 매개 변수를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
그 외에, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드로부터 갈라져 나온 효소가 종래의 서열 기반 비교로 그들의 관계를 검출하지 못하게 되는 경우, 그 밖의 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘이 사용될 수 있다(Lindahl and Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615). 데이터베이스를 검색하기 위한 폴리펩티드 패밀리(프로파일)의 확률론적 표시를 이용하는 검색 프로그램을 사용하여, 서열 기반 검색에서 보다 높은 민감도(sensitivity)를 얻을 수 있다. 예를 들어, PSI-BLAST 프로그램은 반복적인 데이터베이스 검색 과정을 통하여 프로파일을 산출하고, 관계도가 낮은 상동체(remote homolog)를 검출할 수 있다(Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). 폴리펩티드에 대한 패밀리 또는 슈퍼패밀리가 단백질 구조 데이터베이스에서 1개 이상의 표시를 가지는 경우, 훨씬 더 큰 민감성이 달성될 수 있다. GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881)와 같은 프로그램은 쿼리 시퀀스(query sequence)에 대한 구조적 폴딩을 예측하는 신경망에 대한 입력으로 PSI-BLAST, 2차 구조 예측, 구조 정렬 프로파일 및 용매화 포텐셜과 같은 다양한 소스로부터의 정보를 이용한다. 유사하게는, 구조를 알 수 없는 서열과 SCOP 데이터베이스에 존재하는 슈퍼패밀리 모델을 정렬하기 위해 Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919의 방법이 사용될 수 있다. 이들 정렬은 폴리펩티드에 대한 상동성 모델을 만들기 위해 차례로 사용될 수 있고, 이러한 모델은 그 목적을 위해 개발된 다양한 툴을 사용하여 정확성에 대해 평가될 수 있다.
공지된 구조의 단백질에 대해, 구조적 정렬을 검색하고 만들어내는 데 몇몇의 툴 및 리소스가 이용될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 SCOP 슈퍼패밀리는 구조적으로 정렬되었고, 이 정렬은 접근 및 다운로드 가능하다. 둘 이상의 단백질 구조는 거리행렬 정렬(distance alignment matrix) (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) 또는 CE(Combinatiorial extension) Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747)와 같은 다양한 알고리즘을 사용하여 정렬될 수 있다. 이들 알고리즘의 구현은 가능한 구조적 상동체를 발견하기 위해, 대상 구조를 가지는 구조 데이터베이스를 질의하기 위해 추가적으로 이용될 수 있다(Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
상기의 방법들은 하나의 예시로, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 출원의 구체예를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 출원에서, 자일라나제는 자일란에서 1,4-베타-D-자일로시딕(1,4-beta-D-xylosidic) 결합의 내향 가수분해(endohydrolysis)를 촉매하는 효소를 의미한다. 그 예로, EC 번호가 3.2.1.8인 효소 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 자일라나제 활성은 본 출원에 기재된 실시 양태를 포함하여, 당업계에 공지된 방법을 사용함으로써 측정 및 평가할 수 있다.
본 출원에서 "모(Parent) 자일라나제"는 본 출원의 변이체 또는 변이형 폴리펩티드를 생산하기 위하여 변형이 가해지는 자일라나제를 의미한다. 구체적으로는, 모 자일라나제, 모 효소 또는 모서열은 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 또는 야생형 폴리펩티드일 수 있고, 이의 성숙 폴리펩티드일 수 있으며, 이의 변이체 또는 기능적 단편을 포함할 수 있으나, 자일라나제 활성을 갖고 변이체의 모체가 될 수 있는 폴리펩티드라면 이에 제한되지는 않는다.
본 출원에서 제공하는 모 자일라나제는, 이에 제한되지는 않으나 서열번호 1의 폴리펩티드인 것일 수 있다. 또한, 자일라나제 활성을 갖는 한, 서열번호 1의 폴리펩티드와 약 60%, 70%, 75%. 80%. 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 모 자일라나제의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체의 모 자일라나제는, Orpinomyces sp., Neocallimastix sp., Piromyces sp., Ruminococcus sp. 유래일 수 있다. 구체적으로 Orpinomyces sp. 유래일 수 있다.
한편 전술한 미생물은 본 출원에서 제공하는 자일라나제가 유래될 수 있는 미생물의 일 예시로, 미생물의 명칭과 관계없이 그와 분류학적으로 상동인 미생물로부터 유래하는 것도 포함한다.
전술한 미생물은 ATCC, DSMZ, CBS, NRRL, KCTC, KCCM과 같은 공지된 미생물 기탁기관에서 분양받을 수 있다.
본 출원에서, 특정 미생물에서 "유래하는(derived from)" 서열은 그 미생물에서 자연적으로 제조되거나 제조 가능한 것에 제한되지 않고, 그 유전자를 포함하는 미생물에서 제조되고 분리되는 유전자에 의해 코딩되는 서열도 포함한다.
예를 들어, Orpinomyces sp. 유래 자일라나제는 Orpinomyces 속 미생물에서 자연적으로 생산되는 자일라나제 활성을 갖는 효소뿐만 아니라 Orpinomyces 속 미생물에서 생산되는 것, 그리고 당업계에 공지된 유전적 변형(예를 들면, 상기 효소를 코딩하는 서열로 형질전환)을 통해 다른 숙주세포에서 생산되는 것 또한 포함한다.
본 출원에서 "자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드"는 모 자일라나제의 변이체일 수 있다.
본 출원에서 용어, "모 자일라나제의 변이체" 또는 "자일라나제 변이체"는 하나 이상의 아미노산이 모 자일라나제의 아미노산 서열과 상이하고, 자일라나제의 활성을 갖는 단백질을 지칭한다.
