CN116625914A - 一种生乳体细胞便携式计数仪及计数方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生乳体细胞便携式计数仪及计数方法，涉及生乳体细胞快速计数技术领域。其包括：荧光放大模块、计数芯片和具有拍摄功能的移动终端。本发明提供的生乳体细胞便携式计数仪能够实现对生乳样品中体细胞的准确、现场计数。与目前主流的流式体细胞计数仪相比，成本大幅度降低，并且不需要专业的操作人员即可进行检测。同时能够真正实现在牧场、奶站等第一线地点进行现场应用。可作为新型测试方法为生乳体细胞数的现场计数提供实施案例，助力POCT技术的推广应用。

Description

一种生乳体细胞便携式计数仪及计数方法

技术领域

本发明涉及生乳体细胞快速计数技术领域，具体而言，涉及一种生乳体细胞便携式计数仪及计数方法。

背景技术

牛奶体细胞数是衡量奶牛生理健康状况、乳品质量与安全的标准，也是国际上判断奶牛隐形乳房炎的重要指标。高体细胞数直接指证奶牛的乳腺患有炎症性疾病，患有炎症性疾病奶牛所产的生鲜牛乳不仅营养成分含量偏低，而且被人们误饮后甚至会引发群体性食物中毒，直接威胁饮用者的安全和健康。对牛奶体细胞数进行检测，可以及时发现有炎症的奶牛，进而从源头上保障生鲜牛乳的品质。因此，快速准确的牛奶体细胞数检测对于保证牛奶品质和监测奶牛乳房健康都具有重要意义。

现有的牛奶体细胞计数方法可以分为直接检测法和间接检测法两大类。其中，直接检测法是计数牛奶体细胞的标准方法且目前应用较广泛，但通常需要依靠大型检测设备(如流式体细胞计数仪、显微镜等)完成检测，这类仪器价格普遍较昂贵，难以大范围推广使用。间接检测法是利用牛奶体细胞的各种理化特性进行测试，并依靠相关的理化模型从而得出牛奶体细胞值，但该方法通常精度较低。当前，基于微流控芯片和便携式设备的牛奶体细胞计数方法研究是牛奶体细胞计数领域的一个重要发展方向。相对于传统的牛奶体细胞计数方法，该方法具有成本低、体积小、操作简便、准确度高的优势，在现场检测领域有着广阔的应用前景。

目前，专利公开号为CN201910385458.6公开的一种生乳体细胞计数仪及其计数方法，其与流式细胞仪的检测结果的一致性仍然较低，有待进一步提高；此外，仍无法满足方便携带、现场使用的需求，需要外接电源。专利CN104897556A虽然也实现了智能终端计数，然而使用的是碘酊染色，成像效果较差；且测试前，需要先对牛奶样品在芯片外稀释，碘酊染色后再注入到芯片进样口，操作繁琐。此外，芯片检测腔室高度设置为10-100μm，存在体细胞的多层分布重叠现象阻碍识别计数的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生乳体细胞便携式计数仪及计数方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明提供了一种生乳体细胞便携式计数仪，其包括：荧光放大模块、计数芯片和具有拍摄功能的移动终端；

荧光放大模块包括外壳、放大组件和移动终端放置平台，外壳开设有用于安装计数芯片的插槽，且外壳内具有放置放大组件的放大组件安装孔，在放大组件安装孔底部设置有LED光源；放大组件包括聚焦透镜、激发滤光片、第一放大透镜、第二放大透镜和发射滤光片；

沿放大组件安装孔的光路透过顺序依次在放大组件安装孔内安装有聚焦透镜、激发滤光片、第一放大透镜、第二放大透镜和发射滤光片，且计数芯片的光学检测区域位于激发滤光片与第一放大透镜之间；