상기 "자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드", "모 자일라나제의 변이체"와 "자일라나제 변이체"는 혼용 가능하다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 변형은 아미노산의 치환 및/또는 디설파이드 결합 형성일 수 있다.
또한, i) 상기 변이체는 서열번호 1과 70% 이상, 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드이고; 및/또는 ii) 상기 변이체는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iii) 상기 변이체는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는 iv) 상기 변이체는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 ii) 폴리펩티드의 기능적 단편일 수 있다.
구체적으로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 자일라나제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지는 것일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 자일라나제 활성을 가지면서, 모 자일라나제 서열에서 하나 이상의 아미노산의 변형(modification)을 포함하여 모 자일라나제 대비 하나 이상의 변경된 기능 또는 특성을 가지고, 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 모 자일라나제의 변이체로서, 자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 위치에 상응하는 1개 이상의 위치에서의 변형(modification)을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 하기 i) 내지 vii)에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것일 수 있다:
i) 3+36;
ii) 5+34;
iii) 20+41;
iv) 3+36+5+34;
v) 3+36+20+41;
vi) 5+34+20+41; 및
vii) 3+36+5+34+20+41.
본 출원에서 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치로, "상응하는" 은 상기에서 설명한 바와 같다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3, S5, F20, S34, T36, 및 A41 중 1개 이상에 상응하는 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변형 전 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산은 아르기닌(R); 5 번 위치에 상응하는 아미노산은 세린(S); 20 번 위치에 상응하는 아미노산은 페닐알라닌(F); 34 번 위치에 상응하는 아미노산은 세린(S); 36 번 위치에 상응하는 아미노산은 쓰레오닌(T); 및/또는 41 번 위치에 상응하는 아미노산은 알라닌(A)일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 34번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 36번 위치에 상응하는 아미노산의 G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 치환을 포함할 수 있으며, 구체적으로 S, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 41번 위치에 상응하는 아미노산의 G, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, 또는 H로의 구체적으로 S, T, C, Y, N, 또는 Q로의 치환을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 C로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 5번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 20번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 34번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 36번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 41번 위치에 상응하는 아미노산의 극성 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3C, S5C, F20C, S34C, T36C 및 A41C 중 1 이상의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 R3C, S5C, F20C, S34C, T36C 및 A41C 중 2 이상의 치환을 포함할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다:
R3C+T36C;
S5C+S34C;
F20C+A41C;
R3C+T36C+S5C+S34C;
R3C+T36C+F20C+A41C;
S5C+S34C+F20C+A41C;
R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C.
구체적으로, 서열번호 1의 R3C+T36C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 3으로 표시될 수 있으며, 서열번호 1의 S5C+S34C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 5로 표시될 수 있으며, 서열번호 1의 F20C+A41C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 7로 표시될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 전술한 변형의 모든 가능한 조합을 포함한다.
예를 들어, 상기 변이체는 전술한 변형의 조합으로 하기에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것일 수 있다:
3
5
20
34
36
41
3 + 5
3 + 20
3 + 34
3 + 36
3 + 41
5 + 20
5 + 34
5 + 36
5 + 41
20 + 34
20 + 36
20 + 41
34 + 36
34 + 41
36 + 41
3 + 5 + 20
3 + 5 + 34
3 + 5 + 36
3 + 5 + 41
3 + 20 + 34
3 + 20 + 36
3 + 20 + 41
3 + 34 + 36
3 + 34 + 41
3 + 36 + 41
5 + 20 + 34
5 + 20 + 36
5 + 20 + 41
5 + 34 + 36
5 + 34 + 41
5 + 36 + 41
20 + 34 + 36
20 + 34 + 41
20 + 36 + 41
34 + 36 + 41
3 + 5 + 20 + 34
3 + 5 + 20 + 36
3 + 5 + 20 + 41
3 + 5 + 34 + 36
3 + 5 + 34 + 41
3 + 5 + 36 + 41
3 + 20 + 34 + 36
3 + 20 + 34 + 41
3 + 20 + 36 + 41
3 + 34 + 36 + 41
5 + 20 + 34 + 36
5 + 20 + 34 + 41
5 + 20 + 36 + 41
5 + 34 + 36 + 41
20 + 34 + 36 + 41
3 + 5 + 20 + 34 + 36
3 + 5 + 20 + 34 + 41
3 + 5 + 20 + 36 + 41
3 + 5 + 34 + 36 + 41
3 + 20 + 34 + 36 + 41
5 + 20 + 34 + 36 + 41
3 + 5 + 20 + 34 + 36 + 41
또 하나의 예로, 상기 변이체는 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: i) 3번 아미노산의 시스테인으로의 치환; ii) 5번 아미노산의 시스테인으로의 치환; iii) 20번 아미노산의 시스테인으로의 치환; iv) 34번 아미노산의 시스테인으로의 치환; v) 36번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및 vi) 41번 아미노산의 시스테인으로의 치환.
또 하나의 예로, 상기 변이체는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 변형을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
R3C
S5C
F20C
S34C
T36C
A41C
R3C + S5C
R3C + F20C
R3C + S34C
R3C + T36C
R3C + A41C
S5C + F20C
S5C + S34C
S5C + T36C
S5C + A41C
F20C + S34C
F20C + T36C
F20C + A41C
S34C + T36C
S34C + A41C
T36C + A41C
R3C + S5C + F20C
R3C + S5C + S34C
R3C + S5C + T36C
R3C + S5C + A41C
R3C + F20C + S34C
R3C + F20C + T36C
R3C + F20C + A41C
R3C + S34C + T36C
R3C + S34C + A41C
R3C + T36C + A41C
S5C + F20C + S34C
S5C + F20C + T36C
S5C + F20C + A41C
S5C + S34C + T36C
S5C + S34C + A41C
S5C + T36C + A41C
F20C + S34C + T36C
F20C + S34C + A41C
F20C + T36C + A41C
S34C + T36C + A41C
R3C + S5C + F20C + S34C
R3C + S5C + F20C + T36C
R3C + S5C + F20C + A41C
R3C + S5C + S34C + T36C
R3C + S5C + S34C + A41C
R3C + S5C + T36C + A41C
R3C + F20C + S34C + T36C
R3C + F20C + S34C + A41C
R3C + F20C + T36C + A41C
R3C + S34C + T36C + A41C
S5C + F20C + S34C + T36C
S5C + F20C + S34C + A41C
S5C + F20C + T36C + A41C
S5C + S34C + T36C + A41C
F20C + S34C + T36C + A41C
R3C + S5C + F20C + S34C + T36C
R3C + S5C + F20C + S34C + A41C
R3C + S5C + F20C + T36C + A41C
R3C + S5C + S34C + T36C + A41C
R3C + F20C + S34C + T36C + A41C
S5C + F20C + S34C + T36C + A41C
R3C + S5C + F20C + S34C + T36C + A41C
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 1의 3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 2 이상의 위치에 상응하는 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 3번 및 36번 아미노산 쌍; 5번 및 34번 아미노산 쌍; 및/또는 20번 및 41번 아미노산 쌍이 시스테인으로 치환되어, 상기 아미노산 쌍이 디설파이드 브리지를 형성하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 모 자일라나제; 이의 성숙 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 핵산염기 서열과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 핵산염기 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 1의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 2로 표시되는 핵산염기 서열과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는, 99% 이상 및 100% 미만인 핵산염기 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열에서, 3번, 5번, 20번, 34번, 36번 및 41번 아미노산 중 하나 이상의 위치의 아미노산은 고정되고, 상기 서열번호의 아미노산 서열, 이의 성숙 폴리펩티드 또는 이의 기능적 단편과 약 60% 이상, 예를 들어, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드일 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는, 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원의 서열번호 1의 R3C+T36C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 4로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원의 서열번호 1의 S5C+S34C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 6로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원의 서열번호 1의 F20C+A41C 치환을 포함하는 변이체는 서열번호 8로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체는 다른 자일라나제, 예를 들어 야생형 자일라나제, 모 자일라나제, 다른 자일라나제 변이체 등과 비교하여, 선택되거나 검출될 수 있는 폴리펩티드의 임의의 특성 또는 속성이 1 이상 변경된 것일 수 있다.
상기의 특성 또는 속성에는, 산화 안정성, 기질 특이성, 촉매 활성, 열 안정성, 알칼리 안정성, pH 활성 프로파일, 단백질분해에 대한 내성, Km, kcat, kcat/Km 비율, 단백질 접힘, 면역 반응 유도, 리간드에 결합하는 능력, 수용체에 결합하는 능력, 분비되는 능력, 세포의 표면에 전시되는 능력, 올리고머를 형성하는 능력, 신호를 보내는 능력, 세포 증식을 촉진하는 능력, 세포 증식을 억제하는 능력, 세포자멸사를 유도하는 능력, 인산화 또는 글리코실화에 의해 개질되는 능력, 및/또는 질환을 치료하는 능력이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모서열에 비해 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것일 수 있다.
본 출원에서, "효소활성(enzymatic activity)"은 적어도 하나의 촉매 활성(catalytic activity)을 나타낸다. 구체적으로는 kcat/Km으로 주로 표현되는 효소의 전환 효율일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
kcat는 효소가 기질로 완전히 포화되었을 때, 한 개의 효소에 의한 단위시간에 생성물로 전환하는 속도상수(catalytic constant)를 의미하며, 전환수(turnover number)라고도 칭해진다. Km은 반응속도가 최고값(Vmax)의 절반일 때의 기질 농도(substrate concenstration)이다.
효소 활성을 표현하는 방법의 예시로, 특이적 활성(specific activity; umol of converted substrate x mg -1 x min -1) 또는 volumetric activity (umol of converted substrate x mL -1 x min -1)등이 있다.
다만 효소활성을 정의하는 것은 전술한 내용에 제한되지 않고, Irwin H. Segel, Enzyme kinetics, John Wiley & Sons, 1979; A. G. Marangoni, Enzyme kinetics, Wiley-Interscience, 2003; A. Fersht, Enzyme structure and mechanisms, John Wiley & Sons, 1981; Structure and Mechanism in Protein Science: A guide to enzyme catalysis and protein folding, Alan Fersht, W.H. Freeman, 1999; Fundamentals of Enzyme Kinetics, Athel Cornish-Bowden, Wiley-Blackwell 2012 and Voet ef al., "Biochemie" [Biochemistry], 1992, VCH-Verlag, Chapter 13, pages 331-332 with respect to enzymatic activity 등에 알려진 내용을 토대로 정의하고 평가할 수 있다.
하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모효소 대비 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 약 180%, 약 190%, 또는 약 200% 이상의 증가된 효소 활성을 가질 수 있다.
다른 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 모효소 대비 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 또는 약 20% 이하의 감소된 효소 활성을 가질 수 있다.
본 출원에서 용어 "특이적 활성(specific activity)"은 단백질 단위 중량 당 나타나는 효소의 활성으로, unit/mg으로 표현할 수 있다. 단백질의 정량은, 예를 들면 SDS-PAGE 혹은 Bradford assay 등을 이용하여 할 수 있다.
효소 안정성(enzyme stability)이란, 효소 활성이 저장 또는 반응 시간 동안 보존되는 것을 의미한다. 이러한 안정성의 변화를 측정하기 위해, 최초 효소 활성을 정해진 조건 하에 0시간(time zero) (100%) 및 일정 시간 경과 후 (x%) 측정하여 비교함으로써, 효소활성이 상실되는 수준 내지는 효소 안정성을 표현할 수 있다.