移动终端放置平台设置于外壳上，且移动终端放置平台开设有用于移动终端成像的图像采集孔，图像采集孔与外壳的放大组件安装孔相对应；

移动终端上安装有生乳体细胞计数软件；

计数芯片的腔室高度为30-40μm，且计数芯片的腔室具有生乳体细胞荧光染色的荧光染色剂。

本发明提供了一种生乳体细胞便携式计数仪，与现有技术相比，本发明提供的生乳体细胞便携式计数仪具有如下优势：

(1)采用荧光染色剂标记生乳体细胞，成像效果更好(尤其比碘酊染色效果好)，与背景对比更明显，信噪比高，同时在识别细胞和细胞质颗粒之间具有特异性，对目标细胞的识别和计数更方便和准确；

(2)本发明开发的计数芯片可以实现生乳样品的一步式进样及芯片内体细胞的自动荧光染色程序，无需其他任何芯片外实验操作步骤，提升了用户使用方便性。不需要预先对待测生乳样本进行稀释、染色，可以直接将待测样本注入芯片，借助巴氏吸管的弹性胶囊或注射器即可快速完成生乳体细胞的荧光染色然后插入荧光放大模块即可检测。

(3)优化计数芯片的腔室高度为30-40μm，保证体细胞为单层分布，使细胞都处于同一焦平面，后续软件识别计数更方便和准确。腔室高度超过60μm会引起生乳体细胞之间出现多层分布堆积重叠现象，阻碍了识别和计数。考虑到生乳体细胞由上皮细胞和白细胞(多形核中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)组成，其直径在5-30μm之间，腔室高度过低可能导致视野内体细胞由于受到腔室挤压而铺展受限，造成视野内较低的体细胞数，可能引起的计数不准现象。因此，基于微流控芯片的测试方法需要在细胞识别的准确性和计数芯片的腔室高度之间进行平衡。

(4)本发明提供的生乳体细胞便携式计数仪能够实现对生乳样品中体细胞的准确、现场计数。与目前主流的流式体细胞计数仪相比，成本大大降低，并且不需要专业的操作人员即可进行检测。同时能够真正实现在牧场、奶站等第一线地点进行现场应用。可作为新型测试方法为生乳体细胞数的现场计数提供实施案例，助力POCT技术的推广应用。

生乳包括不限于：生牛乳、羊奶、驼奶。

荧光放大模块用于激发生乳体细胞中的荧光物质-DNA复合物，使其发出的特定波长的荧光能够最终到达智能手机的摄像头。其原理为当LED光源通过聚焦透镜和激发滤光片落在计数芯片的光学检测区域。然后激发产生的特定波长的荧光透过放大透镜组、发射滤光片滤去多余的光从而得到目标波长的荧光，最终被智能手机的摄像头捕捉。

移动终端上安装的生乳体细胞计数软件具有很好的响应能力，用户通过操作界面，可以进行生乳体细胞的检测。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述外壳还具有便携式电源，LED光源为发射波长535nm的LED灯泡，且LED灯泡与便携式电源电连接；

在一种可选的实施方式中，外壳还设置有LED灯泡的控制开关。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述激发滤光片的中心波长为525nm,带宽30nm，透过率大于90％。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述发射滤光片的中心波长为615nm,带宽40nm，透过率大于90％。

在本发明中选择PI荧光染色试剂对生乳体细胞中的DNA染色从而获得生乳体细胞数。PI试剂，是一种对双链DNA和RNA直接染色的荧光试剂，PI试剂与DNA结合后，在发射波长为535nm的绿色LED灯泡的激发下可以产生波长为615nm的红色荧光。对所产生的红色荧光进行放大检测，可以得到生乳体细胞的荧光图像。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述计数芯片包括基片、密封膜和巴氏吸管，基片上依次设置有彼此连通的取样口、进样通道、反应单元、光学检测区域、废液池和用于排出计数芯片的空气的放空单元；进样通道为蛇形通道，且蛇形通道上预埋有用于生乳体细胞荧光染色的PI荧光染色剂和作用于体细胞的细胞通透剂；放空单元为巴氏吸管的弹性胶囊或注射器。密封膜覆盖于芯片正面。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述取样口上连接有巴氏吸管的尖嘴吸管。