효소 활성에 영향을 미치는 요소는, 예를 들어 pH, 열, 다른 물질(예를 들어, 산화제, 킬레이트제)의 존재 등이 있다.
본 출원에서 용어, "pH 안정성"이란 특정 pH 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력(ability)을 의미한다. 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 약 pH 4.0 내지 약 pH 12.0 에서 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특정 pH 범위에서 단백질이 기능을 유지하는 경우 "pH 안정성"을 가지는 것으로 정의할 수 있으며, pH 범위에 따라 "내산성", "알칼리 내성" 등을 가지는 것으로 정의할 수 있다.
본 출원에서 용어, "열안정성(thermal stability)"이란 특정 온도 범위에서 단백질이 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 하나의 구체예로, 본 출원에서 제공하는 변이체는 약 20℃내지 약 120℃범위에서 활성을 가질 수 있고, 구체적으로 약 60℃내지 약 100℃범위에서 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내열성(thermal tolerance)"이란 단백질이 특정 온도, 예를 들어 고열 또는 극저온에 노출된 후 기능할 수 있는 능력을 의미한다. 예를 들어, 내열성을 갖는 단백질은 노출된 온도에서는 기능하지 않을 수 있으나, 최적 온도 환경으로 돌아오면 다시 기능을 가질 수 있다.
안정성의 증가는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 높은 효소 활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 증가를 포함한다.
안정성의 감소는 다른 효소, 예를 들어 야생형 효소, 모 효소 및/또는 다른 변이체와 비교하여, 낮은 효소 활성 유지; 단백질이 기능을 유지하는 pH, 온도 및/또는 시간 등의 범위 감소를 포함한다.
본 출원에서 용어, "기질특이성(substrate speicifity)"이란 기질 및 기질과 경쟁하는 분자들을 식별할 수 있는 효소의 능력을 의미한다. 기질특이성은 상이한 기질에 대한 효소의 활성을 측정하여 결정할 수 있다. 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 증가하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다. 다른 하나의 구체예로, 상기 기질특이성의 변화는 목적하는 산물을 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성이 감소하는 방향으로 변화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 제공하는 변이체의 변경된 특성은 사료, 제빵, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 활성, 개선된 활성일 수 있다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 전술한 변이체의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 본 출원의 변이체를 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다.
상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다.
예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 더욱 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
예를 들어 "높은 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 5 내지 10℃아래에서 발생하고; "중간 엄격도"는 프로브의 Tm의 약 10 내지 20℃아래에서 발생하며; "낮은 엄격도"는 Tm의 약 20 내지 25℃아래에서 발생할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, "낮은 엄격도 조건(low stringency condition)" 은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 25% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 50℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
일 예로, "중간 엄격도 조건(medium stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 55℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.일 예로, "중상 엄격도 조건(medium-high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 60℃에서 1 내지 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
일 예로, "높은 엄격도 조건(high stringency condition)"은 써던 블롯팅 표준 절차에 따라 12-24시간 동안, 적어도 100개의 뉴클레오티드 길이의 프로브에 대해, 5 X SSPE, 0.3% SDS, 전단 및 변성된 연어 정자 DNA 200 micrograms/ml 및 35% 포름아미드에서, 42℃에서의 사전 혼성화(prehybridization) 및 혼성화 일 수 있다. 상기 운반체 물질은 최종적으로 65℃에서 2 X SSC, 0.1 내지 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안 각각 2회 내지 3회 세척될 수 있다.
본 출원에서 제공하는 핵산 구조체는, 조절 서열에 적합한 조건 하에서 적절한 숙주 세포에서 코딩서열의 발현을 지시하는 1개 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 변이체의 발현을 가능하게 하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 벡터로 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 전 폴리뉴클레오티드를 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 그와 같은 조작은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 출원에서 제공하는 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 본 출원의 변이체를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용될 수 있는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 본 출원에서 제공하는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는, 본 출원의 변이체를 발현할 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는 전술한 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 핵산 구조체 및/또는 벡터를 포함할 수 있다.
상기 핵산 구조체 또는 벡터는 앞서 설명된 바와 같이 염색체에 통합되거나, 또는 자가 복제되는 염색체외 벡터로 유지될 수 있다.
본 출원의 숙주 세포는 복제 동안 일어나는 돌연변이에 기인하여 모 세포와 동일하지 않은 모 세포의 임의의 자손을 포함한다.
숙주 세포는 변이체의 재조합 생성에 유용한 임의의 세포, 예를 들어, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
원핵 숙주 세포는 임의의 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아일 수 있다.
그람-양성 박테리아에는 바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스, 게오바실러스, 락토바실러스, 락토코커스, 오세아노바실러스, 스타필로코커스, 스트렙토코커스 및 스트렙토마이세스가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.
그람-음성 박테리아에는 캄필로박터, 에스케리키아 콜라이, 플라보박테리움, 푸소박테리움, 헬리코박터, 일리오박터, 네이세리아, 슈도모나스, 살모넬라, 비브리오(예컨대, 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens)) 및 유레아플라스마가 포함되나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 바실러스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 바실러스 알칼로필러스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시이, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 퍼무스, 바실러스 라우투스, 바실러스 렌투스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 푸밀러스, 바실러스 스테아로써모필루스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린지엔시스 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토코커스 속 숙주 세포일 수 있고 구체적으로 스트렙토코커스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 유베리스(Streptococcus uberis) 및 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 하위종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 스트렙토마이세스 속 숙주 세포일 수 있고, 구체적으로 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리콜라, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하나 이들에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 박테리아 숙주 세포는 코리네박테리움 속 숙주 세포일 수 있고, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데세르티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체 예로, 상기 숙주 세포는 에스케리키아 속 미생물일 수 있고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), (Escherichia coli), 에스케리키아 알베르티 (Escherichia albertii), 에스케리키아 페르구소니 (Escherichia fergusonii), 에스케리키아 헤르만니 (Escherichia hermannii), 에스케리키아 불네리스 (Escherichia vulneris), 또는 에스케리키아 블랏태 (Escherichia blattae) 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
숙주 세포는 포유동물, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본 출원에서 "진균"은 자낭균문, 담자균문, 통곰팡이문 및 접합균문뿐 아니라 난균문 및 모든 불완전 진균류를 포함한다.
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본 출원의 "효모"는 자낭포자형성(ascosporogenous) 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자(basidiosporogenous) 효모 및 불완전 진균류(Fungi imperfecti)(블라스토마이세테스(Blastomycetes))에 속하는 효모를 포함한다. 다만, 이러한 분류는 변화할 수 있으며, Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 바에 따라 분류를 정의할 수 있다.
효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 코마가텔라(Komagataella), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 코마가텔라 파피(Komagataella phaffii) 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 진균문 및 난균문 아문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 문헌(Hawksworth et al., 1995)에 정의된 바와 같음). 사상 진균은 일반적으로, 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난 및 그 밖의 복합 다당류로 이루어진 균사 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의한 것이며, 탄소이화는 절대적으로 호기성이다. 대조적으로, 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체(thallus)의 발아에 의한 것이며, 탄소이화는 발효성일 수 있다.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모늄(Acremonium), 아스페르길루스, 아우레오바시듐(Aureobasidium), 비어칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립코코커스(Cryptococcus), 필리바시듐(Filibasidium), 푸사리움, 휴미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리옵토라, 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로차에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레우로투스(Pleurotus), 스키조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 써모아스쿠스(Thermoascus), 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마 세포일 수 있다.
예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 아스페르길루스 야포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 오리자에, 비어칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에나(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브베르미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크루크웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사로크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이, 마이셀리옵토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플레우로투스 에린지이(Pleurotus eryngii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜라(Trametes versicolor), 트리코데르마 하지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코데르마 코닌지이(Trichoderma koningii), 트리코데르마 론지브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코데르마 리세이 또는 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 변이체를 제조하는 방법은 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "배양"은 상기 숙주 세포를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 상기 숙주 세포를 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 숙주 세포의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 숙주 세포를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 라이신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 숙주 세포의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
배지의 온도는 20℃ 내지 55℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 유용 물질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 24 시간 내지 196 시간일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법은 상기 배양단계에서 발현되는 본 출원의 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 하나의 구체예로, 상기 배양단계에서 발현된 변이체는 본 발명이 속하는 분야에 알려져 있는 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 변이체는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무-건조, 증발 또는 침전을 포함하나 이들에 한정되지 않는 통상적인 절차에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
상기 회수 방법은 본 출원의 숙주 세포의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 변이체를 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 및 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 숙주 세포로부터 변이체를 회수할 수 있다.
다른 하나의 구체예로, 배양단계에서 숙주 세포에 의해 발현되는 변이체는 회수되지 않을 수 있다. 상기 구체예에서, 변이체를 발현하는 숙주 세포 자체를 변이체의 공급원으로 사용할 수 있다.
본 출원의 조성물은 자일란(xylan)-함유 물질을 분해하는 데에 사용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 자일란-함유 물질을 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)로 전환하는 데에 사용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 다른 구성요소를 추가로 더 포함할 수 있다. 당업자는 본 출원의 조성물에 추가되는 구성요소를 적절히 선택할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 자일란-함유 물질을 자일로스 및/또는 자일로올리고당(xylo-oligosaccharide)으로 전환하는 데 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백 등 다양한 산업 분야에 적용하기 적합한 임의의 구성요소를 더 포함할 수 있다.
추가될 수 있는 물질의 예시는, 안정화제, 계면활성제, 빌더, 킬레이트제, 분산제, 효소, 효소 안정제, 촉매제, 활성화제, 담체, 합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 현탁화제, 색소, 향료, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제, 희석제, 윤활제, 보존제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에, 자연적으로 발생한 물질 또는 자연적으로 비발생한(Non-naturally occurring) 물질을 더 포함할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원에서 제공하는 조성물은 본 출원에서 제공하는 변이체 외에 동물 사료, 제빵, 바이오매스 당화, 펄프 표백(Pulp bleaching) 등을 포함한 다양한 산업 분야에 통상 사용 되는 추가적인 효소를 더 포함할 수 있다.
예를 들어 상기 추가적인 효소는, 베타-아밀라아제, 셀룰라아제(베타글루코시다아제, 셀로비오히드롤라아제 및 엔도글루카나아제), 글루코아밀라아제, 헤미셀룰라아제(엔도-자일라나제, β-자일로시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, α-D-글루쿠로니다제. 페룰로일 에스터라제, 쿠마로일 에스터라제(coumaroyl esterase), α-갈락토시다제, β-갈락토시다제, β-만나나제(mannanase) 또는 β-만노시다제), 아이소아밀라아제, 아이소머라아제, 리파아제, 피타아제, 프로테아제, 풀룰라나아제 및/또는 알파-아밀라아제와 함께 상업적 과정에서 유용한 그 밖의 효소로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 효소를 더 포함할 수 있다.
본 출원의 자일라나제 변이체 또는 본 출원의 자일라나제 변이체를 포함하는 조성물은 임의의 자일란-함유 물질을 분해시키는 데 사용될 수 있다.
본 출원에서, 자일란-함유 물질은 자일라나제에 의해 분해될 수 있는 임의의 물질이다. 일 예로 상기 자일란-함유 물질은 헤미셀룰로스(hemicellulose)일 수 있다. 구체적으로 상기 자일란-함유 물질은 자일란, 글루쿠로노자일란, 아라비노자일란, 글루코만난 및 자일로글루칸 중 선택되는 물질일 수 있다. 일 예로 상기 자일란-함유 물질은 자일란 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 본 출원은 자일란-함유 물질을 분해 (또는 붕괴)시키는 방법을 제공한다. 이것은 또한 자일란의 가용화 및/또는 펜토산의 가용화로 언급될 수 있다.