发明人发现，一次性巴氏吸管具有成本低廉，且可以将其尖嘴吸管和弹性胶囊分别用于样本的吸入和空气的放空。使用时仅需按压一次性巴氏吸管的弹性胶囊即可完成生乳体细胞的芯片内自动荧光染色，无需进样泵等动力装置，无需芯片外其他试剂准备步骤，可极大的降低生乳体细胞现场检测对仪器设备和试剂的需求。在其他实施方式中，也可用注射器代替弹性胶囊起到相同的功效。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述生乳体细胞计数软件包括界面显示模块、图像获取模块和图像处理模块；

图像获取模块用于：调取智能终端中的生乳体细胞荧光图像，并进行图像页面截取用作计数软件后续算法处理的原始图像；

图像处理模块用于：(1)对图像使用高斯滤波器进行去噪、平滑操作随后进行增强等预处理步骤，以便更好地进行细胞图像分析；(2)随后对图像进行二值化处理，将生乳体细胞的荧光图像从背景中分离开来；(3)使用轮廓检测算法，检测图像中的目标像素点并利用Findcoutour查找范围判断是否为细胞点随后进行计算；(4)反馈到前端展示，从而实现对生乳样品中体细胞的计数。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述智能终端为手机或平板电脑。生乳体细胞计数软件是基于IOS系统开发的，也是基于Java编程语言开发的。

第二方面，本发明提供了一种采用生乳体细胞便携式计数仪进行生乳体细胞计数的方法，其包括如下步骤：

将待测生乳样本导入计数芯片中，使得待测生乳样本与计数芯片内的染色通道上的PI染色试剂和细胞通透剂混合，并进入计数芯片的光学检测区域；然后将计数芯片插入外壳的插槽内，开启LED光源，操作移动终端上的生乳体细胞计数软件，获得体细胞计数结果。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述计数芯片的操作步骤包括：按压计数芯片的弹性胶囊或抽拉注射器，将待测生乳样本吸入计数芯片的染色通道并与固定在染色通道上的PI染色试剂混合，继续按压计数芯片的弹性胶囊使得待测样本进入光学检测区域。

上述方法简单易行，可以既快又准地实现生乳体细胞的计数。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的提供的生乳体细胞便携式计数仪具有如下优势：

(1)采用荧光染色剂标记生乳体细胞，成像效果更好(尤其比碘酊染色效果好)，与背景对比更明显，信噪比高，同时在识别细胞和细胞质颗粒之间具有特异性，对目标细胞的识别和计数更方便和准确；

(2)本发明开发的计数芯片可以实现生乳样品的一步式进样及芯片内体细胞的自动荧光染色程序，无需其他任何芯片外实验操作步骤，提升了用户使用方便性。不需要预先对待测生乳样本进行稀释、染色，可以直接将待测样本注入芯片，借助巴氏吸管的弹性胶囊或注射器即可快速完成生乳体细胞的荧光染色然后插入荧光放大模块即可检测。

(3)优化计数芯片的腔室高度为30-40μm，保证体细胞为单层分布，使细胞都处于同一焦平面，后续软件识别技术更方便和准确。腔室高度超过60μm会引起生乳体细胞之间出现多层分布堆积重叠现象，阻碍了识别和计数。考虑到生乳体细胞由上皮细胞和白细胞(多形核中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)组成，其直径在5-30μm之间，腔室高度过低可能导致视野内体细胞由于受到腔室挤压而铺展受限，造成视野内较低的低体细胞数，可能引起的计数不准现象。因此，基于微流控芯片的测试方法需要在细胞识别的准确性和计数芯片的腔室高度之间进行平衡。

(4)本发明提供的生乳体细胞便携式计数仪能够实现对生乳样品中体细胞的准确、现场计数。与目前主流的流式体细胞计数仪相比，成本大大降低，并且不需要专业的操作人员即可进行检测。同时能够真正实现在牧场、奶站等第一线地点进行现场应用。可作为新型测试方法为生乳体细胞数的现场计数提供实施案例，助力POCT技术的推广应用。

此外，本发明提供的计数方法简单易行，可以快速、准确地实现生乳体细胞的计数。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为基于智能手机的牛奶体细胞便携式计数仪的光路原理图；