본 출원의 추가 실시 형태에서, 방법은 자일란 분해로부터 유래되는 폴리머의 분해 (예를 들어, 분해)에 관한 것이다.
분해 생성물 (예를 들어, 글루코스)은 임의의 발효 공정에 대한 공급원료로서, 예컨대 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 생산에서 또는 기타 제품, 예컨대 생화학 물질 (예를 들어, 생물 기반 아이소프렌)의 생산에서 사용될 수 있다.
본 출원의 변이체, 이를 발현하는 숙주 세포, 상기 변이체 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 이용하여 자일란을 분해할 수 있다. 자일란의 가수 분해 단계에서 본 출원의 변이체 외에 보조인자(cofactor), 조효소(coenzyme) 등이 함께 첨가될 수 있다. 기질의 가수 분해 단계는 최적 pH, 온도 조건 등에서 수행될 수 있으며 당업자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
본 출원의 자일라나제 변이체는 하기 응용들 중 어느 하나로 사용될 수 있다:
a) 동물 사료원료에서의 첨가제; 및/또는
b) 동물용 사료 보충제; 및/또는
c) 곡물 기반 물질 (예를 들어, 이는 통곡물 또는 곡물의 일부일 수 있음)의 분해.
일 구체예로, 본 출원의 자일라나제 변이체는 사료원료에 사용될 수 있다.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 사료원료 또는 사료 성분일 수 있다.
본 출원의 사료 조성물은 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.
일 구체예로 본 출원의 자일라나제 변이체는 식품 조성물 또는 그 제조에 사용 될 수 있다.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 곡물 기반 물질 (통곡물 또는 부분적인 곡물 또는 맥아 곡물, 예를 들어 맥아 보리를 포함함)일 수 있다.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 곡분 (예를 들어, 밀, 귀리, 호밀 또는 보리 가루)일 수 있다.
일 구체예로, 자일란-함유 물질은 보리 맥아 또는 당화액, 또는 맥아 보리 또는 이들의 조합일 수 있다.
일 예로 상기 식품 조성물은 맥주 및 와인을 포함하는 발효 음료일 수 있다. 다른 예로 상기 식품 조성물은 로브, 롤, 번, 피자, 프렛첼, 또띠야, 케익, 쿠키, 비스킷, 크랙커를 포함하는 베이커리 제품일 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 자일라나제 변이체는 밀 글루텐-전분 분리에 사용될 수 있다.
배유로부터 밀겨 및 밀 배아의 초기 분리 후에, 밀 배유 가루의 전분 및 글루텐 분획으로의 분획화는 고품질 α-전분 및 부산물 β-전분 및 활성 글루텐을 얻기 위해 이용 될 수 있다.
곡분 (예를 들어, 밀가루)을 전분 및 글루텐 분획으로 분리하기 위한 방법에서, 그 방법은 곡분 (예를 들어, 밀가루), 물 및 자일라나제 변이체를 혼합하는 단계를 포함한다. 곡분, 물 및 자일라나제 변이체는 동시에 또는 순차적으로 혼합될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 자일라나제 변이체와 혼합하기 전에 곡분 (예를 들어, 밀가루)과 물을 혼합할 수 있다.
본 출원의 자일라나제 변이체를 밀 글루텐-전분 분리에 적용함으로써 더 높은 α-전분 수율 및/또는 더 우수한 품질의 글루텐 (예를 들어, 더 우수한 품질의 활성 글루텐)을 생성할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 출원의 자일라나제 변이체는 곡물 기반 물질의 분해에 사용되고, 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올) 생산 공정의 일부에 사용될 수 있다.
일 예로, 본 출원의 자일라나제 변이체는 바이오 연료 (예를 들어, 바이오에탄올)의 생산 및 바이오 연료 산업에서의 곡물 기반 물질의 이용을 향상시킬 수 있다.
일 예로, 바이오 연료와 자일라나제 변이체를 액화, 당화, 발효, 동시 당화 및 발효 전에 또는 그 동안에, 그리고 발효 후에, 또는 이들의 조합에서 혼합하는 단계를 포함하여 사용할 수 있다.
본 출원의 자일라나제 변이체를 바이오 연료 생산 공정에 적용할 경우, 더 많은 건조 물질 당화액이 공정에 사용될 수 있거나; 최종 시럽에서 더 높은 고형물 함량을 얻거나; 열 전달이 더욱 우수하거나; 에너지 요구량이 더욱 낮아지거나; 증발기 부착오염이 감소되거나; 세정 비용이 감소되거나; 최종 연료 수율이 증가하거나; 부산물 품질이 개선되거나; 증류 후 찌꺼기의 고체 및 액체 부분 분리가 보다 용이하거나; 또는 전술한 이점의 조합을 얻을 수 있다.
본 출원의 자일라나제 변이체는 펄프 표백에 사용 될 수 있다.
예를 들어 펄프에서 착색된 리그닌이 자일란을 통해 결정 셀룰로스에 연결되어 있는 상태에서 자일라나제 변이체를 처리함으로써 자일란을 분해하고 착색된 리그닌을 방출함으로써 펄프 표백을 촉진할 수 있다.
실시예
이하 본 출원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 자일라나제 변이체의 제조
1-1. 주형(Template) 제작
오르피노마이세스(Orpinomyces) sp. PC-2 균주의 지노믹 DNA(Genomic DNA)에서 자일라나제(xylanase) 변이체(이하, Op Xyn로 기재, 서열번호 1) 유전자(서열번호 2)를 증폭하여 pHCE 벡터(Takara)에 클로닝 한 것을 주형(Template)으로 사용하였다.