图2为一次性微流控芯片设计图；

图3为一次性微流控芯片实物图；

图4为基于智能手机的牛奶体细胞便携式计数仪的实物图；

图5为基于智能手机的牛奶体细胞便携式计数仪的三维结构示意图；

图6为荧光放大模块示意图；

图7为基于智能手机的牛奶体细胞便携式计数仪的软件构架图；

图8为基于智能手机的牛奶体细胞便携式计数仪的软件工作图；

图9为线性分析图；

图10为荧光染色牛奶体细胞后注入不同腔室高度微流控芯片的牛奶体细胞图像((A)腔室高度20μm；比例尺为100μm(B)腔室高度40μm；比例尺为100μm(C)腔室高度60μm；比例尺为100μm(D)腔室高度80μm；比例尺为100μm(E)腔室高度100μm；比例尺为100μm)。

图标：1-基片；2-尖嘴吸管；3-进样通道；4-反应单元；5-光学检测区域；6-废液池；7-放空单元；8-手机；9-聚焦透镜；10-激发滤光片；11-第一放大透镜；12-第二放大透镜；13-发射滤光片；14-外壳；15-插槽；16-LED光源；17-移动终端放置平台。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

实施例1

请参阅图1和图6，本实施例提供了一种生乳体细胞便携式计数仪，包括荧光放大模块、一次性检测芯片(也为计数芯片或基片1)和具有拍摄功能的移动终端(本实施例为智能手机8)。本实施例用于牛奶体细胞的计数，在其他实施方式中，也可用于羊奶、驼奶等生乳的体细胞计数。其中荧光放大模块是整个装置结构中最重要的部分，因为如果直接使用智能手机8是无法拍摄获得牛奶体细胞的荧光图像。因此在便携式装置中需要有一个荧光放大模块来将牛奶体细胞的荧光信号进行放大。

参照图6所示，荧光放大模块的结构由外壳14、放大组件和智能手机8放置平台构成。其中外壳14为荧光效应提供了黑暗环境，减少了环境光的干扰。外壳14采用Solidworks制图软件进行设计并依靠三维(Three-dimensional，3D)打印设备制作成型。

外壳14中放置有LED光源16以及用于插入一次性微流控芯片的插槽15和用于荧光检测的透光口；放大组件包括聚焦透镜9、激发滤光片10、第一放大透镜11、第二放大透镜12和发射滤光片13。图6所示，沿光路入射方向，依次为第一放大透镜11、第二放大透镜12和发射滤光片13。图6中第一放大透镜11、第二放大透镜12和发射滤光片13组合为一体的组件，在其他实施方式中可以根据安装需要单独安装。外壳14开设有放大组件安装孔，沿放大组件安装孔的光路透过顺序依次在放大组件安装孔内安装有聚焦透镜9、激发滤光片10、第一放大透镜11(即为放大透镜1)、第二放大透镜12(即为放大透镜2)和发射滤光片13，且计数芯片的光学检测区域5位于激发滤光片10与第一放大透镜11之间。

荧光放大光路原理图参照图1所示，荧光放大模块用于激发牛奶体细胞中的PI-DNA复合物，使其发出的红色荧光能够最终到达智能手机8的摄像头。其原理为当LED光源16通过聚焦透镜9和激发滤光片10落在一次性微流控芯片的光学检测区域5。然后激发产生的红色荧光透过放大透镜组和发射滤光片13滤去多余的光从而得到目标红色荧光最终被智能手机8的摄像头捕捉。

LED光源16：选择了一款发射波长535nm，功率3w的LED灯泡作为便携式牛奶体细胞计数仪的激发光源。同时，选择了9V的电池作为便携式装置的驱动电源，可以保证LED光源16的激发能量。另外电池供电设计可以保证便携式计数仪更好的应用于现场检测，无需其他供电模式，同时可以极大的节约便携式计数仪的体积和成本。此外，为了方便控制LED光源16，还在外壳14开设有控制开关。

滤光片组件：牛奶体细胞主要是由白细胞组成，而白细胞是一种有核细胞，通过选择特定的只对细胞核染色的荧光染料可以实现牛奶体细胞计数。对牛奶样品进行有效的荧光染色是获得准确的体细胞数的前提。在本发明中选择PI荧光染色试剂对牛奶体细胞中的DNA染色从而获得牛奶体细胞数。PI试剂，是一种对双链DNA和RNA直接染色的荧光试剂，PI试剂与DNA结合后，在发射波长为535nm的绿色LED灯泡的激励下可以产生波长为615nm的红色荧光。对所产生的红色荧光进行放大检测，可以得到牛奶体细胞的荧光图像。在上述光源和PI荧光染色试剂确定后，本发明选择了中心波长为525nm,带宽30nm，透过率90％以上的激发滤光片10并配套选择了中心波长为615nm,带宽40nm，透过率90％以上的发射滤光片13。

一次性微流控芯片参照图2所示，本实施例简称为基片1。基片1上具有密封膜，从而与一次性巴氏吸管组合而成的封闭芯片。一次性微流控芯片的实物图参照图3所示。

一次性微流控芯片包括设有微流体通道的基片1(为薄板状结构)，基片1上依次设有连通的尖嘴吸管2(一次性巴氏吸管的吸头)、进样通道3、反应单元4、光学检测区域5、废液池6和放空单元7(一次性巴氏吸管的弹性胶囊)；尖嘴吸管2和放空单元7设于基片1的正面；反应单元4为蛇形通道，蛇形通道上预埋有用于牛奶体细胞荧光染色的PI荧光染色剂和作用于体细胞的细胞通透剂；放空单元7用于排出芯片通道内的空气，将牛奶样品吸入反应单元4中与预埋在其中的PI荧光染色剂和细胞通透剂结合，再进入微流控芯片的光学检测区域5。该微流控芯片使用时仅需按压一次性巴氏吸管的弹性胶囊即可完成牛奶体细胞的芯片内自动荧光染色，无需进样泵等动力装置，无需芯片外其他试剂准备步骤，可极大的降低牛奶体细胞现场检测对仪器设备和试剂的需求。

一次性微流控芯片的材为透明有机玻璃，样品检测池的高度设置为40μm，保证了牛奶体细胞的单层分布，并处于同一焦平面上，方便后续计数软件的识别和计数其他液路通道的高度设置为100μm。同时，考虑到自动进样的实施方案，在微流控芯片设计及加工时预留了放置一次性巴士吸管的进样通道3，保证了自动进样方案的实施。在外置压力源的设计中，摒弃了其他动力型的外接源，选择了一次巴士吸管作为外部压力控制装置。

将一次性巴氏吸管用剪刀剪开，然后将一次性巴氏吸管的尖嘴吸管2和弹性胶囊(放空单元7)部分分别装入芯片左右两端的进样通道3，在巴士吸管放置处覆盖密封胶即可保证整个微流控芯片的密封性。在完成上述的操作后，在微流控芯片进样通道3内预埋PI荧光染色试剂和细胞通透剂后，等其干燥，随后在芯片正面覆盖压敏膜后即可完成整个微流控芯片的组装并用于后续实际样品的测试。

移动终端放置平台17用于放置和固定智能手机8(参照图4和图5所示)。选择的智能手机8为Apple IPOD 5，其后置摄像头像素为500万。其像素值足以满足本便携式计数仪获取牛奶体细胞荧光图像的需求。基于以上的便携式计数仪的设计和3D打印技术，成功得到了基于智能手机8的牛奶体细胞便携式计数仪。

计数软件：本发明的牛奶体细胞计数软件系统是基于IOS系统开发的，本发明设计的牛奶体细胞计数软件具有很好的响应能力，用户通过操作界面，可以进行牛奶体细胞的检测。

设计的牛奶体细胞计数软件是基于Java编程语言开发的。本软件的功能模块主要包括界面显示模块、图像获取模块和图像处理模块，软件架构图参照图7所示。首先打开软件登录主页面，然后开始准备测试。