1-2. 자일라나제 변이체 제작
Op Xyn에 이황화결합을 생성하기 위한 아미노산 쌍 부위를 선정하고, 해당 아미노산 서열을 시스테인 으로 변이시키기 위한 프라이머 를 디자인하여, 하기 표 1과 같은 7종의 변이체를 제조하였다(표 1). 하기 표 1의 변이 내용에는 변이 전 아미노산, 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 한 변이 위치 및 변이 후 아미노산을 차례로 기재하였다.
변이체명칭 변이 내용 서열
번호		 Primer(5'→3')
DS1 R3C Forward
Reverse		 9
10		 GGCCAG TGT TTGAGCGTCGG
GCTCAA ACA CTGGCCCATATGG
T36C Forward
Reverse		 11
12		 AAGGGA TGT ACCTTCAAGGCTGAG
ACCCAG ACA CATGGAACCGCTACC
DS2 S5C Forward
Reverse		 13
14		 AGGTTG TGT GTCGGTGGTGG
ACCGAC ACA CAACCTCTGGCC
S34C Forward
Reverse		 15
16		 AGCGGT TGT ATGACCCTGGGTAAG
GGTCAT ACA ACCGCTACCGCC
DS3 A128C Forward
Reverse		 17
18		 CCGGAT TGT CAGGGAAAGATGGTCAC
TCCCTG ACA ATCCGGGACCCAG
F143C Forward
Reverse		 19
20		 AAGATC TGT CAGATGGATCACACTGG
CATCTG ACA GATCTTGTACTGGGCG
DS4 S66C Forward
Reverse		 21
22		 TTCGGC TGT ACCAAGAAGGCC
CTTGGT ACA GCCGAAATCCAGACC
N193C Forward
Reverse		 23
24		 ATCGGC TGT CTCTACGAGGTCGCA
GTAGAG ACA GCCGATGCCCC
DS5 F20C Forward
Reverse		 25
26		 GATGGC TGT AGCTACGAGATCTGG
GTAGCT ACA GCCATCGAAGACGC
A41C Forward
Reverse		 27
28		 AAGGGA TGT ACCTTCAAGGCTGAG
GAAGGT ACA TCCCTTACCCAGGG
DS6 T71C Forward
Reverse		 29
30		 AAGGCC TGT GCTTACGAGTACATCG
GTAAGC ACA GGCCTTCTTGGTGG
I191C Forward
Reverse		 31
32		 TGGGGC TGT GGCAACCTCTACG
GTTGCC ACA GCCCCAGCCC
DS7 L62C Forward
Reverse		 33
34		 CGCGGT TGT GATTTCGGCTCCAC
GAAATC ACA ACCGCGTCGGGC
V217C Forward
Reverse		 35
36		 CTGGAT TGT TACACCACCAAGCAGG
GGTGTA ACA ATCCAGCTTGGTGACG
구체적으로, 상기 자일라나제 변이체는 주형(Template)과 프라이머(Primer), PCR premix(iNtRON, cat no. 25185)를 사용하여 PCR을 통해 제작하였다. PCR은 Eppendorf Mastercycler Nexus GX2를 이용하였고, 반응 조건은 다음과 같다.
최초 변성(Initial denaturation) - 94℃ 2min
변성(Denaturation) - 94℃ 20sec
어닐링(Annealing) - 50℃ 10sec
신장(Extension) - 72℃ 10min(변성에서 신장까지 30cycle)
최종 신장(Final Extension) - 72℃ 5min
만들어진 7종의 변이체는 In-Fusion HD cloning kit(Takara, Cat. No. 639650)를 이용하여 라이게이션(ligation)한 다음, E.coli Dh5α 균주에 형질전환 후 시퀀싱을 통해 서열 변이 여부를 확인하였다.
실시예 2: 내열성 개선 변이체 선정 및 내열성 효과 확인
실시예 1에서 제조한 변이체 및 Op Xyn 유전자로 각각 형질전환된 E.coli Dh5α 균주를 멸균된 LB 배지(BD Difco)에 접종하고, 37℃ 180 rpm으로 24시간동안 배양한 다음 원심분리를 통해 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 20 ml 용해 완충액(lysis buffer:50mM Tris-HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM imidazole)를 가하여 재분산시킨 다음 초음파 처리(sonication)와 원심분리를 통해 조효소액을 확보하였다. 조효소액을 Ni-NTA 레진(Qiagen, Cat no. 30230)에 흘려주어 흡착시킨 다음, 세정 완충액(washing buffer, 용해 완충액 조성 중 imidazole 농도만 20mM), 용출 완충액(Elution buffer, lysis buffer 조성에서 imidazole만 250mM)를 차례로 흘려주어 효소를 정제하였고, 정제된 효소를 이용하여 역가 및 내열성 평가를 진행하였다.
효소의 농도는 희석된 효소용액 4㎕ + 브래드포드 용액 (Bradford solution, Quick Start™ Bradford 1x Dye Reagent, #5000205) 196㎕을 혼합한 다음 595nm 흡광도를 측정하여 구하였다.
효소 역가는 1% 비치우드 자일란(xylan from beachwood, Megazyme, P-XYLNBE-10G) 96㎕에 1M pH 6.5 인산염 완충액(phosphate buffer) 4㎕를 혼합한 다음, 희석된 효소액 100㎕를 섞고, 37℃에서 15분간 반응을 진행하여 측정하였다. 반응액에 300㎕의 DNS 용액을 혼합하여 반응을 정지시키고 이를 7분간 끓여 발색한 다음 얼음물에서 냉각하였다. 여기에 500㎕ 증류수를 혼합한 액의 550nm 흡광도를 측정하고, 자일로스(xylose, Sigma-Aldrich, X1500)로 만든 표준곡선(standard curve)을 이용하여 역가를 측정하였다.