实现牛奶体细胞计数需要经过以下图像处理步骤：(1)对图像使用高斯滤波器进行去噪、平滑操作随后进行增强等预处理步骤，以便更好地进行细胞图像分析；(2)随后对图像进行二值化处理，将牛奶体细胞的荧光图像从背景中分离开来；(3)使用轮廓检测算法，检测图像中的目标像素点并利用Findcoutour查找范围判断是否为细胞点随后进行计算；(4)反馈到前端展示。从而实现对生鲜牛乳样品中体细胞的计数。

实施例2

本实施例对实际新鲜牛奶样本进行测试和结果分析。

(1)牛奶样品的采集

采集新鲜牛奶并在6小时内进行测试。

(2)牛奶样品的荧光染色程序：

按压一次性微流控芯片的弹性胶囊，将新鲜牛乳样品吸入一次性微流控芯片的染色通道并与固定在染色通道上的PI染色试剂和细胞通透剂混合，形成PI-DNA复合物，随后进入光学检测区域5。

(3)牛奶体细胞荧光图像的获取：

将上述采集了牛奶样品的一次性微流控芯片放入便携式牛奶体细胞计数仪的凹槽内，打开LED光源16，在LED光源16的激发下，PI-DNA复合物会发出红色荧光，荧光经过放大部件的放大和滤光后，被放置在平台上的智能手机8摄像头所捕捉。

(4)打开牛奶体细胞计数软件，在软件的页面上选择开始测试按钮。

(5)使用牛奶体细胞计数软件进行图像处理并计数然后输出检出结果。如图8所示，计数软件的页面包括主页面、选择图像界面、图像预处理界面、结果显示界面。最后计数软件会将计数结果直接显示在智能手机8屏幕上。

(6)结果分析

本发明设计的基于智能手机8的牛奶体细胞计数平台能够正常工作。对采集到的10份新鲜牛乳样品进行了测试，并和商业化的流式体细胞仪检测获得的数据进行对比(下表1所示)。

表1基于智能手机8的牛奶体细胞便携式计数仪的实际样品测试

当通过线性回归分析将基于智能手机8的牛奶体细胞便携式计数仪与商业流式体细胞计数仪进行比较时，发现本发明提供的牛奶体细胞便携式计数仪与流式体细胞计数仪的线性相关系数(R²)很高，参照图9所示，为0.9951。高的R²表明，本系统可以作为牛奶体细胞计数的可靠方法。

实施例3

本实施例进行微流控芯片的腔室高度研究实验。

微流控芯片的腔室高度是一个非常重要的参数，它决定了荧光染色后的牛奶体细胞能否被准确识别以及荧光染色方法计数牛奶体细胞的准确性。现有的用于牛奶体细胞计数领域的微流控芯片的腔室高度尺寸几乎都在100μm左右，都涉及到牛奶体细胞的多层分布现象，为后续的荧光图像识别带来一定的技术困扰。为了更好地研究微流控芯片的腔室高度对牛奶体细胞计数的影响，本实施例制作了一批腔室高度(20、40、60、80和100μm)不同的微流控芯片，其可以在测试工作前制作完成，因此用户只需将准备好的生鲜牛乳样品加入一次性微流控芯片中即可进行测试。

结果参照图10所示，结果表明：当微流控芯片的腔室高度为20μm和40μm时，牛奶体细胞呈现单层分布，可以被清楚地识别和计数。当微流控芯片的腔室高度为60、80和100μm时，由于腔室高度的增加，在同一显微镜视野下，牛奶体细胞的数量相应增加。并且牛奶体细胞之间出现了多层分布堆积重叠现象，阻碍了识别和计数。

因此，基于微流控芯片的测试方法需要在细胞识别的准确性和微流控芯片的腔室高度之间进行平衡。考虑到牛奶体细胞由上皮细胞和白细胞(多形核中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)组成，其直径在5-30μm之间。而在保证单层细胞识别的前提下，希望视野内的体细胞数能够尽可能的多，从而避免在低体细胞数时可能引起的计数不准现象。因此，选择40μm的腔室高度作为一次性微流控芯片检测池的工作高度，以避免因微流控芯片腔室高度过高从而造成的同一视野中的体细胞多层分布现象导致的不在同一焦平面而引起的计数影响。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，其包括：荧光放大模块、计数芯片和具有拍摄功能的移动终端；