상기 DNS 용액 제조법은 다음과 같다. 증류수 500 ml이 포함된 비이커에 6.3g의 3,5-다이나이트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid, samchun, D1267)를 첨가하고 온도를 50℃로 조정한 후 21g의 수산화나트륨(Daejung, 7571-4400)을 첨가하였다. 300ml의 물 및 타르타르산나트륨칼륨 (Potassium sodium tartrate tetrahydrate, Daejung, 6618-4400) 182g을 첨가한 후 페놀(Sigma-Aldrich, P1037) 5g을 첨가하고, 아황산나트륨 (Sodium sulfite anhydrous, Daejung, 7634-4405) 5g을 첨가하여 용해 될 때까지 교반 한 후, 냉각하였다. 여기에 증류수를 가하여 1000ml로 맞춘 다음 여과하고, 갈색병에 7일이상 보관한 이후에 사용하였다.
내열성 평가는 정제된 효소를 0.5 mg/ml의 농도로 맞추어 희석한 다음, 70℃ 워터배스에서 10분간 인큐베이션한 다음, 잔류역가를 측정하였다.
변이체 명 칭 역가 (U/mg) Op Xyn 대비 상대 역가(%) 70℃잔류역가 (%)
Op Xyn 4363 100 1.8
DS1 13877 318 80.8
DS2 2566 59 64.7
DS3 731 17 3.7
DS4 1290 30 3.8
DS5 4302 99 17.0
DS6 1079 25 3.8
DS7 264 6 11.1
그 결과, 효소 역가를 비율로 측정하였을 때, Op Xyn 대비 효소 역가가 50 ~ 300% 범위를 가지면서 내열성(잔류역가) 5배 이상 개선된 변이체 3종(DS1, DS2 및 DS5)을 선별하였다.
DS1, DS2 및 DS5의 70℃에서 인큐베이션 처리시간에 따른 선별된 변이주의 잔류역가 변화를 추가로 확인하여 도 1에 나타내었다. 그 결과, 처리시간이 길어지더라도 DS1, DS2 및 DS5의 잔류역가의 변화는 거의 없는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드로서,
    i) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 가지고; 및/또는
    ii) 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 서열과 70% 이상 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
    iii) 상기 변이형 폴리펩티드는 (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드 코딩 서열, (b) 이의 cDNA, 또는 (c) 상기 (a) 또는 (b)의 전장 상보 서열(full-length complement)과 낮은 엄격도 조건, 중간 엄격도 조건, 중상 엄격도 조건, 높은 엄격도 조건, 또는 매우 높은 엄격도 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드이고; 및/또는
    iv) 상기 변이형 폴리펩티드는 자일라나제 활성을 갖는 i), ii) 또는 iii) 폴리펩티드의 기능적 단편이고; 및
    하기에서 선택된 어느 하나 이상의 변형을 포함하는, 변이형 폴리펩티드:
    3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 하나 이상의 위치의 아미노산에서의 다른 아미노산으로의 치환(substitution), 디설파이드(disulfide) 결합 형성, 및 이의 조합;
    여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드의 변형 전 3번 아미노산은 아르기닌(R);
    5번 아미노산은 세린(S);
    20번 아미노산은 페닐알라닌(F);
    34번 아미노산은 세린(S);
    36번 아미노산은 쓰레오닌(T);
    및/또는 41번 아미노산은 알라닌(A)인 것인, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기 i) 내지 vii)에서 선택된 위치의 아미노산의 변형을 포함하는 것인, 변이형 폴리펩티드;
    i) 3+36;
    ii) 5+34;
    iii) 20+41;
    iv) 3+36+5+34;
    v) 3+36+20+41;
    vi) 5+34+20+41; 및
    vii) 3+36+5+34+20+41;
    여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드의 각 위치의 변형은 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것인, 변이형 폴리펩티드;
    i) 3번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
    ii) 5번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
    iii) 20번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
    iv) 34번 아미노산의 시스테인으로의 치환;
    v) 36번 아미노산의 시스테인으로의 치환; 및
    vi) 41번 아미노산의 시스테인으로의 치환으로,
    여기서, 상기 위치 번호는 서열번호 1의 폴리펩티드의 위치에 상응하는 위치임.
  5. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 하기에서 선택된 어느 하나 이상의 변형을 포함하는 것인, 변이형 폴리펩티드:
    R3C+T36C;
    S5C+S34C;
    F20C+A41C;
    R3C+T36C+S5C+S34C;
    R3C+T36C+F20C+A41C;
    S5C+S34C+F20C+A41C; 및
    R3C+T36C+S5C+S34C+F20C+A41C.
  6. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 3번, 5번, 20번, 34번, 36번, 및 41번 중 2 이상의 위치의 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하고, 상기 치환된 2개의 아미노산 사이에 디설파이드 브리지를 형성하는 것인, 변이형 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 3번 및 36번 아미노산 쌍; 5번 및 34번 아미노산 쌍; 및/또는 20번 및 41번 아미노산 쌍의 시스테인으로의 치환,
    및 상기 아미노산 쌍이 디설파이드 브리지를 형성하는 변형을 포함하는, 변이형 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드에 비하여 내열성 및/또는 열안정성이 증가한 것인, 변이형 폴리펩티드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물과 자일란-함유 물질을 접촉시키는 것을 포함하는, 자일로올리고당 또는 자일로스를 제조하는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포, 및/또는 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 자일란-함유 물질에 처리시키는 것을 포함하는, 자일란-함유 물질을 분해하는 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 및/또는 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주세포.
  13. 제12항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는,
    자일라나제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 제조하는 방법.
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