所述荧光放大模块包括外壳、放大组件和移动终端放置平台，所述外壳开设有用于安装计数芯片的插槽，且所述外壳内具有放置放大组件的放大组件安装孔，在所述放大组件安装孔底部设置有LED光源；所述放大组件包括聚焦透镜、激发滤光片、第一放大透镜、第二放大透镜和发射滤光片；

沿所述放大组件安装孔的光路透过顺序依次在放大组件安装孔内安装有聚焦透镜、激发滤光片、第一放大透镜、第二放大透镜和发射滤光片，且所述计数芯片的光学检测区域位于所述激发滤光片与第一放大透镜之间；

所述移动终端放置平台设置于所述外壳上，且所述移动终端放置平台开设有用于移动终端成像的图像采集孔，所述图像采集孔与所述外壳的放大组件安装孔相对应；

所述移动终端上安装有生乳体细胞计数软件；

所述计数芯片的腔室高度为30-40μm；且计数芯片的腔室具有生乳体细胞荧光染色的荧光染色剂。

2.根据权利要求1所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述外壳还具有便携式电源，所述LED光源为发射波长535nm的LED灯泡，且所述LED灯泡与所述便携式电源电连接；

所述外壳还设置有LED灯泡的控制开关。

3.根据权利要求2所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述激发滤光片的中心波长为525nm,带宽30nm，透过率大于90％。

4.根据权利要求3所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述发射滤光片的中心波长为615nm,带宽40nm，透过率大于90％。

5.根据权利要求1所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述计数芯片包括基片、密封膜和巴氏吸管，所述基片上依次设置有彼此连通的取样口、进样通道、反应单元、光学检测区域、废液池和用于排出所述计数芯片的空气的放空单元；所述进样通道为蛇形通道，且所述蛇形通道上预埋有用于生乳体细胞荧光染色的PI荧光染色剂和作用于体细胞的细胞通透剂；所述放空单元为巴氏吸管的弹性胶囊或注射器。

6.根据权利要求5所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述取样口上连接有巴氏吸管的尖嘴吸管。

7.根据权利要求1所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述生乳体细胞计数软件包括界面显示模块、图像获取模块和图像处理模块；

所述图像获取模块用于：调取智能终端中的生乳体细胞荧光图像，并进行图像页面截取用作计数软件后续算法处理的原始图像；

所述图像处理模块用于：(1)对图像使用高斯滤波器进行去噪、平滑操作随后进行增强等预处理步骤，以便更好地进行细胞图像分析；(2)随后对图像进行二值化处理，将生乳体细胞的荧光图像从背景中分离开来；(3)使用轮廓检测算法，检测图像中的目标像素点并利用Findcoutour查找范围判断是否为细胞点随后进行计算；(4)反馈到前端展示，从而实现对生乳样品中体细胞的计数。

8.根据权利要求7所述的生乳体细胞便携式计数仪，其特征在于，所述智能终端为手机或平板电脑。

9.一种采用权利要求1-8任一项所述的生乳体细胞便携式计数仪进行生乳体细胞计数的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

将待测生乳样本导入计数芯片中，使得所述待测生乳样本与所述计数芯片腔室内的荧光染色试剂混合，并进入所述计数芯片的光学检测区域；然后将所述计数芯片插入外壳的插槽内，开启LED光源，操作移动终端上的生乳体细胞计数软件，获得体细胞计数结果。

10.根据权利要求9所述的生乳体细胞计数方法，其特征在于，所述计数芯片的操作步骤包括：按压计数芯片的弹性胶囊，将待测生乳样本吸入计数芯片的染色通道并与固定在染色通道上的PI染色试剂和细胞通透剂混合，继续按压计数芯片的弹性胶囊使得待测样本进入光学检测区域。